Artículo de método

Diseño y desarrollo guiados por la estructura de nuevos inhibidores de la ciclofilina A y derivados de ganoderiol-F: un enfoque in-silico

DOI:

10.3791/67145

⸱

23 de junio de 2026

 , 
1College of Arts and Sciences, Qatar University, 2BBR Pty Ltd

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí presentamos un protocolo para el diseño guiado por la estructura de la interacción de unión proteína-ligando entre la sangliferina A y la ciclofilina A/Ganoderiol-F, esencial para descubrir nuevos fármacos. La estabilidad del complejo ligando-receptor se evaluó mediante simulación de dinámica molecular.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El eje ciclina Ds-CDKs (Ciclofilina A (Cyp /Ganoderiol F)) desempeña un papel fundamental en el cáncer mediante diversos procesos, como el control de la proliferación e inhibición de las células cancerosas. Los derivados del ganoderiol F pueden servir como dianas oncogénicas para múltiples tipos de cáncer. Este estudio demostró que el diseño y desarrollo guiados por la estructura de nuevos inhibidores de Cyp A y derivados de Ganoderiol F pueden emplearse para seleccionar posiciones calculadas que aumentan la eficacia en inhibidores químicos y su interacción con los receptores elegidos. Para este enfoque, se utilizaron numerosas aplicaciones de software para lograr interacciones moleculares óptimas. En total, se construyeron 117 moléculas novedosas de ligando inhibidores de la ciclofilina utilizando el software Chemsketch. Se prepararon los archivos PDB convertidos de los nuevos ligandos inhibidores de Cyp A para su introducción en el receptor enzimático Sanglifehrin A. Las interacciones de acoplamiento ligando-proteína se realizaron utilizando el software AutoDock 4.2.6 para revelar las mejores interacciones geométricas. Las confirmaciones de acoplamiento se realizaron utilizando el software PyMOL 2.5. Finalmente, se detectaron enlaces de hidrógeno utilizando los programas Chimera y Maestro. El complejo seleccionado acoplado al receptor de ligandos fue sometido a simulación de dinámica molecular. El proceso de simulación de MD demostró la estabilidad del complejo e indicó que el ligando elegido puede utilizarse como inhibidor de fármacos para células cancerosas. En los resultados, los aminoácidos activos en el sitio de unión fueron Arginina 55 en movimiento de 1,53Å, Asparagina (Asn), Glicina (Gly), Treonina (Thr), Lisina (Lys), Isoleucina (Iso), Histidina (Hid), Fenilalanina (Phe) y Cisteína (Cys), con el mayor número de ligandos de enlace hidrógeno de 45 hidroximangiferónicos. Eso se conectaba con el receptor 1nmk en la coordenada de la caja de la cuadrícula X 38,86, Y de 10,987 y Z de 40,734. La evaluación del complejo receptor-ligando 1nmk en la simulación de dinámica molecular (MD) en la versión de Gromac del campo de fuerza CHARMM 36 tiene grados óptimos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La ciclofilina A es un inhibidor fuerte de la Cip A humana. La ciclofilina es un inhibidor robusto que no afecta el sistema inmunitario, posee mejores cualidades farmacológicas y reduce la inhibición del transportador. El mal pronóstico se ha relacionado con la sobreexpresión de ciclofilinas, una familia de proteínas con actividad de isomerasapeptidil-prolina 1. Se ha reportado que las ciclofilinas están sobreexpresadas en numerosos tipos de cáncer, incluido el carcinoma hepatocelular. En el carcinoma hepatocelular (CCH), las ciclofilinas son cruciales tanto para la resistencia a fármacos contra el cáncer como para laproliferación 2. La inhibición adquiere información esencial para identificar nuevos inmunosupresores basados en derivados de quinoxalina mediante acoplamiento molecular a nivel atómico y simulación de MD para determinar el sitio de unión preciso de DC838 a CypA 3.

