Un método automatizado de estrabismo para sincronizar el tiempo del comportamiento y la dinámica cerebral en estudios de dolor en ratones

Summary

Este protocolo proporciona un método para rastrear el estrabismo ocular automatizado en roedores a lo largo del tiempo de una manera compatible con el bloqueo de tiempo a las medidas neurofisiológicas. Se espera que este protocolo sea útil para los investigadores que estudian los mecanismos de los trastornos del dolor, como la migraña.

Abstract

El dolor espontáneo ha sido difícil de rastrear en tiempo real y cuantificar de una manera que evite el sesgo humano. Esto es especialmente cierto para las métricas de dolor de cabeza, como en trastornos como la migraña. El estrabismo se ha convertido en una métrica variable continua que puede medirse a lo largo del tiempo y es eficaz para predecir los estados de dolor en este tipo de ensayos. Este artículo proporciona un protocolo para el uso de DeepLabCut (DLC) para automatizar y cuantificar el estrabismo (distancia euclidiana entre párpados) en ratones restringidos con movimientos de cabeza que giran libremente. Este protocolo permite emparejar y comparar directamente la cuantificación no sesgada del estrabismo ocular con medidas mecanicistas como la neurofisiología. Proporcionamos una evaluación de los parámetros de entrenamiento de IA necesarios para lograr el éxito definido por la discriminación de los períodos de estrabismo y no estrabismo. Demostramos la capacidad de rastrear y diferenciar de manera confiable el estrabismo en un fenotipo similar a la migraña inducida por CGRP con una resolución de menos de un segundo.

Introduction

La migraña es uno de los trastornos cerebrales más prevalentes en todo el mundo y afecta a más de mil millones^{de personas.} Los modelos preclínicos de migraña en ratones han surgido como una forma informativa de estudiar los mecanismos de la migraña, ya que estos estudios pueden controlarse más fácilmente que los estudios en humanos, lo que permite el estudio causal del comportamiento relacionado con la migraña^. Estos modelos han demostrado una respuesta fenotípica fuerte y repetible a los compuestos inductores de migraña, como el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP). Persiste la necesidad de mediciones sólidas de los comportamientos relevantes para la migraña en modelos de roedores, especialmente aquellos que pueden combinarse con métricas mecanicistas como imágenes y enfoques electrofisiológicos.

Los estados cerebrales similares a la migraña se han caracterizado fenotípicamente por la presencia de aversión a la luz, alodinia de la pata, hiperalgesia facial a estímulos nocivos y mueca facial³. Dichos comportamientos se miden por el tiempo total que se pasa en la luz (aversión a la luz) y los umbrales de sensibilidad al tacto facial o de las patas (alodinia de las patas e hiperalgesia facial) y se restringen a una sola lectura durante largos períodos de tiempo (minutos o más). Los comportamientos similares a la migraña se pueden provocar en animales mediante la dosificación de compuestos inductores de migraña como el CGRP, imitando los síntomas experimentados por los pacientes humanos con migraña³ (es decir, demostrando validez aparente). Dichos compuestos también producen síntomas de migraña cuando se administran en humanos, lo que demuestra la validez de constructo de estos modelos⁴. Los estudios en los que los fenotipos conductuales se atenuaron farmacológicamente han conducido a descubrimientos relacionados con el tratamiento de la migraña y proporcionan una mayor justificación de estos modelos (es decir, demuestran validez predictiva)^5,6.

Por ejemplo, se demostró que un anticuerpo monoclonal anti-CGRP (ALD405) reduce el comportamiento de aversión a la luz⁵ y la mueca facial en ratones⁶ tratados con CGRP, y otros estudios han demostrado que los fármacos antagonistas del CGRP reducen los comportamientos similares a la migraña inducidos por el óxido nitroso en animales ^7,8. Ensayos clínicos recientes han demostrado éxito en el tratamiento de la migraña mediante el bloqueo de CGRP ^9,10, lo que ha llevado a múltiples medicamentos aprobados por la FDA dirigidos al CGRP o a su receptor. La evaluación preclínica de los fenotipos relacionados con la migraña ha dado lugar a avances en los hallazgos clínicos y, por lo tanto, es esencial para comprender algunos de los aspectos más complejos de la migraña que son difíciles de probar directamente en humanos.

