Utilización del ensayo de desplazamiento térmico para sondear la unión del sustrato a la selenoproteína O

Resumen

Aquí, presentamos el ensayo de cambio térmico, una técnica de alto rendimiento basada en fluorescencia que se utiliza para investigar la unión de moléculas pequeñas a proteínas de interés.

Resumen

Definir la importancia biológica de las proteínas con funciones desconocidas plantea un obstáculo importante en la comprensión de los procesos celulares. Aunque las predicciones bioinformáticas y estructurales han contribuido al estudio de proteínas desconocidas, las validaciones experimentales in vitro a menudo se ven obstaculizadas por las condiciones óptimas y los cofactores necesarios para la actividad bioquímica. La unión de cofactores no solo es esencial para la actividad de algunas enzimas, sino que también puede mejorar la estabilidad térmica de la proteína. Una aplicación práctica de este fenómeno radica en utilizar el cambio en la estabilidad térmica, medida por alteraciones en la temperatura de fusión de la proteína, para sondear la unión del ligando.

El ensayo de desplazamiento térmico (TSA) se puede utilizar para analizar la unión de diferentes ligandos a la proteína de interés o encontrar una condición estabilizadora para realizar experimentos como la cristalografía de rayos X. Aquí describiremos un protocolo para TSA que utiliza la pseudoquinasa, Selenoproteína O (SelO), para un método simple y de alto rendimiento para probar la unión de metales y nucleótidos. A diferencia de las quinasas canónicas, SelO se une a ATP en una orientación invertida para catalizar la transferencia de AMP a las cadenas laterales de hidroxilo de las proteínas en una modificación postraduccional conocida como ampilación de proteínas. Al aprovechar el cambio en las temperaturas de fusión, proporcionamos información crucial sobre las interacciones moleculares que subyacen a la función de SelO.

Introducción

Gran parte del proteoma humano sigue estando mal caracterizado. El "efecto farola" descrito por Dunham y Kustatscher et al. se refiere al fenómeno en el que las proteínas ampliamente investigadas reciben más atención, dejando de lado las proteínas poco estudiadas ^1,2. Los factores que contribuyen a este efecto incluyen la importancia biológica y la relevancia de la enfermedad de ciertas proteínas. Además, las investigaciones previas que ofrecen conocimientos fundamentales, así como la disponibilidad de herramientas para el análisis funcional, estimulan aún más la investigación sobre proteínas altamente estudiadas ^1,2. Proyectos como la Iniciativa de Proteínas Poco Estudiadas, el Consorcio de Genómica Estructural y la Iniciativa de Función Enzimática tienen como objetivo caracterizar proteínas poco estudiadas utilizando proteómica estructural y funcional ^2,3,4. Un enfoque complementario para identificar las funciones moleculares de las proteínas poco estudiadas es examinar las interacciones de estas proteínas con moléculas pequeñas para obtener información valiosa sobre la regulación y la especificidad del sustrato.

La unión de moléculas pequeñas puede aumentar la estabilidad térmica de una proteína⁵. Este fenómeno, conocido como estabilización de la conformación inducida por el ligando, a menudo resulta en un aumento en la temperatura de fusión de una proteína, proporcionando una indicación medible de la unión del ligando⁶. La estabilidad térmica de una proteína se puede medir utilizando fluorimetría diferencial de barrido (DSF), también conocida como termofluor, o ensayo de desplazamiento térmico (TSA)7,8,9,10. En la TSA, una muestra de proteína se somete a temperaturas crecientes en presencia de un colorante sensible al medio ambiente⁶. A medida que la proteína se despliega y se desnaturaliza, el colorante se une a las regiones hidrofóbicas expuestas de la proteína y emite fluorescencia. Los colorantes fluorescentes extrínsecos, o tintes sensibles al medio ambiente, carecen de fluorescencia intrínseca y, en cambio, emiten fluorescencia al interactuar con su molécula objetivo ^9,11,12. El colorante más utilizado, SYPRO Orange, ofrece varias ventajas, como una mayor estabilidad y una fluorescencia de fondo mínima ^8,9,12. En particular, SYPRO Orange es compatible con los sistemas de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) debido a sus longitudes de onda de excitación y emisión de alrededor de 470 nm y 570 nm, respectivamente. Esta característica única permite mediciones de alto rendimiento, precisas y sensibles que son compatibles con los sistemas de detección de fluorescencia comúnmente utilizados en los sistemas RT-PCR⁸.