Además, investigaciones in vivo demostraron que la ciclofilina DC838 previene la proliferación de células del bazo de ratón inducida por concanavalina. Varios estudios han informado de una serie de inhibidores macrocíclicos de la ciclofilina sintetizados a partir de Sangliferina A (SFA), una sustancianatural 4. La optimización inicial del compuesto reveló que el grupo hidroxilo del residuo de tirosina m5, los centros estereoscópicos en C14 y C15, y el tripéptido de ácido valine5m5tirosina5piperazico en el núcleo de la sangliferina eran factores esenciales que influyen en la potenciadel compuesto 5. La unidad dieno C185C21 de SFA podría ser reemplazada por un grupo estirilo para crear compuestos potentes que muestren un modo de unión novedoso, en el que la mitad estireno interactúa con la arginina (Arg)556 de Cyp A mediante una interacción de apilamiento. Los inhibidores de la ciclofilina no inmunosupresores son eficaces en el tratamiento del virus de la hepatitis C. La ciclosporinaA1, el alisporivir y la mayoría de las demás ciclosporinas son inhibidores fuertes de MRP2, MDR1, OATP1B1 y otros transportadorescruciales de fármacos 7,8.

Por otro lado, el Ganoderiol F purificado de Ganoderma leucocontextum retrasa la progresión del ciclo celular al inhibir las ciclinas CDK4/CDK6 9, y las quinasas dependientes de ciclina (CDKs) son fundamentales para controlar el ciclo celular de los mamíferos. La ciclina D-CDK4/CDK6 y la ciclina E-CDK2 son los actores clave en el control de la progresión del ciclo celular por parte del Ganoderiol F. Por lo tanto, el ganoderiol F podría utilizarse como un posible inhibidor de CDK4/CDK6 en el tratamiento del cáncer demama 10,11. La FA inhibe la fase G1 del ciclo celular, lo que previene el crecimiento de macrófagos dependientes de M-CSF sin afectar la viabilidadcelular 12. El inmunosupresor inhibe la proliferación desactivando la actividad de CDK2. En el contexto del cáncer, el papel de la ciclina D-CDK4/6, junto con otras ciclinas y CDK, está bien establecido. El cáncer se caracteriza por la desregulación anormal de la vía ciclina-CDK. Específicamente, cuando la célula está lista para iniciar la síntesis de ADN, CDK4 media el paso a través de la fase G1 junto con las ciclinas tipo D. Este proceso está crucialmente relacionado con el desarrollo y progresión del cáncer9.

El sitio activo de Cyp A se caracteriza por la arginina catalítica invariante (Arg55) y una mezcla altamente conservada de residuos hidrofóbicos, aromáticos y polares, como Arg55, glutamina (Gln), glicina (Gly) y treonina (Thr)1,13,14. El sitio activo de la familia de las ciclofilinas también está formado por alanina (Ala) y asparagina (Asn)1. Mientras tanto, el sitio activo de SFA está formado por los aminoácidos Arg5515, Gln, Gly, Thr, Ala y Asn, que forman una bolsa hidrofóbica que encierra la mitad de ácidos piperazina de SFA. En contraste con el Cyp A sin ligamento, el enlace entre el macrociclo y la bicicleta de spinning de SFA obliga a Trp121 a realinear sus cadenaslaterales 16.

El 1nmk se selecciona como un código PDB específico de la Sanglifehrin A, como se mencionó en estudiosprevios 17. La SFA, una sustancia natural inmunosupresora, fue descubierta por primera vez en Streptomyces sp. A92-3081 5,18. La SFA muestra altas afinidades por Cyp A y tiene una estructura distinta en comparación con CsA, empleando un método único para suprimir el sistema inmunitario. La compleja estructura molecular de la SFA comprende un macrociclo de 22 miembros con un anclaje de nueve carbonos en la posición 23, que termina en una mitad espiro-bicíclica altamente sustituida. Estudios in vitro con fibroblastos pulmonares humanos fibróticos y muestras de pacientes con fibrosis pulmonar idiopática demostraron que la SFA aumenta la producción de ciclofilina B e inhibe la secreción de colágeno tipoI 19,20. En total, se utilizaron 20 sangliferinas diferentes para aislar la SFA (C16). Su afinidad por las ciclofilinas es aproximadamente 60 veces mayor que la de los otros miembros del grupo SFA en un experimento de unión competitiva sin células15. Por ejemplo, la SFA reduce significativamente la cantidad de IL-12p70 bioactiva, la fuente principal de IL-12 liberada por las células dendríticas, inhibiendo así la actividad celular dendrítica. Este estudio sugiere que la SFA es un nuevo medicamento inmunosupresor potente1.

