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Artículo de método

Un proyecto exhaustivo para evaluar la eficacia de la eritropoyesis humana in vitro y ex vivo

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DOI:

10.3791/67123

⸱

10 de enero de 2025

 ,  , 
1Centre de Lutte contre le cancer Eugène Marquis, INSERM U1242, University of Rennes, 2Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London

En este artículo

Resumen

El modelado de la eritropoyesis proporciona una valiosa oportunidad para comprender la importancia biológica de los actores en este proceso y para evaluar nuevos enfoques terapéuticos que puedan aliviar los defectos de diferenciación. Aquí, describimos un método simple y confiable para diferenciar de manera eficiente las células madre y progenitoras hematopoyéticas CD34+ ex vivo.

Resumen

La eritropoyesis, un proceso notablemente dinámico y eficiente responsable de generar la cuota diaria de glóbulos rojos (aproximadamente 280 ± 20 mil millones de células por día), es crucial para mantener la salud individual. Cualquier interrupción en esta vía puede tener consecuencias significativas, lo que provoca problemas de salud. Según la Organización Mundial de la Salud, se estima que el 25% de la población mundial presenta síntomas de anemia. Este protocolo describe cómo generar células eritroides humanas tanto in vitro utilizando células madre hematopoyéticas como progenitoras (HSPCs) a partir de fuentes como la sangre del cordón umbilical (UCB) o sangre extraída de donantes sanos y ex vivo con HSPCs aisladas de la médula ósea de los pacientes. Utilizando el enfoque genético, los genes de interés se pueden modular en HSPC, y su impacto en la eritropoyesis se puede monitorear en varias etapas del proceso de diferenciación. Este método permite el cribado de compuestos que perturban, mejoran o rescatan la capacidad de las HSPC para diferenciarse en células eritroides maduras e investigar el papel de los genes de interés durante el proceso de diferenciación eritroide.

Introducción

Cada día se producen alrededor de 280 mil millones de glóbulos rojos (RBC) en la médula ósea para garantizar el transporte de oxígeno a todo el cuerpo. La eritropoyesis es un proceso de diferenciación finamente ajustado que produce glóbulos rojos maduros y funcionales a partir de células madre hematopoyéticas. Muchas enfermedades, tanto adquiridas como congénitas, pueden afectar este proceso, como el síndrome mielodisplásico, la anemia aplásica, la talasemia y la anemia diseritropoyética congénita2.

La manifestación clínica de la eritropoyesis interrumpida es la anemia, una de las principales causas de morbilidad en todo el mundo. Los síntomas de la anemia van desde fatiga, dificultad para respirar y mareos hasta afecciones potencialmente mortales, como insuficiencia cardíacay paro cardíaco. Dado que la anemia afecta a 1.800 millones de personas en todo el mundo4, el modelado ex vivo de la eritropoyesis con el fin de investigar estas afecciones y sus mecanismos subyacentes sigue siendo una prioridad mundial. El método descrito aquí tiene como objetivo proporcionar un modelo simple y robusto para estudiar la diferenciación eritroide tanto sana como enferma. Este modelo permite la disección de las funciones de genes específicos en este proceso y permite probar compuestos que podrían beneficiar a los pacientes anémicos. Históricamente, el modelado de la eritropoyesis ineficaz ha tenido muchos desafíos, incluida la escasez de células madre en algunas médulas óseas enfermas y dificultades para imitar el nicho de la médula ósea.

