Perfil de las respuestas del comportamiento materno durante la toma de imágenes de todo el cerebro

Resumen

Aquí se presenta un canal de análisis de video que supera los desafíos en el monitoreo del comportamiento dentro de los entornos de resonancia magnética, lo que permite la detección de respuestas conductuales no instruidas a señales externas. Este análisis facilitará una comprensión más completa de los cambios de estado internos evocados y la actividad de todo el cerebro.

Resumen

Los avances recientes en las herramientas de imágenes de todo el cerebro han permitido a los neurocientíficos investigar cómo la actividad cerebral coordinada procesa las señales externas, influyendo en los cambios de estado internos y provocando respuestas conductuales. Por ejemplo, la resonancia magnética funcional (fMRI) es una técnica no invasiva que permite medir la actividad de todo el cerebro en ratones despiertos que se comportan utilizando la respuesta dependiente del nivel de oxigenación de la sangre (BOLD). Sin embargo, para comprender completamente las respuestas BOLD evocadas por estímulos externos, es crucial que los experimentadores también evalúen las respuestas conductuales durante las exploraciones. El entorno de la resonancia magnética plantea desafíos para este objetivo, lo que hace que los métodos comúnmente empleados de monitoreo del comportamiento sean incompatibles. Estos desafíos incluyen (1) un campo de visión restringido y (2) la disponibilidad limitada de equipos sin componentes ferromagnéticos. Aquí se presenta una canalización de análisis de video conductual que supera estas limitaciones mediante la extracción de información valiosa de videos adquiridos dentro de estas restricciones ambientales, lo que permite la evaluación del comportamiento durante la adquisición de datos neuronales de todo el cerebro. Empleando métodos como la estimación del flujo óptico y la reducción de la dimensionalidad, se pueden detectar diferencias sólidas en las respuestas conductuales a los estímulos presentados durante las exploraciones de resonancia magnética funcional. Por ejemplo, los resultados representativos sugieren que las vocalizaciones de las crías de ratón, pero no los tonos puros, evocan respuestas conductuales significativamente diferentes en ratones hembra materna frente a hembra virgen. En el futuro, esta línea de análisis del comportamiento, inicialmente diseñada para superar los desafíos en los experimentos de resonancia magnética funcional, se puede extender a varios métodos de registro neuronal, proporcionando un monitoreo versátil del comportamiento en entornos restringidos. La evaluación coordinada de las respuestas conductuales y neuronales ofrecerá una comprensión más completa de cómo la percepción de los estímulos conduce a la coordinación de salidas conductuales complejas.

Introducción

El monitoreo de las respuestas conductuales durante las grabaciones neuronales es esencial para comprender la actividad coordinada evocada por estímulos en todo el cerebro. En el caso de que no se prediga que los animales responderán a los estímulos de una manera específica y orientada a un objetivo, la observación de comportamientos no instruidos puede ofrecer información sobre cómo las señales externas informan sus estados internos ^1,2. Los avances recientes en las herramientas de neuroimagen, como las imágenes de calcio de campo amplio y las imágenes de resonancia magnética funcional (fMRI), han permitido a los neurocientíficos expandir las investigaciones más allá de regiones cerebrales singulares. Sin embargo, para lograr una comprensión más completa de estos datos neuronales de alta dimensión, la capacidad de evaluar los resultados conductuales de estos patrones complejos también debe avanzar en consecuencia.

Los métodos de última generación para caracterizar los comportamientos instruidos por la tarea se utilizan ampliamente en la investigación en neurociencia, incluidos los sensores de temperatura y presión para detectar olfateos ^3,4, haces de luz para detectar lamidos⁵ y la estimación de la pose sin marcadores para rastrear partes del cuerpo predeterminadas⁶. Sin embargo, la evaluación basada en datos de patrones de comportamiento no instruidos sigue siendo un desafío en el campo⁷. Si bien los métodos para el análisis del comportamiento basado en datos están avanzando rápidamente, los métodos existentes generalmente requieren una potencia computacional sustancial, equipos especializados o una visión particularmente clara del animal 2,6,8,9. Aquí se presenta una canalización de análisis de video conductual que es fácilmente susceptible a cualquier dato de videografía y permite la extracción de valiosas medidas de comportamiento de videos adquiridos durante la estimulación pasiva.

Este canal de análisis de comportamiento fue diseñado para ser compatible con la adquisición coordinada de datos neuronales y de video en animales con la cabeza fija expuestos a una amplia gama de estímulos externos y múltiples entornos de grabación, incluso aquellos con restricciones considerables. Por ejemplo, el entorno de la resonancia magnética plantea desafíos específicos para el monitoreo del comportamiento, incluido un campo de visión restringido y una disponibilidad limitada de equipos sin componentes ferromagnéticos. Estas limitaciones hacen que los métodos comúnmente empleados sean incompatibles, dejando que medidas como el movimiento de la cabeza (es decir, cómo se mueve el cerebro entre las adquisiciones de volumen) se encuentren entre las formas más accesibles pero limitadas de evaluar las respuestas corporales durante las exploraciones¹⁰. Al superar estas limitaciones, este protocolo facilitó el análisis de los datos de videografía compatibles con la RM, mostrando que los ratones hembra con diferentes experiencias maternas exhiben distintas respuestas conductuales a los estímulos auditivos. A las madres y a las vírgenes se les presentaron estímulos auditivos durante las resonancias magnéticas funcionales, incluidas las vocalizaciones de los cachorros angustiados ("llamadas de cachorros") y los tonos puros. Estos estímulos se presentaron de forma pasiva, es decir, sin ninguna salida conductual instruida. Si bien se predijo que las madres mostrarían respuestas más elevadas a las llamadas de los cachorros en comparación con las vírgenes, hay poca literatura sobre cómo los ratones hembra responden a las señales de los bebés en un entorno de cabeza fija. Por lo tanto, no había una salida de comportamiento específica para rastrear a priori, lo que convierte a este experimento en la prueba perfecta para los análisis de comportamiento basados en datos propuestos. Empleando métodos como la estimación del flujo óptico y la reducción de la dimensionalidad, se detectaron diferencias grupales en las respuestas conductuales, tanto en magnitud como en manifestación espacial.