En este protocolo, se generaban nuevas estructuras de ligandos para Ganoderiol F/Cyp A usando métodos in silico con el software Chemsketch y luego se convertían a archivos PDB usando software compatible. La concepción de unión proteína-ligando es un tema importante en el proceso de descubrimiento y diseño defármacos 21,22. Las interacciones ligando-receptor se acoplaron mediante el software AutoDock 4.2.6. Los sistemas de acoplamiento computacional suelen generar varias configuraciones potenciales de complejo proteína-ligando. Uno o varios candidatos con menor unión energética al receptor 1nmk pueden seleccionarse para la siguiente fase del diseño del fármaco para asegurar la eficacia de ensayos de diseño in silico. Se utilizó software quimera para identificar el ligando óptimo de unión al hidrógeno. Finalmente, se realizaron simulaciones de dinámica molecular (MD) sobre el complejo ligando-receptor para medir su estabilidad. Este método se describe en el protocolo a continuación.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generación in silico de ligandos y preparaciones de ligandos en el software ChemSketch

NOTA: Este software se utilizará para dibujar la estructura de un ligando/molécula, es decir, para editar molecularmente.

  1. Dibuja el ligando/estructura según lo indicado en el proceso de dibujo seguido en el software, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 1).
  2. Pulsa f9 para limpiar la estructura después de dibujar la estructura completa.
  3. Haz clic en Archivo y luego Guardar como. (Navega a la carpeta, por ejemplo, la molécula 1 se guardará en la carpeta 1, y así sucesivamente).
  4. Cambia el tipo Guardar como a molfiles mdl, luego haz clic en Guardar (no es necesario especificar un nombre de archivo; usa el nombre de archivo predeterminado proporcionado por el software, por ejemplo, noname).
    NOTA: Se creará un archivo en la carpeta, y cada archivo tendrá el formato mdl de un ligando de estructura 2D.
  5. Repite los pasos anteriores para todas las moléculas.

2. Conversión de formato de archivo (Open Babel software)

NOTA: El software convierte formatos de archivo. Aquí, el archivo .mol se convertirá al formato .pdb, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 2).

  1. En el lado izquierdo, en el formato de entrada, por favor seleccione mol--mdl mol format en el menú desplegable. De manera similar, en el lado derecho, en el formato de salida, selecciona pdb--formato de banco de datos de proteínas.
  2. En el formato de entrada (en el lado izquierdo), haz clic en ... (el botón de explorar).
  3. Navega a la carpeta (por ejemplo, la carpeta 1), haz clic en el archivo de Chemsketch que acabas de dibujar y ábrelo .
  4. En el formato de salida, haz clic en ....
  5. Se abrirá una ventana predeterminada. Escribe 1.pdb aquí para nombrar el archivo. Para la estructura 1, escribe 1.pdb y haz clic en Guardar. Repite este paso para molécula/estructura 2, tipificando 2.pdb , y así sucesivamente.
  6. Finalmente, desde el centro de la interfaz de software, haz clic en Convertir. Esto convertirá las coordenadas del formato mol MDL al formato PDB.
    NOTA: Ahora, se añadirá un archivo más a la carpeta. Cada archivo tendrá 1 archivo pdb de ligando que se usará en los siguientes pasos.
  7. Haz clic derecho en el archivo recién creado, selecciona Abrir con y luego elige Bloc de Notas.
  8. Repite los mismos pasos para todas las moléculas.
    NOTA: AutoDock 4.2.6 aparecerá en el escritorio tras instalar las herramientas MGL 1.5.7.
  9. Prepara el archivo de entrada 1nmk.pdb como se describe a continuación.
  10. En el archivo 1nmk.pdb, elimina todos los ligandos externos visitando la web de pdb.org y seleccionando la estructura 1nmk. Busca los ligandos bajo el título de molécula pequeña en la estructura 1nmk, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura 3).
  11. Encuentra el ligando llamado SFM, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 4), y abre el archivo 1nmk. Descarga el archivo PDB 1nmk desde la web del PDB. Localiza el residuo de terminación (TER.), como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 5).
  12. Elimina los residuos de los ligandos externos (SFM) en la estructura 1nmk, empezando por el residuo tras TER y terminando antes del residuo listado antes del final. Guarda el archivo PDB modificado de 1nmk en el sistema.
    NOTA: El archivo PDB 1nmk estará listo, y la preparación del archivo del sitio de coordenadas activas del receptor estará en la Tabla 1.
  13. Abre el archivo 1nmk y localiza Arg en el aminoácido número 55.
  14. Encuentra las coordenadas x, y y z, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura 6).

