Artículo de método

Preparación de bibliotecas de ADNc ultrasensibles para la secuenciación de próxima generación de microARN a partir de pequeñas vesículas extracelulares

DOI:

10.3791/67154

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13 de junio de 2025

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1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health (HMH), 2Oncology department, Georgetown University, 3Department of Medicine B, Hadassah - Hebrew University Medical Center, 4EValuate Diagnostics LLC, 5Jersey Shore University Medical Center (JSUMC), 6Illumina Inc.

En este artículo

Resumen

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Las vesículas extracelulares (VE) contienen microARN específicos de la célula que regulan las células receptoras, cuya identificación puede arrojar luz sobre su función y papel como biomarcadores. Nuestro protocolo optimizado de preparación de bibliotecas de ADNc presenta códigos de barras únicos que permiten la multiplexación de muestras y el procesamiento mejorado de EV de baja entrada, al tiempo que utiliza códigos de barras de doble índice de extremo emparejado para la compatibilidad con los secuenciadores Illumina.

Resumen

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Estudios recientes demuestran que las pequeñas vesículas extracelulares (sEV), que se encuentran en todos los biofluidos, desempeñan un papel fundamental en la comunicación intercelular mediante la canalización de proteínas, ADN y ARN. Los microARN (miARN) que se empaquetan en sEV se han convertido en reguladores críticos de entrega en las células receptoras. Dado que las sEV secretadas por células normales y enfermas transportan diferentes cargas de miARN, los estudios recientes de perfiles de sEV-miRNA sugieren que pueden ayudar a identificar nuevos biomarcadores circulantes. Sin embargo, los sEV específicos de células/enfermedades que circulan en diversos biofluidos, una vez aislados, proporcionan bajas cantidades de miARN, que generalmente son difíciles de cuantificar utilizando metodologías espectrométricas convencionales. La secuenciación de próxima generación (NGS) de ARN no codificante pequeño, que permite la amplificación de secuencias de miARN clonadas, ofrece una valiosa oportunidad para evaluar las cargas de miARN de los sEV. Desafortunadamente, los procedimientos comerciales de preparación de bibliotecas de ADNc a menudo requieren entradas de ARN muy por encima de las cantidades no cuantificables disponibles de sEV aislados.

Por lo tanto, teniendo en cuenta la robustez y las capacidades de multiplexación de nuestro procedimiento de preparación de bibliotecas de ADNc existente (es decir, inicialmente optimizado para el análisis de ARN de baja entrada, altamente degradado, fijado en formalina e incluido en parafina (FFPE)), buscamos evaluar su aplicabilidad para el análisis de miARN sEV. Es importante destacar que, teniendo en cuenta las recientes mejoras técnicas de agrupación de chips de secuenciación, buscamos adaptar nuestro enfoque de código de barras de transcripción dentro de un flujo de trabajo de preparación de bibliotecas de ADNc compatible con índices duales y emparejados para mejorar nuestras capacidades de secuenciación y multiplexación. Evaluamos la reproducibilidad y sensibilidad de esta metodología utilizando ARN extraído de 8,4 × 109 sEV en 16 réplicas, y de cantidades decrecientes de sEV de 1010 sEV a tan solo 2,5 × 107 sEV. Los datos demuestran que los 16 códigos de barras de ADN adenilado de 3' permiten una detección altamente reproducible y sensible de los perfiles de miARN sEV a través de repeticiones utilizando tan solo 3,15 pg de ARN pequeños no codificantes totales o 1,35 pg de miARN.

Introducción

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Las pequeñas vesículas extracelulares (sEVs) son partículas derivadas de células de tamaño nanométrico (~30-200 nm de diámetro) envueltas por una membrana bicapa de fosfolípidos, que se hereda de su célula de origen y que protege robustamente sus cargas moleculares 1,2. Es bien sabido que prácticamente todas las células producen y liberan sEVs en el compartimento intercelular, que a su vez pueden detectarse en la mayoría de los biofluidos (es decir, sangre, orina, saliva, etc.)2,3,4. Estudios recientes han demostrado que las cargas moleculares encapsuladas de forma estable (es decir, ADN, ARN, proteínas, lípidos, etc)5,6,7 de las sEVs, una vez en contacto o entregadas a las células receptoras, median la comunicación intercelular8. Los esfuerzos de investigación actuales se han centrado en mejorar el aislamiento de sEVs específicos de células a partir de diversos biofluidos, para identificar y monitorizar con precisión estas cargas moleculares 9,10. Teniendo en cuenta que los sEV contienen pequeños RNAs no codificantes y particularmente microRNAs (miRNAs), que conservan su función reguladora en el momento de la entrega celular, muchos estudios se han centrado en evaluar la utilidad de los miRNAs como biomarcadores que pueden revelar la condición de su célula de origen 11,12,13.

Los microARN (miARN) representan una gran clase (~2.000 conocidos en humanos) de pequeños ARN no codificantes con tamaños que oscilan entre 19 y 25 nucleótidos (nt), que se unen a sitios complementarios imperfectos en las regiones no traducidas 3' de sus dianas de ARNm y dirigen su degradación y/o represión postranscripcional14,15. Funcionalmente, se ha descrito que los miRNAs controlan muchos procesos biológicos, y la desregulación de su expresión se ha asociado con alteraciones en los procesos moleculares, bioquímicos y fisiológicos que contribuyen al inicio y desarrollo de enfermedades, incluido el cáncer 16,17,18. Es importante destacar que los estudios han demostrado que las células enfermas, y en particular las células cancerosas, no solo expresan miRNAs diferencialmente en comparación con las células normales18, sino que su empaquetamiento en sEVs también difiere19,20.

