Artículo de método

Un modelo de ratón de cicatrices hipertróficas similares a las humanas impulsadas por mecanotransducción

DOI:

10.3791/67156

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29 de noviembre de 2024

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1Department of Surgery, University of Arizona, 2Department of Biomedical Engineering, University of Arizona

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo explicará cómo establecer un modelo murino de cicatrización hipertrófica que aumente la señalización de mecanotransducción para simular una cicatrización similar a la humana. Este método consiste en aumentar la tensión mecánica a través de una incisión en cicatrización en un ratón y utilizar un dispositivo especializado para crear tejido cicatricial excesivo y reproducible para análisis histológicos y bioinformáticos detallados.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cicatrización hipertrófica (HTS, por sus siglas en inglés) es un proceso anormal de cicatrización de heridas que resulta en la formación excesiva de tejido cicatricial. Durante la última década, hemos demostrado que la mecanotransducción, la conversión de estímulos mecánicos en respuestas celulares, impulsa la cicatrización excesiva de las cicatrices fibróticas. Un modelo de ratón para evaluar la cicatrización hipertrófica similar a la humana sería una herramienta esencial para examinar diversas terapias y su capacidad para reducir la cicatrización y mejorar la curación. En concreto, nuestro laboratorio ha desarrollado un modelo de herida murina que aumenta la tensión mecánica para promover un HTS similar al humano. Este protocolo utiliza dispositivos de carga biomecánicos, hechos de expansores palatinos modificados de 13 mm, cuyos brazos se colocan a ambos lados de la incisión y se separan gradualmente para aplicar una tensión continua a través del lecho de la herida durante la cicatrización. A lo largo de casi dos décadas de uso, este modelo ha avanzado significativamente para mejorar la eficacia y la reproducibilidad. Utilizando el modelo murino HTS, se puede inducir que las cicatrices fibróticas dérmicas significativas son histológicamente comparables a las cicatrices hipertróficas humanas. Este modelo murino proporciona un entorno para desarrollar productos biológicos implicados en el tratamiento de la HTS y las afecciones relacionadas con la mecanotransducción, como la respuesta a cuerpos extraños.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cicatrización de heridas, el proceso por el cual el cuerpo intenta reparar el tejido dañado y reconstruir la barrera cutánea, puede resultar en una cicatrización atípica si sus procesos de hemostasia, inflamación, proliferación y remodelación son irregulares. La cicatrización hipertrófica (HTS) es un ejemplo de cicatrización irregular de heridas, caracterizada por la deposición excesiva de matriz extracelular y tejido conectivo en el sitio de la lesión, lo que resulta en la formación de un área de tejido cicatricial agrandada 1,2,3. Las áreas del cuerpo que se someten a estimulaciones mecánicas repetidas de estiramiento, como alrededor de las articulaciones o en la cara, son más propensas a desarrollar HTS y fibrosis 4,5,6,7,8,9,10. Nosotros y otros hemos demostrado que el estiramiento mecánico a través de un lecho de herida promueve la formación de HTS a través de la activación de las vías de mecanotransducción, la conversión de estímulos mecánicos en respuestas celulares.

La HTS no solo implica procesos biológicos complejos, sino que también conlleva importantes desafíos sociales, médicos y económicos para las personas afectadas. Las personas afectadas pueden luchar contra la autoestima y la depresión, especialmente cuando las cicatrices están en áreas visibles como la cara y las manos 1,9,10,12. Artículos de revisión científica indican que la prevalencia de HTS varía entre 32% y 72% en Estados Unidos10,13. La gravedad de estos problemas estéticos, especialmente en los casos de lesiones graves por quemaduras en la región facial, se ve subrayada por el creciente número de casos de trasplante facial completo para mejorar la apariencia10. Estas cicatrices también pueden causar deficiencias funcionales al restringir el movimiento 6,14, y a menudo se requiere intervención quirúrgica para extirpar las cicatrices y restaurar la movilidad10. El costo del tratamiento con HTS puede ser sustancial, incluidos los gastos de cirugía, tratamientos, fisioterapia o incluso atención a largo plazo 1,10. Solo en los Estados Unidos, el costo anual del tratamiento del HTS supera los $4 mil millones10.