A pesar de las numerosas ventajas, los experimentos que utilizan estas lecturas del comportamiento de la migraña en roedores a menudo están restringidos en su capacidad de muestreo de puntos de tiempo y pueden ser subjetivos y propensos a errores experimentales humanos. Muchos ensayos conductuales están limitados en la capacidad de capturar la actividad a resoluciones temporales más finas, lo que a menudo dificulta la captura de elementos más dinámicos que ocurren en una escala de tiempo de menos de un segundo, como a nivel de la actividad cerebral. Ha resultado difícil cuantificar los elementos más espontáneos y naturales del comportamiento a lo largo del tiempo con una resolución temporal significativa para el estudio de los mecanismos neurofisiológicos. La creación de una forma de identificar la actividad similar a la migraña en escalas de tiempo más rápidas permitiría validar externamente los estados cerebrales similares a la migraña. Esto, a su vez, podría sincronizarse con la actividad cerebral para crear perfiles de actividad cerebral más robustos de la migraña.

Uno de estos fenotipos relacionados con la migraña, la mueca facial, se utiliza en varios contextos como una medida del dolor en animales que se puede medir instantáneamente y rastrear a lo largo^{del tiempo.} La mueca facial se utiliza a menudo como un indicador de dolor espontáneo, basándose en la idea de que los humanos (especialmente los humanos no verbales) y otras especies de mamíferos muestran cambios naturales en la expresión facial cuando experimentan dolor^. Los estudios que miden la mueca facial como indicación de dolor en ratones en la última década han utilizado escalas como la Escala de Muecas de Ratón (MGS) para estandarizar la caracterización del dolor en roedores¹². Las variables de expresión facial del MGS incluyen el endurecimiento orbital (estrabismo), el abultamiento de la nariz, el abultamiento de las mejillas, la posición de las orejas y el cambio de bigotes. A pesar de que se ha demostrado que el MGS caracteriza de manera confiable el dolor en animales¹³, es notoriamente subjetivo y se basa en puntuaciones precisas, que pueden variar entre los experimentadores. Además, el MGS es limitado en el sentido de que utiliza una escala no continua y carece de la resolución temporal necesaria para rastrear el comportamiento natural a lo largo del tiempo.

Una forma de combatir esto es cuantificar objetivamente un rasgo facial consistente. El estrabismo es el rasgo facial más rastreable⁶. El estrabismo explica la mayor parte de la variabilidad total de los datos cuando se tienen en cuenta todas las variables del MGS (estrabismo, protuberancia de la nariz, protuberancia de las mejillas, posición de las orejas y cambio de bigotes)⁶. Debido a que el estrabismo contribuye más a la puntuación general obtenida utilizando el MGS y rastrea de manera confiable la respuesta a CGRP ^6,14, es la forma más confiable de rastrear el dolor espontáneo en modelos de ratones con migraña. Esto hace que el estrabismo sea un comportamiento no homeostático cuantificable inducido por el CGRP. Varios laboratorios han utilizado las características de la expresión facial, incluido el estrabismo, para representar el posible dolor espontáneo asociado con la migraña ^6,15.

Han persistido varios desafíos con respecto a la realización de estrabismos automatizados de una manera que pueda combinarse con estudios mecánicos de la migraña. Por ejemplo, ha sido difícil realizar un seguimiento fiable del estrabismo sin depender de una posición fija que debe calibrarse de la misma manera en todas las sesiones. Otro desafío es la capacidad de llevar a cabo este tipo de análisis a escala continua en lugar de escalas discretas como el MGS. Para mitigar estos desafíos, nos propusimos integrar el aprendizaje automático, en forma de DeepLabCut (DLC), en nuestra canalización de análisis de datos. DLC es un modelo de aprendizaje automático de estimación de pose desarrollado por Mathis y sus colegas y se ha aplicado a una amplia gama de comportamientos¹⁶. Usando su software de estimación de pose, pudimos entrenar modelos que podían predecir con precisión puntos en el ojo de un ratón con una precisión casi humana. Esto resuelve los problemas de puntuación manual repetitiva y, al mismo tiempo, aumenta drásticamente la resolución temporal. Además, al crear estos modelos, hemos creado un medio repetible para puntuar el estrabismo y estimar la actividad cerebral similar a la migraña en grupos experimentales más grandes. Aquí, presentamos el desarrollo y la validación de este método para rastrear los comportamientos de estrabismo de una manera que puede bloquearse en el tiempo con otras mediciones mecanicistas como la neurofisiología. El objetivo general es catalizar estudios mecanicistas que requieran comportamientos de estrabismo bloqueados en el tiempo en modelos de roedores.