3. Preparación de los parámetros de acoplamiento usando el software AutoDock 4.2.6.

  1. Abre el software de herramientas AutoDock 4.2.6 desde el escritorio.
  2. Selecciona AutoDock 4.2.6 4.0 para la preparación del receptor 1nmk, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura 7).
  3. Abre el menú de Archivos , selecciona Leer moléculas, navega a la carpeta, selecciona 1nmk y pulsa Abrir.
  4. Pulsa Editar, elige Hidrógeno y haz clic en Añadir. Selecciona solo Polar y pulsa OK. (Archivo suplementario 1, Captura de pantalla 8).
  5. Pulsa Editar, elige Cargos y luego selecciona Cargos Kollman.
  6. Pulsa Editar, elige Átomos y luego selecciona Asignar tipo de ad4 (elige cualquiera de ellos).
  7. Abre el menú de Archivo , elige Guardar y escribe pdbqt. Se abrirá una ventana. Navega por la carpeta 1, escribe el nombre del archivo 1nmk.pdbqt y haz clic en Guardar.
  8. Selecciona desde Atom y luego añade como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 9). Marca las casillas para ordenar nodos, guarda coordenadas de transformación, escribe todos los registros y luego haz clic en OK.
  9. Abre el ligando, selecciona entrada y luego abre. Navega a la carpeta 1, cambia el tipo de archivo a todos los archivos, selecciona 1.pdb y haz clic en Abrir. Aparecerá una pequeña ventana, que proporcionará información sobre el ligando seleccionado, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 10).
  10. Abre el ligando, luego el árbol de torsión y después detecta la raíz, como se muestra en el archivo suplementario 1 (Captura de pantalla 11).
  11. Abre el ligando, luego la salida y después guarda como pdbqt. Navega a la carpeta 1, escribe el nombre del archivo 1. pdbqt y haz clic en Guardar, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 12).
    NOTA: Todos los archivos de ligando pdbqt estarán preparados.
  12. Abrir la Rejilla, seleccionar Macromolécula, elegir 1nmk y luego seleccionar Molécula. Aparecerá una advertencia; haz clic en OK, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 13). Navega a la carpeta 1, escribe el nombre del archivo 1nmk.pdbqt, haz clic en Guardar y, cuando se abra una ventana de reemplazo, haz clic en Sí, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 14).
  13. Abre la cuadrícula y luego establece los tipos de mapa, elige Ligando, haz clic en 1 y selecciona Ligando, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 15).
  14. Prepara el archivo de sitios de coordenadas activas del receptor GPF como se muestra en la Tabla 1.
    NOTA: El archivo GPF representa el sitio de coordenadas activo del receptor (Tabla 1).
  15. Haz clic en Rejilla, luego ve a Recuadro de Rejilla, elige Centro, elige un átomo e introduce la caja de Rejilla Central (Archivo Suplementario 1, Captura 16).
    1. Elige Archivo, luego Cerrar, guardando la configuración actual.
    2. Elige Grid, luego Output y guarda como GPF. Ve a la carpeta 1 y escribe el nombre del archivo 1nmk.gpf.
    3. Elige Acoplamiento > Macromolécula > Establece el nombre de archivo rígido, navega a la carpeta 1 y haz clic en 1nmk.pdbqt, luego Abrir, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 17).
    4. Elige Acoplamiento, encuentra 1 y selecciona Ligando (Archivo Suplementario 1, Captura de pantalla 18). Se abrirá una ventana con parámetros predeterminados. Aceptar los parámetros por defecto, tal como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 19).
    5. Luego elige Acoplamiento, ve a Parámetros de búsqueda, selecciona Algoritmo Genético, que abre una ventana con parámetros predeterminados, y después elige Aceptar, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 20).
    6. Elige Acoplamiento y luego Salida, Lamarckian GA, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 21).
    7. Ve a la carpeta 1, escribe el nombre del archivo " 1nmk.dpf" y haz clic en Guardar, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 22).
      NOTA: Cierra la ventana de software de AutoDock 4.2.6, ábrela de nuevo y repite el proceso para la siguiente molécula. Además, el 1nmk.pdbqt, 1nmk.gpf y 1nmk.dpf estarán listos para el paso del proceso de acoplamiento.