Estudios previos han utilizado protocolos similares o más complejos; por ejemplo, Bondu et al. utilizaron un cóctel de citocinas que incluía eritropoyetina (EPO), factor de células madre (SCF) e interleucina-6 (IL6) durante 4 días antes de eliminar la IL6 del cóctel de diferenciación eritroide, en contraste, Yip et al. solo agregaron EPO a su cóctel de citocinas después de 7 días de cultivo líquido. Elvarsdóttir et al. desarrollaron un modelo de cultivo tridimensional (3D) para células CD34+ para facilitar la mayor expansión y maduración de las células eritroides, incluyendo la generación de islas eritroblásticas y eritrocitos enucleados, que son importantes para estudiar fenómenos como los sideroblastos en anillo 5,6,7,8 . Este protocolo utiliza solo tres citocinas para expandir las células (es decir, SCF, trombopoyetina [TPO] y tirosina quinasa 3 similar a FMS [FLT3]) y tres citocinas mantenidas a lo largo de todo el proceso de diferenciación (es decir, EPO, IGF1 y SCF). Uno de los criterios clave compartidos por estos diferentes estudios es el uso de células CD34+. Aunque el origen de estas células varía, se emplean de manera consistente en estos diferentes protocolos. Las fuentes pueden variar desde la recolección no invasiva de UCB hasta procedimientos más invasivos para obtener muestras de médula ósea adulta que se pueden recolectar de pacientes movilizados con factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) o punciones de médula ósea. En general, los modelos de cultivo líquido se llevan a cabo durante 14 días, mientras que los modelos 3D pueden mantener las células durante períodos más largos. Estos protocolos son esenciales para modelar enfermedades genéticas y alteraciones en la eritropoyesis. Los enfoques genéticos, como las eliminaciones de ARN de horquilla corta (shRNA), se pueden emplear para silenciar genes de interés y estudiar sus funciones en la eritropoyesis. El impacto del silenciamiento génico se puede monitorear en varias etapas de diferenciación, proporcionando un modelo humano ex vivo de la producción de glóbulos rojos para estudiar la anemia tanto en la salud como en la enfermedad. Este protocolo incluye la transducción de células de cordón umbilical CD34+ con shRNA que expresan constitutivamente un gen reportero, como la proteína de fluorescencia verde mejorada (EGFP), lo que permite clasificar las muestras mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). A continuación, las células se incuban en medios de diferenciación durante 2 semanas y se controlan mediante análisis de citometría de flujo y tinción inmunoquímica.

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Protocolo

La investigación con muestras primarias se realizó de acuerdo con las directrices institucionales (referencia REC: 21/EE/0133; ID del proyecto IRAS: 283103).

1. Producción de lentivirus

NOTA: Los lentivirus deben producirse en un laboratorio con nivel de bioseguridad L2 en condiciones estériles. Se deben usar todos los EPP requeridos para este laboratorio, incluidos los guantes dobles. El material contaminado se descontamina con desinfectante virucida antes de su eliminación en un contenedor esterilizado en autoclave. Aquí, se utiliza una mezcla de shRNA (control) que alberga un gen reportero de EGFP para ilustrar el proceso.

Día 1

  1. Calentar la gelatina a 37 °C en un baño de agua hasta que se disuelva por completo. Diluir la gelatina al 0,1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  2. Rebozar un plato de 150 mm con 2 mL de gelatina al 0,1%. Utilice 2 platos por virus. Incubar las placas durante 30 min a 37 °C.
  3. Siembre 5 millones de células HEK293T por plato recubierto de gelatina en 20 mL de Medio de Águila Modificado (DMEM) al 10% de Dulbecco y coloque las células en una incubadora a 37 °C.

Día 2

  1. Compruebe que las celdas han alcanzado aproximadamente el 50% de confluencia. Cambie el medio con 22 mL de DMEM al 10% sin alterar la capa celular 2 h antes de la transfección.
  2. Prepara la mezcla de transfección.
    NOTA: Se prepara una mezcla de transfección por plato, ya que un volumen mayor podría afectar la formación de precipitado de calcio-fosfato.
    1. Prepare la mezcla de reacción en un tubo de centrífuga de 15 mL de la siguiente manera: 32 μg de plásmido, 20 μg de plásmido PAX (pCMVdR8.74), 9 μg de plásmido VSVG (pMD.G2) y aumente el volumen hasta 1125 μL usando H2O.
    2. Añadir 125 μL de CaCl2 a la reacción e incubar 5 min a temperatura ambiente (RT) en un rodillo.
    3. Prepare 1,25 ml de 2x HEPES en un tubo de centrífuga de 15 ml separado.
    4. Agregue 2x HEPES gota a gota a la mezcla de reacción mientras agita suavemente el vórtice, luego coloque la mezcla en un rodillo durante 10 minutos a RT.
  3. Dispensar la reacción gota a gota sobre las células en forma de espiral y colocar las células en una incubadora a 37 °C después de mover suavemente la placa en forma de cruz para homogeneizar el medio.