La TSA es una herramienta versátil para investigar las interacciones de las proteínas con posibles cofactores o fármacos y para identificar las condiciones estabilizadoras de la cristalografía. Algunas de sus ventajas sobre otros métodos de cribado son su relativa simplicidad de configuración y alto rendimiento con placas de 96 o 384 pocillos 13,14,15. El desarrollo de esta técnica ha sido transformador para los estudios de descubrimiento de fármacos, ya que ofrece comodidad y permite el estudio de diversos aditivos como iones, ligandos y fármacos ^6,16. Además, la adaptabilidad de la TSA ha animado a los científicos a ampliar su utilidad, facilitando la medición de las afinidades de unión junto con los ensayos de cribado^17,18. La TSA es una herramienta eficaz en los estudios de biología estructural para identificar las condiciones que promueven la estabilización de la proteína de interés para la cristalización¹⁹. Por lo tanto, su flexibilidad y relativa facilidad han posicionado a la TSA como una técnica fundamental en la caracterización de proteínas. Aquí, usaremos TSA para analizar la unión de metales y nucleótidos a la pseudoquinasa poco estudiada, la selenoproteína O (SelO), como ejemplo.

Las quinasas son una de las familias de proteínas más atacadas en el descubrimiento de^{fármacos 20}. Se predice que aproximadamente el 10% de las quinasas humanas son inactivas y se denominan pseudoquinasas porque carecen de los residuos catalíticos clave necesarios para la catálisis^21,22. La selenoproteína O (SelO) es una pseudoquinasa conservada evolutivamente que carece del aspartato conservado en el motivo catalítico HRD²³. En los eucariotas, SelO se localiza en las mitocondrias y protege a las células del estrés oxidativo^24,25. Los análisis estructurales y bioquímicos muestran que SelO transfiere monofosfato de adenosina (AMP) del ATP a sustratos proteicos en una modificación postraduccional conocida como AMPilation²⁵. Estudios recientes indican que las enzimas que catalizan la AMPilación pueden unirse a nucleótidos alternativos como UTP in vitro^26,27. En particular, los estudios han demostrado que el homólogo SelO de Salmonella typhimurium cataliza la proteína UMPilación, o la transferencia de UMP, de una manera dependiente del manganeso²⁸. Teniendo en cuenta estas intrigantes observaciones, probamos la unión de SelO a ATP y UTP en presencia de magnesio y manganeso, sirviendo como un ejemplo representativo de las aplicaciones de TSA. El siguiente protocolo se puede adaptar fácilmente para optimizar y examinar las interacciones de otras proteínas y aditivos de interés.

