Artículo de método

Análisis específico de hebras de proteínas en cadenas replicantes de ADN mediante el enriquecimiento y secuenciación del método de ADN naciente asociado a proteínas

DOI:

10.3791/67120

⸱

2 de mayo de 2025

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1Hormel Institute, University of Minnesota, 2West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, State Key Laboratory of Biotherapy, Sichuan University, 3Institute for Cancer Genetics, Department of Pediatrics and Department of Genetics and Development, Columbia University Medical Center

En este artículo

Resumen

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El enriquecimiento y secuenciación del ADN naciente asociado a proteínas (eSPAN) se desarrolló para detectar la abundancia relativa de una proteína asociada a la cromatina en dos cadenas de ADN replicantes, revelando así una visión molecular sobre la replicación de la cromatina y sus procesos acoplados. Este protocolo describe los procedimientos eSPAN en células madre embrionarias (ES) de levaduras y ratones.

Resumen

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La duplicación genómica se orquesta mediante proteínas respondesomes, incluidas las helicasas, que desenrollan el ADN de doble cadena en cadenas simples antiparalelas individuales, cada una requiriendo modos de replicación distintos: continua (adelantadora) y discontinua (lag). Comprender las interacciones de las proteínas asociadas a la cromatina con cadenas de ADN replicantes in vivo es crucial para esclarecer los mecanismos de ensamblaje de la cromatina y la reparación del ADN acoplados a la replicación del ADN. Este protocolo presenta el método de enriquecimiento y secuenciación de ADN naciente asociado a proteínas (eSPAN), diseñado para cuantificar los niveles relativos de proteínas en cadenas de ADN naciente y rezagada en horquillas de replicación. El procedimiento eSPAN comienza con inmunoprecipitación de cromatina (ChIP, en levadura) o escisión bajo objetivos y etiquetado (CUT&Tag; en células de mamíferos) de una proteína de interés, seguido del enriquecimiento del ADN naciente asociado a proteínas mediante inmunoprecipitación de bromodeoxiuridina (BrdU). Se aplica secuenciación de nueva generación específica de cadena a ADN ssDNA aislado. Esta técnica puede utilizarse para determinar si una proteína está enriquecida en las horquillas de replicación delanteras o rezagadas. El eSPAN proporciona preferencia de hebra a nivel genómico de proteínas asociadas a la cromatina, incluidas las histonas en los forks de replicación.

Introducción

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En los organismos eucariotas, la duplicación del genoma se inicia desde múltiples sitios llamados orígenes de replicación, donde el complejo de reconocimiento de origen (ORC) se une e inicia la maquinaria proteica de reclutamiento, incluida la helicasa CMG, para iniciar la replicacióndel ADN 1. La maquinaria respondesora en cada origen de replicación forma dos bifurcaciones que se muevenbidireccionalmente 2,3. Las bifurcaciones de replicación gemela replican las dos cadenas parentales de ADN mediante la síntesis continua de la cadena principal y la síntesis discontinua de la cadena rezagada. Dada esta naturaleza asimétrica de cada horquilla de replicación, los componentes de replicación, incluidas las ADN polimerasas en las cadenas delantera y rezagada, son diferentes. Análisis genéticos previos basados en ADN polimerasas mutantes demuestran que el ADN Pol ε y el ADN Pol δ son las principales polimerasas responsables de la replicación de la cadena que lidera y rezaga respectivamente, 4,5. Se han desarrollado varios métodos para detectar la preferencia de hebras de la ADN polimerasa, incluyendo Pu-seq 6,7, HydEn-seq8 y emRiboSeq o RiboSeq 9,10. Estos métodos genéticos para diseccionar la especificidad de la cadena se limitan a las ADN polimerasas y requieren introducir mutaciones en cada proteína 4,5,11,12. Rastrear la asociación de cualquier proteína objetivo con cadenas delanteras y rezagadas de las horquillas de replicación del ADN proporcionará información valiosa sobre la replicación del ADN. En este esfuerzo, primero desarrollamos la técnica eSPAN (enriquecimiento y secuenciación de ADN naciendo asociado a proteínas, Figura 1) en células de levadura. Como estudio de prueba de principio, primero demostramos que Pol δ y Pol δ están enriquecidos en hebras guía y rezagada, respectivamente. También descubrimos la preferencia de hebras de componentes clave de replicación del ADN, incluyendo la helicasa replicativa de ADN, la proteína de unión al ADN de cadena simple (proteína de replicación A), la lámpara de antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) y su factor de replicación cargador C (RFC)13. Es importante destacar que nosotros y otros hemos utilizado este método para descubrir los mecanismos de transferencia parental de histonas, un proceso que fue intratable durante más de 4 décadas14, 15, 16, 17.

El método eSPAN implica dos pasos secuenciales: enriquecimiento de la proteína objetivo por ChIP18 o CUT&Tag 19 y enriquecimiento del ADN naciente asociado a la proteína mediante inmunoprecipitación con BrdU. En una cepa estándar de levadura (W303 o S288C), el BrdU o EdU extracelular no puede entrar en las células ni incorporarse en los cromosomas. Estas cepas carecen de un transportador nucleódico adecuado para la captación de timidina ni de la timidina quinasa necesaria para fosforilar la timidina en TMP, que convierte BrdU (o EdU) en BrdUMP (EdUMP). La expresión del transportador nucleódico equilibrativo humano 1 (hENT1) y del virus del herpes simple timidina quinasa (HSV-TK) potencia la absorción de timidina y la conversión de BrdU (o EdU) en BrdUMP (EdUMP)20. Por lo tanto, para realizar el experimento eSPAN en levadura, las cepas tuvieron que insertarse con una estructura BrdU-Incorporadora (BrdU-Inc) (HSV-TK y hENT1)13,21.