Día 3

  1. Cambie el medio con 16 mL de DMEM al 10% sin alterar la capa de la célula.

Día 4

  1. Recoja el sobrenadante y guárdelo a 4 °C durante la noche. Agregue 16 mL de DMEM fresco a cada placa sin alterar la capa celular.

Día 5

  1. Recoge el sobrenadante y concáscate con el sobrenadante a partir del día 4. Filtro para eliminar residuos con un filtro de 0,45 μM.
  2. Trasvasar cada 30 mL (día 4 + día 5) de sobrenadante en un tubo cónico para ultracentrifugación. Agregue los tubos en un cubo giratorio, con adaptadores para el fondo cónico si es necesario.
  3. Equilibre los tubos cara a cara con una precisión de 0,02 g y ultracentrífuga a 90.000 x g durante 2 h a 4 °C.
  4. Deseche el sobrenadante y agregue 200 μL de medio de células madre por tubo. Cierre los tubos con parafilm e incube el tubo en una cámara frigorífica durante 2-4 h bajo agitación.
  5. Prepare 20 μL de alícuota de cada virus y almacene los viales a -80 °C. Mantenga 2 μL de cada virus y agregue 400 μL de DMEM.
    NOTA: Esta dilución se utilizará para la valoración.

2. Titulación de lentivirus

NOTA: Los lentivirus deben manipularse en un laboratorio de nivel de bioseguridad L2 en condiciones estériles. Se deben usar todos los EPP requeridos para este laboratorio, incluidos los guantes dobles. El material contaminado se descontamina con desinfectante virucida antes de su eliminación en un contenedor esterilizado en autoclave.

  1. Siembre HEK293T en una placa de 24 pocillos. Agregue 50,000 celdas/pocillo en 500 μL de DMEM al 10%.
    NOTA: Use 6 pocillos por virus y guarde un pocillo para las células no transducidas.
  2. Realice la transducción. Agregue los diferentes pocillos: 2 μL, 4 μL, 8 μL, 16 μL, 32 μL y 64 μL del virus diluido del paso 1.13. Homogeneizar suavemente.
  3. Cambie el medio 24 h más tarde añadiendo 500 μL de DMEM al 10%.
  4. En el día 4 después de la transducción, prepare las células para la citometría de flujo.
    1. Prepare tampón FACS con PBS, 2% de suero fetal bovino (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina (P/S), 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y 1/2.000 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
    2. Retire el sobrenadante y añada 500 μL de tampón FACS directamente con EDTA a cada pocillo.
    3. Separe las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
  5. Filtre las células a través de un colador de 40 μm y transfiéralas en tubos FACS.
  6. Determine el porcentaje de células EGFP mediante citometría de flujo.
  7. Configure las siguientes puertas:
    1. Configure DAPI frente a dispersión lateral (SSC-A) para excluir celdas muertas.
    2. Configure la altura de SSC (SSC-H) frente al área de SSC (SSC-A) para excluir agregados de celdas y seleccionar celdas individuales.
    3. Configure el área de dispersión frontal (FSC-A) frente a SSC-A para bloquear las celdas y eliminar los residuos en función del tamaño.
    4. Configure la proteína de fluorescencia verde (GFP) frente a la SSC-A para seleccionar células GFP+ .
  8. Titula el virus.
    1. Calcule la concentración de partículas (número de partículas/mL) para cada condición:
    2. Células EGFP x Factor de dilución del virus (200) x Número de células sembradas x1000)/volumen del virus.
      NOTA: Por ejemplo, las células se trataron con 64 μL de virus diluido a 1/200. Tras el análisis por citometría de flujo, el 54% de las células eran EGFP+. En esas condiciones, el título será (54% x 200 x 50 000 x 1000)/64 = 8,44 x 107 partículas/mL.

3. Transducción de células CD34+ aisladas de la sangre del cordón umbilical

NOTA: Esta parte se realiza en condiciones estériles. Aquí, las células UCB CD34+ (pureza >85%) se transducen con un shRNA (control) que alberga un reportero de eGFP. El experimento se realiza con tres réplicas técnicas. La proporción debe ajustarse al número de muestras.