Mientras que varios estudios se centran en establecer los procesos moleculares y las vías que dirigen el empaquetamiento de las sEV en células normales y enfermas 19,21,22, los estudios de biomarcadores se centran actualmente en la identificación de pequeñas firmas distinguibles de ARN y/o miARN no codificante que son empaquetadas y secretadas por células enfermas/cancerosas específicas a través de sEVs. Por lo tanto, el aislamiento dirigido de sEV específicos de células enfermas a partir de diversos biofluidos humanos y la evaluación de sus cargas moleculares multiómicas puede permitir el desarrollo de ensayos de diagnóstico y pronóstico para la detección no invasiva de diversas enfermedades y cánceres humanos 23,24,25,26. Aunque los sEV-miRNAs son los transcritos no codificantes más estudiados, otras pequeñas especies de ARN no codificante (i.e., isoformas de miRNA (isomiRs), piwiRNAs, fragmentos de ARN de transferencia (tRFs), rRNAs, RNAs huérfanos no codificantes (oncRNAs)...) también están siendo evaluadas por su potencial utilidad como biomarcadores circulantes de sEV, con especial énfasis en la detección de diferentes cánceres 27,28,29,30,31,32.

Ventajosamente, el análisis de secuenciación de próxima generación (NGS) de pequeños transcritos de ARN no codificante (incluidos los miARN), después de su código de barras y la preparación de la biblioteca de ADNc, es ideal para la exploración de pequeñas especies de ARN no codificante conocidas y/o desconocidas contenidas en sEV circulantes, que pueden estar asociadas con enfermedades27. De hecho, la NGS de ARN pequeño sEV proporciona un enfoque de alto rendimiento para el descubrimiento de transcripciones de ARN no codificante pequeñas específicas de células que, de otro modo, permanecerían desconocidas si se evaluaran globalmente con tecnologías específicas del objetivo (es decir, PCR multiplex, microarrays, paneles personalizados, etc.) 32,33,34. Teniendo en cuenta que previamente optimizamos un protocolo de preparación de bibliotecas de ADNc ultrasensible y altamente reproducible, que desarrollamos para el análisis de ARN embebidos en parafina (FFPE) fijados en formalina (FFPE) altamente degradados y de baja concentración35,36, buscamos adaptarlo para el análisis de pequeños ARN no codificantes y miARN encapsulados dentro de sEV 37,38,39,40.

Con la interrupción del instrumento Illumina HiSeq2500, que nos proporcionó años de análisis de miRNA de doble índice de un solo extremo de alta calidad de las cargas sEV 37,40, buscamos explorar la reproducibilidad y la sensibilidad de nuestro protocolo cuando se adapta a los instrumentos de secuenciación actualizados que utilizan ahora la química de índice dual de extremo emparejado. Con la intención de conservar las capacidades de multiplexación del protocolo original, mantuvimos los 16 códigos de barras existentes para la preparación de transcripciones de ADNc de ARN pequeño antes de integrarlas dentro de la química de índice dual de extremo emparejado. Utilizando solo un par de códigos de barras i5 e i7, permitimos la preparación de una sólida biblioteca de ADNc basada en laboratorio donde el procesamiento y análisis simultáneos de hasta 16 muestras individuales mejoran la reproducibilidad analítica del ARN sEV de baja entrada. Por lo tanto, presentamos los procesos bioquímicos, los códigos de barras actualizados, los cebadores de PCR y marcadores de tamaño, y los pasos de aislamiento necesarios para generar bibliotecas de ADNc altamente reproducibles utilizando cantidades ultrabajas de miRNAs aislados de sEVs de plasma humano.

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Protocolo

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1. Todos los reactivos y oligonucleótidos se preparan de la siguiente manera:

NOTA: Todos los nucleótidos utilizados en este protocolo se detallan en la Figura 1 y el Archivo Suplementario 1 a las concentraciones que se utilizan para implementar este protocolo. Consulte el Archivo Suplementario 2 para las secuencias de cebadores.

  1. Preparar una solución madre de cóctel calibrador, que se utilizará en cada ligadura individual como control de las diferentes reacciones enzimáticas:
    1. Vuelva a suspender el oligonucleótido portador (0,5 μM) (Archivo suplementario 1) con agua libre de ARNasa.
    2. Combine los 10 calibradores (10 μL cada uno, Archivo Suplementario 1) en un solo tubo de 1,5 mL para alcanzar un stock de 100 μM, dilúyalo con el oligonucleótido portador para alcanzar la solución de 0,0052 nM y almacene a -20 °C.
  2. Vuelva a suspender cada uno de los 17 adaptadores 3' adenilados únicos (16 experimentales y 1 de prueba con código de barras) (Figura 1A) con agua libre de nucleasas a una concentración de 50 μM.
    NOTA: Cada adaptador se alícuota en tubos individuales que contienen 2,5 μL para su almacenamiento a -80 °C durante un máximo de 2 años, para evitar los ciclos de congelación y descongelación de las existencias más grandes.
  3. Vuelva a suspender los diferentes oligonucleótidos de ARN experimentales, incluido el portador de extracción de ARN (Archivo suplementario 1), el portador de ligadura de ARN 3' (archivo complementario 1), la prueba de ligadura de ARN (archivo suplementario 1) y la ligadura 3' (archivo suplementario 1; adaptador 19 nt-3' y adaptador 24 nt-3') y ligadura 5' (archivo suplementario 1; adaptador 5'-adaptador 19 nt-3' y adaptador 5'-adaptador nt-3') marcadores, a 250 ng/μL.
  4. Diluya el adaptador de 5' purificado por HPLC a 100 μM con agua libre de nucleasas (Figura 1A).
  5. Vuelva a suspender la RT y los primeros cebadores de RT/PCR de 5' y 3' a 100 μM con agua sin nucleasas (Figura 1B).
  6. Vuelva a suspender los oligonucleótidos i7 e i5 de PCR 5' e i5 de PCR a 100 μM con agua libre de nucleasas (Figura 1B).
    NOTA: Alicuone cada cebador de ADN para un máximo de 10 experimentos y almacene a -80 °C.
  7. Prepare el colorante de carga de gel de poliacrilamida (PAA), mezcle y alícuota 1 mL en tubos y almacene a -80 °C.
    1. Prepare una solución de 0,5 M Na2H2 EDTA añadiendo 18,6 g de Na2H2 EDTA a 50 mL de agua libre de nucleasas. Agregue gránulos de NaOH lentamente a la solución preparada de Na2H2 EDTA para alcanzar un pH de 8.0. Aumente el volumen hasta 100 ml con ddH2O para obtener una solución madre de 0,5 M Na2H2 EDTA (pH 8,0)
    2. Pesar 15 mg de azul de bromofenol en un tubo de 15 ml, volver a suspender el polvo en 600 μl de agua sin nucleasas, añadir 14,25 ml de formamida desionizada. Por último, añadir 150 μL de una solución de 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0. Coloque la solución final de PAA en tubos de 1 ml y almacene a -80 °C.
    3. Prepara el tinte de carga en gel de agarosa 5x.
      1. Pesar y disolver 1,86 g deNa2H 2-EDTA en 50 mL de agua libre de RNasa y ajustar el pH a 8,0 añadiendo gránulos de NaOH. Agregue agua libre de ARNasa a 100 mL para obtener una solución de EDTA de 50 mM de Na2H 2.
      2. A 5 mL de 50 mM Na2H2 EDTA, agregue 20 mg de azul de bromofenol, 20 mg de xileno cyanol FF y 2 g de Ficoll tipo-400. Agite el tubo que contiene los tres colorantes para mezclar y agregue 5 mL adicionales de 50 mM Na2H2 EDTA. Alícuota de tubos individuales de 1 ml de 5x gel de agarosa cargando colorante y almacenar a -80 °C.