Protocolo

1. Configuración experimental

1. Utilice un termociclador que pueda detectar fluorescencia, como un instrumento de RT-PCR, para realizar el protocolo descrito. Si utiliza SYPRO Orange, como se describe en este protocolo, utilice un modo de escaneo que permita la excitación en torno a los 470 nm y la detección de emisiones en torno a los 570 nm. Programe el termociclador para mantener la muestra a 20 °C durante 2 minutos, seguido de un aumento de la temperatura de 0,5 °C/1 min hasta 95 °C; medir la intensidad de fluorescencia cada 1 °C.
   NOTA: Recomendamos un paso opcional al final del ciclo para devolver el bloque de muestra a 20 °C (Figura 1).
2. Cada reacción contiene cuatro componentes: tampón, proteína de interés, aditivo y colorante fluorescente extrínseco. Diseñe el experimento para incluir controles como sin proteína, sin colorante, proteína sin aditivos y solo aditivos para determinar cualquier fluorescencia de fondo que pueda influir en la interpretación de los resultados. Si está disponible, incluya un control positivo, como un aditivo conocido por unirse y estabilizar la proteína de interés.
3. Utilice proteína purificada para el ensayo. Para seguir este ejemplo, utilice E. coli SelO, expresada y purificada como se describió anteriormente^25,29. Brevemente, exprese SelO marcado con His-sumo (E. coli SelO ppSumo) en células Rosetta DE3 y purifíquelo utilizando la afinidad de Ni²⁺-NTA. Escinda la etiqueta His-sumo con proteasa Ulp y purifique aún más el SelO mediante cromatografía de filtración en gel.
4. La fluorescencia de SYPRO Orange dependerá de su interacción con la proteína de interés. Dado que estas interacciones variarán de una proteína a otra, optimice la concentración de proteínas y colorantes para obtener la máxima relación entre la señal y el ruido de la señal de fluorescencia.
   NOTA: SYPRO Orange no es compatible con algunas proteínas y aditivos como los detergentes^11,30. Los colorantes extrínsecos adicionales enumerados en el ^{punto 12} pueden examinarse según sea necesario.

2. Determinación de la concentración óptima de colorante (Figura 2A)

1. Prepare diluciones de 20 μL de 50x, 40x, 30x, 20x y 10x SYPRO Orange a partir de la solución madre, que se proporciona a 5.000x en DMSO.
2. Dispensar 8 μL de proteína de 6,25 μM diluida en tampón TSA en seis pocillos separados de una placa de PCR de 384 pocillos.
   NOTA: En nuestro ejemplo, utilizamos el siguiente tampón TSA para realizar las diluciones: 10 mM Tris pH 8, 150 mM de NaCl y 1 mM de DTT. Las muestras se pueden analizar por triplicado para mejorar la fiabilidad de los resultados.
3. Agregue 1 μL de tampón TSA a cada pocillo.
   NOTA: Este volumen de tampón se reemplazará con la adición de moléculas pequeñas después de la optimización de la concentración de colorantes y proteínas.
4. Añada 1 μL de cada dilución en serie de la solución de colorante SYPRO Orange a cada pocillo. Añada 1 μL de tampón sin colorante al pocillo final para el control sin colorante.
5. Cubra la placa con una película adhesiva ópticamente transparente.
6. Gire brevemente la placa a 1.000 × g durante 1 min en una centrífuga equipada con un adaptador de placa PCR.
7. Coloque la placa en una máquina RT-PCR e inicie el protocolo de termociclado descrito en el paso 1.1.

3. Determinación de la concentración óptima de proteínas (Figura 2B)

1. Prepare 20 μL de diluciones en serie de 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM y 1,56 μM de proteína utilizando tampón TSA (10 mM Tris pH 8, 150 mM de NaCl y 1 mM de DTT).
2. Dispensar 8 μL de diluciones en serie de la proteína en cinco pocillos separados de una placa de 384 pocillos.
3. Dispense tampón solo en el^6º pozo como un control sin proteínas.
4. Agregue 1 μL de tampón TSA a cada pocillo.
   NOTA: Este volumen de tampón se reemplazará con la adición de moléculas pequeñas después de la optimización de la concentración de colorantes y proteínas.
5. Agregue 1 μL de cada solución de colorante SYPRO Orange 50x a cada pocillo.
6. Cubra la placa con una película adhesiva ópticamente transparente.
7. Gire brevemente la placa a 1.000 × g durante 1 min en una centrífuga equipada con un adaptador de placa PCR.
8. Coloque la placa en una máquina RT-PCR e inicie el protocolo de termociclado descrito en el paso 1.1.