Día 1

  1. Prepare los siguientes medios y búfer:
    1. Preparar el medio de descongelación: FBS suplementado con 1% de P/S y 10 μg/mL de ADNasa
    2. Preparación del tampón FACS: PBS suplementado con 1% de P/S y 2% de FBS (± 10 μg/mL de ADNasa)
    3. Prepare el medio de estimulación (en medio de células madre) agregando 150 ng/mL de SCF, 150 ng/mL de FLT-3, 10 ng/mL de IL-6, 25 ng/mL DE G-CSF, 20 ng/mL de TPO y 1% de HEPES.
  2. Descongele 100.000 células UCB CD34+ sumergiéndolas durante 30 s en el baño de agua a 37 °C. Agregue 1 ml de medio descongelante gota a gota a cada vial y luego vuelva a suspender suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
  3. Transfiera suavemente la suspensión celular gota a gota en un total de 5 mL de medio de descongelación.
    NOTA: Para evitar la pérdida de células, mantenga a un lado una alícuota de 2 mL de medio descongelante que se utilizará al final para lavar la punta y el vial.
  4. Centrifugar durante 8 min a 320 x g a RT. Lavar las células en 10 mL de tampón FACS + ADNasa.
  5. Centrifugar durante 8 min a 320 x g en RT. Vuelva a suspender el pellet celular en 2 mL de medio de estimulación (punta de lavado y tubo con medio de estimulación).
  6. Cuente las células usando 5 μL de suspensión celular y 5 μL de azul de tripán.
    NOTA: Apunte a un mínimo de 75,000 celdas en total (25,000 celdas/condición).
  7. Transfiera los 2 mL de suspensión celular a una placa de 24 pocillos e incube durante ≥4-6 h a 37 °C.
    NOTA: Todas las celdas (75.000-100.000) se siembran en un pocillo en este paso.
  8. Recoja las células en tubos FACS y rellénelas con 1 ml de medio de células madre. Centrífuga durante 8 min a 320 x g a RT.
  9. Descongele el virus y agregue el volumen requerido a los medios de estimulación en una multiplicidad de infección (MOI) de 30.
  10. Vuelva a suspender las células peletizadas en medios que contengan virus a 100.000 células por 100 μl de virus en 1 pocillo de una placa de 96 pocillos. Agregue PBS a los pocillos vacíos e incube durante la noche a 37 °C.

Día 2

  1. Prepare el medio de expansión (en medio de células madre) agregando 150 ng/mL SCF, 150 ng/mL FLT3-L y 20 ng/mL TPO.
  2. Agregue el volumen completo de suspensión celular del pocillo de placa de 96 pocillos a los tubos FACS con 1 mL de medio de células madre. Lave el pocillo y la punta con medio de células madre, lo que resulta en la adición de 2 mL de medio de células madre a la suspensión celular en el tubo FACS.
  3. Centrífuga durante 8 min a 320 x g a RT.
  4. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 2 mL de medio de expansión. Agregue la suspensión celular en un pocillo de placa de 24 pocillos (lave el pocillo y la punta en el proceso para obtener un total de 2 mL). Incubar las células durante 4 días a 37 °C.
    NOTA: La clasificación de células se realiza el día 7.

4. CD34+ EGFP+ Clasificación celular y diferenciación eritroide

NOTA: Esta parte se realiza en condiciones estériles.

