Cuantificación de glucosa de Bergmeyer para muestras microbiológicas

Summary

La cuantificación de glucosa de Bergmeyer es una técnica enzimática espectrofotométrica utilizada principalmente para pruebas clínicas que miden de forma precisa y sensible la cantidad de glucosa. En este trabajo se presenta un protocolo para el uso de este método en muestras microbiológicas.

Abstract

La concentración de glucosa es un indicador clave del metabolismo celular y podría indicar la tasa de metabolismo total, una aberración en el metabolismo de la glucosa y, en algunos casos, cómo las células acoplan el metabolismo de la glucosa con el metabolismo energético. Además, los niveles de glucosa intracelular y extracelular son indicativos del estado metabólico celular. Las técnicas enzimáticas, como la cuantificación de glucosa de Bergmeyer, son más precisas y sensibles que otras técnicas, como el ácido dinitrosalicílico o los métodos de fluorescencia, que se suelen utilizar en microbiología. Aunque se utiliza principalmente en el área clínica, la cuantificación de glucosa de Bergmeyer también se puede aplicar a cualquier célula, pero no se ha informado en detalle para bacterias, hongos, levaduras u otros microorganismos.

En este trabajo se presenta una metodología para cuantificar la glucosa a partir de muestras de bacterias y levaduras utilizando el método enzimático de cuantificación de glucosa de Bergmeyer. El procedimiento involucró las enzimas glucosa oxidasa, peroxidasa y dihidrocloruro de o-dianisidina incubadas a 37 °C durante 20 min, seguidas de la adición de ácido sulfúrico. A continuación, se mide la absorbancia a 545 nm. Es importante destacar que si bien esta técnica presenta dificultades para medir altas concentraciones de glucosa (por encima de 60 g/L), es posible medir concentraciones por debajo de 50 g/L utilizando factores de dilución. Este enfoque enzimático es valioso para la investigación y el análisis en microbiología y otras áreas científicas. La precisión y sensibilidad del método lo hacen útil para detectar incluso concentraciones bajas de glucosa en muestras microbiológicas.

Introduction

La glucosa sirve como fuente principal de energía y carbono para numerosos microorganismos, incluidas bacterias, levaduras y hongos. Estos microorganismos absorben la glucosa a través de transportadores ubicados en la membrana extracelular, donde se somete a una serie de reacciones bioquímicas dentro de la vía metabólica de la glucólisis para convertirse en piruvato¹. Existen diversas técnicas para la cuantificación de azúcares reductores como la glucosa. Por ejemplo, se puede emplear el reactivo^{de Benedict 2}, el uso de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS)^3,4, el método de la antropona⁵ o los métodos del ácido fenol-sulfúrico⁶. Sin embargo, estos métodos detectan cualquier azúcar reductor presente en la muestra, como la fructosa y la maltosa, lo que puede contribuir a la señal y complicar la cuantificación precisa de un azúcar en particular.

Además, requieren un estricto control de temperatura y el manejo de sustancias peligrosas, lo que puede complicar el proceso y afectar la precisión. Estos métodos también pueden sufrir interferencias de otros compuestos presentes en la muestra, lo que dificulta la cuantificación precisa de la glucosa. Por el contrario, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) ofrece una alternativa más precisa, que permite la discriminación entre la glucosa y otros azúcares reductores, aunque con mayores costes operativos. Estos métodos contrastantes ponen de manifiesto la necesidad continua de desarrollar técnicas de cuantificación de glucosa precisas y rentables⁷.

El método de glucosa oxidasa-peroxidasa-ácido sulfúrico (GOX-H₂SO₄) emplea dos enzimas, la glucosa oxidasa (GOD) y la peroxidasa (POD). GOD es una enzima oxidorreductasa que es muy selectiva para la oxidación de la β-D-glucosa⁸. Este complejo actúa como catalizador durante la reacción que se produce cuando la glucosa está en presencia de oxígeno, produciendo ácido glucónico y peróxido de hidrógeno (_H2O2). El_H2O2 se detecta mediante un aceptor cromogénico de oxígeno, la o-dianisidina, que, al interactuar con el POD, provoca su oxidación y liberación de_H2O2, evitando que el ácido glucónico se convierta de nuevo en glucosa (ver Figura 1). El color obtenido se estabiliza mediante la adición de ácido sulfúrico (_H2,_SO4), que también detiene la reacción enzimática, evitando así posibles interferencias que podrían producirse si la reacción continúa⁹.