4. Configuración de un experimento de TSA (Figura 3A)

NOTA: Después de la optimización de las concentraciones de proteínas y colorantes de naranja SYPRO, el ensayo se puede realizar con la adición de las moléculas pequeñas deseadas para analizar la unión.

1. Definir el número de condiciones considerando las réplicas y los controles adecuados.
   NOTA: Por ejemplo, probaremos la unión de SelO a ocho condiciones por triplicado. Incluyendo los controles (sin aditivo, sin proteína y sin colorante), tenemos 11 reacciones x 3 (triplicado) = 33 reacciones en total.
2. En función de la concentración óptima de proteína y colorante observada para SelO, asegúrese de que cada reacción contenga 8 μL de 6,25 μM de proteína, 1 μL de aditivo y 1 μL de colorante SYPRO Orange 50x para un total de 10 μL de volumen de reacción. Por lo tanto, la concentración final utilizada es de 5 μM de proteína y 5x colorante SYPRO Orange.
3. Prepare 288 μL de solución de proteína de 6,25 μM utilizando tampón TSA. Este volumen de solución de trabajo de proteínas representa 36 reacciones (33 reacciones con un 10% adicional para variaciones en el pipeteo).
4. Dispense 8 μL de proteína de 6,25 μM en pocillos separados de una placa de 384 pocillos. Dispense tampón solo para el control sin proteínas.
5. Agregue 1 μL de moléculas pequeñas a una concentración de 10x para lograr 1x final. Para seguir este ejemplo, agregue 1 μL de 20 mM MgCl₂ para lograr una concentración final de 2 mM. Dispense tampón solo para el control sin aditivos.
6. Agregue 1 μL de cada solución de colorante SYPRO Orange 50x a cada pocillo.
7. Cubra la placa con una película adhesiva ópticamente transparente.
8. Gire brevemente la placa a 1.000 × g durante 1 min en una centrífuga equipada con un adaptador de placa PCR.
9. Coloque la placa en una máquina RT-PCR e inicie el protocolo de termociclado descrito en el paso 1.1.

5. Análisis de datos

1. Exporte datos de la máquina RT-PCR para unidades de fluorescencia relativa (RFU) con respecto a la temperatura (°C).
2. Utilice el software de su elección para extraer y trazar puntos de datos hasta la intensidad más alta medida para cada curva de fusión. Es importante destacar que confirme que los controles sin proteínas y sin colorantes exhiben una fluorescencia de fondo baja sin aumentos de fluorescencia dependientes de la temperatura (Figura 3A, B y Tabla Suplementaria S1). Realice análisis de datos utilizando software de libre acceso como MoltenProt³¹ o DSFWorld³².
3. Determine la temperatura de fusión utilizando el ajuste sigmoidal de Boltzmann para los datos. La temperatura de fusión (T_m) se define como la temperatura a la que se observa un 50% de desnaturalización o la mitad de la intensidad máxima (Figura 3C).
4. Un cambio térmico en la curva de fusión puede sugerir aditivos estabilizadores o desestabilizadores. Para calcular el cambio de la temperatura de fusión (T_m), use la fórmula: T_m = T_m aditivo _- T_m tampón. Un valor positivo describe una condición estabilizadora o un aditivo que interactúa; un valor negativo describe una condición desestabilizadora (Figura 3D).

Resultados

El SelO eucariota consta de una secuencia de diana mitocondrial N-terminal, un dominio similar a la quinasa y una selenocisteína altamente conservada en el extremo C de la proteína²³. Esta enzima residente en las mitocondrias codifica un dominio pseudoquinasa que se conserva de las bacterias a los seres humanos²³. El análisis estructural del homólogo SelO de Pseudomonas syringae reveló alteraciones de aminoácidos en el sitio activo que facilitan la unión de ATP en orientación invertida en comparación con las quinasas canónicas²⁵. En consecuencia, SelO cataliza la ampilación, en lugar de la fosforilación, de múltiples proteínas involucradas en la señalización antioxidante para proteger a las células del daño oxidativo y la muerte celular²⁵. Además de la AMPilación, se ha demostrado que algunas AMPilasas procariotas y eucariotas catalizan la UMPilación^27,28.