  1. Prepare los siguientes medios y búfer.
    NOTA: Los medios con citocinas deben prepararse frescos:
    1. Prepare el tampón FACS complementando PBS con 1% de P/S y 2% de FBS.
    2. Prepare el medio de expansión (en medio de células madre) agregando 150 ng/mL SCF, 150 ng/mL FLT3-L y 20 ng/mL TPO.
    3. Prepare el medio de diferenciación de eritrocitos (en medio de células madre) agregando 25 ng/mL de SCF, 3 U/mL de EPO y 50 ng/mL de IGF1.
    4. Prepare 2 medios de diferenciación de eritrocitos (en medio de células madre) agregando 50 ng/mL SCF, 6 U/mL de EPO y 100 ng/mL de IGF1.
  2. Agregue el volumen completo de células a un tubo FACS separado (lave el pocillo y la punta en el proceso con medio de células madre). Centrifugar durante 8 min a 320 x g a RT. Vuelva a suspender las células peletizadas en 100 μL de tampón FACS.
  3. Añadir 5 μL de CD34 Ab/tubo e incubar en la oscuridad a 4 °C durante 20 min.
  4. Vuelva a suspender las células en 1 mL de tampón FACS con DAPI (dilución 1/2000 en tampón FACS) y centrifugar durante 8 min a 320 x g a RT.
  5. Vuelva a suspender las células en 200 μL de tampón FACS con DAPI (dilución 1/2000 en tampón FACS) y filtre las células a través de un filtro de 40 μM antes de la clasificación.
  6. Prepare las cuentas para el control:
    1. Añadir 0,5 μL de anticuerpo CD34 (Ab) a 1 gota de perlas en 100 μL de PBS e incubar en la oscuridad a 4 °C durante 20 min.
    2. Agregue 1 mL de PBS. Centrifugar durante 8 min a 320 x g en RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 500 μL de PBS.
  7. Preparar líneas celulares leucémicas para el control de GFP.
    NOTA: Utilice cualquier línea celular GFP+ disponible como control; En su lugar, se pueden usar cuentas.
    1. Añada células GFP- (2 tubos FACS con 100.000 células) y GFP+ (1 tubo FACS con 100.000 células) en el tubo FACS.
      NOTA: Un total de 3 tubos.
    2. Lave las células en 1 mL de tampón FACS. Centrífuga durante 8 min a 320 x g a RT.
    3. Resuspenda 100.000 células GFP en 500 μL de tampón FACS (sin teñir), 100.000 células GFP en 500 μL de tampón FACS con DAPI (dilución 1/2000 en tampón FACS) (DAPI teñido) y 100.000 células GFP+ en 500 μL de tampón FACS (células GFP+ ).
      NOTA: Los tubos de control se utilizarán para los ajustes de compuerta y compensación en el citómetro de flujo. Si las células utilizadas son 100% GFP, se pueden añadir células GFP al tubo (50.000 células GFP y 50.000 células GFP+).
    4. Filtre las células a través de un colador de 40 μm antes de clasificarlas.
  8. Configure las siguientes puertas:
    1. Configure DAPI frente a dispersión lateral (SSC-A) para excluir celdas muertas.
    2. Configure la altura de SSC frente al área de SSC (SSC-A) para excluir agregados de celdas y seleccionar celdas individuales.
    3. Configure el área de dispersión frontal (FSC-A) frente a SSC-A para eliminar los residuos en función del tamaño.
    4. Configure GFP frente a SSC-A para seleccionar celdas GFP+ .
    5. Configure CD34 (PerCP-Cy5.5) frente a SSC-A para seleccionar células CD34+ .
  9. Voltee el tubo de recolección FACS antes de la recolección de células para cubrir las paredes del tubo con FBS.
  10. Recoja las células en el medio de células madre.
    NOTA: Apunte a 75,000-80,000 celdas (25,000 celdas x 3)
  11. Centrifugar durante 8 min a 320 x g en RT y resuspender las células en 3 mL de medio de diferenciación eritroide.
  12. Vuelva a suspender y luego dispense 1 mL por pocillo en 3 pocillos de una placa de 24 pocillos. Llene todos los pozos exteriores con PBS.
  13. Realice una depleción parcial de los medios cada dos días y reemplácelos con un medio de diferenciación de eritrocitos 2x.
    1. Para actualizar el medio, asegúrese de que las celdas estén colocadas en la parte inferior de la placa. Incline suavemente la placa y extraiga 500 μL de medio.
    2. Refresque añadiendo 500 μL con un medio de diferenciación eritroide de citocinas 2x.
    3. Transfiera las células el día 6 a una placa de 12 pocillos y agregue 1 mL de medio para hacer un volumen final de 2 mL.