Protocol

NOTA: Todos los animales utilizados en estos experimentos fueron manejados de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Iowa.

1. Preparar el equipo para la recopilación de datos

1. Asegure la disponibilidad de todo el equipo necesario: asegúrese de que el hardware recomendado para ejecutar DLC tenga al menos 8 GB de memoria. Consulte la Tabla de materiales para obtener información relacionada con el hardware y el software.
   NOTA: Los datos se pueden recopilar en cualquier formato, pero deben convertirse a un formato legible por DLC antes del análisis. Los formatos más comunes son AVI y MP4.
2. Configure al menos una cámara para que se pueda detectar un ojo de un animal. Si ambos ojos son visibles, realice un filtrado adicional, ya que puede causar interferencias en el seguimiento. Consulte la sección 10 para ver un ejemplo de dicho filtrado para los datos proporcionados aquí.
3. Instale DLC usando el paquete que se encuentra en Deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/installation.
4. En la configuración de la cámara, incluya una sola cámara en un ángulo lateral (~90°) con respecto al ratón. Para seguir este ejemplo, muestree a 10 Hz, con los ratones restringidos pero libres de acceder a toda su gama de movimientos de la cabeza en relación con el cuerpo. Manténgase entre 2 y 4 pulgadas de la cámara al animal.

2. Configuración de DLC

1. Después de instalar DLC, cree el entorno para trabajar. Para ello, vaya a la carpeta donde se descargó el software DLC utilizando el directorio de cambios con el siguiente comando.
   CD folder_name
   NOTA: Aquí es donde se encuentra el archivo DEEPLABCUT.yaml.
2. Ejecute el primer comando para crear el entorno y habilítelo escribiendo el segundo comando.
   conda env create -f DEEPLABCUT.yaml
   conda activar Deeplabcut
   NOTA: Asegúrese de que el entorno esté activado antes de cada uso de DLC.
   Después de activar el entorno, abra la interfaz gráfica de usuario (GUI) con el siguiente comando y comience a crear el modelo.
   python -m deeplabcut

3. Crear el modelo

1. Después de abrir la GUI, comience a crear un modelo haciendo clic en Crear nuevo proyecto en la parte inferior.
2. Asigne al proyecto un nombre significativo y único para identificarlo más adelante e introduzca un nombre como experimentador. Consulte la sección Ubicación para ver dónde se guardará el proyecto.
3. Seleccione Examinar carpetas y busque los vídeos para entrenar el modelo. Seleccione Copiar vídeos a la carpeta del proyecto si los vídeos no se van a mover de su directorio original.
4. Seleccione Crear para generar un nuevo proyecto en el equipo.
   NOTA: Los videos deben cubrir toda la gama de comportamientos que observará (es decir, entrecerrar los ojos, no entrecerrar los ojos y todos los comportamientos intermedios). El modelo solo podrá reconocer un comportamiento similar al de los datos de entrenamiento y, si faltan algunos componentes del comportamiento, es posible que el modelo tenga problemas para reconocerlo.

4. Configurar los ajustes

NOTA: Aquí es donde se pueden definir detalles como qué puntos rastrear, cuántos fotogramas extraer de cada video de entrenamiento, tamaño de punto de etiquetado predeterminado y variables relacionadas con cómo se entrenará el modelo.

1. Después de crear el modelo, edite las opciones de configuración seleccionando Editar config.yaml. Seleccione editar para abrir el archivo de ajustes de configuración y especificar los ajustes clave relacionados con el modelo.
2. Modifique las partes del cuerpo para incluir todas las partes del ojo que desea rastrear, luego modifique numframes2pick al número de fotogramas necesarios por video de entrenamiento para obtener 400 fotogramas en total. Por último, cambie el tamaño del punto a seis para que el tamaño predeterminado al etiquetar sea lo suficientemente pequeño como para colocarlo con precisión alrededor de los bordes del ojo.

5. Extraer fotogramas de entrenamiento

1. Después de la configuración, navegue hasta la pestaña Extraer fotogramas en la parte superior de la GUI y seleccione Extraer fotogramas en la parte inferior derecha de la página.
2. Supervise el progreso usando la barra de carga en la parte inferior de la GUI.