Anteriormente, proporcionamos el protocolo eSPAN para proteínas de replicación de ADN en lalevadura 22. Recientemente, integramos el método CUT&Tag en el protocolo eSPAN en células de mamíferos para abordar pasos técnicamente complejos que requieren optimización, como la reticulación, el corte de cromatina, y para minimizar el número de célulasiniciales 17,23. Aquí, proporcionamos eSPAN de histonas para visualización utilizando células de levadura (Figura 2). Este método se utiliza principalmente para analizar la distribución de formas modificadas de histonas en cadenas de ADN replicantes. Aunque analizamos varias marcas de histonas, usamos H3K4me3, una marca en la histona parental H3, como ejemplo. Para analizar componentes y factores replicsomas implicados en la reparación del ADN en bifurcaciones de replicación, recomendamos cortar la cromatina en pequeños fragmentos mediante la sonicación, como se describe en nuestra primerapublicación 22. Para las células de mamíferos, adoptamos los procedimientos modificados Cut&Tag para reemplazar el paso ChIP descrito en lalevadura 23. Esta modificación reduce la cantidad de material de partida (células) y, lo más importante, permite la generación de bibliotecas eSPAN para la secuenciación sin el uso de kits de preparación de ADN monocatenario. Para el protocolo de levadura, optamos por no usar el método Cut&Tag porque la cantidad de material inicial era suficiente. Más importante aún, descubrimos que los procedimientos Cut&Tag no eran consistentemente efectivos para las células de levadura en nuestras manos.

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Protocolo

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NOTA: Para las directrices de preparación de tampones y reactivos, consulte las directrices de preparación de tampones y reactivos (Archivo Suplementario 1).

1. Histone eSPAN en levadura en gemación

NOTA: La mayoría de las cepas de levadura carecen de un transportador funcional de nucleósidos para la captación de timidina. Para marcar eficazmente el ADN con BrdU o EdU para eSPAN, se requiere una cepa21 positiva para timidina quinasa (TK+). Además, solo se pueden usar cepas de levadura tipo 'A' de apareamiento para la detención del ciclo celular usando el factor alfa.

