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Artículo de método

Desarrollo y aplicación de tirosina fosfatasas reguladas por rapamicina

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DOI:

10.3791/67142

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6 de septiembre de 2024

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Regenerative Medicine, University of Illinois at Chicago

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el diseño, la creación y la aplicación de las fosfatasas reguladas por rapamicina. Este método proporciona una alta especificidad y un estricto control temporal de la activación de la fosfatasa en las células vivas.

Resumen

Las tirosina fosfatasas son una familia importante de enzimas que regulan funciones fisiológicas críticas. A menudo están desregulados en las enfermedades humanas, lo que los convierte en objetivos clave de los estudios biológicos. Las herramientas que permiten la regulación de la actividad de la fosfatasa son fundamentales en la disección de su función. Los enfoques tradicionales, como la sobreexpresión de mutantes negativos constitutivamente activos o dominantes, o la regulación negativa mediante siRNA, carecen de control temporal. Los inhibidores de la fosfatasa a menudo tienen poca especificidad y solo permiten a los investigadores determinar qué procesos se ven afectados por la inhibición de la fosfatasa.

Desarrollamos un enfoque quimiogenético, el sistema regulado por rapamicina (RapR), que permite la regulación alostérica de un dominio catalítico de fosfatasa que permite un control temporal estricto de la activación de la fosfatasa. El sistema RapR consiste en un dominio iFKBP insertado en un sitio alostérico en la fosfatasa. La dinámica estructural intrínseca del dominio RapR interrumpe el dominio catalítico, lo que lleva a la inactivación de la enzima. La adición de rapamicina media la formación de un complejo entre iFKBP y una proteína FRB coexpresada, que estabiliza la iFKBP y restaura la actividad del dominio catalítico de la fosfatasa.

Este sistema proporciona una alta especificidad y un estricto control temporal de la activación de la fosfatasa en las células vivas. Las capacidades únicas de este sistema permiten la identificación de eventos transitorios y la interrogación de vías de señalización individuales aguas abajo de una fosfatasa. Este protocolo describe las pautas para el desarrollo de una RapR-fosfatasa, su caracterización bioquímica y el análisis de sus efectos sobre la señalización y regulación posteriores de la morfodinámica celular. También proporciona una descripción detallada de una estrategia de ingeniería de proteínas, ensayos in vitro que analizan la actividad de la fosfatasa y experimentos de imágenes de células vivas que identifican cambios en la morfología celular.

Introducción

Las proteínas tirosina fosfatasas son una familia crítica de proteínas involucradas en una gran cantidad de eventos de señalización celular. Se ha demostrado que desempeñan un papel clave en la regulación de la proliferación, migración y apoptosis celular 1,2,3. En consecuencia, la desregulación de la proteína tirosina fosfatasas conduce a una variedad de enfermedades y trastornos debilitantes 4,5,6,7. El estudio de la función fisiológica de las tirosina fosfatasas y su papel en el desarrollo de estas patologías se ha visto históricamente obstaculizado por la falta de herramientas necesarias para investigar las complejidades de la señalización de la fosfatasa8.

Tradicionalmente, las fosfatasas se estudian utilizando métodos que no tienen la especificidad deseada y/o no proporcionan un control temporal de su actividad. Estas limitaciones críticas de las herramientas disponibles dificultan la disección de las funciones específicas de las fosfatasas en las vías de señalización. La sobreexpresión de mutantes negativos constitutivamente activos y dominantes o la regulación a la baja de la expresión de la fosfatasa proporcionan especificidad, pero carecen de control temporal y, a menudo, pueden desencadenar mecanismos compensatorios que enmascararán la verdadera función de la enzima.

Los inhibidores farmacológicos permiten la regulación temporal de las fosfatasas. Sin embargo, muchos inhibidores de la fosfatasa son notoriamente inespecíficos debido a la composición bien conservada del sitio activo en las tirosina fosfatasas9. Además, debido a las limitaciones de diseño, los inhibidores dirigidos al sitio catalítico exhiben una permeabilidad deficiente de la membrana celular10. Otra limitación de los inhibidores es que solo permiten examinar los efectos de la inactivación de la fosfatasa11. Por lo tanto, existe la necesidad de herramientas que permitan la activación específica y regulable temporalmente de las fosfatasas. Estas herramientas permitirán a los investigadores identificar los efectos directos de la activación de la fosfatasa, separándolos de múltiples cascadas de señalización paralelas a menudo activadas por estímulos biológicos. Es importante destacar que el estricto control temporal de la actividad permite la identificación de eventos transitorios inducidos por una fosfatasa y separa los efectos de la actividad aguda y prolongada de la fosfatasa. La combinación de la regulación temporal con el análisis mutacional permitirá una disección detallada de las funciones específicas de los dominios individuales de la fosfatasa y la interrogación de su señalización posterior12.