En el futuro, la evaluación coordinada de las respuestas conductuales y neuronales se puede aprovechar para lograr una comprensión más completa de cómo los estímulos externos alteran los estados internos e informan resultados conductuales complejos. Esta comprensión debe extenderse a los estímulos presentados en ausencia de tareas impuestas y comportamientos instruidos. La canalización de análisis presentada aquí se puede extender a varias técnicas de registro neuronal, lo que proporciona un monitoreo de comportamiento versátil incluso en entornos restringidos.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Columbia (IACUC), y todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas, regulaciones y recomendaciones pertinentes. Los detalles del equipo y el software utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Software

1. Descargue MATLAB desde el sitio web de Mathworks.
   NOTA: El código que comprende esta canalización de análisis se puede ejecutar únicamente a través de MATLAB y se escribió específicamente para ser compatible con MATLAB 2023a.
2. Esta canalización requiere Computer Vision Toolbox y Image Processing Toolbox dentro de MATLAB. Agregue las cajas de herramientas a los complementos de MATLAB haciendo clic en Administrar complementos, Obtener complementos y, a continuación, búsquelos y agréguelos.
   NOTA: Se proporcionan cinco scripts de MATLAB como archivos complementarios, titulados de la siguiente manera: script1_videocoreg.m (Archivo de codificación suplementaria 1), script2_optflow_roiselect.m (Archivo de codificación suplementaria 2), script3_optflow_analysis.m (Archivo de codificación suplementaria 3), script4_optflow_pca.m (Archivo de codificación suplementaria 4) y script5_optflow_pca_analysis.m (Archivo de codificación suplementaria 5). También se proporcionan dos vídeos de ejemplo (Vídeo 1 y Vídeo 2) y sus correspondientes archivos de temporización de eventos (Archivo Complementario 1 y Archivo Complementario 2). Se recomienda ejecutar primero la canalización con los datos de ejemplo.
   PRECAUCIÓN: Tenga cuidado con los comentarios en el código que incluyan un signo de exclamación, ya que estas son áreas que requieren acción antes de la ejecución. Por ejemplo, hay comentarios como "¡edite el bloque de código a continuación!" para resaltar dónde se deben realizar ediciones para adaptarse a las estructuras de archivos, los detalles del experimento o las necesidades de análisis. Estas opciones están configuradas de forma predeterminada para adaptarse a los dos vídeos de ejemplo proporcionados, pero necesitarán ajustes una vez que uno comience a ejecutar la canalización con sus propios datos.
3. Para ejecutar cada sección de cada script, haga clic en Ejecutar y Avanzar en el menú Editor .

2. Corinscripción de vídeo

NOTA: El primer script proporcionado en esta canalización de análisis es script1_videocoreg.m (Archivo de codificación suplementario 1), que alinea espacialmente todos los vídeos entre sí mediante el corregistro. Las entradas de este script son los vídeos sin procesar y las salidas principales son los vídeos transformados.

1. Edite las secciones 1, 2, 3, 4, 5 y 6 del script donde se indique para adaptarse a las estructuras de datos.
2. Ejecute la sección 1.
3. Elija tres puntos en cada vídeo para etiquetar, como se muestra en la Figura 1A. Estos tres puntos se utilizarán para corregistrar todos los fotogramas entre sí. Ejecute la Sección 2 del script para mostrar el primer fotograma de cada vídeo y utilice el ratón para hacer clic una vez en los dos primeros puntos y, a continuación, haga doble clic en el tercer punto. Una vez seleccionados los puntos del último vídeo, pulse Intro.
4. Ejecute la sección 3 y la sección 4.
5. Establezca la marca alineada en 0 y ejecute la Sección 5. A continuación, establezca el indicador alineado en 1 y vuelva a ejecutar la Sección 5 .
6. Ejecute la Sección 6 y compare la figura resultante en paralelo con la Figura 1B. Cualquier aberración observada en la imagen promedio no alineada de la izquierda debe disminuirse en la imagen promedio alineada de la derecha.

3. Estimación de flujo óptico: FOV completo

NOTA: Para evaluar el movimiento a través de los videos escaneados, es necesario estimar el flujo óptico para cada video transformado. Esto se puede hacer para el campo de visión completo (FOV) de cada video con el script proporcionado script2_optflow_roiselect.m (Archivo de codificación suplementario 2). Las entradas para este script son los vídeos transformados y las salidas son matrices 3D que indican la magnitud del flujo óptico de cada píxel a lo largo del tiempo para cada vídeo. La Figura 2A muestra un fotograma de ejemplo con vectores de flujo óptico superpuestos en azul, donde la longitud de cada vector representa la magnitud relativa del flujo óptico de ese píxel. Se descubrió que guardar las salidas como vídeos era más eficiente que guardarlas como matrices 3D.