  1. Sincronización de células de levadura y marcaje de BrdU (8 h)
    1. Inocular una sola colonia de cepa de levadura adecuada (TK+) en 10 mL de medio YPD y cultivar a 30 °C en una incubadora agitada durante la noche a 220 rpm.
    2. Mide la densidad óptica, OD600 nm, con un espectrofotómetro y diluye el cultivo en 200 mL frescos de medio YPD con OD600 ~0,2-0,3.
    3. Haz crecer el cultivo hasta OD600 ~0,4-0,5 (normalmente tarda 3-4 horas) a 30 °C en una incubadora agitada a 220 rpm.
    4. Añade 300 μL de factor α (5 mg/mL) y cultiva durante 1,5 horas a 25 °C, 220 rpm.
    5. Añade otra dosis de 300 μL de factor α (5 mg/mL) y cultiva durante otra 1,5 horas a 25 °C, 220 rpm.
    6. Preparar la solución de fijación de paraformaldehído al 37,5% y precalentar el medio (200 mL YPD + HU (hidroxiurea)+ BrdU) a 30°C durante la sincronización celular.
      PRECAUCIÓN: Maneja el BrdU con precaución, ya que es un posible mutágeno y teratogénico. Prepara una solución de paraformaldehído al 37,5% en una campana extractora química para evitar la exposición a vapores nocivos, ya que el paraformaldehído es un posible carcinógeno.
    7. Comprueba la morfología de las células (forma de barra) con un microscopio óptico para asegurarte de que al menos el 90% de las células de levadura están en la fase G1 15 minutos antes de la parada G1 a las 3 horas. Alternativamente, realizar un análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para confirmar la detención deG1 24.
      NOTA: Comprueba la morfología celular y confirma la detención de G1 (90% con forma de barra) en este paso.
    8. Recoge las células (pellet) por centrifugación a 1600 g durante 5 minutos a 4 °C y lava el pellet de celda dos veces con 20 mL de agua doble destilada bien fría.
    9. Resuspende las células en 200 mL de YPD +HU+ BrdU precalentados (30 °C).
      NOTA: El propósito de la liberación de HU es asegurar que la mayoría de las células de levadura estén en la fase S temprana de replicación, lo que mejorará la consistencia y garantizará la reproducibilidad de los resultados. Omitir la HU es aceptable si se requiere trabajar con células en fase logarítmica.
    10. Cultiva las células en una incubadora agitada a 30 °C, 220 rpm durante 45 minutos.
      NOTA: Se puede realizar un análisis FACS para confirmar la fase S temprana. Para el análisis FACS, es importante incluir una muestra log-phase como control para definir con precisión la población de células G1. Para una incorporación eficiente de BrdU, es ventajoso comenzar con células de rápido crecimiento. Algunos mutantes con defectos de crecimiento lento tienden a mostrar una mala eficiencia de marcaje BrdU. La eficiencia de la incorporación de BrdU y el rendimiento de BrdU-IP se evalúan mediante PCR cuantitativa comparando regiones replicadasy no replicadas 22 utilizando ADN aislado del paso 1.6.7.
  2. Fijación y recogida de muestras (1 h)
    1. Añade 6 mL de paraformaldehído al 37% recién preparados hasta una concentración final del 1%, mezcla bien y incuba a 25 °C durante 20 minutos con agitación suave, a 90 rpm.
    2. Apaga la fijación añadiendo 12 mL de glicina 2,5 M, mezcla bien y incuba a 25 °C durante 5 minutos con suaves agitaciones a 90 rpm.
    3. Pelleta las células a 1600 g durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT). Luego, lava las células dos veces con 20 mL de agua fría centrifugando a 1600 g durante 5 minutos.
    4. Recoge las pilas en tubos de 2 mL con tapa roscada (50 mL de celdas/tubo) y guárdalas a -80 °C.
      NOTA: Las celdas pueden almacenarse hasta un año (punto de pausa).
  3. Lisis celular de levadura y fragmentación de la cromatina (5 h)
    1. Descongela los pellets celulares, resuspende mediante un suave vórtice y lava con 0,4 mL de tampón de lisis ChIP con inhibidores de proteasa y mezcla de antibióticos (previniendo el crecimiento de bacterias contaminantes) y centrifuga a 5 000 g durante 1 minuto.
    2. Añade 0,1 mL de tampón de lisis ChIP que contiene inhibidores de proteasas y una mezcla de antibióticos, seguido de aproximadamente 100 μL de perlas de vidrio (0,5 mm).
    3. Lisa por perlas batiendo durante 3 ciclos (30 s encendido/apagado, 1 minuto apagado) en una habitación fría a 4 °C.
    4. Haz agujeros en el fondo del tubo con una aguja caliente de 16 G.
      NOTA: Para mantener la aguja caliente, intenta mantener el tubo cerca de disparar.
    5. Recoge el lisato anidando el tubo en un tubo vacío de baja unión de ADN de 1,5 mL y centrifuga a 1600 g durante 2 minutos, RT.
    6. Aspira el sobrenadante con cuidado sin alterar el pellet (la cromatina estará en la fracción de restos celulares).
      PRECAUCIÓN: Ten cuidado de no aspirar accidentalmente el pellet celular al usar la aspiradora.
    7. Resuspende los pellets celulares pipeteando 0,35 mL de MNasa Digestion Buffer suplementado con 0,5 mM de espermidina y 0,1 mM de 2-mercaptoetanol.
    8. Añade 10 unidades de MNase a las reacciones, mézclalas suavemente invirtiendo 4-6 veces inmediatamente e incuba a 37 °C en baño maria durante 20 minutos.
      NOTA: Las condiciones digestivas deben optimizarse para cada lote de enzima MNasa para enriquecer fracciones mononucleosomas, di- o trinucleosomas.
    9. Templa la digestión de la MNasa añadiendo 5 μL de 0,5 M EDTA para una concentración final de 10 mM de EDTA. Mézclalos suavemente por inversión y deja los tubos inmediatamente en hielo durante al menos 30 minutos.
      NOTA: Las muestras pueden almacenarse a 4 °C durante la noche en este paso. Las condiciones de digestión de la MNasa deben optimizarse para obtener la mayoría de fracciones mononucleosomas (140-450 pb)
    10. Sonica la mezcla de reacción con microtubos bioruptores (1,5 mL) durante 3 minutos (alta potencia, 30 s encendido/apagado). Centrifuga a 10.000 g durante 5 minutos a 4 °C.
      NOTA: Esta breve sonicación ayuda a liberar la cromatina en el buffer.
    11. Transfiere el sobrenadante a tubos nuevos y centrifuga otros 10 minutos a 10.000 g a 4 °C.
    12. Recoger el sobrenadante (unos 400 μL), guardar 30 μL de la muestra como ADN de entrada y congelar a -20 °C. Utilizar el lisato celular restante (~370 μL) en la siguiente inmunoprecipitación de cromatina (paso 1.4.1).
  4. Inmunoprecipitación de cromatina histonal (durante la noche)
    1. Añade 0,5 μg de anticuerpo H3K4me3 al lisato y nuta en el rotor, 10 rpm a 4 °C durante la noche.
      NOTA: Aquí se usa H3K4me3 como ejemplo. La cantidad de anticuerpos debe ser analizada experimentalmente.
    2. Centrifuga a 15.800 × g durante 10 minutos a 4 °C y transfiere el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mL.
    3. Añadir 20 μL de perlas de proteína G Sepharose prelavadas (3 veces lavadas con buffer de lisis ChIP), nutar en el rotor durante 3 minutos cada una, recoger las perlas por centrifugación a 350 × g, 4 °C) e incubar a 4 °C durante 2 horas.