4. Cygwin-I (proceso de acoplamiento)

NOTA: Para crear archivos GLG y DLG , ejecuta el algoritmo. El algoritmo (AutoGrid) se ejecuta en este terminal Cygwin. En Cygwin, navega hasta la carpeta. Por ejemplo, si la carpeta 1 está en la unidad C, debería contener una carpeta llamada "proyecto", seguida de otra carpeta llamada "moléculas" y después todas las carpetas dentro de ella. Sigue estos pasos.

  1. Abre el terminal Cygwin .
  2. Escribe cd c:/ y pulsa Enter. Luego escribe proyecto en CD y pulsa Enter.
  3. Tipifica moléculas cd y pulsa Enter, luego cd 1 y Enter. Ahora la carpeta 1 está en el terminal Cygwin.
  4. Escribe ./autogrid4.exe -p 1nmk.gpf -l 1nmk.glg & y pulsa Enter, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 23).
    NOTA: En "./autogrid4.exe -p 1nmk.gpf -l 1nmk.glg &", -l es una l menor menos.
  5. Escribe tail -f 1nmk.glg y pulsa Enter, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 4).
  6. Si AutoGrid se completa con éxito, cierra esta ventana de Cygwin, abre una nueva ventana de Cygwin y repite el proceso anterior para la molécula 2.
  7. Repite este paso para todas las moléculas y ejecuta el algoritmo (AutoDock 4.2.6).
    NOTA: Para AutoDock 4.2.6, repite el proceso de navegar hasta la carpeta y, cuando se acceda a la carpeta, escribe y pulsa Enter para AutoDock 4.2.6.
  8. Escribe ./autodock4.exe -p 1nmk.dpf -l 1nmk.dlg & y pulsa Enter, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 24).
    NOTA: En el paso anterior "-l" aparece una letra minúscula "L" con signo negativo.
  9. Tipo de cola -f 1nmk.dlg
    NOTA: Si el AutoDock 4.2.6 se completa, cierra la ventana Cygwin y repite el proceso para la molécula 2.
  10. Sigue este procedimiento de Cygwin para todas las moléculas.
  11. Después de crear archivos DLG para moléculas, ve a la carpeta 1 y abre el archivo DLG en WordPad. Pulsa Ctrl + F, escribe y pulsa Enter tres veces para llegar a la tabla RMSD, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 25).
  12. Abre una ventana de Microsoft Excel o anota la página y crea tres columnas: No., Min. Binding Energy, y Run.
  13. Anota los datos según la tabla RMSD en el archivo de registro. La energía de enlace está en la parte superior de la mesa, junto con la secuencia en la que se observó. Haz esto con todas las moléculas.
    NOTA: La molécula con menor energía de unión se considera mejor que las demás.
  14. Crea otra hoja de cálculo con los detalles (número de serie, energía mínima de unión y carrera) de las 20 moléculas principales.
    NOTA: El siguiente procedimiento se realizará únicamente para las 20 moléculas principales.

5. Cygwin-ii

  1. Abre el terminal Cygwin, escribe cd c:/ y pulsa Enter.
  2. Escribe cd project y pulsa Enter, tipifica moléculas cd y pulsa Enter.
  3. Escribe cd (número de carpeta de la molécula superior seleccionada) y pulsa Enter.
    NOTA: El número debe corresponder a la carpeta en el terminal Cygwin.
  4. Escribe grep '^docked' 1nmk.dlg |corta -c9- > 1nmk_run.pdbqt y pulsa Enter. A diferencia de AutoGrid y AutoDock, no aparecerá ningún mensaje de finalización exitosa para esto y pulsará Enter, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 26).
  5. Pulsa Enter y el archivo se creará.
  6. Tipifica corte -c-66 1nmk_run.pdbqt > 1nmk_run.pdb y pulsa Enter. El archivo se creará, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 27).
  7. Cierra la ventana del Cygwin.
    NOTA: Para visualizar la interacción de ligandos y receptores tras el acoplamiento usando el software PyMOL 2.5
    1. Abre el software PyMOL 2.5, luego abre el archivo y después selecciona receptor.
    2. Abre el archivo, luego selecciona la configuración de ligandos elegida, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 28).
    3. En PyMOL 2.5, selecciona Ocultar Molécula y Ocultar Receptor. En el menú Receptor , seleccione Mostrar Superficie, como se muestra en la Figura 1A.
      NOTA: Para visualizar el enlace de hidrógeno en el complejo de receptores ligando-1nmk, se utilizará el software de Quimera UCSF en 20 ligandos con menor energía de enlace.