6. Etiquetar marcos de entrenamiento

1. Vaya a la pestaña Marcos de etiqueta en la GUI y seleccione Marcos de etiqueta. Busque la nueva ventana que muestra las carpetas para cada uno de los videos de capacitación seleccionados. Seleccione la primera carpeta y se abrirá una nueva GUI de etiquetado.
2. Etiquete los puntos definidos durante la configuración para cada fotograma del vídeo seleccionado. Una vez que todos los fotogramas estén etiquetados, guárdelos y repita el proceso para el siguiente video.
3. Para un etiquetado adecuado del estrabismo, use dos puntos lo más cerca posible del pico más grande del ojo (centro) e indique las posiciones arriba/abajo para cada punto. Estrabismo aproximado como el promedio de estas dos longitudes.
   NOTA: Al etiquetar, el DLC no guarda automáticamente el progreso. Se recomienda guardar periódicamente para evitar la pérdida de datos etiquetados.

7. Crear un conjunto de datos de entrenamiento

1. Después de etiquetar manualmente, vaya a la pestaña Entrenar red y seleccione Entrenar red para solicitar al software que comience a entrenar el modelo.
2. Supervise el progreso en la ventana de comandos.

8. Evalúe la red

1. Una vez completado el entrenamiento de red, vaya a la pestaña Evaluar red y seleccione Evaluar red. Espere unos momentos hasta que desaparezca el círculo de carga azul, lo que indica que ha terminado de autoevaluarse y que el modelo está listo para su uso.

9. Analizar datos/generar videos etiquetados

1. Para analizar vídeos, vaya a la pestaña Analizar vídeos . Seleccione Agregar más videos y seleccione los videos que se van a analizar.
2. Seleccione Guardar resultado(s) como csv si una salida csv de los datos es suficiente.
3. Cuando se hayan adquirido todos los vídeos, seleccione Analizar vídeos en la parte inferior para comenzar el análisis de los vídeos.
   NOTA: Este paso debe completarse antes de generar videos etiquetados en el paso 9.5
4. Una vez que se hayan analizado los videos, vaya a la pestaña Crear videos y seleccione los videos analizados.
5. Seleccione Crear videos y el software comenzará a generar videos etiquetados que representan los datos que se muestran en el .csv correspondiente.

10. Procesar los datos finales

1. Aplique las macros que se encuentran en https://research-git.uiowa.edu/rainbo-hultman/facial-grimace-dlc para convertir los datos sin procesar al formato utilizado para este análisis (es decir, la distancia euclidiana).
2. Importe y aplique macros etiquetadas como Paso 1 y Paso 2 al csv para filtrar todos los puntos de datos subóptimos y convertir los datos a una distancia euclidiana promediada para los puntos más centrados en la parte superior e inferior del ojo.
3. Ejecute la macro llamada Step3 para marcar cada punto como 0 sin estrabismo y 1 entrecerrar los ojos en función del valor de umbral en el script, que se establece en 75 píxeles.
   NOTA: Los parámetros de estas macros pueden requerir ajustes dependiendo de la configuración experimental (ver discusión). El umbral para entrecerrar los ojos y el filtro automático para el valor máximo del ojo son parámetros que pueden modificarse en función del tamaño del animal y de la distancia a la cámara. También puede ajustar los valores utilizados para eliminar puntos subóptimos en función de la selectividad con la que se deban filtrar los datos.

Results

Aquí, proporcionamos un método para la detección confiable de estrabismo a alta resolución temporal utilizando DeepLabCut. Optimizamos los parámetros de entrenamiento y proporcionamos una evaluación de las fortalezas y debilidades de este método (Figura 1).

Después de entrenar nuestros modelos, comprobamos que eran capaces de estimar correctamente los puntos superior e inferior del párpado (Figura 2), que sirven como puntos de coordenadas para la medida de la distancia euclidiana. La distancia euclidiana se define como las longitudes medias de las distancias entre los dos puntos superior e inferior del ojo. Nuestro modelo fue capaz de detectar casos de no estrabismo (Figura 2A) y estrabismo (Figura 2B). Los puntos azules indican los puntos utilizados para determinar la distancia euclidiana para cada fotograma. Los puntos verdes, amarillos, naranjas y morados se utilizaron para ayudar al modelo a estimar correctamente la distancia euclidiana y disminuir el valor de probabilidad cuando la cabeza está en una posición subóptima (es decir, teniendo en cuenta el movimiento de la cabeza y los cambios de posición a lo largo de las sesiones). A continuación, validamos la precisión del modelo utilizando varios métodos diferentes.