Utilizamos E. coli SelO recombinante purificada en TSA para examinar la unión de los nucleótidos de ATP y UTP a SelO en presencia de cationes divalentes. Al igual que las quinasas canónicas, SelO alberga el motivo DFG en el que el aspartato se une al ion metálico para coordinar el nucleótido en el sitio activo. En primer lugar, optimizamos la concentración de proteína y colorante para mediciones de fluorescencia robustas en TSA, determinando que 5 μM a 10 μM de E. coli SelO era óptimo con 5x SYPRO Orange (Figura 2). Además, demostramos que la no proteína, así como los controles sin colorante, tenían una señal de fluorescencia baja que no respondía al aumento de temperatura. Detectamos aumentos de aproximadamente +4 °C y +12 °C en la estabilidad térmica de E. coli SelO en presencia de ATP-Mg²⁺ y ATP-Mn²⁺, respectivamente (Figura 3). Sin embargo, no observamos un cambio en la estabilidad térmica tras la incubación con UTP, lo que indica que E. coli SelO puede no exhibir una unión detectable a UTP.

Figura 1: Configuración del termociclador. Un ejemplo del programa de termociclador utilizado para aumentar la temperatura de la muestra en +0,5 °C/min mientras se mide la fluorescencia SYPRO Orange utilizando el canal FRET. La recomendación también incluye una incubación a temperatura ambiente al inicio y al final del protocolo. Abreviatura: FRET = Transferencia de energía de resonancia de Förster. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Optimización de las concentraciones de proteínas y colorantes. (A) Resultados representativos de la optimización de la concentración de colorante SYPRO Orange utilizando 5 μM de Escherichia coli SelO. (B) Resultados representativos de la optimización de la concentración de E. coli SelO utilizando 5x el colorante SYPRO Orange. La curva de desnaturalización térmica representa las unidades de fluorescencia relativas (eje y) con respecto a la temperatura (eje x). Los resultados representan la media ± SD de los pozos triplicados (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Curvas de desnaturalización térmica y análisis de Δ T_m de SelO en presencia de nucleótidos y cationes divalentes. (A) Datos brutos de las curvas de desnaturalización térmica de las muestras (5 μM de Escherichia coli SelO en presencia de 200 μM de ATP o UTP y 2 mM de cationes divalentes, 5x SYPRO Orange) exportados de la máquina RT-PCR y trazados. SelO ATP-Mg representa muestras con SelO, ATP y MgCl₂, SelO ATP-Mn representa muestras con SelO, ATP y MnCl₂, SelO UTP-Mg representa muestras con SelO, UTP y MgCl₂, SelO UTP-Mn representa muestras con SelO, UTP y MnCl₂. Tenga en cuenta que los controles sin colorante y sin proteínas exhiben una fluorescencia baja. Los resultados representan la media ± SD de los pozos triplicados (n = 3). (B) Curvas de desnaturalización térmica trazadas a la intensidad más alta y que se ajustan a la ecuación sigmoidal de Boltzmann. Aunque la desnaturalización térmica de SelO no se vio afectada por UTP, observamos un marcado cambio en la desnaturalización térmica en presencia de ATP (curvas moradas). Los resultados representan la media ± SD de los pozos triplicados (n = 3). (C) Histograma que representa los valores de T_m derivados del ajuste sigmoidal de Boltzmann de los datos representados en la Figura 3B. Los resultados representan la media ± SD de los pozos triplicados (n = 3). SelO 39,2 °C ± 0,085, SelO ATP-Mg 43,3 °C ± 0,133, SelO ATP-Mn 50,9 °C ± 0,085, SelO UTP-Mg 39,1 °C ± 0,056, SelO UTP-Mn 39,9 °C ± 0,087. (D) Histograma que representa el cambio en la temperatura de fusión ΔT_m (T_m aditivo_- T_m tampón). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla suplementaria S1: Ejemplo de datos para TSA de SelO en presencia de metales y nucleótidos. Hoja de cálculo de datos brutos exportados desde la máquina RT-PCR y datos procesados para eliminar valores después de la intensidad máxima de RFU como se describe en los pasos del protocolo 5.1 y 5.2. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El ensayo de desplazamiento térmico (TSA) sirve como un método eficiente para detectar las interacciones proteína-ligando, incluidas las que tienen cofactores e inhibidores. En este protocolo, utilizamos TSA para medir la unión de la pseudoquinasa SelO a nucleótidos y cationes divalentes. Nuestros hallazgos muestran que SelO exhibe una mayor estabilidad térmica en presencia de ATP y Mg²⁺/Mn²⁺. Esta observación se alinea con informes previos que indican que los homólogos de SelO de E. coli, S. cerevisiae y H. sapiens catalizan la transferencia de AMP de ATP a la cadena lateral de hidroxilo de los sustratos proteicos^25,29. Aunque TSA proporciona información valiosa sobre la unión de nucleótidos, es posible que no identifique el sustrato in vivo. Otras moléculas, además del sustrato, también pueden influir en la estabilidad térmica de una proteína. Para identificar con precisión un sustrato, se deben tener en cuenta factores como la concentración celular y la afinidad de unión. Sin embargo, la TSA es una excelente herramienta para examinar una gran variedad de condiciones, como la unión de moléculas pequeñas, utilizando la estabilización térmica como lectura.