2. Preparación de las muestras de ARN EV

  1. Tras el aislamiento de los sEV, evalúe su morfología mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM; Figura 2), concentración utilizando el Análisis de Seguimiento de Nanopartículas (NTA; Figura 3), y la distribución de proteínas de superficie mediante nanoimágenes de superresolución (Figura 4), o tecnología de cuantificación de sEV equivalente.
  2. Alícuota un número equivalente de sEVs en diferentes tubos, añadir RNasa-A (12,5 μg/mL) e incubar a 37 °C durante 1 h.
  3. Inicie la extracción de pequeños ARN no codificantes, incluidos los miARN, de los sEV utilizando el kit de extracción de ARN pequeño e inicie el aislamiento de la fase de ARN.
  4. Separe la fase acuosa inferior del tampón de lisis de ARN, agréguelo a un nuevo tubo y luego agregue 4 ng de oligonucleótido transportador de ARN (Archivo suplementario 1) a cada muestra de ARN, antes de realizar el aislamiento de la columna siguiendo las instrucciones del fabricante.
  5. Aspire cada muestra de ARN individual a 9,5 μL para iniciar el protocolo de preparación de la biblioteca de ADNc.

3. Configure las ligaduras del adaptador con código de barras de 3' con 16 muestras de ARN y 1 muestra de prueba

  1. Identifique 16 muestras individuales de ARN-sEV, alículas en 9,5 μL de agua libre de nucleasas en tubos de microcentrífuga siliconados de 1,5 mL y colóquelas en hielo al menos 10 minutos antes de comenzar los experimentos.
  2. Prepare el tampón de ARN ligasa 10x (sin ATP) fresco antes del experimento.
    1. En un tubo siliconado de 1,5 mL, combine 343 μL de agua bidestilada libre de nucleasas (ddH2O), 500 μL de 1 M de Tris pH 7.5, 100 μL de 1 M MgCl2, 50 μL de 20 mg/mL de albúmina sérica bovina de 20 mg/mL y 7 μL de 14 M de 2-mercaptoetanol.
    2. Mezcle la solución agitando el tubo, centrifugar durante 2 s a 2.000 × g a temperatura ambiente (RT) en una centrífuga de mesa y luego colóquela en hielo.
      NOTA: Todos los pasos que describen una "centrífuga durante 2 s" se realizan con una microcentrífuga a RT con una velocidad no superior a 2.000 × g.
  3. Descongele el cóctel calibrador de 0,0052 nM colocando el tubo en hielo durante 10 min.
  4. Prepare la mezcla maestra de ligadura para 18 reacciones en un tubo siliconado de 1,5 ml combinando 40 μL de tampón de ARN ligasa 10x, 10 μL de cóctel calibrador de 0,0052 nM y 40 μL de ddH2O sin nucleasa.
  5. Mueve y gira el tubo de 1,5 ml y colócalo en hielo.
  6. Añada 4,5 μL de la Mezcla Maestra de Ligadura a cada una de las 16 muestras de ARN sEV alícuotas individualmente, y la reacción de ligadura de prueba contiene 100 ng de oligonucleótido de prueba de ligadura de ARN (Archivo Suplementario 1) previamente alícuota y a un volumen de 9,5 μL. Desliza para mezclar y girar los tubos antes de volver a colocarlos en hielo.
  7. Transfiera las 16 muestras y la reacción de prueba a un bloque de calor durante 1 minuto a 90 °C y vuelva a transferir a hielo.
  8. Transfiera individualmente 4 μL de PEG al 50% a cada tubo, agite para mezclar y gire los tubos antes de volver a colocarlos en hielo.
  9. Descongele 2,5 μL de alícuotas de cada uno de los 17 adaptadores con código de barras de 3' (16 experimentales (#1 a #16) y adaptador de prueba (#17)) y colóquelos en hielo para descongelar.
  10. Transfiera 1 μL de cada uno de los 17 adaptadores a las 16 muestras correspondientes que contengan sEV-RNA y una muestra de prueba, con Ligation Master Mix (es decir, 4,5 μL) y 50% PEG (es decir, 4 μL).
    NOTA: Todas las soluciones y reacciones se mezclan agitando los tubos y haciéndolos girar, en lugar de pipetear las soluciones hacia arriba y hacia abajo, para evitar la pérdida de material.
  11. Prepare la enzima de ligadura K227Q truncada de ARN ligasa 2 T4 diluida agregando 10 μL de la enzima con 10 μL de ddH2O libre de nucleasa en un nuevo tubo siliconado de 1,5 mL.
  12. Transfiera 1 μL de la enzima de ligadura K227Q truncada de ARN ligasa 2 T4 diluida a cada uno de los 17 tubos (16 muestras de ARN experimental y 1 de prueba de ARN). No pipetee hacia arriba y hacia abajo, cambie las puntas entre cada tubo, mantenga los tubos en hielo, mezcle la mezcla, centrifugue y coloque los tubos en hielo.
  13. Coloque las ligaduras sobre hielo fresco en un soporte de tubo en una cubitera en la cámara frigorífica, durante la noche durante un máximo de 18 h.