Para hacer frente a la falta de capacidades deseadas en las herramientas existentes, el grupo Karginov ha desarrollado el sistema Rapamicina Regulado (RapR) 13,14,15. El sistema RapR utiliza un dominio de conmutación diseñado, iFKBP, que permite la regulación alostérica de la proteína de interés (POI). La inserción del dominio iFKBP en una posición acoplada alostéricamente al sitio catalítico del POI lo hace susceptible a la regulación por rapamicina. En ausencia de rapamicina, iFKBP interrumpe el sitio catalítico debido a la dinámica estructural intrínsecamente alta de iFKBP y, por lo tanto, inactiva el POI. La adición de rapamicina induce la interacción de iFKBP con la proteína FRB coexpresada (Figura 1). Esto provoca la estabilización del dominio del interruptor, lo que en consecuencia restaura la estructura y la función del dominio catalítico del POI. Como tal, la herramienta permite la activación específica y regulable temporalmente del POI.

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Figura 1: Esquema del sistema regulado por rapamicina RapR-Shp2. RapR permite la activación alostérica de la proteína de interés con la adición de rapamicina. Esta figura fue modificada de Fauser et al.12. Abreviaturas: iFKBP = FKBP12 insertable; FRB = dominio de unión a FKBP-rapamicina; R = rapamicina; Shp2 = Proteína tirosina fosfatasa que contiene el dominio Src homología-2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La herramienta RapR se puede aplicar a diferentes familias de proteínas. Se puede utilizar para regular las proteínas quinasas, así como las fosfatasas12,14. Este protocolo se centrará en la aplicación de la herramienta RapR para el control de la fosfatasa Shp2. Shp2 es una proteína tirosina fosfatasa de expresión ubicua que está involucrada en procesos de señalización como la proliferación, migración, inmunomodulación y diferenciación 1,16,17,18. La desregulación de Shp2 se ha asociado con una serie de cánceres sólidos, leucemia mieloide y trastornos del desarrollo 5,7. Sin embargo, Shp2 ha sido víctima de las mismas deficiencias de la herramienta descritas anteriormente. Para combatir estas limitaciones, se desarrolló y caracterizó RapR-Shp2, un constructo Shp2 específica y temporalmente regulable12.

Antes del desarrollo de RapR-Shp2, se sabía que Shp2 estaba involucrado en la migración celular 19,20,21. Sin embargo, se desconocía su papel específico en la señalización involucrada en este proceso. También se desconocía en qué escala de tiempo Shp2 regula la migración de las células y qué cambios morfodinámicos específicos induce en diferentes momentos de su activación. Además, no estaba claro si la activación aguda y prolongada de Shp2 causará efectos diferentes. Usando RapR-Shp2, se encontró que la activación aguda de Shp2 induce la diseminación celular transitoria, un aumento en las protuberancias, polarización celular y migración. También se identificaron vías específicas aguas abajo de Shp2 que regulan distintos cambios morfodinámicos12. Este protocolo proporciona detalles para el diseño y la caracterización de RapR-Shp2, que se pueden utilizar para guiar el desarrollo y la aplicación de otras fosfatasas de RapR.

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Protocolo

1. Diseño de RapR-fosfatasas

  1. Planificación
    NOTA: Usando RapR-Shp2 como ejemplo, este protocolo detalla los pasos importantes para crear una tirosina fosfatasa regulada por rapamicina. El protocolo descrito está optimizado para Shp2 y es posible que se necesiten modificaciones adicionales para adaptarse a las propiedades específicas de las fosfatasas individuales.
    1. Para asegurar que la actividad catalítica de Shp2 esté puramente controlada por la rapamicina y no por mecanismos endógenos, introduzca una mutación en la fosfatasa para mantenerla en una conformación constitutivamente activa. En el caso de Shp2, introduzca la mutación D61A.
      NOTA: Si no se introduce una mutación activadora para una PTPasa específica, entonces su variante RapR funcionará como un sistema activado por AND regulado por señales endógenas y rapamicina.
    2. Identificar los sitios de inserción de iFKBP en el dominio catalítico de la fosfatasa utilizando la estructura cristalina para guiar la selección como se describió anteriormente13. Si no se dispone de una estructura, se debe realizar la alineación de la secuencia de aminoácidos con el dominio catalítico de la fosfatasa Shp2 para identificar los sitios de inserción (Figura 2A). Asegúrese de que el sitio de inserción esté ubicado en un bucle flexible que esté acoplado estructuralmente a la bolsa catalítica pero colocada lejos de la bolsa para evitar obstáculos estéricos de la unión del sustrato por parte de iFKBP.
      NOTA: Más detalles de la inserción se discuten en la Discusión.
    3. Considere el tipo de secuencia de enlace que se utilizará entre el dominio iFKBP insertado y la fosfatasa de interés. La elección de la secuencia óptima del enlazador es extremadamente importante para el éxito de la herramienta RapR y se analiza más a fondo en la Discusión (Figura 2B).