La utilidad de TSA se extiende más allá de su aplicación en el análisis de la unión de moléculas pequeñas a sitios activos o reguladores de proteínas. La TSA ha contribuido significativamente a la caracterización biofísica de las proteínas al proporcionar condiciones estabilizadoras que hacen que la proteína sea más propicia para los experimentos de cristalografía. En particular, la TSA ofrece varias ventajas, como su sencilla configuración y sus capacidades de alto rendimiento mediante el uso de materiales de laboratorio comúnmente disponibles, como placas de PCR y máquinas de RT-PCR. Estas ventajas permiten probar numerosas condiciones que pueden no ser factibles o tan sencillas con otras técnicas. Múltiples estudios han utilizado TSA para medir la estabilidad térmica de proteínas recombinantes con una biblioteca de compuestos para determinar las condiciones óptimas para la cristalización de proteínas ^19,33.

Es necesario incluir controles adecuados para evitar interpretaciones erróneas de las curvas de fusión, ya que la autofluorescencia de las placas o los aditivos es una preocupación común. Es posible que TSA no sea adecuado para compuestos que exhiben autofluorescencia o apagan la fluorescencia de la naranja SYPRO. Una posible solución es seleccionar los tintes alternativos descritos en el ^{punto 12}. El protocolo TSA descrito aquí se puede adaptar fácilmente para otras proteínas y aditivos de interés. Los aditivos no se limitan únicamente a compuestos solubles en agua, como se demuestra en nuestro protocolo con nucleótidos y cationes divalentes. En cambio, los aditivos pueden abarcar una amplia gama de condiciones, como la variación del pH, los ligandos o los fármacos solubilizados en DMSO⁸. Además, la preincubación del ligando con la proteína puede proporcionar resultados más reproducibles al reducir la interferencia y los artefactos del colorante. Los aditivos como los lípidos y los detergentes pueden provocar una alta fluorescencia debido a sus interacciones con SYPRO Orange. Un ejemplo de una curva de desnaturalización se muestra en la Figura 3A , que representa una baja fluorescencia de fondo combinada con un aumento significativo de la fluorescencia tras la desnaturalización térmica de la proteína. La concentración óptima de colorante y proteína producirá la máxima relación señal-ruido, al tiempo que mantendrá una señal de fluorescencia constante en todas las réplicas.