Teniendo en cuenta la omnipresencia de la HTS y las medidas extremas tomadas para abordar sus complicaciones, las terapias convencionales (p. ej., escisión quirúrgica, inyecciones de corticosteroides y terapia con láser) siguen siendo muy variables 1,2,15,16,17. Si bien estos tratamientos pueden ofrecer alivio en algunos casos, pueden ser insuficientes debido a la naturaleza compleja de la patología cicatricial. Factores como las diferencias genéticas entre los individuos y una comprensión incompleta de los mecanismos que impulsan la HTS hacen que las estrategias terapéuticas permanezcan clínicamente insatisfactorias 18,19,20. El futuro de la terapia HTS parece estar en nuevos enfoques innovadores que se dirigen a los impulsores mecanicistas celulares de HTS, como la mecanotransducción11,21, que hemos demostrado ampliamente que impulsa la cicatrización excesiva de cicatrices fibróticas 5,6,7,8,11,21,22,23,24,25. Específicamente, habíamos desarrollado previamente un modelo murino que aumenta la tensión mecánica de la herida para promover un HTS9 similar al humano. Sin embargo, después de casi dos décadas de uso, el modelo ha avanzado significativamente para mejorar la eficacia y la reproducibilidad. Este protocolo permitirá a los investigadores utilizar mejor un modelo de ratón HTS actualizado y optimizado para explorar las poblaciones celulares y los impulsores detrás de la cicatrización excesiva. El objetivo general de este método es proporcionar a los investigadores un protocolo diseñado para producir cicatrices hipertróficas similares a las humanas en ratones.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se obtuvo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Arizona para todos los experimentos (número de control: 2021-0828). Este protocolo utiliza ratones machos C57BL/6J de 15 semanas de edad, aunque podría aplicarse a otras edades y cepas 9,26.

1. Creación del dispositivo de carga biomecánico HTS

NOTA: La modificación de los expansores palatinos en el dispositivo HTS puede ocurrir en cualquier momento antes del experimento.

  1. Tome el expansor palatino sin modificar y preséntelo en el núcleo del espacio de creación o en el núcleo de fabricación con las especificaciones de acuerdo con la Figura 1A,B.
    NOTA: Si no hay ningún espacio de creación o núcleo de fabricación disponible, continúe con los siguientes pasos.
  2. Utilice una herramienta de doblado de alambre Mini Universal Bender (MUB) para modificar el expansor palatino para que se ajuste a las especificaciones de la Figura 1A,B.
  3. Coloque el dispositivo plano sobre una superficie como se muestra en la Figura 1A1.
  4. Doble los brazos 90° hacia arriba para los brazos superiores y 90° hacia abajo para los brazos inferiores cuando el dispositivo quede plano con el MUB como se ve en la Figura 1A2. Consulte la Figura 1A3 para ver la apariencia del dispositivo cuando descansa plano sobre una superficie, donde los brazos ahora están perfectamente paralelos con el cuerpo del dispositivo.
  5. Doble cada brazo hacia atrás en la página 90° a lo largo del eje de la línea punteada como se ve en la Figura 1A4. Consulte la Figura 1A5 para ver el dispositivo después de doblarlo.

2. Depilación e incisión inicial en el postoperatorio día 0 (POD 0)

NOTA: Limpie y autoclave varios juegos de instrumentos quirúrgicos antes de la cirugía (p. ej., tijeras de disección, bisturí, pinzas Adson, destornillador de agujas). Prepare suturas 5-0 esterilizadas para su uso y tenga a mano un marcador quirúrgico.