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Figura 2: Esquema de las consideraciones al diseñar la RapR-fosfatasa. (A) Alineación de Shp2 (morado), PTP1B (verde) y PTP-PEST (rosa) con los sitios de inserción conservados resaltados. (B) Representación de la inserción del enlazador entre Shp2 e iFKBP. (C) Dominio fosfatasa de Shp2 en color beige con sitios de inserción indicados en azul. Esta figura fue modificada de Fauser et al.12. Abreviaturas: Shp2 = proteína tirosina fosfatasa que contiene el dominio Src homología-2; iFKBP = FKBP12 insertable; PTP = proteína tirosina fosfatasa; RapR = Regulado por rapamicina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Creación de la RapR-fosfatasa

  1. Inserción de iFKBP en la fosfatasa de interés mediante mutagénesis dirigida al sitio modificada
    1. Genere un "megaprimer" de codificación iFKBP a través de PCR.
      1. Diseñe cebadores para la síntesis de "megacebadores" que contengan 20-25 nucleótidos recocidos en el extremo 5' o 3' de iFKPB, una secuencia de enlace que conectará iFKPB con la fosfatasa de interés, y 28-32 nucleótidos correspondientes al sitio de inserción (Figura 3). Confirme que el producto resultante contiene el iFKPB flanqueado por fragmentos de recocido antes y después del sitio de inserción en la fosfatasa de interés.
      2. Sintetice el iFKBP que contiene "megaprimer" mediante PCR (10 μL de tampón polimerasa 5x, 1 μL de ADN molde de 50 ng/μL que contiene iFKBP, 2 μL de dNTP de 10 mM, 0,5 μL de un stock de 100 μM de cada cebador "megaprimer" [avance y retroceso], 35 μL de agua, 1 μL de ADN polimerasa). Divida esta reacción de PCR en 2 reacciones separadas de 25 μL antes de ejecutar la PCR. Ejecute el ciclo de PCR de acuerdo con las recomendaciones del fabricante de la ADN polimerasa o el siguiente ciclo de PCR estándar: (i) 98 °C durante 2 min, (ii) 98 °C durante 30 s, (iii) 55-70 °C durante 30 s, (iv) 72 °C durante 30 s, (v) repita los pasos ii-iv 25x, (vi) 72 °C durante 2 min.
      3. Purificar el "megaprimer" mediante electroforesis en gel de agarosa. Cargue el contenido de PCR del paso anterior en un gel de agarosa al 1% y aplique 120 V durante aproximadamente 30 min. Busque el "megaprimer" de 400 nucleótidos de largo en el gel, extirpe el fragmento y purifique con un kit de extracción en gel (consulte la Tabla de materiales).
        NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
    2. Mutagénesis dirigida al sitio modificada
      1. Prepare la reacción de mutagénesis dirigida al sitio modificado utilizando un plásmido que contenga el gen de la fosfatasa de interés como molde (5 μL de tampón polimerasa 5x, 2 μL de plantilla de 50 ng/μL, 2 μL de dNTP de 10 mM, 10 μL de "megaprimer" extraído, 2,5 μL de agua, 2,5 μL de DMSO, 1 μL de ADN polimerasa).
        NOTA: La adición de DMSO en la mezcla de reacción reduce la temperatura de recocido22.
      2. Ejecute el siguiente ciclo de PCR: paso inicial de desnaturalización a 98 °C durante 3 min, seguido de 18 ciclos de pasos consecutivos de incubación a 98 °C durante 30 s, 65 °C durante 20 s, 60 °C durante 20 s, 55 °C durante 20 s, 50 °C durante 20 s, 72 °C durante 18 min. Ejecute el ciclo durante la noche (el tiempo de ciclo es de 7 h). Una vez finalizado el ciclo, almacene la reacción PCR a 4 °C.
        NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
      3. Una vez finalizado el ciclo, añadir 1 μL de enzima DpnI e incubar a 37 °C durante 1 h.
        NOTA: DpnI digerirá la plantilla residual, aumentando el rendimiento del producto recién sintetizado.
      4. Transformar el producto digerido en DH5α células competentes siguiendo las instrucciones del fabricante. Plaqueta la transformación en placas de agar LB con el antibiótico adecuado para la selección (carbenicilina para la construcción pcDNA RapR-Shp2). Incubar a 37 °C durante la noche. Una vez que las colonias hayan crecido, almacene las placas LB a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
        NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
  2. Aislamiento de la construcción de ADN deseada que contiene RapR-fosfatasa
    1. Realizar un cribado PCR de colonias bacterianas23. Como no todas las colonias cultivadas en una placa LB contendrán el plásmido deseado, asegúrese de realizar una criba antes del aislamiento del ADN plasmídico.
      NOTA: Utilice cebadores para la pantalla que se recocen en la plantilla y en el gen iFKBP. El cribado se puede realizar utilizando la mezcla maestra de polimerasa Taq (ver Tabla de Materiales).
    2. Una vez identificadas las colonias positivas, inocular una colonia positiva en 3 mL de caldo LB que incluya el antibiótico adecuado, incubar y agitar a 37 °C durante la noche.
    3. Extraiga el ADN plasmídico del cultivo líquido siguiendo las instrucciones del fabricante para el kit de extracción de ADN plasmídico (consulte la tabla de materiales)
      NOTA: Se recomienda secuenciar la construcción RapR PTPasa recién creada antes de continuar con la evaluación in vitro .