    4. Centrifuga a 350 × g en RT y lava las cuentas según el siguiente orden.
      1. Lava dos veces con 1 mL de tampón de lisis helado durante 3 minutos cada vez por rotación a 10 rpm en un rotador en RT.
      2. Lava una vez con 1 mL de tampón de lisis helado con 0,5 M de tampón NaCl durante 3 minutos por rotación a 10 rpm en un rotador en RT.
      3. Lava una vez con 1 mL de buffer de lavado Tris/LiCl bien frío durante 3 minutos por rotación a 10 rpm en un rotador en RT.
      4. Lava uno con 1 mL de buffer de lavado RT Tris/EDTA (no buffer TE, Archivo Suplementario 1 para la receta). Saca todo el líquido posible del pellet con una aguja de 16 g y media.
  5. Extracción de ADN (2 h)
    1. Añadir 0,1 mL de resina quelante al 10% bien mezclada para extracción de ADN a las perlas lavadas (del paso 1.4.4.4.), la muestra de entrada (del paso 1.3.12) y el vórtice.
    2. Hervírlo durante 10 minutos en un bloque térmico de 100 °C, luego enfría hasta RT para hacer reticulación inversa.
      NOTA: Se recomiendan encarecidamente los clips de bloqueo stop-pop para tubos de centrifugadora para mantener el sello de cierre.
    3. Añade 5 μL de 20 mg/mL de proteasa K a las perlas e incuba a 55 °C durante 30 minutos mientras agitas a 400 rpm.
    4. Hervir las perlas en un bloque térmico a 100 °C durante otros 10 minutos para inactivar la actividad de la proteasa K.
      NOTA: Se recomiendan encarecidamente los clips de bloqueo stop-pop para tubos de centrifugadora para mantener el sello de cierre.
    5. Centrifuga las cuentas a 6000 g durante 2 minutos en RT y guarda el sobrenadante.
    6. Añade 100 μL de 2XTE al pellet. Vórtice y centrifuga a 6000 g durante 2 minutos en RT.
    7. Mezcla y guarda los supernadantes (de los pasos 1.5.5 y 1.5.6) tomados arriba (unos 180 μL).
    8. Purificar muestras de 30 μL en 18 μL de buffer de elución (EB, suministrado con kit de purificación PCR) utilizando columnas de purificación de ADN para la preparación de la biblioteca de ADN ssDNA (desde el paso 1.3.12 como entrada y el paso 1.5.7 como muestras H3K4me3 ChIP-seq).
      NOTA: Las muestras de ADN pueden almacenarse a -20 °C durante hasta un mes (punto de pausa).
  6. Inmunoprecipitación BrdU (5 h)
    1. Hervir muestras (unos 150 μL de entrada y H3K4me3 ChIP del paso 1.5.7) durante 5 minutos en un bloque de calor a 100 °C, y enfriarlos inmediatamente en hielo durante 5 minutos. Añadir 15 μL de 10x PBS y +1,35 mL de búfer IP de BrdU + 0,5 μL de anti-BrdU Ab + 1 μL de ARNt de E.coli (10 mg/mL).
      NOTA: Este es un paso crítico. Utiliza los tubos de centrifugación de baja unión al ADN para evitar la unión inespecífica al ADN.
    2. Nutate durante 2 h en un rotor a 4 °C a 10 rpm.
    3. Transfiere la mezcla a un tubo de 1,5 mL que contenga 20 μL de perlas de proteína G Sepharose (lavadas tres veces con 1 mL de buffer IP BrdU y girar durante 3 minutos cada una a 10 rpm para cada lavado en RT) y nutar durante 1 h a 4 °C sobre el rotor a 10 rpm.
    4. Centrifuga a 800 × g durante 1 minuto en RT y lava según lo siguiente: tres veces con 1 mL de buffer IP frío BrdU, 3 min en un rotor y una vez con 1 mL de buffer TE durante 3 minutos.
    5. Centrifuga a 800 × g durante 1 minuto en RT y aspira el sobrenadante.
    6. Añade 100 × μL de TE + 1% de SDS buffer en las perlas restantes. Incuba a 65 °C durante 5 minutos. Centrifuga a 800 × g durante 1 minuto en RT.
    7. Purifica el sobrenadante en 18 μL de EB utilizando columnas de purificación de ADN (BrdU IP y muestra de H3K4me3 eSPAN).
      NOTA: Utiliza tubos de centrifugación de baja unión para evitar la unión inespecífica al ADN. Las muestras de ADN pueden almacenarse a -20 °C durante hasta un mes (punto de pausa).
  7. Preparación y secuenciación de bibliotecas de ssDNA (3 h)
    1. Preparar las bibliotecas de ADN monocatenario con 15 μL de entrada purificada, BrdU IP, H3K4me3 ChIP y muestras de eSPAN (pasos 1.5.8 y 1.6.7) (incluyendo adaptasa, extensión y ligación) según los manuales proporcionados por ssDNA y el kit de preparación de bibliotecas de ADN de baja entrada, y purificar el producto de ligación obtenido en 20 μL de tampón de elución de bajo EDTA (proporcionado por DNA Library Prep Kit).
      NOTA: Hay dos pasos de purificación por ligadura con el kit. Este protocolo sigue el procedimiento de 200 pb, <1 ng.
    2. Amplificar la biblioteca de ADN usando una mezcla total de 50 μL de reacción (reactivos proporcionados por el kit de preparación de la biblioteca ssDNA): 20 μL de biblioteca de ADN purificado, 4 μL de reactivo W2, 10 μL de reactivo W3, 1 μL de enzima W4, 1,5 μL de cebadores Indexes I7 (10 μM, véase Secuencia Suplementaria de Oligo) y 1,5 μL de cebador Indexes I5 (10 μM, véase Secuencia Suplementaria de Oligo), 16 μL de ddH2O libre de DNasa. Calienta la mezcla PCR a 98 °C durante 30 s, seguido de 18 ciclos de 10 s a 98 °C, 30 s a 60 °C, 1 min a 68 °C y un ciclo de 10 min a 68 °C.
      NOTA: Cada biblioteca debe utilizar una combinación única de imprimadores i7 e i5. El número de ciclos de amplificación debe ajustarse en función de la cantidad de la biblioteca para evitar la sobreamplificación, que puede provocar artefactos de PCR. Dada la cantidad típicamente baja de ADN en las muestras de eSPAN, se utilizan hasta 18 ciclos.
    3. Purificar los productos de PCR mezclando 60 μL (1,0x volumen) de perlas (precalentadas a 30 °C) (véase la Tabla de Materiales).
    4. Mezcla bien los productos de PCR y las cuentas.
      1. Déjalo en RT durante 5 minutos. Une las cuentas en el soporte magnético durante 3 minutos y lava las cuentas dos veces con (cada vez 200 μL) etanol recién preparado al 80%.
      2. Seca las perlas al aire durante 2 minutos y eluílas en un tampón de 20 μL de baja EDTA (proporcionado en el Kit de Preparación de la Biblioteca de ADN).
    5. Mide la concentración de la biblioteca y la distribución del tamaño de los fragmentos utilizando sistemas de electroforesis de alta resolución (véase la Tabla de Materiales).
    6. Agrupar una cantidad igual de bibliotecas individuales, incluyendo la entrada, H3K4me3 ChIP, BrdU IP y eSPAN, y realizar secuenciación paralela de extremos emparejados con la plataforma de secuenciación Illumina. Para el proceso de análisis de datos, consulte la sección 3.
      NOTA: Los criterios de evaluación para los resultados del control de calidad son: (i) No se detectan picos de adaptador/cebador de dímero (por debajo de 180 pb). (ii) Todas las bibliotecas que se agruparán tienen una distribución de tamaño similar y estrecha (~300 de ancho de base). El secado excesivo de las cuentas puede resultar en un bajo rendimiento; Utiliza una estación de trabajo de ADN para evitar contaminaciones. Las bibliotecas pueden almacenarse indefinidamente a -20°C (punto de pausa).