Figura 1: Resumen del método de cuantificación de glucosa utilizando la enzima glucosa oxidasa, que reacciona con la glucosa para producir peróxido de hidrógeno (_H2O2) y ácido glucónico. Posteriormente, la enzima peroxidasa reacciona con_H2O2 en presencia de diclorhidrato de O-dianisidina. En el paso final, se agrega ácido sulfúrico (H₂SO₄) para detener la reacción enzimática, lo que da como resultado un color rosa que se mide a 529 nm. Abreviaturas: POD = peroxidasa; DIOS = glucosa oxidasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El método enzimático GOX-H₂SO₄ es una técnica ampliamente utilizada para medir la concentración de glucosa en muestras biológicas, la mayoría de las cuales son de interés clínico. Sin embargo, pocos estudios han investigado una técnica que permita cuantificar la cantidad de glucosa en un medio de crecimiento para evaluar su consumo. Por lo tanto, en el presente protocolo se presenta la metodología para cuantificar la glucosa mediante la reacción enzimática de glucosa oxidasa, peroxidasa, diclorhidrato de o-dianisidina y H₂SO₄ en muestras líquidas microbiológicas, la cual surge como una modificación del trabajo realizado por Bergmeyer⁹, mediante el uso de reactivos al 50% (v/v) de_H2SO4 y menores cantidades.

Protocol

1. Preparación de la solución

1. Prepare 100 mL de tampón de fosfato 0,1 M. Pesar 1,28 g de fosfato de dihidrógeno potásico (KH₂PO₄) y 0,1304 g de fosfato dipotásico (K₂HPO₄) y añadirlos a un vaso de precipitados de vidrio. Ahora, agregue 70 mL de agua desionizada (H₂Odi) y ajuste el pH a 5.5 usando ácido clorhídrico (HCl) 1 M o hidróxido de potasio (KOH). Transfiera la solución a un matraz aforado y ajuste el volumen final a 100 mL. A continuación, transfiera la solución a un recipiente ámbar y almacene la solución a 4-8 °C durante un máximo de 3 meses.
   PRECAUCIÓN: Use guantes de nitrilo durante todo el proceso de preparación para evitar el contacto con la piel y la posible contaminación, ya que el diclorhidrato de o-dianisidina es potencialmente cancerígeno.
2. Prepare una solución al 1% p/v de diclorhidrato de o-dianisidina. Pesar 0,01 g de diclorhidrato de o-dianisidina y colocarlo en un tubo de centrífuga de 2,0 mL. Con una micropipeta de 1.000 ml, añada 1,0 ml de H₂Odi para disolver el compuesto y, a continuación, mezcle lentamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Proteja la solución de la luz envolviendo el recipiente en papel de aluminio y guárdelo a -20 °C para mantener la estabilidad.
   NOTA: Para facilitar el soporte del tubo durante la medición en la balanza analítica, se puede utilizar un vaso de precipitados de 10 ml como soporte adicional. Esto ayuda a estabilizar el tubo, asegurando una medición precisa al minimizar el riesgo de desplazamiento o inclinación que podría alterar los resultados obtenidos en la balanza.
3. En un matraz aforado de 100 mL, añadir 10 mL de solución tampón de fosfato seguida de 1 mL de solución de diclorhidrato de o-dianisidina al 1% v/v. A continuación, ajuste el volumen final a 100 mL con tampón de fosfato para obtener una concentración final de una mezcla de o-dianisidina y tampón al 0,01%. Transfiera la solución a un matraz de color ámbar y envuélvalo con papel de aluminio para protegerlo de la luz. Almacene la solución a 4-8 °C durante un máximo de 3-4 meses.
   NOTA: La refrigeración es esencial para evitar la descomposición, que podría comprometer la integridad de las mediciones experimentales. Para evitar la degradación de la mezcla de o-dianisidina y tampón, se puede colocar una pequeña porción de 13 mL (suficiente para 12 muestras) en un tubo de plástico de 14 mL sobre hielo hasta su uso.
4. Prepare la solución 50% H₂SO₄ . Colocar un matraz aforado de 100 mL con 30 mL de H₂Odi en un baño de hielo y dejar enfriar durante 10 min. A continuación, vierta lentamente 51 mL de H₂SO₄ (98% v/v) por las paredes del matraz, agitando cuidadosamente para homogeneizar la solución. Espera a que la mezcla se enfríe, ya que la reacción es exotérmica (genera calor). Ajuste el volumen final a 100 mL con H₂Odi y transfiera la solución a un matraz de vidrio ámbar.
   NOTA: Use una campana extractora y siga todos los protocolos de seguridad, asegúrese de usar el equipo de protección adecuado. Preparar 50 mL de solución de carbonato cálcico al 40% para neutralizar los posibles derrames que puedan producirse.
5. Prepare 50 mM de solución de acetato de sodio disolviendo 0,04 g de acetato de sodio en 5 mL de_H2Odi en un vaso de precipitados. Ajuste el pH a 5.1 usando ácido acético glacial. Por último, ajuste el volumen a 10 mL con H₂Odi.