4. Aislamiento PAGE de los ARN pequeños ligados del adaptador 3'

  1. Coloque los 17 tubos en un bloque de calor a 90 °C durante 1 min para desactivar la ARN ligasa T4 2, y colóquelos en hielo durante 2 min para que se enfríen.
  2. Combine 1 μL de GlycoBlue y 26 μL de NaCl libre de nucleasas 5 M en un tubo nuevo y transfiera 1,2 μL de esta solución de precipitación a cada uno de los 17 tubos.
  3. Agregue 63 μL de etanol al 100% a cada uno de los 17 tubos, cierre, mueva y gire hacia abajo durante 2 segundos antes de volver a colocar en hielo.
  4. Combine el contenido de los 16 tubos de ARN sEV en un solo tubo siliconado de 1,5 ml, manteniendo separado el tubo de ligadura de ARN de prueba.
  5. Invierta el tubo que contiene las muestras combinadas 3 veces para mezclar, centrifugar brevemente durante 2 s y colocar en hielo durante 60 minutos para que precipite.
  6. Prepare un gel grande (16 x 20 cm2) de poliacrilamida (PAGE) al 15% de la siguiente manera:
    1. Siliconar (es decir, usar una solución a base de silicona) y fundir las placas de vidrio cortas y largas junto con espaciadores de 0,1 cm.
    2. Prepare la mezcla de gel PAGE al 15% combinando 9 mL de diluyente del sistema, 18 mL de concentrado del sistema, 3 mL de tampón del sistema, 240 μL de APS (9%) y 12 μL de TEMED en un tubo cónico de 50 mL.
    3. Transfiera rápidamente la solución entre las placas de vidrio con una pipeta de 30 mL. Antes de que el gel polimerice, agregue un peine de 14 pocillos (0,1 cm de grosor) y coloque el gel en posición vertical durante 30 minutos a RT.
  7. Recuperar el tubo con las muestras de ARN combinadas del hielo y centrifugarlo a 16.000 × g durante 60 min a 4 °C.
  8. Mientras tanto, termine de configurar el PAGE al 15% retirando suavemente el peine, limpie los pocillos con H2O sin nucleasas con una botella rociadora sobre un fregadero, antes de secar y configure el PAGE al 15% en el aparato de gel, donde los depósitos superior e inferior se llenan con una solución de Tris-Borate EDTA (TBE) 0,5x, antes de una pre-ejecución de 30 minutos a 450 V.
  9. Retire el tubo de la centrífuga (Paso 4.6) y seque cuidadosamente el pellet de ARN con una pipeta Pasteur con una punta sin filtro de 10 μL en su extremo conectada a un sistema de vacío, sin alterar el pellet.
  10. Vuelva a suspender el pellet de ARN que contiene las 16 ligaduras de ARN precipitadas en 20 μL de ddH2O sin nucleasa y agregue 20 μL de solución de carga de gel de PAA. Agite el tubo para mezclar, centrifugar durante 2 s y colóquelo en hielo.
  11. Reemplace 0.5x TBE de aparato de gel por 0.5x TBE nuevo.
  12. Coloque un tubo con una escalera de tamaño de ARN de 20 pb, dos tubos con cada uno de los dos marcadores de tamaño de ADN corto de ligadura 3' (Archivo complementario 1) y un tubo que contenga el oligonucleótido de prueba de ligadura de ARN (es decir, ligado con un adaptador de código de barras # 17).
  13. A cada uno de los tubos (es decir, escalera, oligonucleótidos cortos de ADN de ligadura 3' y prueba de ligadura de ARN), agregue 20 μL de solución de carga de gel de PAA.
  14. Coloque el tubo de muestra de 16 ARN ligado y el tubo de ensayo de ligadura de ARN 1 a 90 °C durante 1 minuto y vuelva a colocar en hielo.
  15. Reemplace el tampón TBE 0.5x de los depósitos inferior y superior (es decir, agregue tampón por debajo del nivel del pozo para que no haya contaminación cruzada entre los pozos durante la carga) y cargue la escalera en los extremos del gel, la ligadura de prueba de ARN, los dos marcadores de tamaño de ADN cortos a ambos lados del pozo que contienen las 16 ligaduras combinadas de ARN con código de barras de 3' (consulte la Figura 5).
  16. Haga funcionar el gel PAGE al 15% con todas las muestras durante 90 minutos a 450 V (~35 mA) en condiciones frías (es decir, con ventiladores que soplan aire en las placas de vidrio).
  17. Retire el 15% de PAGE del vidrio y rocíe ligeramente con la solución de SYBR Gold (10 μL de SYBR Gold en 25 mL de 0.5x TBE) y déjelo reposar inclinado durante 5 minutos en la oscuridad.
  18. Coloque el gel en un transiluminador de luz azul (Figura 5) y alinee el adaptador 19 nt-3' y los oligonucleótidos de ADN corto del marcador de tamaño del adaptador 24 nt-3' con una regla y extirpe el área del gel que contiene las construcciones de miARN ligadas (la Figura 6 muestra la ligadura 3' y la construcción resultante). Por separado, extirpe la banda superior de la ligadura de prueba de ARN, que también se utilizará para una ligadura de prueba 5' al día siguiente.
  19. Coloque las dos piezas de gel extirpadas separadas (es decir, para 16 muestras de ARN y para la ligadura de prueba) en diferentes tubos rompedores de gel de 0,5 mL colocados en tubos siliconados de 1,5 mL, centrifugar a 16.000 × g durante 3 min en RT y luego vuelva a suspender las dos piezas de gel fragmentadas con 300 μL de solución de NaCl de 400 mM, cierre los tubos, y sellarlos con parafilm.
  20. Colocar los tubos en un agitador con agitación a 1.100 rpm a 4 °C, durante la noche (16-17 h).