6. Software de UCSF Chimera para visualización de enlaces en H y análisis de resultados

  1. Abre UCSF Chimera, luego selecciona Archivo, luego Abrir, y navega a la unidad c:/, luego a Proyecto, Moléculas), selecciona 1nmk.pdb y ábrelo.
  2. Selecciona el disco donde se encuentran las moléculas y luego abre la proteína del programa UCSF.
  3. Selecciona Residue y luego elige UNL Zoom.
  4. Selecciona Zona, luego pulsa Aceptar, luego selecciona Acción, después elige Etiqueta, selecciona Residuo y elige Nombre + Especificador.
  5. Selecciona Herramientas, luego elige Análisis de Estructuras y después elige Buscar enlace H, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 29).
  6. Abre la ventana predeterminada y marca las casillas para enlaces H de color que no cumplen criterios precisos, y solo encuentra enlaces H con seleccionados.
  7. Seleccione Borrar selección para iniciar una nueva encuesta, luego Zoom y busque las líneas azul/naranja , que representan los enlaces H, como se muestra en la Figura 3.
  8. Comprueba cuántos bonos hay que contar.
    NOTA: El zoom debe mostrar las interacciones del enlace H con Arg55, Asn149, Gly150, Lys151, Thr 152, Lys54, Lys155, isoleucina 15623, histidina 5424, fenilalanina (Phe)53, cisteína (Cys)52, Gly72, Asn71 e Hid70, e indicar si están dentro del sitio activo de la proteína, como se muestra en la Figura 3A - D.
  9. Fíjate en el número de enlaces H y el número de moléculas.
  10. Coloca el ratón sobre la línea que muestra el enlace H, indicando interacciones con Arg55 y Metionina, Gln, Gly y Thr.
  11. Pulsa la tecla Imprimir pantalla .
  12. Abre la aplicación Pintura , pega la Figura Suplementaria y guárdala en la carpeta nombrada.
    NOTA: Para mostrar claramente los enlaces H y los aminoácidos del sitio activo, la estructura 2D de los ligandos y receptores elegidos debe ser la siguiente:

7. Preparación del diagrama de interacción de ligandos para la confirmación del acoplamiento y la muestra del enlace en H

  1. Abre el software AutoDock 4.2.6.
    1. Selecciona Análisis y abre Macromolécula, luego elige 1nmk, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 30).
    2. Selecciona Análisis y abre Docking, luego elige Abrir, navega al archivo dlg.pdb y seleccionalo, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 31).
    3. Selecciona Análisis y abre Docking, luego elige Escribir el ligando de Pantalla Virtual de AutoDock y guardarlo como un archivo PDB, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 32).
  2. Abre el software PyMOL 2.5 como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 33).
    1. Abre el archivo guardado dlg.pdb y luego abre el archivo 1nmk.pdb.
    2. Abrir archivo, seleccionar Exportar molécula y luego guardar, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 34).
    3. Abre el software Maestro, abre Archivo y luego elige Importar Estructura como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 35).
    4. Importa el Diagrama de Interacción de Ligandos, guarda la estructura 2D, como se muestra en el Archivo Suplementario 2.