2. Preparación de enzimas

1. En un microtubo estéril de 2,0 mL, pesar 0,01 g de glucosa oxidasa y mezclar con 1 mL de acetato de sodio de 50 mM, pH 5,0, para obtener una concentración final de 10 mg/mL. Cubra el tubo con papel de aluminio y guárdelo a -20 °C.
   NOTA: La solución puede almacenarse hasta 2 meses a -20 °C.
2. Calcule el volumen de solución enzimática V₂ necesario para lograr la actividad enzimática deseada en cada cubeta de plástico (con un volumen total de 1,5 mL) utilizando la Ec (1): V₁C₁ = V₂C₂, donde V₁ es 1.500 μL, C₁ es 28,5 U de actividad enzimática y C₂ (la concentración de la solución enzimática) es 12.970 U/mL (10 mg de la enzima [129.000 unidades/g] en 1 mL de H₂Odi).
   V₂ = (1.500 μL × 28,5 U)/12.970 U = 3,29 μL (1)
   NOTA: Para un pipeteo más preciso, el valor se puede redondear a 3,3 μL.
3. En un nuevo microtubo de 2 mL, pesar 0,0031 g de enzima peroxidasa y añadir 1 mL de tampón fosfato, pH 5,5, para alcanzar una concentración final de 3,1 mg/mL. Cubra el microtubo con papel de aluminio y guárdelo a -20 °C.
4. Calcule el volumen de la solución de peroxidasa necesaria para lograr la actividad enzimática deseada por cubeta utilizando la Ec (1). Comience con un volumen total de cubeta de 1.500 μL y una actividad enzimática objetivo de 1,25 U. A continuación, determine el volumen necesario de la solución enzimática, dada su concentración de 1.551 U.
   V₂ = (1.500 μL × 1,25 U)/1.551 U = 1,208 μL
   NOTA: Para un pipeteo más preciso, el valor se redondeó a 1,20 μL.

3. Estándar de glucosa

1. Prepare un patrón de D-glucosa de 1 g/L añadiendo 0,01 g de D-glucosa a 10 mL de_H2Odi en un matraz aforado. Para diluir la concentración a 0,5 g/L, tome 500 μL de la solución madre y mézclela con 500 μL de H₂Odi para obtener un volumen final de 1 mL.
   NOTA: Este proceso de dilución es esencial para crear soluciones estándar precisas.