TSA ofrece la ventaja de la simplicidad con sus componentes mínimos, reduciendo así el número de variables para la optimización. Los pasos críticos incluyen la determinación de las concentraciones óptimas tanto del colorante como de la proteína. Es importante tener en cuenta que la TSA requiere proteínas purificadas y de "buen comportamiento". La proteína y el aditivo deben ser estables en el tampón a las concentraciones utilizadas en la TSA. Las proteínas o afecciones que son propensas a la agregación u oligomerización pueden dar lugar a lecturas de fluorescencia erróneas. Las proteínas agregadas o desplegadas pueden exhibir una alta fluorescencia inicialmente con solo un pequeño aumento tras la desnaturalización. La oligomerización de las proteínas también puede dar lugar a múltiples estados de transición, lo que complica el análisis¹⁰. La concentración de proteína se puede ajustar para evitar la agregación.

TSA es compatible con una amplia gama de tampones y sales, lo que permite optimizar las condiciones de estabilización de la proteína y el aditivo¹¹. Los volúmenes de las soluciones de proteínas y aditivos pueden ajustarse para superar las limitaciones de las concentraciones de proteínas y aditivos. Por ejemplo, se podrían usar concentraciones más bajas de aditivo, como 5x, en lugar de la solución 10x utilizada en los resultados representativos. En particular, la cantidad relativa de proteína y aditivo necesaria para realizar el ensayo es baja, ya que las placas de PCR de 384 pocillos pueden acomodar volúmenes tan bajos como 10 μL de muestra total.

Dadas las fortalezas de TSA, es ideal para investigar proteínas poco estudiadas, como las pseudoquinasas. Las pseudoenzimas son proteínas catalíticamente inactivas que son estructuralmente homólogas a las enzimas activas³⁴. Estudios estructurales y bioquímicos recientes demostraron que algunas pseudoenzimas son enzimas activas, mientras que la mayoría tienen funciones no catalíticas^35,36. Aunque catalíticamente inactivas, las pseudoenzimas están implicadas en diversas enfermedades y desempeñan funciones importantes, como el andamiaje y la modulación alostérica³⁷. Sin embargo, se desconoce el mecanismo de acción y la importancia funcional de muchas pseudoenzimas. Las actividades de algunas pseudoenzimas están reguladas por la unión de ligandos, lo que da como resultado una mayor estabilidad térmica que se asocia con cambios conformacionales de la proteína¹⁴. Proponemos que TSA es una herramienta valiosa para examinar la unión de ligandos a pseudoenzimas para determinar el ligando óptimo para la actividad funcional.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Adenosina 5′-trifosfato sódico sal disódica hidrato	Sigma Aldrich	A2383-10G	se utiliza para obtener resultados representativos, pero no es necesario para realizar TSA
Avanti J-15R con conjunto de portador de microplacas	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 Sistema de PCR en tiempo real	Bio-Rad	12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plateas, pared delgada, con faldón, transparente/blanco	Cloruro de magnesio Bio-Rad	HSP3805
	Sigma Aldrich	M8266-100G	utilizado para resultados representativos, pero no requerido para realizar TSA
Cloruro de manganeso (II) tetrahidratado	Sigma Aldrich	M3634-500G	utilizado para resultados representativos pero no requerido para realizar TSA
Microseal 'B' Placa de sellado PCR Película, adhesivo, óptico	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO Tinción de gel de proteína de naranja	Sigma Aldrich	S5692-500UL
Uridina 5′-trifosfato sal trisódica hidrato	Sigma Aldrich	U6625-100MG	utilizado para resultados representativos pero no requerido para realizar TSA