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Figura 3: Esquema del diseño del cebador y la estrategia modificada de clonación de mutagénesis dirigida al sitio. El paso 1 es la síntesis del iFKBP que contiene "megacebador" con "extremos pegajosos" recocidos hasta el sitio de inserción de la fosfatasa de interés, y el paso 2 es la inserción del "megacebador" en la fosfatasa de interés. Esta figura fue modificada a partir de Karginov et al.13. Abreviatura: iFKBP = FKBP12 insertable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Evaluación de la RapR-PTPasa mediante ensayo de actividad in vitro

NOTA: Este protocolo se utiliza para evaluar la regulación de la actividad de la RapR-PTPasa modificada. A continuación se describe el análisis de Shp2 inmunoprecipitado utilizando como sustrato un fragmento N-terminal fosforilado de paxilina. Es posible que sea necesario seleccionar un sustrato diferente para una PTPasa específica de interés.

  1. Día 1
    1. Placa de 800.000 HEK293T células/pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos en medio DMEM suplementada con suplemento de L-glutamina (concentración final de 2 mM) y 10% de FBS por volumen. Colocar en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante la noche.
  2. Día 2
    1. Una vez que las celdas estén ~60-80% confluentes, transfecte de acuerdo con el protocolo preferido del fabricante del regente de transfección (consulte la Tabla de materiales).
      1. Ejemplo de un protocolo de transfección: Añadir 1 μg de ADN plasmídico (pcDNA-mCherry-FRB y pcDNA-flag-RapR-Shp2, cada uno) a 200 μL de DMEM sin suero y 6 μL de reactivo de transfección e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 15 min. Añadir 100 μL de mezcla de transfección por pocillo de células. Incluir muestras transfectadas con constructos negativos de Shp2 constitutivamente activos y dominantes como controles. Incubar durante la noche en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2 .
  3. Día 3
    1. Preparación de la proteína-G sefarorosa
      NOTA: Prepare las puntas de pipeta cortadas antes de manipular Sepharose. Las puntas de corte deben usarse en cada paso donde se manipule Sepharose. La sepharose debe resuspenderse completamente en cada paso antes del pipeteo.
      1. Vuelva a suspender y tome la cantidad adecuada de proteína-G sefarorosa en un tubo de 1,5 ml. Para cada pocillo en una placa de 6 pocillos, use 10 μL de proteína-G Sepharose. Para una placa completa de 6 pocillos, use 60 μL de Sepharose.
      2. Lave la Sepharose con 1 mL de tampón de lisis (ver Tabla de Materiales). Microcentrífuga durante 1 min a 2.000 × g y retire con cuidado el tampón de lisis. Repita 2 veces.
      3. Vuelva a suspender la sefarosa en 380 μL de tampón de lisis. Añadir BSA a una concentración final de 1 mg/mL y anticuerpo (0,5 μL por cada muestra IP, anticuerpo anti-bandera [ver Tabla de Materiales]). Invertir en un rotador a 4 °C durante 1,5 h.
        NOTA: La cantidad óptima de anticuerpo debe determinarse experimentalmente para cada anticuerpo utilizado.
    2. Preparar las células para la inmunoprecipitación.
      1. Añadir una cantidad adecuada de rapamicina (1 mM de solución madre en etanol) a una concentración final de 1 μM o añadir el mismo volumen de etanol (control negativo) a las muestras. Incubar durante 1 h en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2 .
      2. Coloque la placa de 6 pocillos con celdas en hielo y lave suavemente las celdas con 3 ml de PBS frío. Aspire el PBS y agregue 300 μL de tampón de lisis (con 1 μM de rapamicina para la muestra de fosfatasa activada o un volumen equivalente de etanol en la muestra de control negativo) y raspe con un raspador de células. Transfiera las muestras a tubos de 1,5 ml y microcentrífuga durante 10 min a 1.000 × g a 4 °C.
      3. Transfiera 20 μL del sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mL para comprobar los niveles de expresión. Añadir 20 μL de tampón Laemmli 2x con un 5% de β-mercaptoetanol a cada tubo que se utilizará para comprobar la expresión e incubar a 95-100 °C durante 5 min. Utilice el sobrenadante restante para la inmunoprecipitación en el paso 3.3.3.3.
    3. Inmunoprecipitación de RapR-Shp2
      1. Lavar la proteína-G sefarorosa del paso 3.3.1.3. con 1 mL de tampón de lisis. Microcentrífuga durante 1 min a 2.000 × g a 4 °C cada vez y aspire cuidadosamente el tampón de lisis. Repita este paso 2 veces.
      2. Con las puntas de corte, vuelva a suspender la sefarosa en el tampón de lisis (50 μL por muestra, por lo tanto, para una placa de 6 pocillos, vuelva a suspender en 300 μl de tampón de lisis). Pipetear 50 μL de la mezcla de Sepharose en suspensión en un tubo nuevo de 1,5 mL por separado para cada muestra.
        NOTA: Habrá sefarosa resuspendida en la solución tampón de lisis sobrante debido al volumen de la Sepharose.
      3. Añada el sobrenadante restante de las células preparadas del paso 3.3.2.3 en cada tubo de Sepharose. Gire a 4 °C durante 1,5-2 h.
    4. Ensayo de actividad de la fosfatasa
      NOTA: El sustrato de Shp2 debe prepararse fosforilando un fragmento N-terminal purificado de paxilina utilizando cinasa Src constitutivamente activa siguiendo el protocolo de reacción de quinasa12 descrito anteriormente.
      1. Hacia el final del paso 3.3.3.3, prepare la solución de fosfotaxilina. Por muestra, agregue la solución de fosfopaxilina (concentración final de 3 μg/mL) a 40 μL de tampón de imidazol total (consulte la tabla de materiales). Añadir rapamicina a la concentración final de 1 μM a la alícuota de la solución de fosfopaxilina para muestras de RapR-Shp2 activadas y un volumen equivalente de etanol a la solución para muestras no activadas.
      2. Ajuste el agitador de calor a 32 °C.
        NOTA: Otras fosfatasas pueden necesitar una temperatura diferente para una actividad óptima.
      3. Lavar Sepharose con las muestras del paso 3.3.3.3 2x con 0,5 mL de tampón de lisis (ver Tabla de Materiales). Lave las muestras 2 veces con 0,5 ml de tampón de lavado. Cada tampón debe tener rapamicina a 1 μM para las muestras activadas o un volumen equivalente de etanol para las muestras no activadas. Retire la mayor cantidad posible de tampón después del lavado final.
        NOTA: Una vez alcanzado este paso, puede ser útil utilizar una pipeta para eliminar las cantidades finales de tampón lentamente y con cuidado para asegurarse de que no se aspire nada de la Sepharose. Cualquier tampón sobrante influirá en la concentración de fosfopaxilina y dará lugar a una lectura inexacta.
      4. Añadir 40 μL de la mezcla preparada de tampón de fosfo-paxilina imidazol a cada muestra, con o sin rapamicina (dependiendo de la muestra). Agitar muy suavemente para mezclar y colocar inmediatamente en el agitador de calentamiento e incubar durante 40 min a 32 °C. Ajuste el agitador de calentamiento a un mínimo de 1.000 rpm para asegurarse de que la muestra esté completamente agitada durante la incubación.
      5. Detenga la reacción añadiendo 40 μL de 2x Tampón Laemmli a cada muestra. Incubar las muestras a 95-100 °C durante 5 min. Enfríe las muestras.
      6. Cargue 15 μL de cada muestra (incluidas las muestras de lisado del paso 3.3.2.3.) en un gel de poliacrilamida SDS con un gradiente del 4-15% y ejecute un protocolo estándar de Western blot utilizando membranas de PVDF.
      7. Transferencia con un anticuerpo anti-Flag para detectar la construcción RapR-Shp2, anti-mCherry para detectar mCherry-FRB y anti-pY118 o anti-pY31 paxilina para detectar la fosforilación de paxilina.
        NOTA: Las manchas occidentales resultantes deben tener un aspecto similar al de la Figura 4.