4. Preparación de la curva estándar

1. Utilizando un nuevo microtubo de 2 mL, añadir los volúmenes de tampón y glucosa indicados en la Tabla 1.
2. Ajuste el baño térmico seco a 37 °C. Una vez que la temperatura sea estable, agregue 3,3 μL de glucosa oxidasa a todos los tubos y luego agregue 1,2 μL de peroxidasa a cada tubo. Incubar los tubos a 37 °C durante 20 min.
3. Después de la incubación, añadir inmediatamente 750 μL de 50% H₂SO₄ (v/v) a cada microtubo y dejar enfriar la mezcla en un baño de hielo durante 2 min. Esto da como resultado un volumen final de 1.500 μL. Finalmente, transfiera la solución a una cubeta de plástico y mida la absorbancia a 529 nm.

Tabla 1: Curva de calibración de glucosa para el método GOX-H₂SO₄ . Abreviaturas: DIOS = glucosa oxidasa; POD = peroxidasa; H₂SO₄ = ácido sulfúrico. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

5. Análisis de muestras microbiológicas

1. Obtenga la muestra cultivando bacterias o levaduras en un medio de cultivo líquido bajo condiciones específicas, incluyendo temperatura, velocidad de agitación y tiempo de incubación. Una vez que el cultivo alcance la densidad óptica (DO) o la concentración celular deseada, recoja el cultivo para su posterior procesamiento.
   NOTA: Pseudomonas reptilivora se cultivó a una velocidad de agitación constante de 300 rpm y 28 °C, mientras que Debaryomyces hansenii se cultivó con una velocidad de agitación de 200 rpm a 30 °C en un agitador orbital. En el caso específico de D. hansenii, el aceite de canola comestible también se utilizó como inductor de la producción de lipasa.
2. Limpie el área de trabajo con una solución de alcohol al 70% o un agente de limpieza adecuado de acuerdo con los protocolos de bioseguridad. Encienda un quemador para asegurar la asepsia.
3. Transfiera 100 μL del medio de cultivo a un microtubo de 1,5 mL o 2 mL utilizando puntas estériles.
4. Centrifugar las muestras a 7.500 × g durante 7 min a 4 °C, o a 10.000 × g durante 7 min sin control de temperatura. Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante, que contiene glucosa en solución, y deseche el pellet.
5. Utilice 0,5 μL del sobrenadante para concentraciones de glucosa que oscilan entre 1 y 20 g/L, luego mezcle con 749,5 μL de tampón o-dianisidina, 3,3 μL de GOD y luego 1,2 μL de POD. Incubar los microtubos durante 20 min a 37 °C, como se detalla en el paso 4.2 y añadir inmediatamente 750 μL de 50% H₂SO₄ y dejar enfriar en un baño de hielo durante 2 min.
   1. Para concentraciones superiores a 20 g/L, realizar una dilución 1:1 con H₂Odi estéril antes de continuar.
   2. Si las muestras sobrenadantes se congelaron previamente a -80 °C o -20 °C, descongélelas a temperatura ambiente y en vórtice durante 30 s antes de su uso. Si es necesaria la dilución, utilice H₂ODI estéril.
   3. Para muestras con concentraciones de glucosa superiores a 30 g/L, realizar una dilución 1:1 con Odi H₂estéril, lo que da como resultado un factor de dilución de 2.
6. Calcule la concentración total de glucosa en cada muestra usando la Ec (2) en un programa de hoja de cálculo.
   (2)
   Dónde:
   x = concentración de glucosa (g/L) δ = volumen de reacción final (0,0015 L)
   y = absorbancia M.S. = cantidad de muestra utilizada*
   NOTA : Los valores b y m son de la ecuación que modela la línea de tendencia de la curva de calibración para el método (y = mx + b). *El valor M.S. debe basarse en la cantidad de muestra utilizada para obtener la proporción en la dilución correspondiente (es decir, si toma 0,5 μL del sobrenadante, M.S. = 0,0000005 L = 0,5 × ^10-6 L); si se utiliza un factor de dilución (DF), se multiplique la absorbancia obtenida por el DF.
   Por ejemplo, si se obtiene una absorbancia de 0,5 y se utilizó un DF de 2, el resultado sería 1,0. Por lo tanto, y = 1.0, y este valor debe ingresarse en la Ec (2), como se describió anteriormente.