2. Histone eSPAN con celda ES del ratón

NOTA: El eSPAN de histona con célula ES de ratón es esencialmente idéntico a un protocolo23 previamente publicado.

  1. Marcado y recogida de muestras de BrdU para células ES de ratón (3 h)
    1. Cultivar células ES de ratón en un medio de cultivo celular ES a 37 °C con una atmósfera humidificada de 5% de CO2 para alcanzar una confluencia entre el 70% y el 80%. En general, se requerían alrededor de 1 millón de células para la eSPAN de histonas. Haz las células semilla un día antes de los experimentos para asegurarte de que las células crecen en una etapa exponencial.
    2. Cambiar el medio e incubar las células con BrdU a una concentración final de 50 μM durante 30 minutos a 37 °C con una atmósfera humidificada del 5% de CO2 .
      NOTA: La eficiencia del marcado de BrdU puede monitorizarse mediante análisis cuantitativo por PCR. Alternativamente, se puede utilizar el análisis de inmunofluorescencia o FACS para monitorizar la eficiencia de incorporación de BrdU. Las celdas sin etiquetar pueden usarse como control negativo. Estas son las condiciones estándar de etiquetado para las células ES de ratón. Se recomienda ajustar las condiciones de marcado en consecuencia para células con tasas de proliferación y duración de fase S variables.
    3. Enjuaga las células dos veces suavemente con PBS bien frío.
    4. Tripsiniza y recoge las células en pellets a 200 × g durante 5 minutos.
    5. Haz una pipete suave de las células hasta el medio para resuspenderlas y luego cuentalas. Centrifuga el número necesario de celdas a 500 × g durante 5 minutos en RT.
    6. Resuspende el pellet de celda en 4 mL de tampón de lavado pipeteando y desecha el sobrenadante. Centrifugar a 500 × g durante 5 minutos en RT.
    7. Vuelve a suspender los pellets con 4 mL de buffer de lavado y centrifuga a 500 × g durante 5 minutos en RT.
    8. Descarta el sobrenadante y vuelve a suspender las celdas en el buffer de lavado.
    9. Coloca las perlas magnéticas recubiertas con ConA (usa 10 μL de perlas para 250000 celdas; escala al usar más celdas) y vuelve a suspender en 1 mL de tampón de unión. Tras múltiples inversiones, coloca los tubos en el soporte magnético para permitir que las cuentas se asienten.
    10. Usando una pipeta o un aspirador de baja velocidad, descarta los sobrenadantes. Repite los pasos de lavado dos veces y vuelve a suspender las cuentas en el buffer de fijación.
    11. Añade cuentas magnéticas prelavadas recubiertas con ConA a las muestras. Mezcla bien y rota en RT durante 10-20 minutos.
    12. Coloca los tubos en un soporte magnético para descartar todos los sobrenacionantes.
  2. Etiquetado19 para células ES de ratón (2 días)
    1. Resuspende las perlas (perlas magnéticas recubiertas de ConA unidas con células del paso 2.1.10) en 200 μL de buffer de anticuerpos helados. Añadir IgG como control negativo o las concentraciones adecuadas de anticuerpos primarios contra las proteínas de interés.
    2. Mezcla bien y haz nutación a 4 °C durante la noche.
    3. Mezcla 2 μg del anticuerpo secundario y una cantidad adecuada de pA-Tn5 en una proporción molar de 1:2. Reduce el volumen total a 8 μL/muestra con glicerol al 50% (v/v). Pipeteo varias veces para mezclar bien y incubar en RT durante 1 hora.
    4. Coloca las muestras de CUT&Tag en un soporte magnético durante 30 segundos y descarta todos los sobrenadantes. Añade 1 mL de buffer Dig-wash al pellet de cuentas y invierte varias veces.
      NOTA: De este paso a los siguientes pasos de lavado (pasos 2.2.5-2.2.6), se recomienda incubar las perlas en los buffers durante 3-5 minutos después del paso de inversión para evitar ataduras inespecíficas.
    5. Coloca los tubos sobre un soporte magnético y elimina todos los sobrenacionantes. Añadir 200 μL de tampón Dig-300 para resuspender las perlas y añadir los 8 μL de la mezcla de anticuerpos secundarios y pA-Tn5 a cada muestra. Después de mezclar bien con pipeteo varias veces, incuba en RT durante 1 hora.
    6. Coloca los tubos sobre un soporte magnético y elimina todos los sobrenacionantes. Añade 1 mL de buffer Dig-300 para volver a suspender las perlas e invierte varias veces.
    7. Coloca los tubos sobre un soporte magnético y elimina todos los sobrenacionantes. Repite el paso de lavado 3 veces más.
    8. Elimina completamente los sobrenadantes y añade 250 μL de tampón de etiquetado para volver a suspender las perlas e incubar a 37 °C durante 1 hora.
      NOTA: Se recomienda agitar suavemente en el paso de reacción en un termomezclador porque las perlas pueden sedimentarse en el fondo de los tubos.
    9. Coloca los tubos sobre un soporte magnético y elimina todos los sobrenacionantes. Usa 1 mL de buffer de lavado TAPS para volver a suspender las esferas y invierte varias veces.
    10. Coloca los tubos sobre un soporte para imán y descarta todos los sobrenacionantes.
    11. Añade 250 μL de tampón Dig-300 que contiene 15 mM de EDTA, 0,1% (p/v) SDS y 0,1 mg/mL de proteinasa K en las perlas restantes. Vórtice para mezclar bien y incubar a 37 °C durante la noche con suaves agitaciones.
  3. Purificación genómica del ADN y etiquetado in vitro en células ES de ratón (durante la noche)
    NOTA: Se extrae ADN genómico de las mismas células para eSPAN y se prepara para la etiquetación in vitro , que se utiliza para BrdU-IP-ssSeq. La etiquetación genómica de ADN y su siguiente, BrdU-IP-ssSeq, son para fines de normalización de eSPAN.
    1. Resuspender las células en 300 μL de tampón de lisis genómica de ADN y vórtice a máxima velocidad hasta que no se vean pellets.