1. Edite la sección 1 del script donde se indica que se ajusta a las estructuras de datos.
2. Ejecute la sección 1.

4. Selección del ROI

NOTA: Los siguientes pasos de análisis se hacen mucho más manejables en términos de carga computacional y necesidades de almacenamiento de datos al seleccionar una región de interés (ROI) dentro del campo de visión completo en la que centrar el análisis. El ROI se puede seleccionar de acuerdo con el experimento y los comportamientos de interés o a través de un enfoque más basado en datos. Para los resultados representativos presentados aquí, la desviación estándar de la magnitud del flujo óptico de cada píxel en el campo de visión completo se calculó con el script script2_optflow_roiselect.m, Sección 2 (Archivo de codificación suplementario 2). Las entradas para esta parte del script son las salidas de la Sección 1, y la salida principal es una visualización de la desviación estándar de la magnitud del flujo óptico en todos los píxeles de todos los vídeos. En los resultados representativos presentados, el campo de visión del espejo mostró una desviación estándar relativamente alta del flujo óptico, lo que guió la elección demostrada del ROI.

1. Edite la sección 2 del script donde se indica para adaptarse a las estructuras de datos.
2. Ejecute la Sección 2 y utilice la imagen resultante para ver dónde fluctúa el flujo óptico de forma más drástica en los vídeos analizados. Un ejemplo de esta imagen se muestra en la Figura 2B.

5. Cuantificación óptica del flujo: retorno de la inversión

NOTA: La sección 3 del script script2_optflow_roiselect.m (Archivo de codificación suplementario 2) permite al usuario seleccionar un ROI con una herramienta de dibujo y guardar las coordenadas de los límites. Las entradas para esta parte del script son las salidas de la Sección 1, y las salidas son vectores 1D que indican la magnitud del flujo óptico promedio del ROI a lo largo del tiempo para cada video.

1. Edite la sección 3 del script donde se indique para adaptarse a las estructuras de datos y las necesidades de análisis.
   NOTA: Hay algunas opciones sobre cómo proceder con la selección del ROI. Elija una opción:
   1. Opción 1: Analice el campo de visión completo del video.
      1. Establezca la marca selectROI en 0 y establezca provideROI en 0.
   2. Opción 2: Analizar un nuevo ROI.
      1. Establezca la marca selectROI en 1 y establezca provideROI en 0. A continuación, edite newCoordsName.
   3. Opción 3: Analice un ROI previamente extraído.
      NOTA: Solo seleccione esta opción si uno ha ejecutado previamente este código y ha creado un ROI.
      1. Establezca la marca selectROI en 0 y establezca provideROI en 1. A continuación, edite inputCoords para proporcionar un conjunto predeterminado de coordenadas.
2. Ejecute la sección 3.

6. Comparación de la magnitud del flujo óptico

NOTA: El script proporcionado script3_optflow_analysis.m (Supplemental Coding File 3) requiere la mayor especialización para ajustarse a los datos del usuario. Las entradas principales son los vectores 1D que indican la magnitud del flujo óptico promedio del ROI a lo largo del tiempo para cada video, y cuando se combinan adecuadamente con los inicios de eventos y la información de grupo/condición, las salidas principales son comparaciones estadísticas que se pueden adaptar a los intereses del análisis.

1. Edite las secciones 1-3 del script para adaptarlas a las estructuras de datos y las necesidades de análisis.
2. Establezca las marcas de opciones de análisis zsc, blrm, blzsc, demeanPerTrial y applyLPfilter en 0 o 1 según lo desee en la Sección 1. En los resultados representativos presentados, zsc, blrm y applyLPfilter se establecieron en 1, y todas las demás opciones se establecieron en 0.
3. Establezca LPfilter en un número que represente el filtro de paso bajo deseado en hercios (Hz). En los resultados representativos presentados, se aplicó un filtro de paso bajo de 5 Hz, ya que no se esperaba que las respuestas conductuales fluctuaran a una velocidad superior a 5 Hz.
4. Ejecute las secciones 1 a 3. La sección 3 debe producir gráficos para las series temporales de flujo óptico promedio del grupo, el flujo óptico acumulativo promedio del grupo y el flujo óptico acumulativo resumido, incluidos gráficos como los que se muestran en la Figura 3. La sección 3 se puede ejecutar para cualquier combinación de comparaciones de grupos/condiciones.

7. Flujo óptico PCA

NOTA: Sobre la base de la estimación de la magnitud del flujo óptico, las salidas de script2_optflow_roiselect.m (Archivo de codificación suplementario 2) también contienen información sobre la distribución espacial del flujo óptico fotograma a fotograma por vídeo. Con el fin de reducir la dimensionalidad de esta información espacial, el script proporcionado script4_optflow_pca.m (Archivo de codificación suplementario 4)  realiza un análisis de componentes principales (PCA) sobre el flujo óptico estimado. Las entradas principales son las matrices de flujo óptico 3D, previamente guardadas como videos para cada video de comportamiento, y la salida principal es un archivo .mat por video que contiene información de variación de PC y explicada.

1. Edite la sección 1 del script para adaptarla a las estructuras de datos y a las necesidades de análisis.
2. Establezca las marcas de opciones de análisis stimnum, dsfactor y fnfactor como se desee en la Sección 1. En los resultados representativos presentados, se analizó cada tipo de estímulo por separado, y se mantuvo el valor predeterminado de 1 para dsfactor y fnfactor, lo que resultó en que no se rebajara el muestreo en el espacio o el tiempo.
3. Ejecute la sección 1.