8. Simulación MD

NOTA: Para abrir GROMACS en Linux sigue estos pasos

  1. Descarga Ubuntu 20.04.6.
    1. Activa la aplicación de Características de Windows en el PC. Y luego elige el subsistema de Windows para Linux y pulsa OK.
    2. Sigue estos y pulsa Enter para instalar GROMACS:
      1. Escribe sudo apt-get update y pulsa Enter, luego sudo apt-get upgrade y pulsa Enter.
      2. Escribe sudo apt-get install gcc y pulsa Enter, y escribe sudo apt-get install cmake y pulsa Enter.
      3. Escribe sudo apt-get install built-essential y pulsa Enter, luego sudo apt-get install liDevfftw3-d y pulsa Enter.
      4. Escribe sudo apt-get install GROMACS y pulsa Enter, luego shift + Ctrl + T.
    3. Abre la carpeta en el ordenador personal y nómbrala GROMACS, como se muestra en el Archivo Suplementario 1 (Captura de pantalla 36).
    4. Abre la carpeta GROMACS y pulsa Shift + Ctrl + Derecha para entrar en Linux.
      NOTA: Las simulaciones usaron el modelo de agua y la versión 4.0 de GROMACS, Win64-multinúcleo, que incorporaba el campo de fuerza CHARMM 36. El intervalo de tiempo se estableció en 2 fs, eligiendo la distancia de corte de 1,0 a 1,2 nm.

9. Creación de topología de ligandos usando módulos pdb2gmx de GROMACS (Archivo suplementario 1, Captura de pantalla 37)

  1. Crea el archivo lig.gro, extrae el ligando de la estructura proteica escribiendo grep UNL 135_clean.pdb > lig.pdb y pulsando Enter, luego renombra "UNL" a "LIG" en el archivo.
  2. Abre lig.pdb en PyMOL 2.5, elimina átomos no deseados pulsando seleccionar los átomos y eliminar el átomo. Haz clic en guardar para guardar la versión limpia como lig_clean.pdb.
  3. Abre el archivo limpio en Avogadro para añadir hidrógeno usando la herramienta Build y guárdalo como lig.mol2. Edita la parte superior del archivo en un editor de texto para asegurarte de que el nombre del residuo está configurado como LIG.
  4. Escribe perl sort_mol2_bonds.pl lig.mol2 lig_fix. mol2 y pulsa Enter.
  5. Genera la topología de ligandos usando CGenFF: sube lig_fix. mol2, procesa la entrada y descarga lig_fix.pdb. Activa el entorno Python y ejecuta python cgenff_charmm2gmx_py3_nx1.py LIG lig_fix. mol2 lig.str charmm36-jul2022.ff y pulsa Enter.
    NOTA: Este paso generará cuatro archivos de ligandos (lig.prm, lig.itp, lig.top y lig_ini.pdb).
  6. Genera el archivo ligand.gro , escribe gmx editconf -f lig_ini.pdb -o lig.gro y pulsa Enter.
  7. Separa la proteína guardando solo los átomos no ligandos en prot_clean.pdb y asegúrate de que los átomos de UNL estén listados en la parte superior del complejo combinado.

10. Creación de topología de proteínas en módulos pdb2gmx de GROMACS (Archivo suplementario 1, Captura de pantalla 38).

  1. Preparar la topología de proteínas, tipo gmx pdb2gmx -f prot_clean.pdb -o pro.gro -ter y pulsar Enter .
  2. Crea el complejo de proteína y ligando después de añadir el archivo lig.gro al final del archivo pro.gro . Luego escribe gmx editconf -f complex.gro -o box.gro -c -d 1.0 -bt cubic y pulsa Enter.
  3. Genera solvato usando el modelo de carga puntual específica del agua para mantener el equilibrio, tipifica gmx solvate -cp box.gro -cs spc216.gro -o solv.gro -p topol.top y pulsa Enter.
  4. Crear archivos de iones, escribir gmx grompp -f iones.mdp -c solv.gro -p topol.top -o ions.tpr y pulsar Enter. Escribe gmx genion -s iones.tpr -o solv_ions.gro -p topol.top -pname NA -nname CL -neutral, y pulsa Enter, luego elige el grupo 15 para añadir iones.
  5. Genera minimización de energía em.gro.
  6. Escribe gmx grompp -f em.mdp -c solv_ions.gro -p topol.top -o em.tpr y pulsa Enter, y escribe gmx mdrun -v -deffnm em y pulsa Enter.
    NOTA: El sistema solvado minimizará la energía usando un máximo de 50.000 pasos con un criterio de convergencia de fuerzas de 1.000,0 kJ/mol/nm.
  7. Crea los archivos índice, escribe gmx make_ndx -f lig.gro -o index_lig.ndx, pulsa Enter.
  8. Escribe gmx genrestr -f lig.gro -n index_lig.ndx -o posre_lig.itp -fc 1000 1000 1000 y pulsa Enter.
  9. Genera el archivo index.ndx , escribe gmx make_ndx -f em.gro -o index.ndx y pulsa Enter.
  10. Genera el archivo NVT de equilibrio nvt.gro , escribe gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -t nvt.cpt -r nvt.gro -p topol.top -n index.ndx -o npt.tpr y pulsa Enter. Luego, escribe gmx mdrun -deffnm nvt y pulsa Enter.
    NOTA: La equilibración del sistema se realizó a una temperatura de 27,35 °C (300,5 K) para el conjunto del número de átomos (N), volumen (V) y temperatura (V) (NVT) del sistema durante 100 ps.
  11. Actualizar el archivo de topología topol.top para incluir la topología de ligandos y los parámetros para obtener NPT.
  12. Genera equilibrio NPT.
  13. Crea la segunda fase de equilibrio NPT, tipifica gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -t nvt.cpt -r nvt.gro -p topol.top -n index.ndx -o npt.tpr y pulsa Enter, y escribe gmx mdrun -deffnm npt y pulsa Enter.
    NOTA: La NVT equilibrada se refiere al número de partículas, volumen y temperatura, mientras que la NPT equilibrada se refiere a la estabilidad para el número de partículas, la presión y la temperatura. Los archivos NVT.mdp y NPT.mdp son necesarios para producir los resultados de la simulación MD de la siguiente manera.