5. Análisis de la diferenciación eritroide por citometría de flujo dos veces por semana desde el día 6 hasta el día 14

  1. Prepare los siguientes medios y búfer.
    1. Prepare el tampón FACS complementando PBS con 1% de P/S y 2% de FBS
    2. Prepare el medio de diferenciación de eritrocitos (en medio de células madre) agregando 25 ng/mL de SCF, 3 U/mL de EPO y 50 ng/mL de IGF1.
  2. Recoja 200 μL de células de cada pocillo de la placa de 12 pocillos y reemplácelas con 250 μL de 2x medios de diferenciación eritroide. Agregue 1 mL de tampón FACS a cada tubo.
  3. Centrifugar durante 8 min a 320 x g a RT. Vuelva a suspender las células peletizadas en 100 μL de tampón FACS.
  4. Añadir 1 μL de CD71 Ab (1/100), 1 μL de CD34 Ab (1/100) y 1 μL de CD235a Ab (1/100) e incubar en la oscuridad a 4 °C durante 20 min.
  5. Vuelva a suspender las células en 1 mL de tampón FACS con DAPI (dilución 1/2000 en tampón FACS). Centrífuga durante 8 min a 320 x g a RT.
  6. Vuelva a suspender las células en 200 μL de tampón FACS con DAPI (dilución 1/2000 en tampón FACS).
  7. Prepare las cuentas para el control:
    1. Agregue 1 gota de perlas de compensación a dos tubos en 100 μL de PBS y luego agregue 0,55 μL de un solo anticuerpo a cada tubo para hacer controles de tinción única (uno para CD34, uno para CD71 y uno para CD235a).
      NOTA: 1 gota es suficiente para ambos controles.
    2. Incubar en la oscuridad a 4 °C durante 20 min. Agregue 1 mL de PBS.
    3. Centrifugar durante 8 min a 320 x g en RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 500 μL de PBS.
  8. Preparar una línea celular leucémica para el control.
    NOTA: Las células K562 expresan el marcador CD71 y se pueden utilizar como control positivo para configurar el FACS.
    1. Añada células GFP- (2 tubos FACS con 100.000 células) y células GFP+ (1 tubo FACS con 100.000 células) en el tubo FACS.
    2. Lave las células en 1 mL de tampón FACS. Centrífuga durante 8 min a 320 x g a RT.
    3. Resuspenda 100.000 células GFP en tampón FACS (sin teñir), 100.000 células GFP en tampón FACS con DAPI (dilución 1/2000 en tampón FACS) (DAPI teñido) y 100.000 células GFP+ en tampón FACS (células GFP+ ).
  9. Configure las siguientes puertas:
    1. Configure DAPI frente a dispersión lateral (SSC-A) para excluir celdas muertas.
    2. Configure la altura de SSC frente al área de SSC (SSC-A) para excluir agregados de celdas y seleccionar celdas individuales.
    3. Configure el área de dispersión frontal (FSC-A) frente a SSC-A para eliminar los residuos en función del tamaño.
    4. Configure CD235a (APC-Cy7) frente a CD71 (PE).
    5. Configure CD34 (PerCP-Cy5.5) frente a SSC-A.
  10. Ejecute una muestra de células GFP sin teñir y células completamente teñidas para ajustar los voltajes de modo que las células se sitúen en el lugar correcto.
  11. Ejecute perlas, celdas GFP+ y celdas teñidas con DAPI. Compare y aplique compensación a la configuración del citómetro.
  12. Ejecute los ejemplos y registre los eventos.