5. Ligadura del adaptador de 5'

  1. Transfiera dos geles fragmentados separados y sus soluciones (muestras con código de barras de 16 x 3' (códigos de barras # 1 a # 16) y ARN de prueba con código de barras de 3' (código de barras # 17)) a dos tubos de filtro separados de 5 μm, cada uno colocado en tubos siliconados de 1,5 mL, séllelos con parapelícula y centrifugue durante 5 minutos a 2,300 × g a RT.
  2. Agregue 950 μL de etanol al 100% a cada solución filtrada, cierre los tubos, invierta para mezclar, centrifugue durante 2 s, selle los tubos con parafilm y colóquelos en hielo durante 1 h.
  3. Prepare un caldo acuoso de DMSO al 50% combinando 1 ml de agua sin nucleasas con 1 ml de DMSO, envuelva el tubo en papel de aluminio y guárdelo en RT en la oscuridad.
  4. Prepara un gel PAGE al 15% y ejecútalo previamente, siguiendo los pasos descritos en la sección 4.6.
  5. Centrifugar los tubos que contienen las 16 muestras de ARN ligadas 3' y la ligadura de ARN de prueba a 16.000 × g durante 60 min a 4 °C para precipitar los ARN ligados.
  6. Retire con cuidado el sobrenadante sin tocar los gránulos de ARN y seque al vacío.
  7. Vuelva a suspender el gránulo ligado 3' de 16 muestras de ARN y analice el ARN en 8 μL de ddH2O libre de nucleasas sin pipetear hacia arriba y hacia abajo. Agite ligeramente los tubos para mezclar, centrifugue durante 2 s (2.000 × g) a RT y coloque los tubos en hielo.
  8. Prepare el tampón de ARN ligasa 10x (con ATP) mezclando 500 μL de 1 M de Tris (pH 7,5), 100 μL de 1 M de MgCl2, 50 μL de 20 mg/mL de BSA acetilado, 200 μL de 10 mM de ATP, 7 μL de 2-mercaptoetanol 14 M y 143 μL de agua libre de ARNasa en un tubo de 1,5 mL.
  9. Agregue 2 μL de tampón de ARN ligasa 10x (es decir, con ATP), 1 μL de adaptador de 100 μM 5' y 4 μL de DMSO acuoso al 50% a cada tubo. Agite para mezclar, gire durante 2 segundos a RT, luego configure el tubo a 90 °C durante 1 minuto para desnaturalizar el ARN y vuelva a colocarlo en hielo.
  10. Añadir 3 μL de DMSO al 50%, frotar para mezclar, girar para pelletizar, añadir 3 μL de ARN ligasa T4 a cada tubo, agitar los tubos, centrifugar durante 2 s a RT y colocar los tubos en el agitador a 37 °C durante 75 min.
    NOTA: No pipetee hacia arriba y hacia abajo.
  11. Prepare la escalera de ADN de 20 nt y dos tubos separados que contienen los oligonucleótidos de ADN largo del marcador de tamaño de ligadura 5' (Archivo suplementario 1; adaptador 5'-19 nt-3' y adaptador 5'24 nt-3'), y agregue 20 μL de PAA a cada uno de los tubos.
  12. Una vez completada la ligadura del adaptador 5', agregue 20 μL de PAA a cada una de las dos ligaduras (es decir, 16 muestras de ARN y ARN de prueba), mezcle agitando, gire hacia abajo y ajuste a 90 °C durante 1 minuto, después de lo cual vuelva a colocar las trompas en hielo.
  13. Vacíe los depósitos superior e inferior de aparatos de gel y agregue una solución fresca de 0,5x TBE por debajo del nivel de los pozos del depósito superior.
  14. Cargue la escalera en el extremo del gel, la muestra de ARN de prueba ligada 5', los dos oligonucleótidos de ADN largo con marcador de tamaño (es decir, adaptador 5'-adaptador 19 nt-3' y adaptador 5'-adaptador 24 nt-3') en los pocillos que rodean el pocillo donde se cargarán las muestras de ARN 16 ligado 5' (la Figura 6 muestra la ligadura 5' y la construcción resultante). Haga funcionar el gel durante 90 minutos a 450 voltios.
  15. Una vez finalizada la ejecución, retire el gel del aparato y del vaso y rocíelo con una solución de SYBR Gold (es decir, 10 μL de SYBR Gold en 25 mL de 0,5x TBE) y déjelo reposar en la oscuridad durante 5 minutos.
  16. Utilizando el adaptador 5'-19 nt-3' y los marcadores de tamaño de los marcadores de tamaño de 5'-24 nt-3' adaptadores de ADN largo como guías de tamaño, extirpe directamente la sección del gel que contiene las muestras de 16 ARN ligadas 5' (Figura 7).
    NOTA: La ligadura de ARN de prueba se evalúa en el gel para demostrar que la ligadura del adaptador 5' permite un cambio de tamaño equivalente a los marcadores de tamaño. La ligadura de ARN de prueba no se extirpa del gel; solo las 16 muestras de ARN combinadas ligadas.
  17. Transfiera la pieza de gel extirpada que contiene las 16 muestras de ARN ligado a un tubo rompedor de gel de 0,5 mL colocado en un tubo de 1,5 mL, centrifugue a 16.000 × g durante 3 min a RT y, a continuación, añada 300 μL de 300 mM de NaCl y 1 μL de 100 μM 3' RT/PCR cebador (Figura 1B) a las piezas de gel trituradas en el tubo.
  18. Sellar el tubo con parafilm y colocar en un agitador agitando a 1.100 rpm a 4 °C, durante la noche (17-18 h) en una cámara frigorífica.