8. Comparación de PCA de flujo óptico

NOTA: El script proporcionado script5_optflow_pca_analysis.m (Archivo de codificación suplementario 5) llevará a cabo comparaciones exploratorias de los resultados de PCA entre grupos. Las entradas principales son la PC específica del estímulo y la información de varianza explicada obtenida de script4_optflow_pca.m (Archivo de codificación suplementaria 4), y las salidas principales son mapas de calor con umbrales estadísticos que representan las cargas de la primera PC, aunque también se pueden analizar otras PC con este script.

1. Edite la sección 1 del script para adaptarla a las estructuras de datos y al análisis.
2. Ejecute la Sección 1 y la Sección 2.
3. Edite las entradas de la Sección 3 , específicamente las variables group y myTitle , para reflejar el análisis de grupo deseado, así como threshT. threshT representa el umbral de la estadística T por encima del cual los resultados se considerarán significativos, que se puede calcular en función de las tablas de estadísticas T a valores p disponibles públicamente y los grados de libertad.
4. Ejecute la Sección 3 para cada grupo de interés. El código debe producir un mapa estadístico de resumen de grupo, como los que se muestran en los paneles izquierdo y central de la Figura 4. Ajuste el rango de caxis y, por lo tanto, los límites de la barra de color, según lo desee para la visualización.
5. Edite las entradas de la Sección 4 , específicamente las variables mag y myTitle para reflejar la comparación de grupo deseada, así como threshT. threshT representa el umbral de la estadística T por encima del cual los resultados se considerarán significativos, que se puede calcular en función de las tablas de estadísticas T a valores p disponibles públicamente y los grados de libertad.
6. Ejecute la sección 4 para cada comparación de grupo de interés. El código debe producir un mapa estadístico de comparación de grupos, como se muestra en el panel derecho de la Figura 4. Ajuste el rango de caxis y, por lo tanto, los límites de la barra de color, según lo desee para la visualización.

Resultados

Para demostrar el potencial de este proceso de análisis, se adquirieron videos de comportamiento de ratones hembra con la cabeza fijada, específicamente madres y vírgenes, mientras se presentaban a los ratones estímulos auditivos durante las imágenes de resonancia magnética funcional (fMRI). Los estímulos consistieron en llamadas de cachorros y tonos puros presentados de forma pasiva, por lo tanto, sin ninguna salida conductual instruida. Las llamadas de los cachorros eran grabaciones de vocalizaciones ultrasónicas emitidas por cachorros de ratón de 6 días de edad aislados temporalmente de su nido. Estas llamadas de cachorros generalmente provocan el acto materno de recuperación de cachorros, en el que la madre localiza, se mueve, investiga, luego recoge al cachorro y lo devuelve a la seguridad del nido, un comportamiento que las hembras vírgenes generalmente no exhiben^. Trabajos anteriores han demostrado que las llamadas de los cachorros provocan^{una actividad} evocada robusta en la corteza auditiva primaria de las madres, pero no en las vírgenes, mientras que las respuestas de tonos puros no muestran diferencias entre los grupos. Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que se identificarían diferencias grupales en las respuestas conductuales a las llamadas de los cachorros, pero no en los tonos puros. Sin embargo, hay poca literatura sobre los comportamientos específicos de los ratones hembra en respuesta a las señales de los cachorros en un entorno de fijación de la cabeza. Por lo tanto, no se esperaba ningún resultado conductual específico, lo que convierte a este experimento en la prueba perfecta para los análisis de comportamiento basados en datos propuestos.

En el transcurso de ocho días, todos los animales se habituaron gradualmente al manejo del experimentador, la fijación de la cabeza y el entorno de resonancia magnética. La habituación a la fijación de la cabeza y al entorno experimental es crucial para evaluar las respuestas conductuales a los estímulos presentados. Si no se habitúan adecuadamente al medio ambiente, los animales solo pueden mostrar respuestas de estrés, eliminando cualquier efecto impulsado por estímulos que de otro modo podría analizarse a través de la videografía.

Si bien la configuración del aparato conductual fue generalmente la misma para cada sesión de adquisición de datos, es posible que el campo de visión (FOV) de la cámara cambiara ligeramente cada vez que se fijaba la cabeza de un animal para las exploraciones de fMRI (consulte el ejemplo de FOV en la Figura 1A). Esto se debió probablemente a ligeros cambios en la posición de la montura de la cámara, así como a variaciones individuales en la fijación del cráneo del poste de la cabeza para cada animal. Por lo tanto, los videos de los escaneos debían alinearse entre sí a través del corregistro lineal para permitir la comparación de la información espacial que contenían entre los escaneos y los animales. El corregistro se adaptó a los datos representativos. Por ejemplo, en un día de escaneo estándar, se adquirieron de 3 a 4 escaneos por animal, lo que resultó en 3 a 4 videos por animal por día. Entre cada escaneo, no hubo movimiento de los componentes de la base, incluidos los componentes de la cámara y la fijación de la cabeza. Por lo tanto, una vez que se determinó la transformación de coregistro para un video por animal por día, se pudo aplicar a los otros 2 o 3 videos de ese animal el mismo día. Si bien esto ahorró tiempo en el paso de corregistro de esta canalización, las transformaciones espaciales también se pueden calcular para cada video individualmente, si es necesario. Se eligieron tres características presentes en cada video como puntos para etiquetar y calcular la transformación espacial. En los datos representativos mostrados, esos tres puntos eran el centro del poste de la cabeza, la vista frontal del ojo derecho del animal y la vista de perfil del ojo derecho del animal (visible en un espejo colocado en un ángulo de 45 grados). En la Figura 1A, B, se muestran ejemplos de corregistro de vídeos, que muestran el fotograma medio calculado a partir de todos los vídeos tomados durante este experimento, tanto antes como después del corregistro, para demostrar el efecto de este paso.