Para validar el número ideal de fotogramas utilizados para el modelo, entrenamos y probamos cuatro modelos de diferentes tamaños de fotogramas de muestra (Figura 3). Primero comparamos los valores de error cuadrático medio (RMSE) entre los datos de prueba y de entrenamiento para validar qué tan bien los modelos podían predecir con precisión los datos de prueba con los que no habían sido entrenados. Esta comparación mostró que la variabilidad entre los puntos etiquetados manualmente y los puntos etiquetados con el modelo se estabilizó después de 300 fotogramas. Esta tendencia se correlacionó con los promedios informados para la probabilidad que también pareció estabilizarse después de 300 fotogramas etiquetados. Utilizamos estos valores de probabilidad informados para filtrar los puntos que eran inferiores a 0,92. Estos valores de probabilidad indican el grado de confianza del modelo en que un punto determinado se etiquetó correctamente en función de los datos de entrenamiento. Promediamos estos valores para los puntos que contribuyen a la métrica de distancia euclidiana para examinar qué tan bien se desempeñaron los modelos entre sí. Si bien no hubo una diferencia significativa entre 300 y 400 fotogramas, usamos 400 fotogramas porque promedió por encima del valor de probabilidad de 0,95, que se acerca a nuestro umbral para el filtrado manual y se alinea con el umbral utilizado en modelos similares para la estimación de pose¹⁶.

Otra forma en que validamos la precisión del modelo fue con una matriz de confusión que comparaba los fotogramas anotados manualmente con los fotogramas etiquetados con DLC. Dos individuos ciegos anotaron manualmente 300 fotogramas del mismo ojo en ocho vídeos. Utilizamos estos datos para construir una matriz de confusión para evaluar los verdaderos y falsos positivos y negativos (Figura 4), donde los datos puntuados manualmente se utilizaron como la verdad fundamental. Para DLC, se registró un valor positivo de estrabismo cuando la distancia euclidiana se registró como inferior a 75 píxeles (es decir, el animal entrecierra los ojos) y se registró un valor negativo para valores superiores a 75 píxeles (es decir, el animal no entrecierra los ojos). Encontramos un valor predictivo positivo del 96,96%, que es el porcentaje de tiempo que el modelo predice con precisión el estrabismo en relación con un estrabismo anotado manualmente. Encontramos un valor predictivo negativo del 99,66%, que es el porcentaje de tiempo que el modelo predice con precisión que no hay estrabismo en relación con el estrabismo anotado manualmente. Estos muestran la proporción de valores negativos y positivos que se etiquetaron correctamente. También encontramos una tasa de verdaderos positivos del 98,1% y una tasa de verdaderos negativos del 99,46%, que representan la predicción precisa del modelo de valores positivos y negativos en relación con todos los valores positivos y negativos, respectivamente. Nuestro coeficiente de correlación de Matthews, o MCC, fue del 93,8%, lo que indica el coeficiente de correlación entre los valores observados y los predichas.

Una vez que estuvimos seguros de que nuestro modelo rastrea de manera confiable el estrabismo, comparamos este método DLC con un método de seguimiento del estrabismo publicado anteriormente utilizando un conjunto de datos preclínicos de migraña¹⁴. Nos referiremos a este otro método como el "modelo de estrabismo de área (ASM)" porque se desarrolló utilizando el área de ojo abierto como variable continua que mide el estrabismo¹⁴. El modelo de estrabismo de área utiliza un software de detección facial entrenado combinado con un script personalizado de MATLAB para analizar el área media de píxeles del ojo y excluir los fotogramas con una tasa de error de seguimiento del >15%¹⁴. Una limitación importante es que el "ASM" no es de código abierto y, por lo tanto, no es ampliamente accesible. El contenido descargable permite una mayor optimización y adaptabilidad sin necesidad de una compra significativa de software y hardware.