6. Transcripción inversa de los pequeños ARN y miARN no codificantes ligados a 5' y 3' con código de barras

  1. Pipetear la solución del tubo que contiene el gel triturado en un tubo de filtro de 5 μm insertado en un tubo libre de RNasa siliconado de 1,5 mL y girar brevemente para permitir que la solución atraviese el filtro.
  2. Agregue 950 μL de etanol al 100% a esta solución filtrada, invierta el tubo para mezclar, centrifugue durante 2 s y colóquelo en hielo durante 60 minutos.
  3. Precipitar el pellet de ARN por centrifugación del tubo a 16.000 × g a 4 °C durante 1 h.
  4. Recupere el tubo, retire el sobrenadante con cuidado sin tocar el pellet y seque al vacío el pellet antes de volver a suspenderlo en 5,6 μL de H2O libre de nucleasas.
  5. Configure la reacción RT agregando 3 μL de tampón de primera cadena 5x, 4,2 μL de dNTP 10x (cada uno a 2 mM) y 1,5 μL de ditiotreitol (DTT) al tubo. Desliza para mezclar y gira durante 2 s.
  6. Configure la reacción a 90 °C durante 30 s exactamente y luego transfiera el tubo a un bloque a 50 °C durante 2 minutos.
  7. Inicie la reacción RT añadiendo 0,75 μL de enzima transcriptasa inversa a la solución, agite para mezclar y ajuste a 50 °C durante 35 min.
  8. Transfiera el tubo a 95 °C durante 1 min para desnaturalizar la enzima y las hebras de ADNc/ARN, luego agregue 95 μL de H2O sin RNasa, agite el tubo para mezclar y colóquelo en hielo durante 2 min. Este tubo contiene ADNc generado a partir de las 16 muestras de ARN, cada una con un código de barras de 3' por separado.

7. Realice la prueba de PCR y amplificación a gran escala

  1. Prepare un tampón de PCR 10x fresco combinando 304 μL de H2O sin nucleasas, 125 μL de 2 M de KCl, 50 μL de 1 M de Tris pH 8.0, 10 μL de 1 M MgCl2, 5 μL de Triton X-100 al 1% y 6 μL de 1 M 2-mercaptoetanol en un tubo que se pueda almacenar en hielo.
  2. Ensamble una reacción de PCR piloto/de prueba para el ADNc producida en el paso 6.8 (arriba) combinando 67 μL de H2O libre de nucleasas con 10 μL de tampón de PCR 10x, 10 μL de 10x dNTP, 0,5 μL de cebador de PCR de 100 μM 5', 0,5 μL de cebador de PCR de 100 μM 3', 10 μL de biblioteca de stock de ADNc, y 2 μL de 50x Taq polimerasa en un tubo de PCR nuevo.
    NOTA: Antes de realizar las amplificaciones de PCR, configure el instrumento estableciendo dos archivos diferentes de la siguiente manera: Para el archivo # 1: 94 °C durante 45 s, 50 °C durante 85 s y 72 °C durante 60 s durante 12 ciclos y 4 °C; y para el archivo #2: 94 °C durante 45 s, 50 °C durante 85 s y 72 °C durante 60 s durante 2 ciclos, y 4 °C.
  3. Para la reacción de PCR piloto/prueba, coloque el tubo de PCR que contiene los 100 μL de la reacción de PCR en el termociclador y ejecute el archivo # 1.
  4. Una vez que se complete el archivo # 1, abra el tubo de PCR y transfiera 12 μL de la reacción a una microcentrífuga de 1.5 mL que contenga 3 μL de tinte de carga de gel 5x. Cierre el tubo y escriba "12 ciclos" en la tapa.
  5. Tome el tubo de PCR, colóquelo en el termociclador e inicie el Archivo # 2.
  6. Una vez que el archivo # 2 esté completo, transfiera 12 μL de la reacción de PCR a un tubo de 1.5 mL que contenga 3 μL de tinte de carga de gel 5x y escriba "14 ciclos" en su tapa.
  7. Repita las amplificaciones de PCR cuatro veces seguidas más (es decir, dos ciclos de PCR cada uno), mientras transfiere 12 μL de producto de PCR al final de cada amplificación y, a su vez, obtenga cuatro tubos diferentes, marcados como 16, 18, 20 y 22 ciclos.
  8. Cargue la escalera de 20 nt y cada uno de los productos amplificados por PCR en una agarosa al 2,5% y ejecute el gel en 0,5x TBE durante 30 minutos a 120 V.
  9. Identifique el ciclo óptimo de amplificación de PCR (Figura 8A), en función de la proporción y la presencia de dímeros de cebadores (banda inferior) y el ADNc amplificado (banda superior).
    NOTA Teniendo en cuenta que la entrada total de ARN con 16 muestras puede ser inferior a 1 ng, se espera que los dímeros de cebadores generen un producto más rápido y en mayores cantidades que el ADNc purificado. Por lo tanto, el ciclo de PCR adecuado generalmente se selecciona entre 18 y 22 ciclos. En la Figura 8A, el ciclo de PCR adecuado para esta biblioteca es 20. En la Figura 8B, se detalla el tamaño de la construcción de PCR.
  10. Una vez identificado el ciclo de amplificación de PCR adecuado, configure una PCR negativa (sin ADNc) y cuatro reacciones de PCR positivas de 100 μL (es decir, cada una con 12 μL de ADNc).
    1. Para simplificar la preparación de las reacciones de PCR, configure una mezcla maestra de PCR (es decir, para 4,5 reacciones) en un tubo de 1,5 ml combinando 292,5 μL deH2Olibre de nucleasas, 45 μL de tampón de PCR 10x, 45 μL de dNTP 10x, 3,25 μL de cebador RT/PCR de 3' (Figura 1B) y 2,25 μL de cebador de PCR de 5' (Figura 1B). Invierta este tubo para mezclar y girar para recogerlo en el fondo del tubo.
    2. Transfiera 86 μL de la mezcla maestra de PCR a cada uno de los cuatro tubos de PCR de 0,5 mL.
    3. Agregue 12 μL de biblioteca de ADNc (almacenada en hielo), luego 2 μL de polimerasa Taq de titanio 50x en cada uno de los 4 tubos de PCR, y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
    4. Prepare el tubo de reacción de PCR sin plantilla agregando 77 μL de H2Osin nucleasas, 10 μL de tampón de PCR 10x, 10 μL de dNTP 10x, 0,5 μL de cebador de PCR 5', 0,5 μL de cebador de PCR de 3' y 2 μL de polimerasa Taq 50x a un tubo de PCR separado y pipeteando hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
    5. Configure los tubos de PCR en el termociclador utilizando el ciclo de PCR identificado en el paso 7.9 y configure un nuevo programa en el termociclador para amplificar según sea necesario.
  11. Prepare un gel de agarosa al 2,5% con 0,5x TBE y bromuro de etidio, y transfiera 12 μL de cada tubo de PCR a tubos individuales que contengan 3 μL de colorante de carga de gel 5x.
  12. Prepare la escalera de 20 nt combinando 3 μL de escalera con 9 μL de H2O sin nucleasa y 3 μL de colorante de carga de gel.
  13. Cargue el gel, hágalo funcionar durante 30 minutos a 120 V y verifique que la amplificación de PCR sea similar entre las cuatro reacciones diferentes y que el control sin plantilla esté vacío (Figura 8C).
  14. Combine las cuatro reacciones de PCR entre dos tubos de microcentrífuga siliconados de 1,5 mL (es decir, dos tubos que contengan 90 μL de producto cada uno) y agregue 18 μL de NaCl 5 M y 800 μL de etanol al 100% en cada uno de los dos tubos.
    1. Invierta los tubos para mezclar y almacene a -20 °C para precipitar durante la noche.