6. Validación analítica

1. Calcular los parámetros analíticos de validación del método GOX-H₂SO₄ de acuerdo a lo establecido por el Centro Nacional de Metrología y la Entidad Mexicana de Acreditación¹⁰ (CENAM-ema).
   1. Calcule la precisión como un porcentaje del coeficiente de variación o %CV = (S/x) × 100, donde x es la media del grupo de muestra y S es la desviación estándar con un valor de aceptación del ≤10%.
   2. Determine la linealidad ajustando la curva estándar al modelo lineal R² por encima de 0,995.
   3. Calcule el límite de cuantificación (LOQ) utilizando la ecuación: LOQ = yB + 10sB, donde yB representa la concentración de analito que produce una señal equivalente a la señal objetivo, y 10sB denota 10 veces la desviación estándar del blanco
   4. Calcule el error sistemático usando esta ecuación: Inclinación = x - m, donde x = promedio de la concentración experimental y m es la concentración teórica.
   5. Determine la precisión como el grado de concordancia entre un valor real y un valor teórico.
      % de recuperación = (CR/CV) × 100
      Donde CR es el promedio de la concentración experimental y CV es el coeficiente de variación de la concentración teórica.

7. Interferencia de otros azúcares reductores

1. Evalúe cuatro azúcares reductores por separado: glucosa, fructosa, galactosa y xilosa de una solución madre de 0,5 g/L. Además, use trehalosa como control negativo. Siga el protocolo para todas las muestras y mida la absorbancia a 545 y 529 nm.

Results

El análisis espectrofotométrico de GOX-H₂SO₄ reveló una única absorbancia máxima a 529 nm (λmax) (Figura 2A), con valores de absorbancia adicionales observados a 545 nm. Al analizar los valores de absorbancia a diferentes concentraciones de glucosa, obtuvimos una linealidad (R²) de 0,9977 para λ529 nm y R² de 0,9967 para λ545 nm (Figura 2B). La linealidad, dentro de un rango dado, se refiere a la capacidad de proporcionar resultados dir...

Discussion

La cuantificación de la glucosa en los medios de cultivo es esencial para comprender el crecimiento microbiano y la actividad metabólica, ya que la glucosa sirve como fuente de energía primaria para muchos microorganismos. En este estudio, empleamos el método GOX-H₂SO₄ para medir con precisión los niveles de glucosa en medios de cultivo, con el objetivo de optimizar los procesos microbianos en las fermentaciones de bacterias o levaduras. Nuestros hallazgos son consi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtubo de 1,5 mL	Eppendorf	-	-
Microtubo de 2,0 mL	Eppendorf	-	-
CaCO3	Meyer	471-34-1	Carbonato de calcio
D-glucosa	Meyer	50-99-7	D-glucosa
Baño seco	FisherScientific	11-718-4	Serial 911NO251. Bloque WxDxH mm/in: 124 x 76 x 39 / 4,9 x 3,0 x 1,5
Glucosa oxidasa	Sigma Aldrich	G6125-50KU Polvo de	enzima
H2O	-	-Agua	desionizada
H2SO4	Meyer	7664-93-9	Ácido sulfúrico
HCl	Meyer	7647-01-0	Ácido clorhídrico
K2HPO4	Meyer	7758-11-4	Fosfato dipotásico
KH2PO4	Meyer	7778-77-0	Fosfato monopotásico
KOH	Meyer	1310-58-3	Hidróxido de potasio
Lambda 35	PerkinElmer-Espectrofotómetro
Microtubo centrífuga	-	-	-
o-Dianisidina diclorhidrato	Sigma Aldrich	D3252
Peroxidasa	Sigma Aldrich	P8125-50KU	Enzima polvo
pH-meter	Hanna	1131	Hanna 1170
Acetato de sodio	Meyer	127-09-3	Meyer
Espátulas de pesaje	-	--