    2. Para cada muestra, añade RNasa A a 100 μg/mL. Una vez combinados, incubar a 37 °C durante 10 minutos.
    3. Añadir 100 μL de solución de precipitación de proteínas a cada muestra. Mezcla bien por vortexing y centrifuga a 15.000 g en RT durante 3 minutos.
    4. Salva el sobrenadante transfiriéndolo a nuevos tubos de 1,5 mL. Añade 1x volumen de isopropanol a las muestras y mezcla bien.
    5. Gira a máxima velocidad en RT durante 3 minutos para pelletar el ADN genómico. Vierte cuidadosamente los sobrenacionantes.
    6. Añade 1 mL de etanol recién preparado al 70% (v/v) a cada muestra e invierte varias veces. Centrifuga a velocidad máxima en RT durante 3 minutos.
    7. Centrifuga a 15.000 g durante 1 minuto en RT y retira el etanol restante usando una pipeta P20. Deja secar al aire durante 5-10 minutos.
    8. Añade 50 μL deddH 2Oy se activa brevemente el vórtice para resuspender el ADN genómico. Disuelve a 65 °C durante 30 minutos.
    9. Centrifugar brevemente y transferir los sobrenacionantes a nuevos tubos de 1,5 mL. Cuantifica la concentración de ADN mediante espectrofotómetro.
    10. Establece la reacción de etiquetado in vitro según la Tabla 1.
    11. Mezcla bien y incuba durante 30 minutos a 37 °C con un suave agitado.
    12. Añade 10 mM de EDTA, 0,1% (p/v) de SDS y 0,1 mg/mL de Proteinasa K a cada muestra. Mezcla bien con vórtices e incuba durante la noche a 37 °C con agitación.
  4. Extracción de ADN y reemplazo de oligoterapia (3 h)
    NOTA: Tanto fenol-cloroformo-isoamílico (PCI) como la purificación en columna pueden aplicarse para la extracción de ADN. Aquí se proporcionan procedimientos detallados mediante purificación por columnas.
    1. Añade 1,25 mL (5x volumen) de buffer de unión (suministrado con el kit de purificación PCR) a las muestras (pasos 2.2.11. y 2.3.12.) y mezcla bien invirtiendo varias veces.
    2. Carga la mezcla en columnas de purificación de ADN (en tubos de recogida de 2 mL) y centrifuga durante 30 s a 10.000 × g en RT. Descarta el flujo directo.
    3. Añadir un buffer de elución de 600 μL (incluido en el kit) a las columnas y centrifugar durante 1 minuto a 10.000 × g en RT. Descartar el flujo directo.
    4. Centrifuga a máxima velocidad durante 2 minutos para eliminar completamente el buffer restante. Coloca las columnas en tubos nuevos de 1,5 mL con tapas abiertas y seca al aire durante 1 minuto.
    5. Añade 32 μL de ddH2O libre de DNasa (o 10 mM Tris·HCl, pH = 8,0) en el centro de la membrana y déjala reposar durante 1 minuto. Centrifugar a máxima velocidad durante 2 minutos y el ADN CUT&Tag ya está en solución.
    6. Añadir 32 μL de muestra de ADN CUT&Tag a un nuevo tubo PCR y luego añadir 2 μL de mezcla dNTP (2,5 mM cada uno), 4 μL de buffer 10x Ampligase y 2 μL de rep-B (10 μM). Golpea suavemente y mezcla pipeteando.
    7. Apaga brevemente el ciclo y ejecuta el siguiente programa para el reemplazo deoligo 23.
      50 °C, 1 min
      45 °C, 10 min
      Rampa a 37 °C, 0,1 °C/s
      37 °C, en espera
    8. En el termociclador, añadir 1 μL de ADN polimerasa T4 y 1 μL de Ampligasa a cada tubo (volumen final, 40 μL/muestra). Mezcla pipeteando suavemente.
    9. Continúa la reacción a 37 °C en el termociclador durante 30-60 minutos.
      NOTA: El ADN puede almacenarse a -20 °C si no se procede a IP BrdU justo después de este paso (punto de pausa seguro).
  5. Inmunoprecipitación BrdU (esencialmente igual que el protocolo de levadura) (2 h)
    1. Transfiere las muestras a tubos de baja unión de ADN de 1,5 mL. Hervir muestras 5 minutos en un bloque térmico a 100 °C y enfriar inmediatamente en hielo durante 5 minutos. Añadir 15 μL de 10x PBS y +1,35 mL de búfer IP de BrdU + 0,5 μL de anti-BrdU Ab + 1 μL de ARNt de E.coli (10 mg/mL).
    2. Nutato durante 2 h en un rotor a 4 °C.
    3. Transfiere la mezcla a un tubo que contenga 20 μL de perlas de proteína G Sepharose (lavadas tres veces con 1 mL de tampón IP de BrdU, cada una durante 3 minutos).
    4. Incuba a 4 °C durante 1 hora.
    5. Centrifuga a 800 × g durante 1 minuto y lava según lo siguiente: tres veces con 1 mL de buffer IP frío de BrdU, 3 minutos en un rotor; una vez con 1 mL de buffer de TE durante 3 minutos.
    6. Centrifuga a 800 × g durante 1 minuto y aspira el sobrenadante.
    7. Añade 100 μL de TE + 1% de SDS buffer a las perlas restantes. Incubar a 65 °C durante 15 minutos. Centrifuga a 800 × g durante 1 minuto.
    8. Purificar el sobrenadante en 18 μL de tampón de elución (suministrado con el kit) utilizando columnas de purificación de ADN (BrdU IP y muestra eSPAN H3K4me3).
  6. Amplificación y secuenciación por PCR (1,5 h)
    1. Amplificar y etiquetar muestras de biblioteca de ADN monocatenario usando diferentes combinaciones de índices. Prepara la reacción PCR añadiendo los siguientes componentes (ADN purificado [ChIP o ESPAN], cebador I5-indexador [1 μL], cebador I7-indexador [1 μL], NEBNext Mezcla Masterra PCR 2X de alta fidelidad (2x) [10 μL], ddH2O hasta 20 μL), mezclando las muestras pipeteando y centrifugando brevemente.
    2. Calienta la mezcla de PCR a 98 °C durante 30 s, seguida de 12-14 ciclos de 10 s a 98 °C y 20 s a 63 °C, y un ciclo de 2 minutos a 72 °C.
    3. Purificar los productos de PCR con 18 μL de perlas paramagnéticas (0,8x volumen) en 20 μL de tampón de bajo EDTA.
    4. Mide la concentración de la biblioteca y la distribución del tamaño de los fragmentos utilizando sistemas de electroforesis de alta resolución.
    5. Agrupar una cantidad igual de bibliotecas individuales, incluyendo la entrada, H3K4me3 ChIP, BrdU IP y eSPAN, y realizar secuenciación paralela de extremos emparejados con la plataforma de secuenciación Illumina.