4. Análisis de la actividad de RapR-Shp2 en células vivas

NOTA: Este protocolo se utiliza para determinar la capacidad de RapR-Shp2 para desfosforilar sustratos endógenos e inducir la señalización posterior. Otras RapR-PTPasas requerirán un análisis de sus sustratos y vías específicas.

  1. Día 1
    1. Placa de 198.000 células A431/pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos en medio DMEM suplementada con 10% de FBS y L-glutamina (concentración final de 2 mM). Colocar en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante la noche.
  2. Día 2
    1. Infecte las células con construcciones adenovirales que expresan RapR-Shp2 y FRB agregando el adenovirus directamente a los medios que ya están en la placa. Deje el adenovirus en las células en una incubadora a 37 °C y 5% deCO2 durante la noche. Utilice las células infectadas con FRB solo como control negativo.
      NOTA: Las cantidades de adenovirus deberán determinarse caso por caso, dependiendo del título.
  3. Día 3
    1. Prive a las células A431 incubándolas en DMEM con 0,5% de FBS durante 4 h antes del experimento.
    2. Agregue rapamicina a una concentración final de 1 μM o el mismo volumen de etanol (control negativo) a las células durante 2-4 h.
      NOTA: La incubación podría ser diferente para otras fosfatasas.
    3. Coloque la placa de 6 pocillos con celdas en hielo y lave suavemente las celdas con 3 ml de PBS frío. Aspire el PBS, agregue 300 μL de tampón de lisis (consulte la tabla de materiales) y raspe vigorosamente con un raspador de células. Transfiera las muestras a tubos de 1,5 ml y microcentrífuga durante 5 min a 2.000 × g a 4 °C.
    4. Transfiera 250 μL de cada muestra a un nuevo tubo de 1,5 mL. Añadir 250 μL de tampón Laemmli 2x con β-mercaptoetanol al 5% e incubar a 95-100 °C durante 5 min.
    5. Cargue 25 μl de cada muestra en un gel SDS-PAGE con un gradiente del 4 al 15 % y ejecute un protocolo estándar de Western blot con membranas de PVDF.
    6. Evalúe la desfosforilación mediada por RapR-Shp2 de EGFR y PLCγ utilizando anticuerpos anti-pY992 EGFR y anti-pY783 PLCγ. Evaluar la activación aguas abajo de la quinasa MAP Erk1/2 evaluando su fosforilación en los residuos pT202/pY204.
      NOTA: Las manchas occidentales resultantes deben tener un aspecto similar al de la Figura 5.