11. Liberar los restricciones de posición y ejecutar la simulación de dinámica molecular de producción para recopilar datos

  1. Escribe gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -n index.ndx -o md_0_10.tpr y pulsa Enter. Luego, escribe gmx mdrun -deffnm md_0_10 y pulsa Enter.
  2. Someter el sistema a una simulación MD de 1 ns para probar la estabilidad del complejo.
    NOTA: La desviación cuadrática media de la raíz (RMSD) cuantifica la desviación estructural media de los átomos en comparación con una estructura de referencia, y la desviación cuadrática media de fluctuación (FMSD) mide las fluctuaciones atómicas promediadas en el tiempo alrededor de sus posiciones medias. Los dos valores son necesarios para finalizar las ejecuciones de simulación MD.
  3. Realizar análisis estructurales, incluyendo RMSD, FMSD, enlaces en H y energía libre.
  4. Dibuja los gráficos de análisis usando qtgrace_v026_win7 software y el archivo md_0_10.gro para mostrar la caja de trayectoria usando el software VMD.

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Resultados

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Como se menciona en la introducción, los estudios in vivo e in vitro demuestran la importancia de los inhibidores de la ciclofilina para simplificar la estructura de la sangliferina, reduciendo así la proliferación del bazo de ratón al interferir con el ciclo celulardel ratón 5. Además, la ciclofilina A, junto con derivados del ganoderiol F, desempeña un papel vital en el plegamiento de proteínas, las respuestas inmunitarias y la señalización cel...

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Discusión

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Se extrajo de Streptomyces una nueva sustancia natural inmunosupresora llamada SFA o receptor molecular 1nmk. Se utilizó el análisis de acoplamiento molecular para determinar las energías de unión de los ligandos construidos con la proteína objetivo. Los resultados mostraron que, de todos los ligandos diseñados, SFA difiere estructuralmente de CsA y muestra una afinidad considerable por CypA 16. La cipografía A, que posee actividad de isomerasa cis-trans ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de interés.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Autodock Autodock v4.2.6http://autodock.scripps.edu/downloads/autodock-registration/autodock-4-2-download-page/
CGenFFCGenFFv2024https://cgenff.umaryland.edu
Chemsketch Chemsketch v2024http://www.acdlabs.com/resources/freeware/
Cygwin terminal Cygwin terminal v3.6.3http://www.cygwin.com/
Gromacs tutorialGromacs tutorialv25.04 (Plucky Puffin)http://www.mdtutorials.com/gmx/complex/index.html
MGL tools MGL tools v1.5.7mgl tools 1.5.6 rc3
Open babelOpen babelv3.1.1http://openbabel.org/wiki/main_page
PyMOLPyMOLv3.1.6.1PyMOL | pymol.org
UbuntuUbuntuv25.04lhttps://ubuntu.com/download/desktop
UCSF chimeraUCSF chimerav1.19chimera-1.17.3-win64.exe

Referencias

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