8. Purificación de la biblioteca amplificada por PCR

  1. Centrifugar los dos tubos que contienen las reacciones PCR positivas mezcladas a 16.000 × g durante 60 min a 4 °C.
  2. Después de 60 minutos, retire el sobrenadante, seque al vacío los gránulos de ADN y vuelva a suspenderlos en 19,5 μL de tampón 1x y luego agregue 0,5 μL de enzima PmeI.
  3. Configure los digerentes de PmeI a 37 °C durante 2 h para eliminar cualquiera de los marcadores de tamaño de ADN que corrían en los pocillos adyacentes (es decir, adaptador de 19 nt-3', adaptador de 24 nt-3') o portadores de ARN (es decir, portador de extracción de ARN, portador de ligadura de ARN posterior a 3') contaminantes potenciales (es decir, consulte los sitios de PmeI incluidos en los cebadores de ARN y ADN en el Archivo complementario 1)
  4. Ejecute los dos digestores en tres pocillos diferentes de un gel de agarosa al 2,5% utilizando TBE 0,5x para evitar acumular un exceso de dímeros de cebadores en un solo pocillo y crear un frotis.
    1. Agregue 3 μL de colorante de carga de gel 5x a cada uno de los digestos, combine los dos digestos y luego cargue 16.5 μL en tres pocillos adyacentes separados.
    2. Cargue la escalera de tamaño de ADN de 20 nt en los pocillos finales del gel y haga funcionar el gel durante 90 min a 150 V (Figura 8D).
  5. Para purificar las bibliotecas de ADN, extirpe las bandas superiores de PCR de los tres carriles adyacentes del gel y transfiéralas a un tubo nuevo de 1,5 ml.
  6. Purifique la biblioteca amplificada de PCR utilizando un kit de extracción en gel, siguiendo las instrucciones del fabricante, y cuantifique el producto de ADN purificado utilizando un fluorómetro, siguiendo las instrucciones del fabricante.