Utilizamos un conjunto de datos de 10 ratones CD1 hembra y 10 machos. Experimentalmente, todos los animales fueron aclimatados en restricciones suaves durante 30 minutos durante un total de 3 días antes del inicio de las grabaciones. Cada animal fue registrado durante 5 min de la línea de base y luego 5 min para los registros de tratamiento. Durante las sesiones de tratamiento, los animales fueron tratados con PBS (vehículo) o 0,1 mg/kg de CGRP (tratamiento) por vía intraperitoneal para inducir un estado similar a la migraña. Los datos se recogieron en una habitación bien iluminada utilizando cámaras equipadas con luz infrarroja para iluminar el rostro, lo que garantizó una detección precisa de los puntos de referencia. La cámara infrarroja incluía un objetivo Kowa LM35JC 2/3" 35 mm con montura C de iris manual con una distancia focal de 254 mm y una apertura adecuadamente ajustada. Después de recopilar los datos, utilizamos el ASM y el DLC para analizar los datos. Dado que la puntuación manual se ha utilizado convencionalmente en el campo para cuantificar la mueca facial, siendo el estrabismo un componente de la mueca facial¹⁴, también comparamos nuestros datos con los datos puntuados manualmente.

Con base en hallazgos previos de que la inyección periférica de CGRP induce una respuesta de estrabismo en ratones, esperamos observar diferencias significativas en la respuesta de estrabismo entre el vehículo y el tratamiento con CGRP ^6,14. Comparamos los métodos ASM, manual y DLC y descubrimos que nuestro modelo detectó de manera robusta un fenotipo de estrabismo, al igual que los métodos manual y ASM (Figura 5). Es importante tener en cuenta que se utilizó el modelo ASM para evaluar el dolor y el estrabismo inducidos por CGRP. En ese estudio, Rea et al. compararon la respuesta del estrabismo después de la CGRP con la respuesta del estrabismo después de la inyección de formalina de la pata trasera como un ensayo de inducción del dolor "más tradicional"¹⁴. Además, está bien documentado que el CGRP induce hipersensibilidad al tacto en ratones mediante el uso de von Frey ^3,17. De acuerdo con el campo, normalizamos el estrabismo promedio durante la sesión de tratamiento a una línea de base de pretratamiento de 5 minutos para cada animal y comparamos los animales tratados con PBS (n = 10) con los animales tratados con CGRP (n = 11). A continuación se presentan los análisis estadísticos de los grupos tratados con PBS frente a los grupos tratados con CGRP. Encontramos que los animales tratados con CGRP exhibieron una disminución del área media de píxeles utilizando el método de seguimiento de estrabismo de área (p = 0.012, Figura 5A) y exhibieron una distancia euclidiana disminuida cuando se puntuaron manualmente (p = 0.0007, Figura 5B) y utilizando nuestro modelo DLC (p = 0.007, Figura 5C). Cuando comparamos cada método a lo largo del tiempo en un solo animal representativo, se observó el mismo patrón (Figura 5). Este animal mostró un fenotipo de estrabismo muy claro en respuesta al tratamiento con CGRP, pero no al PBS. Todos los modelos fueron capaces de detectar estas diferencias, pero los datos se representaron más claramente en nuestro modelo DLC (Figura 5). Las métricas precisas y precisas son especialmente importantes cuando los datos deben analizarse a resoluciones más finas en las que el promedio no es indicativo de la lectura completa del comportamiento (por ejemplo, la actividad cerebral). El método DLC para detectar el estrabismo en ratones nos permite recopilar datos en una escala de tiempo de milisegundos y bloquearlos en el tiempo con medidas de actividad cerebral (por ejemplo, potenciales de campo local), que ocurre en una escala de tiempo de milisegundos. A continuación, podemos utilizar esta técnica para construir un perfil más robusto de un estado cerebral indicativo de dolor espontáneo en el contexto de la migraña y otros trastornos cerebrales complejos.