3. Análisis de datos eSPAN para células de levadura (1 día)

NOTA: Este proceso de análisis de datos se aplica únicamente a los datos de levadura; el análisis de datos eSPAN para células ES puede seguirse, como se describe en una publicaciónreciente 23.

  1. Extrae archivos de secuencia en bruto, recorte secuencias de adaptadores con las herramientas Trim Galore y elimina lecturas menores a 10 bp para reducir el tamaño del archivo de salida y evitar fallos de los programas de alineación. Asegúrate de que los archivos estén en el formato file1_1.fq, file1_2.fq para lecturas emparejadas:
    /TrimGalore-0.6.10/trim_galore file.fq-o trim --longitud 10 - emparejado
  2. Genera archivos índice de pajarita para el genoma de referencia:
    bowtie2-build genome.fa
  3. Mapea las lecturas al genoma de referencia correspondiente (genoma de Saccharomyces (sacCer3) para levadura) usando Bowtie 2:
    Bowtie2 -x genoma -1 trim_1.fq -2 trim_2.fq --local --sin cola de milano ---sin discordancia --maxins 1000 -D 20 -R 3 -N 1 -L 20 -i S,1,0.50
  4. Elimina las lecturas multimap con herramientas SAMs y las lecturas duplicadas con las herramientas Sambamba:
    Vista de Samtools -BHS - Q 40 Input.BAM -O Output.BAM
    sambamba-1.0.1.1-linux-amd64-markdup estático output.bam filtered.bam -r
  5. Usa deeptools para generar los archivos de cobertura de lectura más importantes en las hebras Watson y Crick por separado para cada muestra a partir de archivos BAM limpios:
    bamCobertura -b filtrado.bam -o watson.bw --filtroRNAstrand inverso -bs 1 - extenderReads
    bamCobertura -b filtro.bam -o crick.bw --filtroRNAstrand forward -bs 1 - extendReads
  6. Calcular el sesgo medio en cada posición delnucleosoma 25 para cada muestra basándose en la fórmula: log2 las lecturas directas (cadena Watson)/inversa (cadena Crick) tras la posición de referencia del nucleosoma sesepararon 25. Los scripts R para estos cálculos están disponibles en https://github.com/clouds-drift/eSPAN-bias. Para un cálculo estándar, utiliza los siguientes comandos.
    NOTA: Este paso solo se aplica a los datos de levadura; el cálculo del sesgo para las células ES puede seguirse, como se describe en una publicaciónreciente 23.
    Rscript cal_bias. R -w watson.bw -c crick.bw -r replication_origins.bed
  7. Si es necesario, ajusta el sesgo de hebra según el sesgo BrdU:
    Script normalize_bias. R -i matrix_files -c classes_list -C condition_list --objetivo target_list --control control_list
    NOTA: "matrix_files" es una lista de archivos generados por el cal_bias. Escritura R separada por comas. por ejemplo, 'archivo1', 'archivo2', 'archivo3'. "classes_list" es una lista de clases de muestra correspondientes a cada archivo separadas por comas (por ejemplo, 'brdu', 'H3K4me3_eSPAN', 'H3K56ac_eSPAN'). "condition_list" es una lista de condiciones de muestra correspondientes a cada archivo y separadas por comas. Cada archivo se emparejará por clase y condición para el ajuste de sesgo. "target_list" es una lista de clases tomadas del classes_list. Definirá las clases que actuarán como datos a ajustar por los controles (por ejemplo, 'H3K4me3_eSPAN','H3K56ac_eSPAN'). "control_list" es una lista de clases extraídas de la lista de clases. Definirá las clases que actuarán como los datos a ajustar por los controles. Asegúrate de que la longitud de la lista sea la misma que la target_list (por ejemplo, 'brdu')
  8. Tras el cálculo y el ajuste, agrupa muestras y crea visualizaciones de los datos.
    Rscript draw_bias. R -s' bias_matrix/file1.txt, bias_matrix/file2.txt' -o 'bias.pdf' -g grupo 1,grupo 2 --intervalo=T
    -s requiere una lista de archivos de sesgo generados por los scripts anteriores
    -o es el archivo de salida
    -g define los grupos experimentales para calcular, es decir, réplicas biológicas para representar el sesgo medio.
    --intervalo T o F, para mostrar errores estándar en los gráficos dentro de los grupos experimentales.
    NOTA: La información sobre el origen de la replicación se definió por los datos IP de BrdU. La información sobre la posición de un solo nucleosoma se obtuvo de un artículo previamentepublicado 25. Para el análisis de datos de células ES de ratón, la información de origen se obtuvo del conjunto de datosOK-seq 26, y el cálculo del sesgo medio debe seguir el protocolo descrito en el trabajoanterior 23.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