6. Análisis de la diferenciación eritroide por tinción de Giemsa

  1. Prepare 5 frascos de tinción de portaobjetos:
    1. Prepare un frasco de tinción en portaobjetos con la solución de azul de eosina-metileno 1:1 de May-Grünwald y PBS.
    2. Prepare un frasco de tinción en portaobjetos con 2,5 mL de caldo Giemsa + 50 mL de PBS.
    3. Prepara un frasco de tinción deslizante con agua destilada.
    4. Prepare un frasco de tinción en portaobjetos con PBS.
    5. Prepare un frasco de tinción deslizante con metanol helado.
  2. Recoja 100.000 células para una tinción óptima, agregue 1 ml de PBS y centrifugue 300 x g durante 5 minutos.
  3. Deseche el medio y vuelva a suspender en 150 μL de PBS.
  4. Prepare los portaobjetos, el papel de filtro y el adaptador cónico en una citocentrífuga y coloque lentamente la preparación de la célula en el adaptador cónico.
  5. Girar a 800 x g durante 3 min. Retire los portaobjetos y colóquelos en el frasco de portaobjetos de metanol en hielo durante 15 minutos.
  6. Sumerja los portaobjetos en la solución de May-Grünwald durante 5 minutos y agite de vez en cuando para asegurar una tinción adecuada.
  7. Luego, sumerja los portaobjetos en el frasco de PBS hasta que no se escurra ninguna mancha.
  8. Sumerja los portaobjetos en la solución de Giemsa durante 20 minutos y agite de vez en cuando para asegurar una tinción adecuada.
  9. Sumerja cuidadosamente los portaobjetos con PBS hasta que no se escurra ninguna mancha.
  10. Deje que los portaobjetos permanezcan en PBS durante 3 minutos más.
  11. Sumerja los portaobjetos rápidamente en agua destilada y séquelos al aire en RT.
  12. Añade una gota de resina sintética en cada punto de las celdas y añade suavemente un cubreobjetos encima.
  13. Deje que los portaobjetos se sequen durante 1 h en RT y selle el cubreobjetos con esmalte de uñas para evitar que se sequen.

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Resultados

Las células CD34+ de la sangre del cordón umbilical o de la médula ósea se descongelan, estimulan y transducen en primer lugar con un shRNA que expresa GFP (Figura 1A). Las células CD34+GFP+ se clasifican 4 días después de la transducción, de acuerdo con la estrategia de compuerta ilustrada en la Figura 1B. Los resultados representativos mostraron la maduración de las células CD34+ después de la transducción y la clasi...

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Discusión

En este trabajo describimos un método eficaz y fiable para inducir la diferenciación eritroide de células madre hematopoyéticas CD34+ (HSPC) aisladas de médula ósea adulta (BM) o de sangre de cordón umbilical (UCB). Esta línea incluye la edición/modificación de células primarias para investigar la función de cualquier gen de interés durante el proceso de diferenciación eritroide. Este método se ha utilizado con éxito para investigar la relevancia funcional de genes que no esta...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

C.P., S.B. y K.RP. contaron con el apoyo del programa HARP, la organización benéfica Barts (G-002167), el fondo Kay Kendall contra la leucemia (KKL1149) y la Academia de Ciencias Médicas (SBF004\1099). Agradecemos a la Dra. Pantelitsa Protopapa por la adquisición de la tinción y microscopía de MGG. También reconocemos las instalaciones de citometría de flujo y microscopía del Barts Cancer Institute de la Universidad Queen Mary de Londres. Agradecemos a la organización benéfica del Reino Unido Anthony Nolan por proporcionarnos las unidades de sangre de cordón umbilical utilizadas en este manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2x Perlas HEPESMerck51558
Thermo Scientific01-2222-42
CD235a APC Cy7Biolegend349115
CD34 PerCP Anticuerpo Cy5.5BD Biosciences347222
CD71 PE anticuerpoBiolegend334106
DAPIMerckD9542
DMEMThermo Scientific41966-029
DNAseMerckD4527-200KU
DPX medio de montaje VWR1.00579.0500
FACSAria Fusion BD BiosciencesNA
FBSMerckF9665
GelatinaMerckG1393
Giemsa soluciónAbcamab150670
HEPESMerckH0887-100mL
EPO HumanoPeproTech100-64
Lando Flt-3 HumanoPeproTech300-19
G-CSF humanoPeproTech300-23
IGF1 humanoPeproTech100-11
IL-6 humanoPeproTech200-06
SCF humanoPeproTech300-07
TPO humanoPeproTechAF-300-18
LSRFortessa Analizador de célulasBD BiosciencesNA
May-Grunwald solución Generon26250-01
Escáner de alto rendimiento Pannoramic 250 3DHISTECHNA
Penicilina/EstreptomicinaThermo Scientific15140-122
Shandon Cytospin 3 Thermo ScientificNA
Tecnologíascélulas madre9655
Medio de células madre de

Referencias

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