Figura 1: Descripción general del procedimiento para generar una red entrenada con DLC. Esquema general del proceso por el cual se rastrean las características oculares de un animal y luego se analizan mediante aprendizaje automático. Abreviatura: DLC = DeepLabCut. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ejemplo de seguimiento automatizado del estrabismo en un ratón CD1 representativo. (A) Ejemplo de un fotograma que muestra el estrabismo de seguimiento DLC (puntos de colores) en el contorno del ojo durante el día del tratamiento cuando el ratón no está entrecerrando los ojos. (B) Ejemplo de un fotograma que muestra la detección automatizada de estrabismo el día del tratamiento, utilizando nuestro modelo DLC. La distancia euclidiana se midió utilizando la distancia media entre B y C, los puntos azules, en la parte superior e inferior del ojo. Los conjuntos de puntos azules en la parte superior e inferior del ojo se utilizan cuando se rastrea la distancia euclidiana. Los otros puntos (verde, amarillo, naranja, morado) son puntos de referencia de encuadre utilizados para ayudar al modelo a estimar los puntos de distancia euclidiana y filtrar el posicionamiento subóptimo de la cabeza después de la recopilación de datos. Abreviatura: DLC = DeepLabCut. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Justificación del número de fotogramas utilizados para entrenar el modelo. (A) El análisis de error cuadrático medio indica la distancia media entre los valores previstos y observados para los conjuntos de datos de prueba y entrenamiento. El conjunto de datos de entrenamiento representa los fotogramas muestreados al entrenar el modelo, y el conjunto de datos de prueba representa los fotogramas que no son de entrenamiento utilizados para validar el grado en que el modelo podría identificar imágenes similares pero diferentes. Utilizamos cinco conjuntos de datos de entrenamiento y prueba y descubrimos que los valores de RMSE se nivelaron alrededor de 300 fotogramas para el grupo de prueba. (B) La probabilidad de que un punto dado esté correctamente etiquetado (media + SEM). Esto mostró que 400 fotogramas etiquetados manualmente eran ideales porque los conjuntos de datos sin procesar tenían un promedio superior a 0,95 de probabilidad, mientras que tenían una puntuación RMSE más cercana a la de los datos de entrenamiento. Esto significó que el modelo pudo aproximarse de cerca a los puntos en los que había sido entrenado y, al mismo tiempo, informar sobre la mayoría de los fotogramas con una alta probabilidad. Abreviatura: RMSE = error cuadrático de la media radicular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Matriz de confusión para las mediciones de estrabismo DLC. Tomamos una muestra de 300 s de ocho videos (cinco CGRP y tres PBS) y comparamos esos puntos con una puntuación binaria de sí o no etiquetada manualmente para el estrabismo. Cuantificamos los valores predichos como los identificados por DLC y los valores reales como los puntuados manualmente por un humano. A continuación, comparamos esto con los datos puntuados manualmente para ver con qué frecuencia el estrabismo se identificó correctamente en relación con el sí o el no binario puntuado manualmente del estrabismo. Abreviaturas: DLC = DeepLabCut; CGRP = péptido relacionado con el gen de la calcitonina; PBS = solución salina tamponada con fosfato; TP = verdaderos positivos; FP = falsos positivos; FN = falsos negativos; TN = negativos verdaderos; VPP = valor predictivo positivo; VAN = valor predictivo negativo; TPR = tasa de verdaderos positivos; TNR = tasa negativa verdadera; MCC = coeficiente de correlación de Matthew. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Fenotipo de estrabismo en tres modelos diferentes para detectar el estrabismo. Las dos filas superiores contienen el mismo animal representativo con cada condición (PBS o CGRP) en tres modelos diferentes para detectar el estrabismo. La fila inferior refleja los promedios de todos los animales. (A) Hubo una disminución en el área media de píxeles (área media total de píxeles/línea de base) en ratones tratados con CGRP frente a ratones tratados con PBS (t(18) = 2,805, p = 0,012) después de procesar todos los datos utilizando el modelo de estrabismo de área previamente publicado y validado¹⁴. (B) Hubo una respuesta similar en los datos puntuados manualmente (t(18) = 4,064, p = 0,0007). (C) Los ratones tratados con CGRP mostraron una menor distancia promedio de párpado a párpado (distancia euclidiana del tratamiento/distancia euclidiana previa al tratamiento, línea de base) que los ratones tratados con PBS (t(18) = 3.040, p = 0.007 cuando utilizaron DLC para procesar todos los datos. N = 20 (10 hembras, 10 machos). Las barras de error indican la media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Este protocolo proporciona un método detallado de fácil acceso para el uso de herramientas basadas en el aprendizaje automático que pueden diferenciar el estrabismo con una precisión casi humana mientras mantienen la misma (o mejor) resolución temporal de los enfoques anteriores. Principalmente, hace que la evaluación del estrabismo automatizado esté más disponible para un público más amplio. Nuestro nuevo método para evaluar el estrabismo automatizado tiene varias mejoras en comparación con los modelos anteriores. En primer lugar, proporciona una métrica más robusta que la ASM al utilizar menos puntos que realmente contribuyen a la cuantificación del estrabismo. Esto disminuye la probabilidad de falsos positivos y negativos al hacer que el análisis se base en menos puntos al generar los valores que denotan estrabismo. En otras palabras, el modelo DLC hace que cada punto alrededor del ojo sea necesario, pero no suficiente para la inclusión de un punto de tiempo. Esto nos permite filtrar datos subóptimos utilizando el mismo número de puntos que ASM sin tener que depender de la mayor variabilidad que proviene de depender de tantos puntos constituyentes. Además, redujimos el error humano potencial al diseñar modelos que no dependen completamente de la precisión de las personas capacitadas.