5. Análisis de los cambios morfodinámicos inducidos por la activación de RapR-Shp2 en células HeLa mediante imágenes de células vivas

NOTA: Este protocolo se utiliza para determinar el efecto de la activación de RapR-Shp2 en la formación de protuberancias celulares, la propagación celular y la migración.

  1. Día 1
    1. Coloque 700.000 células HeLa en una placa de cultivo celular de 35 mm y colóquelas en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2 . Deje que las células se adhieran al plato (~2-3 h).
    2. Transfecte las células de acuerdo con el protocolo preferido del fabricante del reactivo de transfección (consulte la tabla de materiales).
      1. Ejemplo de protocolo de transfección: Añadir 0,5 μg de ADN (plásmidos pcDNA-mCherry-FRB y pcDNA-Venus-RapR-Shp2, cada uno) a 100 μL de DMEM sin suero y 6 μL de reactivo de transfección. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min. Añadir la mezcla de transfección a las células e incubar durante la noche en una incubadora a 37 °C y 5% deCO2 . Utilice las células transfectadas con pcDNA-mCherry-FRB solo como control negativo.
    3. Cubra un cubreobjetos de vidrio redondo de 25 mm #1.5 de 25 mm con fibronectina (5 mg/L) incubando durante 1 h a 37 °C.
  2. Día 2
    1. Lave el cubreobjetos de vidrio recubierto con PBS.
    2. Coloque las células HeLa transfectadas en el cubreobjetos de vidrio recubierto en medios DMEM suplementados con 10% de FBS y L-glutamina (concentración final de 2 mM) para lograr una confluencia del 30% 4 h antes de la toma de imágenes.
    3. Dos horas después del enchapado, cambie suavemente el medio de la placa por el medio Leibovitz L-15 sin suero precalentado durante 2 h.
    4. Teñir las células con la tinción de membrana plasmática CellMask Deep Red de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    5. Coloque el cubreobjetos en una cámara de células de imagen limpia (consulte la Tabla de materiales). Agregue 1 mL de medio L-15 precalentado y cubra con 1 mL de aceite mineral precalentado para evitar la evaporación. Mantenga la cámara a 37 °C hasta la obtención de imágenes.
    6. Visualice las celdas a 37 °C utilizando una platina calentada.
      1. Seleccione los canales adecuados para la obtención de imágenes de la construcción RapR y CellMask para la obtención de imágenes de epifluorescencia. Para seguir este protocolo, utilice el objetivo 40x al que se hace referencia (consulte la Tabla de materiales) y los siguientes conjuntos de filtros: filtros de excitación 514/10 y de emisión 540/21 para imágenes de Venus-RapR-Shp2, filtros de excitación 561/10 y de emisión 595/40 para imágenes de mCherry-FRB, y filtros de excitación 640/20 y de emisión 655LP para imágenes de CellMask Deep Red. Utilice un espejo policromático multibanda para todos los canales fluorescentes (ver Tabla de Materiales).
      2. Captura imágenes cada 2 minutos durante 4-4,5 h.
        NOTA: Los cambios morfodinámicos más rápidos requerirán una adquisición más frecuente.
      3. Después de 1 hora de toma de imágenes, agregue rapamicina hasta una concentración final de 1 μM para estimular RapR-Shp2.

6. Análisis de imágenes

NOTA: Este protocolo describirá la creación de máscaras de celda basadas en . Archivos de pila TIF recopilados de experimentos de imágenes en vivo. A continuación, describirá cómo crear una macro en ImageJ para analizar las máscaras, lo que dará como resultado una hoja de cálculo del área de celda que luego se analiza para detectar cambios a lo largo del tiempo. Por último, se analizará la actividad protrusiva y retráctil de las células mediante Metamorph.