Esta tubería depende en gran medida del flujo óptico, un método de visión por computadora utilizado para estimar el movimiento de los objetos en un video mediante la estimación de sus velocidades aparentes^{entre fotogramas} consecutivos. Se eligió el flujo óptico porque permite la cuantificación del movimiento, un indicador de las respuestas conductuales, sin ninguna parte del cuerpo predeterminada o acciones de interés. Además, este método se adaptó a la limitada calidad de imagen de los videos representativos, que se adquirieron con la única cámara compatible con RM accesible en el momento del experimento. En esta tubería, se utiliza el algoritmo de Horn-Schunck de estimación de flujo óptico global y denso; sin embargo, otros algoritmos, como el algoritmo de Lucas-Kanade, se pueden emplear fácilmente con ligeras alteraciones en los scripts de MATLAB proporcionados 14,15,16. La Figura 2A muestra un fotograma de vídeo de ejemplo con vectores de velocidad de flujo óptico relativo superpuestos para cada píxel. Tenga en cuenta que los vectores más grandes aparecen en áreas donde uno esperaría movimiento, como el hocico y las patas del animal.

Si bien la canalización estimó el flujo óptico para todos los videos en el campo de visión completo, los pasos de análisis restantes se hicieron mucho más manejables en términos de carga computacional y necesidades de almacenamiento de datos mediante la selección de una región de interés (ROI) dentro del campo de visión. El ROI se puede seleccionar de acuerdo con el experimento y los comportamientos predeterminados de interés o a través de un enfoque más basado en datos. Dado que los datos representativos no incluían ningún resultado conductual específico para rastrear a priori, se siguió un enfoque basado en datos. Se calculó la desviación estándar de la magnitud del flujo óptico en todos los videos en cada píxel, como se visualiza en la Figura 2B. Las áreas de mayor desviación estándar incluyeron los contornos del animal, como alrededor del ojo y el hocico, lo que infunde confianza en que las fluctuaciones del flujo óptico observadas fueron guiadas por el movimiento del animal y no por el ruido en los videos. Las áreas de menor desviación estándar incluyeron los contornos de la base, que podrían ser el resultado de pequeñas vibraciones en la cámara y la base que ocurrieron durante el escaneo. El entorno de la resonancia magnética está inevitablemente plagado de vibraciones durante la adquisición de datos debido a la conmutación de gradientes, que pueden manifestarse en fluctuaciones de flujo óptico observadas en los componentes reflectantes de la cuna. Afortunadamente, estas vibraciones son constantes a lo largo de la adquisición de datos, por lo que son independientes de la condición del estímulo y no se espera que afecten a los resultados del análisis del comportamiento. Se observaron desviaciones estándar de flujo óptico particularmente elevadas en los píxeles del espejo, correspondientes a la vista de perfil de la cara del animal, lo que guió la selección del ROI para los datos representativos. Esta también fue una región donde las respuestas conductuales, como batir y olfatear, podrían esperarse como parte del repertorio conductual típico de ratones hembra que buscan una cría aislada que emite llamadas^{de cachorro 17}.

Después de elegir un retorno de la inversión y extraer la magnitud media del flujo óptico de todos los vídeos, el flujo óptico durante las épocas de interés pudo compararse entre grupos y condiciones. Tenga en cuenta que los primeros 20 segundos (s) del vector de flujo óptico de cada video se enmascararon para estabilizar el brillo; sin embargo, esto se puede ajustar para adaptarse a las necesidades experimentales. Para cada vídeo, el vector de flujo óptico fotograma a fotograma para el ROI elegido se puntuó Z, luego, siguiendo el trabajo previo en la clasificación de la expresión facial, se filtró de paso bajo a 5 hercios (Hz) para tener en cuenta que la velocidad de fotogramas de 30 Hz de la cámara era más rápida que cualquier fluctuación de comportamiento esperada². Finalmente, los vectores puntuados y filtrados con puntuación Z se dividieron en épocas de presentación de estímulos para evaluar el efecto de la presentación de estímulos en el flujo óptico. Para cada época, se restó la señal de referencia media previa al estímulo para normalizar el flujo óptico al período previo al estímulo. La Figura 3A muestra series temporales de flujo óptico ejemplares para dos videos, uno materno y otro virgen, con datos resumidos del grupo en la Figura 3B-E. Las figuras 3B y 3D muestran el flujo óptico acumulado a lo largo del tiempo durante la presentación del estímulo en relación con la línea de base, mientras que la figura 3C y la figura 3E resumen el flujo óptico acumulado 2,5 s después del inicio del estímulo. El flujo óptico acumulativo se calculó para capturar el movimiento general a lo largo del tiempo sin asumir que las respuestas espontáneas del comportamiento ocurrirían de una manera bloqueada en el tiempo. En general, estos resultados representativos demuestran que las llamadas de los cachorros, pero no los tonos puros, evocaron respuestas conductuales significativamente diferentes de los ratones hembra maternos frente a los ratones hembra vírgenes, como se predijo (prueba U de Mann-Whitney entre grupos: llamadas de cachorros: p = 0,026; tonos puros: p = 0,093). Sin embargo, este efecto estímulo no sobrevivió a un ANOVA de 2 vías, mientras que el efecto grupo sí (estímulo: F(1,10) = 0,19, p = 0,67; grupo: F(1,10) = 8,61, p = 0,015). En general, estos resultados sugieren que las madres mostraron un mayor movimiento evocado por estímulos en comparación con las vírgenes, siendo la respuesta materna a las llamadas de los cachorros más consistente que a los tonos puros. Esto puede reflejar una mayor atención o estrés en las madres, así como la relevancia conductual de las llamadas de los cachorros, que, a diferencia de los tonos puros, evocan la respuesta de la recuperación de las crías en las madres en entornos naturalistas. Tomados en conjunto, estos resultados representativos sugieren que la estimación del flujo óptico durante la presentación de estímulos externos puede extraer información sobre las respuestas conductuales matizadas y espontáneas.