Al procesar los datos, descubrimos que nuestro método filtraba con precisión los puntos subóptimos y los puntos atípicos que eran más grandes de lo que era posible, dado el tamaño máximo del ojo del ratón (sección 10 del protocolo). Utilizamos macros que comprobaron si cada uno de los 10 puntos que rodeaban el ojo individualmente tenían un valor de probabilidad superior a 0,92 y filtramos los que estuvieran por debajo de ese valor. En el futuro, esto se puede ajustar para que los datos procesados sean más o menos selectivos. Las macros también filtraron cualquier valor de distancia euclidiana superior a 200 píxeles, ya que encontramos que la mayor distancia posible entre la parte superior e inferior del ojo era de 150 píxeles. Es posible que esto deba cambiar dependiendo de la configuración experimental. Si la cámara no está a la misma distancia del ojo, el valor máximo podría ser significativamente mayor o menor. La fuerza de estas macros es que nos permitieron extraer mediciones entre la parte superior e inferior del ojo de una manera que dependía de que el modelo informara una mayor probabilidad para todos los puntos constituyentes que rodean el ojo.

Tanto el DLC como el ASM están limitados en el sentido de que dependen de que el ratón esté en una posición fija a una distancia predeterminada de la cámara para permitir un escalado de aumento coherente entre las condiciones de referencia y de tratamiento. Por lo tanto, el movimiento del propio animal, la posición incorrecta dentro del aparato o un cambio en el procedimiento experimental comprometerían la capacidad del modelo para detectar el área total del ojo. Nuestro modelo mejora un poco estas limitaciones utilizando la distancia euclidiana, es decir, la distancia hacia arriba y hacia abajo de la longitud del ojo, lo que permite un mejor seguimiento a pesar de las diferencias en los ángulos de la cámara, el movimiento del animal y la variación experimental a lo largo de diferentes sesiones sin necesidad de una recalibración adicional. Sin embargo, reconocemos que las mejoras en la normalización para tener en cuenta el movimiento de la cabeza podrían resultar en un seguimiento aún mejor del estrabismo en los animales en movimiento.

Otra limitación de nuestro método es que filtraba los puntos donde la distancia euclidiana se acercaba a cero, denotando el cierre del ojo. A pesar de filtrar estos contribuyentes significativos al estrabismo, aún pudimos detectar una respuesta al estrabismo inducida por CGRP de manera más robusta que los métodos anteriores (p = 0,007). La eliminación de este componente del estrabismo se vuelve especialmente limitante cuando se trata de comparar con puntos de interés adicionales, como la actividad cerebral. Creemos que encontrar la importancia al eliminar esos puntos muestra la solidez de este método, pero reconocemos que la eliminación de estos componentes del estrabismo no es lo ideal. Los estudios futuros que utilicen este método deben incluir un mayor número de marcos atípicos para entrenar mejor a los modelos en el reconocimiento del estrabismo a medida que se acerca a cero. En general, el desarrollo de un método para rastrear de manera confiable el estrabismo automatizado puede permitir estudios destinados a asociar características importantes del comportamiento natural con su estado cerebral, lo que permite una investigación sólida de los perfiles de actividad cerebral, como en el contexto de la migraña.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de herramientas CUDA 11.8
cuDNN SDK 8.6.0
Ordenadores Intel con Windows 11, 13.ª generación
Módulo adicional LabFaceX 2D Eyelid Tracker para un mouse de itinerancia libre:	FaceX LLC	NA	Cualquier cámara que pueda grabar el ojo de un animal es suficiente, pero este es nuestro hardware de seguimiento ocular.
Controlador de GPU NVIDIA que es la versión 450.80.02 o superior
NVIDIA RTX A5500, 24 GB DDR6	NVIDIA	[490-BHXV]	Cualquier GPU que cumpla con los requisitos mínimos especificados para su versión de DLC, actualmente 8 GB, es suficiente. Utilizamos NVIDIA GeForce RTX 3080 Ti GPU
Python 3.9-3.11
TensorFlow versión 2.10