9. Amplificación PCR final para añadir códigos de barras compatibles con el secuenciador

  1. Prepare una nueva mezcla tampón de PCR 10x como la descrita en el paso 7.1.
  2. Configure las reacciones de PCR incluyendo un control negativo (sin amplicones) y tres reacciones de PCR utilizando 0,75 ng del producto de PCR purificado a partir de la primera amplificación de PCR en cada uno de los tres tubos de la siguiente manera:
    1. Configure tres reacciones de PCR individuales mezclando 75 μL de ddH2O, 10 μL de tampón de PCR 10x, 10 μL de 10x dNTPs, 1 μL de cebador de PCR 5' 2 nd (es decir, cebador i503 (Figura 1B)), 1 μL de cebador 3' PCR2nd (es decir, cebador i702 (Figura 1B)), 1 μL de producto PCR (es decir, 0,75 ng de producto de1ª PCR purificado en gel) y 2 μL de polimerasa Taq de titanio.
    2. Configure el control de PCR negativo (es decir, sin plantilla de ADN) mezclando 76 μL de ddH2O, 10 μL de tampón de PCR 10x, 10 μL de 10x dNTPs, 1 μL de cebador de PCR 5' 2 (es decir, cebador i503 (Figura 1B)), 1 μLde cebador PCR 3' 2 (es decir, cebador i702 (Figura 1B)), y 2 μL de Taq polimerasa.
    3. Configure las cuatro reacciones de PCR (es decir, un control negativo y tres positivos) en un termociclador programado de la siguiente manera: 72 °C durante 3 min, 95 °C durante 30 s y 95 °C durante 10 s, 55 °C durante 30 s, 72 °C durante 30 s durante 9 ciclos, y luego 72 °C durante 5 min, y una retención final a 10 °C.
  3. Una vez completados los ciclos de PCR, tome 10 μL de la mezcla de reacción y agregue 3 μL de colorante de carga, y evalúe los productos en un gel de agarosa al 2,5% como se muestra en la Figura 9A, junto con la escalera de 20 nt.
  4. Tras la validación del tamaño del producto de PCR (es decir, la banda superior de PCR que funciona a 164 pb, como se muestra en la Figura 9B y la Figura 6 para ver el tamaño y los detalles de la construcción final) y la distribución de la banda, combine los productos de PCR en dos tubos agregando a cada 135 μL de producto de PCR (es decir, 90 μL + 45 μL), 13,5 μL de NaCl 5 M, y 650 μL de etanol al 100%, y precipitar a -20 °C durante la noche.
  5. Al día siguiente, centrifugar los dos tubos de PCR a 16.000 × g durante 60 minutos a 4 °C.
  6. Seque cada pellet, vuelva a suspender con 19,5 μL de tampón PmeI 1x y agregue 0,5 μL de PmeI durante 2 h a 37 °C en un agitador para eliminar aún más cualquiera de los marcadores de tamaño que corrían en los pocillos adyacentes (es decir, adaptador de 19 nt-3', adaptador de 24 nt-3') o portadores de ARN (es decir, portador de extracción de ARN, portador de ligadura de ARN posterior a 3') contaminantes.
  7. Colocar los productos digeridos en tres pocillos de un gel de agarosa al 2,5% y separar a 150 V durante 90 min.
  8. Se extirpa la banda superior, que corre a 164 pb (Figura 9C), y se purifica el producto de ADN utilizando un kit de aislamiento de ADN y se cuantifica con un fluorómetro.
  9. Ejecute el producto final de PCR en un chip de ADN para validar el tamaño, la concentración y la pureza de la biblioteca antes de las diluciones y el análisis con un secuenciador.
  10. Transfiera el archivo de datos FASTQ a la canalización de RNAworld para el recorte del adaptador, la demultiplexación y la alineación con el genoma humano, antes de los análisis de miARN, como se describió anteriormente41. Alternativamente, utilizando el script presentado en el Archivo Suplementario 3, demultiplexe las lecturas del archivo FASTQ y procese posteriormente utilizando una tubería analítica de ARN pequeño de su elección.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Como se detalla en el protocolo anterior, describimos el procesamiento simultáneo de hasta 16 muestras individuales de ARN de pequeñas vesículas extracelulares (sEV) (es decir, para el análisis de pequeños ARN no codificantes y miARN), que se analizan juntas dentro de una sola biblioteca, después de someterse a un código de barras de 3'. Los sEVs seleccionados para nuestros análisis se aislaron por ultracentrifugación, como se describió anteriormente37,40, a part...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemos desarrollado un protocolo de preparación de bibliotecas de ADNc para la secuenciación de próxima generación (NGS) reproducible y sensible de ARN no codificantes, incluidos los microARN (miARN) aislados de manera eficiente de pequeñas vesículas extracelulares (sEV). Teniendo en cuenta que se puede recuperar una cantidad limitada de pequeños ARN y miARN no codificantes de sEV aislados global o selectivamente, buscamos optimizar nuestro procedimiento de preparación de bibliotecas de A...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O.L. es un fundador no empleado de EValuate Diagnostics, Inc con un pequeño porcentaje de capital en la empresa. Los demás autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deseamos agradecer al laboratorio del Dr. Thomas Tuschl por su apoyo y por proporcionar acceso a la tecnología original desarrollada en su laboratorio, así como por permitirnos acceso a la cartera de productos de RNAworld.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1% Triton X-100 InvitrogenHFH10
10 mM ATP AmbionAM8110G
10x dNTPs AmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific 15581044
14 M MercaptoethanolSigmaO3445I-100 
Escalera de 20 nt Jena BioscienceM-232S
20 mg/mL Albúmina sérica bovinaSigmaB8894-5ML 
50x Titanio Taq Laboratorios Clontech 
Persulfato de amonioFisher Scientific 7727-54-0
Transiluminador de luz azul- Safe Imager 2.0 ThermofisherG6600
BRL Sistema de electroforesis de gel vertical con placas y peines de vidrioGIBCOV16
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD9170-5VL
Microcentrífuga Eppendorf 5424RUSA scientific4054-4537Q
Eppendorf ThermomixerUSA scientific4053-8223Q
Tubo de filtro con Filtro de 5 mmIST Engineering Inc.5388-50
Tubos de microcentrífuga siliconados de baja retención de Fisherbrand 1,5 mLFisher Scientific02-681-320
Tubo rompedor de gel 0,5 mLIST Engineering Inc.3388-100
Aparato de electroforesis en gel 7 cm x 10 cm- Mini-sub Cell GT con bandejas de gel y peinesBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Illumina NextSeq 1000/2000 secuenciador Illumina20047256
Jersey-Cote (solución basada en silicio)LabScientific, Inc 1188
KCl 2 MAmbionAM9640G
MgCl2 1 MAmbionAM9530G
Minifuge centrífuga personal de doble rotorUSA scientific2641-0016
Modelo V16 Aparato de electroforesis en gel de poliacrilamida, gafas, peines y espaciadoresCiore Life Science21070010
OligonucleótidosIDTDefinido durante el pedido
Owl EasyCast B2 mini sistema de electroforesis- con bandejas de gel y peinesThermofisher ScientificB2
Qiaquick Gel Extraction kit Qiagen28704
Qubit FluorómetroThermofisher ScientificQ33238
Enzima de restricción PmeI y 10x Cut Smart BufferNEBR0560S
Transcriptasa inversa- Superíndice IIIThermoFisher12574026
agua libre de RNasa AmbionAM9932
Agitador- Eppendorf ThermomixerEppendorf 5385000024
SeaKem LE agarose Lonza50002
Kit de transcripción inversa Superscript III Invitrogen18080-044
SYBR GoldLife Technologies S11494
Titanio Taq PolimerasaTakara639208
T4 ARN Ligasa 1 NEBM0204S
T4 ARN ligasa 2 truncado K227Q NEB0351L
TEMEDFisher Scientific O3446I-100
Termociclador con tapa calefactadaBiosystem Applied Biosystem4359659
Tris 1 M pH 7.5 Invitrogen15567027
Tris 1 M pH 8.0AmbionAM9855G
UltraPure Sequagel sistema concentrado, diluyente y tampónNational DiagnosticsEC-833
639208

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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