  1. Genere una máscara binaria de imágenes CellMask utilizando la función MovThresh del paquete de softwareCellGeo 24.
  2. Copie la carpeta MovThresh en la carpeta de análisis de imagen.
  3. Copie las imágenes de CellMask u otro canal de marcador de membrana en la carpeta MovThresh.
    1. Si se crearon varias celdas en una sola posición, recorte las imágenes para generar archivos que contengan una sola celda antes de crear la máscara en MatLab.
  4. Asegúrese de que el directorio esté configurado correctamente en la carpeta MovThresh en MatLab.
  5. Ejecuta MovThresh.
  6. Importe pilas de imágenes de una en una.
  7. Seleccione Curva suavizada y, a continuación, ejecute Reumbral.
  8. Guardar como número Mask_Image en una nueva carpeta con la etiqueta Máscaras.
  9. Una vez que todas las pilas de imágenes se hayan convertido en máscaras, abra las pilas de imágenes en el software ImageJ25.
    1. Análisis de área de celda en ImageJ
      1. Abra todas las pilas de imágenes de máscara en ImageJ.
      2. Ajuste las medidas establecidas en el área.
      3. Haga clic en Complementos | Macros | Grabar.
      4. Haga clic en Procesar | Binario | Hacer binario.
        1. Seleccione la opción predeterminada .
          NOTA: No haga clic en nada adicional mientras graba la macro. Si se incluyen pasos adicionales, se recomienda reiniciar desde el paso 6.9.1.3.
      5. Haga clic en Analizar | Analizar partículas.
        1. Desmarque todas las casillas excepto Resumen.
      6. Termine de grabar y haga clic en Crear para crear la macro.
      7. Presione Ejecutar para cada pila de imágenes después de seleccionarla y guarde la tabla de resultados para cada pila de imágenes. La opción predeterminada se guardará como un archivo csv.
      8. Guarde la macro y reutilícela para futuros análisis (opcional).
    2. Procesamiento de datos de área en una hoja de cálculo
      1. Para cada célula analizada, promedie el área de la célula a partir de imágenes tomadas antes de la activación con rapamicina.
      2. Divida todos los valores de área por el área promedio de la celda que precede a la adición de rapamicina.
      3. Calcule el valor promedio para cada punto de tiempo para todas las celdas de las que se obtienen imágenes y determine los intervalos de confianza del 90%. Grafique los datos.
    3. Análisis de la actividad protrusiva de las células
      1. Copie la carpeta ProActive en la carpeta de análisis de imágenes.
      2. Copie las pilas de imágenes enmascaradas de MovThresh en la carpeta ProActive recién creada.
      3. Abra MatLab y establezca el directorio en la carpeta ProActive.
      4. Ejecute ProActive.
      5. Importe los archivos de la pila de imágenes de celda enmascaradas en la GUI de ProActive.
      6. Definir el tipo de actividad. El análisis de actividad protrusiva generará datos de área ganada ; El análisis de la actividad retractiva generará datos de área perdida ; y la actividad total generará datos generales de cambio de área (tanto perdidos como ganados).
      7. Establezca el área en Definir normalización.
      8. Suaviza la curva utilizando los valores de umbral sugeridos o utilizando la media para volver a umbralizar cada punto de tiempo. Esto promedia los umbrales en una ventana específica, minimizando las inconsistencias en los umbrales entre puntos de tiempo.
      9. Haga clic en Archivo | Guardar como | Resultados (.mat)
        1. Si procesa los tres tipos de actividad de área, asigne a los archivos de datos procesados el nombre siguiente: ProResultData #, RetResultData # o ResultData #.
          NOTA: Incluya el espacio antes del número y numere los datos comenzando por 1.
      10. Repita desde el paso 6.9.3.6. para todas las pilas de imágenes enmascaradas importadas.
      11. Una vez que se hayan procesado todas las celdas, cierre la GUI de ProActive.
      12. Abra DataToFileTotalArea en el editor de Matlab para procesar los archivos "ResultData" de actividad total.
      13. Cambie el número de celdas para que coincida con el número de archivos de resultados que se han generado. Si se procesaron 7 celdas en los pasos 6.9.3.5 a 6.9.3.10, asegúrese de que las tres primeras líneas del script sean las siguientes:
        filename='Datos de resultados ';
        celdas=1:7;
        retraso = 1;
      14. Presione Ejecutar y repita esto para que DataToFileProtArea y DataToFileRetArea procesen datos protrusivos y retractivos, respectivamente. Este análisis producirá tres archivos de texto "AllCells.txt", "AllCellsPro.txt" y "AllCellsRet.txt"
      15. Abra los archivos .txt en una hoja de cálculo y normalice como en la sección 6.9.2. Calcule el valor promedio para cada punto de tiempo para todas las celdas de las que se obtienen imágenes y determine intervalos de confianza del 90%. Grafique los datos.
        NOTA: Los gráficos resultantes de los pasos anteriores deben tener un aspecto similar al de la Figura 6.

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Resultados

La Figura 4 muestra los resultados que se pueden esperar del ensayo de actividad de fosfatasa basado en paxilina. En este experimento, se comparó la actividad de la fosfatasa Shp2 negativa constitutivamente activa y dominante con la de RapR-Shp2 activa e inactiva utilizando fosfopaxilina como lectura. Los constructos Shp2 fueron inmunoprecipitados y sometidos al ensayo de actividad descrito en el protocolo. Las lecturas de fosfo-paxilina para Shp2 constitutivamente activo y RapR-Shp2 activo ...