Finalmente, se realizó un análisis más exploratorio para descubrir las características espaciales del comportamiento capturado en los datos representativos. Para investigar qué píxeles en el ROI fluctuaron de manera coordinada durante la presentación del estímulo, se realizó un análisis de componentes principales (PCA) sobre la información del flujo óptico espacial a lo largo del tiempo. Este análisis reveló los píxeles que más contribuyeron a la primera PC, así como los píxeles que mostraron diferencias de grupo para cada condición de estímulo, como se muestra en la Figura 4. Los paneles más a la derecha de la Figura 4A, B sugieren que las madres mostraron más movimiento en la nariz en comparación con las vírgenes durante la presentación de ambos tipos de estímulos. En los dos grupos y las dos condiciones de estímulo, el primer CP explicó el 5,41% ± el 0,59% de la varianza total en el análisis de flujo óptico. Si bien el ROI del espejo se mantuvo para esta parte de nuestro análisis, los análisis futuros podrían expandirse a una porción más amplia del FOV para caracterizar movimientos coordinados más allá de la cara en respuesta a estímulos. Por ejemplo, la comparación del movimiento de las patas puede revelar diferencias más significativas entre los grupos, dado que las llamadas de los cachorros suelen iniciar la recuperación de las crías en las madres, pero no en las vírgenes, y que las patas pueden moverse más libremente que la cabeza del animal.

Si bien los resultados representativos hasta ahora sugirieron que esta tubería puede evaluar las respuestas conductuales no instruidas a estímulos externos en entornos de videografía restringidos, quedaba la pregunta de si las fluctuaciones observadas en el flujo óptico realmente reflejaban un comportamiento animal significativo. Para responder a esta pregunta, se analizó un conjunto de datos de validación independiente utilizando la misma canalización. En un experimento separado, se entrenó a ratones machos con restricción de agua para asociar una señal de luz con la entrega de una recompensa de agua de 6 μL ("alta recompensa") o 1 μL ("baja recompensa"). Cabe destacar que, a diferencia del experimento de estimulación auditiva, este experimento tenía una lectura conductual a priori : la tasa de lamido. Se estableció un lickómetro a través de la detección de lamidas basada en video, facilitada por el análisis del brillo de los píxeles cerca de la tromba de agua. Por lo tanto, la lectura de comportamiento suministrada por el lickómetro podría usarse para comparar la lectura de comportamiento de esta tubería suministrada por la estimación de flujo óptico, lo que respalda su validez en la detección de comportamientos espontáneos. Después del corregistro de video, la estimación del flujo óptico, la selección del ROI (una vez más contiene el FOV del espejo) y la cuantificación del flujo óptico, la comparación de la magnitud del flujo óptico reveló una diferencia significativa entre las respuestas de comportamiento a las recompensas altas frente a las bajas. Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 5A, B, donde la Figura 5A muestra las series de tiempo promediadas por el grupo, y la Figura 5B resume el flujo óptico acumulado 2,5 s después del inicio del estímulo (prueba de rangos con signo de Wilcoxon emparejada entre condiciones: p = 0,031). Obsérvese que los valores de flujo óptico fueron mayores en comparación con el comportamiento espontáneo registrado en los datos representativos, lo que enfatiza aún más el desafío de evaluar las respuestas conductuales matizadas y no instruidas. La Figura 5C muestra la tasa real de lamidos registrada por el lickómetro para cada una de las dos condiciones de recompensa, mientras que la Figura 5D muestra que se registran más lamidos durante la condición de alta recompensa en comparación con la condición de baja recompensa dentro de los 2,5 segundos posteriores a la entrega de la recompensa (prueba de rango con signo de Wilcoxon emparejada entre condiciones: p = 0,031). En conjunto, ambos análisis revelaron una tendencia similar en la comparación de las respuestas de alta y baja recompensa, validando la línea de análisis de video presentada para capturar diferencias significativas en el comportamiento de los animales en todas las condiciones.

Tomados en conjunto, los resultados representativos mostrados aquí sugieren que la presentación de las llamadas de los cachorros evocó respuestas significativamente diferentes en los ratones hembra materna frente a los ratones hembra virgen, mientras que los tonos puros no lo hicieron. El análisis de un conjunto de datos de validación confiere confianza en que las diferencias observadas en el flujo óptico reflejan diferencias significativas en las respuestas conductuales a estímulos externos.