eSPAN puede utilizarse para adquirir información específica de la cadena sobre una proteína objetivo, como histonas y modificaciones de histonas. En este resultado representativo, se realizaron procesos de recogida de muestras y eSPAN siguiendo el esquema descrito en la Figura 2 utilizando el sistema de levadura de gemación. El tratamiento y la extracción de la muestra siguen la condición de fase S temprana tratada por hidroxiurea según este protocolo. Se emplearon dos cepas de levadura, WT ...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La detección de proteínas asociadas a cadenas de replicación avanzadas y rezagadas es importante para comprender los mecanismos de replicación de la cromatina y el proceso asociado, que son directamente relevantes para la investigación del cáncer humano y los mecanismos de resistencia a los fármacos. Se han empleado varios métodos, como el gel 2D, la inmunoprecipitación nativa de Cromatina (nChIP), iPOND y la captura incipientede cromatina 29,30,31, para estudiar la replicación del ADN y procesos ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo contó con el apoyo de subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud R35GM118015 (Z.Z.), R01GM130588 (C.Y.) y el Hormel Startup Fund (C.Y.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific15575020
1,5 mL de tubos de baja unión de ADN  Eppendorf22431021
Buffer de amplificagase 10xLucigenA1905B
10x PBS y nbsp;Corning21-040-CV
10 TBSBioRad1706435
16 G x 1-1/2 in. BD PrecisionGlid NeedleBD Biociencias305198
KIT DE BIBLIOTECA ACCEL-NGS 1S MÁS ADNTecnologías integradas de ADN10009817kit de preparación de la biblioteca de ADN ssDNA y de baja entrada  
Bioanalizador Agilent 2100  AgilentBioanálisis 2100
Kit Agilent DNA 1000  Agilent5607-1504
Ampligase LucigenA0110KManipula el paraformaldehído con cuidado, es sólido inflamable y peligroso.
AMPure XPBeckmanA63881
Reactivo SPRI XP AMPureBeckman CoulterA63882
Anticuerpos anti-BrdU y nbsp;BD Biociencias555627
Anticuerpo anti-H3K4me3  ABCAMab8580
Contador de celdas automatizado , modelo TC10BioRad145-0001
Bacitracina Sigma11702
Bacto peptona Thermo Fisher Scientific211830
Clorhidrato de Benzamidina  SigmaB2417Sólidos combustibles
BrdU SigmaB5002Trata el BrdU con cuidado, ya que es un posible mutágeno y teratógeno.
BSANew England BiolabsB9000S
CaCl2SigmaC4901
Incubadora de cultivos celulares  Thermo Fisher Scientific y nbsp; Incubadora de CO2 con camisa de agua modelo Forma serie II3140
Medio de cultivo celular y nbsp;
Línea celular ES-E14 
Chelex-100 BioRad1422842200– Tamaño de malla seca 400
Cloroformo Sigma366919
Cuentas magnéticas recubiertas de concanavalina A (ConA) y perlas magnéticas recubiertas de Concanavilina A y perlas magnéticasPoliciencias86057-10
DigitoninaMillipore300410-5MG
DMSOSigmaD8418
E. coli  tRNA Sigma10109541001
etanol y la informaciónThermo Fisher ScientificBP2818100Manipula el etanol con cuidado, es inflamable
GlucosaSigmaG7021
Glicerol y nbsp;SigmaG5516
HCl SigmaH1758
HEPES SigmaH3375
Isopropanol Thermo Fisher ScientificBP26324Manipula el isopropoñol con cuidado, es inflamable
KAPA HiFi HotStart Ready MixRoche7958889001
KClSigmaP9541
KOHsigma221473Manipula el KOH con cuidado, es corrosivo
Vacío a baja velocidad
Soporte magnético y soporte magneto;MilliporeLSKMAGS08
Ciclador térmico de PCR de gradiente MastercyclerEppendorf5331
MgCl2SigmaM8266
Nucleasa microcócica   (MNase)WorthingtonLS004798
Kit de purificación PCR MinElute  Qiagen28006
Batedor de cuentas pequeñasMini BeadBeater 24 Disruptor607
Mini-centrífugas y nbsp;Eppendorf5424R
MnCl2Sigma244589
Vibrador multiplataformaFisherbrand02-217-765
Incubadora de agitadores multiplataformaÍndice de referenciaINCU-SHAKER 10L
Bloque térmico multitérmico y nbsp;EppendorfTermomezclador C
N-[Tris(hidroximetil)metilo]-3-aminopropanesulfónico ácido   (GOLPES)SigmaT5130200– Tamaño de malla seca 400
NaCl SigmaS9888
NaOH SigmaS8045Manipula el NaOH con cuidado, es corrosivo
NEBNext HiFi 2 veces; Mezcla maestra PCRNew England BiolabsM0541
NP-40 Igepal CA-630Termo CientíficaJ61055. AP
Paraformaldhídosigma158127Manipula el paraformaldehído con cuidado, es sólido inflamable y peligroso.
enzima pA-Tn5  Addgene121137
PefablocSigma11429868001
Fenol-cloroformo-isoamílico alcohol  Invitrogen15593049
Pipeta P1000, P200, P20 y P2Eppendorf2231300004
PMSFSigma10837091001
Comprimido cóctel inhibidor de proteasaSigmaS8830
Comprimido cóctel inhibidor de proteasa  SigmaS8830
Proteína G-perlas de sefarosa GE Healthcare17-0618-02
Solución de precipitación de proteínasQiagen848023
Solución de precipitación de proteínasQiagen848023Manipula el KOH con cuidado, es corrosivo
Solución de precipitación de proteínas  Qiagen848023
Proteinasa K Sigma311584401
QIAquick PCR kit de purificación Qiagen28106
RNasa ASigma10109169001
SDS SigmaL3771
Espectrofotómetro Thermo Scientific.2000/2000c
Espermidina SigmaS2626
T4 DNA PolNew England Biolabs,  M0203
Centrífuga de sobremesa Beckman CoulterAllegra X-5
Tris Sigma11814273001
Triton X-100 SigmaT8787
extracto de levadura y nbsp;Thermo Fisher Scientific212730

Referencias

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