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Discusión

Este protocolo proporciona pasos detallados para el desarrollo, la caracterización y la aplicación de fosfatasas controladas quimiogenéticamente. La herramienta RapR-Shp2 se basa en un interruptor regulado por rapamicina insertado en el dominio catalítico Shp2. El punto fuerte de esta herramienta es la especificidad y el estricto control temporal de la actividad de la fosfatasa. La herramienta es aplicable a otras fosfatasas y, en combinación con la tecnología RapR-TAP descrita anteriorm...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Dra. Jordan Fauser por su contribución al desarrollo de RapR-Shp2 y los protocolos asociados. El trabajo fue respaldado por un premio 5R35GM145318 del NIGMS, un premio R33CA258012 del NCI y un premio P01HL151327 del NHLBI.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
#1.5 Cubreobjetos de vidrio 25 mm RedondosWarner Instruments64-0715
Tubos de 1,5 mLUSA Scientificcc7682-3394
2x Tampónpara 500 mL: 5,18 g Tris-HCL, 131,5 mL glicerol, 52,5 mL 20% SDS, 0,5 g azul de bromofenol, pH final 6,8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Gel PrefabricadoBiorad4561096
5x Tampón Phusion PlusThermo ScientificF538L
A431 CellsATCCCRL-1555
AgarsoseGoldBiotechA-201
Attofluor Cell ChamberinvitrogenA7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)Gemini Bio-products100-106Heat Inactivated Triple 0.1 µ m
Brig 35,30 conAcros329581000
BSAGoldBiotechA-420
CellGeoN/AN/APublicado en 10.1083/jcb.201306067
CellMask Rojo Intenso Colorante de membrana plasmáticainvitrogenC10046
Criba de colonia MasterMixGenesee42-138
DH5a competente célulasNEBC2987H
DMEMCorning15-013-CV
DMSOThermo ScientificF-515
DNA LadderGoldBioD010-500
dNTPsNEBN04475
DpnI EnzimaNEBR01765
DTTGoldBioDTT10DL-Ditiothreitol, Reactivos de Cleland
EGTAAcros409910250
Fibronectina de plasma bovinoSigmaF1141
FuGENE(R) 6 Reactivo de transfecciónPromegaE2692reactivo de transfección
Kit de extracción en gel ThermoScientificK0692GeneJET Kit de extracción de gel
Gel Green Tinción de ácido nucleico GoldBioG-740-500
Tinte de carga de gel púrpura 6xNEBB7024A
GlutamaxGibco35050-061GlutaMAX-l (100x) 100 mL
Células HEK 293T ATCCCRL-11268
Células HeLaATCCCRM-CCL-2
HEPESFischerBP310-500
ImageJ Software de procesamiento N/AN/A
Igepal CA-630 (NP40)SigmaI3021
TampónImidazol 25 mM Imidazol pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KClSigmaP-4504
L-15 1xCorning10-045-CV
LB AgarFisherBP1425-2
Tampónde lisis20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
MATLABMathWorksN/AR 2022b para ejecutar las funciones de CellGeo
Software de automatización y análisis de imágenes de microscopía MetamorphN/AN/A
MgCl2Fisher ChemicalM33-500
Aceite mineralSigmaM5310
MiniPrep KitGene Choice96-308
Mini-PROTEAN TGX Geles prefabricados 12 pocillosBio-Rad4561085
Grado de Biología Molecular AguaCorning46-000-CV
Espejo policroico multibandaTecnología Chroma89903BS
NaClFisher ChemicalS271-3
Olympus UPlanSAPO 40x objetivoOlympusN/A
PBS sin Ca y MgCorning21-031-CV
Tubos de PCRlabForce1149Z650.2 mL 8 tiras y tapones, tiras rígidas Tapas de cúpula unidas individualmente
Phusion Plus ADN polimerasaThermo ScientificF630S
Imprimaciones IDT
Protein-G SepharoseMillipore16-266
Membranas de PVDFBioRad1620219Immun-Blot PVDF/Sándwiches de papel de filtro
RapamicinaFisher AAJ62473MF
0,25% Tripsina, 2,21 mM EDTA, 1x [-] sodioCorning25-053-CI
Tris-Acetato-EDTA (TAE) 50xFischerBP1332-1para electroforesis
Tampón20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-MercaptoetanolFisher ChemicalO3446I-100
Anti-EGFRSeñalización celular2232
Anti-ERK 1/2Señalización9102
Anticuerpo anti-banderaMillipore-SigmaF3165
Anti-GAPDH AnticuerpoinvitrogenAM4300
Anticuerpo Anti-GFPClontech632380
Anti-mCherryAnticuerpo invitrogenM11217
Anti-paxilina AnticuerpoThermo FischerBDB612405
Anti-EGFR Y992 AnticuerpoSeñalización Celular2235
Anti-fosfo-Erk 1/2 T202/Y204 AnticuerpoSeñalización Celular9101
Anti-fosfo-paxilina Y31 AnticuerpoMillipore-Sigma05-1143
Anti-fosfo-PLCγ Y783Señalización de células14008
anti-PLC y gamma; Señalización Celular de Anticuerpo5690
Laemmli filtro estéril % de Se utilizó la actualización de de lavado celular de anticuerpo de anticuerpos

Referencias

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