Figura 1: Coregistro de video. (A) Ejemplos de corregistro de video que representan características predeterminadas (centro del poste de la cabeza, vista frontal del ojo derecho, vista de perfil del ojo derecho) etiquetadas en tres cuadros, cada uno tomado de diferentes videos de diferentes animales. Observe en la superposición cómo los tres puntos no estaban alineados, lo que demuestra cómo la configuración de comportamiento cambió ligeramente entre las sesiones de adquisición de datos. (B) El fotograma promedio en los últimos 10 segundos de cada video antes (izquierda) y después (derecha) de realizar el corregistro de video. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Estimación del flujo óptico. (A) Fotograma de ejemplo con vectores de flujo óptico relativos superpuestos en azul. (B) La desviación estándar promedio de píxeles del flujo óptico en todos los videos. El ROI elegido alrededor de la vista de perfil de la cara del animal a través del espejo está delineado en magenta. La barra de color corresponde a la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Visualización y comparación del flujo óptico entre grupos y condiciones. (A) Ejemplos de series temporales de flujo óptico con puntuación Z y paso bajo filtrado de 5 Hz para un video de una madre y un video de una virgen. (B) y (D) Flujo óptico acumulativo medido durante el período de estímulo de las llamadas de cachorro (B) y tonos puros (D). El sombreado representa el error estándar de la media (SEM). (C) y (E) Flujo óptico acumulativo durante los primeros 2,5 s de presentación de estímulos para llamadas de cachorros (C) y tonos puros (E). * Indica p < 0.05, prueba U de Mann-Whitney entre grupos (llamadas de cachorros: p = 0.026; tonos puros: p = 0.093), N = 6 por grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Comparación de PC₁ entre grupos. (A,B) Mapas que representan las cargas del primer componente principal (PC₁) del flujo óptico durante las llamadas PUP (A) y los tonos puros (B) entre grupos, estadísticamente umbralizados a p < 0.05 sin corrección para comparaciones múltiples. El mapa de calor indica el grado en que la fluctuación del flujo óptico de cada píxel contribuyó a PC₁, en relación con otros píxeles. El texto negro pequeño indica el porcentaje de varianza explicado por el PC₁ (llamadas de cachorro de madres: 4,95% ± 0,72%; llamadas de cachorros vírgenes: 4,44% ± 0,59%; tonos puros de madres: 4,95% ± 0,39%; tonos puros de vírgenes: 4,72% ± 1,24% (media ± desviación estándar)). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Validación de la canalización de análisis de comportamiento. (A) Series de tiempo promedio con puntuación Z, línea de base previa al estímulo restado y paso bajo de 5 Hz filtradas de flujo óptico durante la entrega de recompensa alta y baja. El sombreado representa el SEM, la línea vertical blanca indica la entrega de recompensas y los asteriscos rojos indican artefactos de flujo óptico temporales debido al inicio y desplazamiento de la señal de luz. (B) Resumen del flujo óptico acumulado durante los primeros 2,5 s después de la entrega de recompensa. * Indica p < 0,05, prueba de rangos con signo de Wilcoxon emparejada entre condiciones (p = 0,031). (C) Tasa media de lamidos, obtenida por lickómetro, durante la entrega de recompensas altas y bajas. El sombreado representa SEM y la línea vertical blanca indica la entrega de recompensas. (D) Número de lamidas registradas durante los primeros 2,5 s después de la entrega de recompensa. * Indica p < 0,05, prueba de rangos con signo de Wilcoxon emparejada entre condiciones (p = 0,031), N = 6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vídeo 1: Ejemplo de vídeo 1. PCR_Br011_20231015_1842_output.avi. Haga clic aquí para descargar este video.

Vídeo 2: Ejemplo de vídeo 2. PCR_Br014_20231015_1722_output.avi. Haga clic aquí para descargar este video.

Archivo complementario 1: Archivo de temporización de eventos para Video 1. PCR_Br011_20231015_1842_output_videoTimestamps.mat. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Archivo de temporización de eventos para Video 2. PCR_Br014_20231015_1722_output_videoTimestamps.mat. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Fichero de codificación suplementario 1: script1_videocoreg.m. Este script alinea espacialmente todos los vídeos entre sí a través del corregistro. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Fichero de Codificación Suplementaria 2: script2_optflow_roiselect.m. Este script estima el flujo óptico para el campo de visión completo de cada video transformado y permite la selección de un retorno de la inversión para el resto de la canalización. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Fichero de Codificación Suplementaria 3: script3_optflow_analysis.m. Este script compara la magnitud del flujo óptico en diferentes grupos/condiciones para el ROI elegido. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Fichero de codificación suplementario 4: script4_optflow_pca.m. Este script realiza PCA en el flujo óptico estimado del ROI elegido. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 5: script5_optflow_pca_analysis.m. Este script compara los resultados de PCA entre grupos/condiciones para el ROI elegido. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El canal de análisis de comportamiento presentado permite la extracción de información valiosa de videos de animales que exhiben comportamientos no instruidos en respuesta a estímulos presentados pasivamente. Estos videos representativos del comportamiento se adquirieron junto con datos de imágenes de resonancia magnética funcional (fMRI) de todo el cerebro, para lo cual se superaron múltiples limitaciones para capturar las respuestas del comportamiento en el entorno de la resonancia magnética. Empleando el método de estimación del flujo óptico, se revelaron diferencias en la forma en que las madres frente a las vírgenes responden a las llamadas de las crías, pero no a los tonos puros, lo que apoya la hipótesis inicial 13,14,15,16. Aprovechando la reducción de dimensionalidad de la información de flujo óptico, este hallazgo se extendió a un análisis exploratorio de la distribución espacial de estos comportamientos.

Esta línea de análisis es ampliamente susceptible a varios paradigmas experimentales. Es completamente independiente del tipo de datos neuronales adquiridos y no requiere una potencia computacional excesiva ni equipos especializados. El principal requisito experimental es que los datos de videografía se registren con las marcas de tiempo relevantes de los inicios de la presentación de estímulos. Además, al proporcionar los scripts de MATLAB utilizados para realizar los análisis demostrados, la implementación de esta canalización debería ser bastante sencilla, incluso para aquellos con una experiencia mínima en MATLAB. Los pasos generales, tal como se describen en el protocolo, consisten en el corregistro de video, la estimación del flujo óptico, la selección de la región de interés (ROI), la cuantificación del flujo óptico específico del ROI, la comparación de la magnitud del flujo óptico, el análisis de componentes principales (PCA) y la comparación de PCA. En cada paso, la canalización se puede modificar para adaptarse a las necesidades experimentales y analíticas, como se indica en el protocolo y se destaca con comentarios a lo largo del código.

Hay varias limitaciones que se deben tener en cuenta al emplear la canalización de análisis de vídeo presentada. En primer lugar, el diseño del aparato conductual debe ser considerado cuidadosamente. Si no está claro qué respuestas conductuales se pueden esperar, puede ser beneficioso para los análisis futuros tener tantos puntos de vista sobre el animal como sea posible. Por lo tanto, se recomienda instalar uno o varios espejos para capturar simultáneamente las vistas frontal y de perfil del animal, como se muestra en los fotogramas de video de ejemplo en la Figura 1A. En segundo lugar, se recomienda que la iluminación proporcionada para la adquisición de vídeo sea lo suficientemente brillante como para ver todas las características relevantes del campo de visión (FOV), pero no tanto como para alcanzar la saturación. En la Figura 1A, se puede observar que la vista frontal de la nariz del ratón se encuentra en un punto cercano a la saturación, lo que dificulta la captura de cualquier fluctuación en el brillo que indique movimiento. Esto puede haber contribuido a la falta de variación del flujo óptico observada en esta parte del FOV, como se muestra en la Figura 2B. Afortunadamente, la vista de perfil de la nariz no enfrentó este problema, lo que permitió analizar el ROI del espejo. Además, se debe considerar la posibilidad de saturación si en el experimento están involucrados estímulos visuales. En el experimento del conjunto de datos de validación, una señal de luz utilizada para señalar la entrega de una recompensa de agua introdujo una saturación temporal en los videos adquiridos, lo que representa un artefacto temporal en la estimación del flujo óptico. Este artefacto se puede observar en la Figura 5A, donde los dos picos agudos en las trazas de flujo óptico para ambas condiciones de recompensa se alinean exactamente con el momento en que se encendió y apagó la señal de luz. Este artefacto dificultó el análisis de estas cortas ventanas de tiempo con la canalización presentada, y si no hubiera estado presente, los resultados presentados en la Figura 5B podrían haber sido aún más significativos. La iluminación constante de la escena es una suposición necesaria para la mayoría de los algoritmos de flujo óptico^14,16. Por lo tanto, esta canalización de análisis de vídeo no se recomienda para experimentos en los que la iluminación del entorno cambia drásticamente, tanto dentro como entre ensayos. En tercer y último lugar, la suficiente habituación de los animales al entorno de grabación es un componente clave de cualquier experimento que aproveche este proceso. Si no están habituados adecuadamente, los animales pueden mostrar respuestas significativas al estrés, eliminando cualquier efecto sutil impulsado por estímulos que, de otro modo, podría analizarse mediante análisis de video.

En el futuro, este canal de análisis conductual se puede emplear para facilitar la evaluación coordinada de las respuestas conductuales y neuronales registradas simultáneamente. Como se ha demostrado, la evaluación cuantitativa de comportamientos no instruidos permite evaluar la prominencia de los estímulos en un entorno de registro complejo, así como probar diferentes respuestas conductuales en grupos y condiciones experimentales. Se pueden realizar análisis adicionales para explorar las diferencias individuales o las tendencias ensayo por ensayo en las respuestas conductuales, de modo que se pueda examinar la actividad neuronal correspondiente. Además, la incorporación de PCA para obtener información espacial sobre el movimiento evocado por estímulos se puede utilizar para investigar más a fondo si los tipos específicos de secuencias de comportamiento observadas durante la presentación de estímulos difieren entre grupos y condiciones. Esta canalización de análisis se puede extender fácilmente a varios métodos de registro neuronal, lo que proporciona un monitoreo versátil del comportamiento en entornos restringidos. Al investigar cómo se representan los estímulos externos tanto en el cerebro como en el comportamiento, los investigadores están preparados para obtener una comprensión más completa de cómo la percepción de los estímulos afecta los estados internos y sus manifestaciones externas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
MATLAB Computer Vision Toolbox	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/computer-vision.html
MATLAB Image Processing Toolbox	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/image-processing.html
Software MATLAB		de MathWorks
" 12M-i" con luz LED integrada	MRC Systems GmbH	12M-i	https://www.mrc-systems.de/downloads/en/mri-compatible-cameras/manual_mrcam_12m-i.pdf