  1. Limpie el espacio operativo con etanol en aerosol al 70%.
  2. Coloque una almohadilla térmica a 35 °C en la mesa de preparación prequirúrgica. Pega una almohadilla absorbente sobre la almohadilla térmica. Coloque otra almohadilla absorbente sobre la almohadilla anterior (para recoger el vello afeitado). Coloque el cono (o los conos) de anestesia en la almohadilla absorbente.
    NOTA: [Opcional] Si dispone de un extractor de humos de sobremesa, coloque el cono cerca del espacio de trabajo y encienda la succión.
  3. Coloque el ratón en la cámara de inducción de anestesia con isoflurano al 1-3% y flujo de oxígeno de 2 L/min hasta que los ratones respiren tranquilamente (2-3 min).
  4. Inserte la nariz de cada ratón en la abertura del cono nasal, permitiendo la inhalación de anestesia compuesta por isoflurano al 1-3% con 2 L/min de oxígeno. Confirme la anestesia adecuada por la falta de reacción a un pinzamiento del dedo del pie. Aplique ungüento lubricante oftálmico en los ojos del ratón.
  5. Use una maquinilla de afeitar eléctrica para afeitar el vello del dorso en el área como se ve en la Figura 1C.
  6. Aplique la pasta depilatoria con un dedo enguantado o un hisopo de algodón sobre la piel, cubriendo el área afeitada. Después de 45 s, limpie la pasta con una gasa y luego con un hisopo con alcohol. Limpie el dorso con otro hisopo con alcohol para eliminar la pasta depilatoria, dejando un parche sin pelo (Figura 1C).
    NOTA: Es fundamental usar una cantidad moderada de pasta, retirar la pasta de inmediato y limpiar el mouse después de quitar la pasta para evitar quemaduras dérmicas por la pasta depilatoria. La piel murina es delgada, lo que la hace susceptible a quemaduras químicas rápidas que pueden tener efectos perjudiciales tanto en la salud del ratón como en la calidad experimental.
  7. Etiqueta la oreja del ratón para su identificación.
  8. Al quitar el pelo, vuelva a colocar al ratón en la jaula para evitar una exposición excesiva al isoflurano. Supervise el mouse.
  9. Retire la almohadilla absorbente superior cubierta de pelo para tener una superficie de trabajo prequirúrgica limpia.
  10. Establezca un área de trabajo quirúrgico separada. Coloque una almohadilla térmica a 35 °C sobre la mesa quirúrgica. Pega una almohadilla absorbente sobre la almohadilla térmica. Coloque el cono (o los conos) de anestesia en la almohadilla absorbente.
  11. Coloque un ratón en la cámara de inducción de anestesia con un 2-4% de isoflurano y un flujo de oxígeno de 2 L/min hasta que el ratón respire tranquilamente (2-3 min).
  12. Saque el ratón de la cámara de inducción y colóquelo en la superficie de operación. Inserte la nariz de cada ratón en la abertura del cono nasal, permitiendo la inhalación de anestesia compuesta por isoflurano al 1-3% con 2 L/min de oxígeno. Confirme la anestesia adecuada por la falta de reacción a un pinzamiento del dedo del pie. Aplique ungüento lubricante oftálmico en los ojos del ratón.
  13. Inyecte 0,05 mg/kg de buprenorfina de liberación sostenida en el hombro por vía subcutánea con una aguja de 21 g para el tratamiento del dolor posquirúrgico.
  14. Desinfecte el dorso del ratón con tres rondas alternas de exfoliante a base de yodo/clorhexidina y un hisopo con alcohol. Con el rotulador quirúrgico y una regla, marque una línea de 2 cm en la línea media dorsal donde se realizará la incisión de espesor completo, como se muestra en la Figura 1D.
  15. Use un bisturí o unas tijeras de disección (preferencia quirúrgica) para hacer la incisión de la línea media dorsal de espesor completo a través del área marcada.
    NOTA: Tenga cuidado de no cortar el tejido subyacente (por ejemplo, músculo), como se ve en la Figura 1D.
  16. Usando suturas 5-0 en un patrón interrumpido simple, cierre la incisión dividiendo la herida como se muestra en la Figura 1D. Use al menos 5 suturas espaciadas uniformemente.
  17. Corta una gasa Telfa en un trozo de 3 cm x 1 cm. Colóquelo en el centro de un apósito adhesivo de espuma y coloque el apósito adhesivo en el dorso del ratón de manera que la gasa cubra la incisión como se muestra en la Figura 1D. Coloque un apósito cortado por la mitad en el abdomen y envuélvalo circunferencialmente hasta que se encuentre con el vendaje dorsal.
  18. Una vez completado el vendaje, coloque al ratón en una jaula estéril separada y vigílelo hasta que se haya recuperado completamente de la anestesia.
  19. Repita el procedimiento con todos los ratones, independientemente del grupo experimental. Deje que la incisión sane durante los próximos 4 días antes del siguiente paso.

3. Colocación del dispositivo de carga biomecánico HTS (POD 4)

NOTA: Limpie y autoclave los dispositivos HTS y varios juegos de instrumentos quirúrgicos antes de la cirugía (p. ej., tijeras de disección, bisturí, pinzas Adson, destornillador de agujas, grapadora de piel, grapas de piel). Prepare las suturas 5-0 esterilizadas para su uso. [Opcional] Si dispone de un extractor de humos de sobremesa, coloque el cono cerca del espacio de trabajo y encienda la succión.

  1. Prepare el área de la cirugía como se describe en los pasos 2.1 y 2.2.
  2. Anestesiar al ratón y proporcionar analgesia siguiendo los pasos 2.11-2.13.
  3. Utilice las pinzas o el destornillador de agujas para separar el vendaje del abdomen del ratón trabajando la herramienta de lado a lado contra el lado ventral. Dejando la herramienta entre la envoltura y la piel para elevar el vendaje de la piel, use unas tijeras para cortar el vendaje.
    NOTA: Tenga cuidado de no cortar la piel del ratón, arrancar el apósito o alterar la incisión en proceso de curación.
  4. Limpie el dorso con un hisopo con alcohol. Examine la incisión en busca de dehiscencia de la herida o signos de infección.
  5. Asegúrese de que el dispositivo HTS no esté extendido/expandido y esté en su forma más reducida, como se muestra en la Figura 1B. Cubra ligeramente los brazos del dispositivo con pegamento médico.
  6. Con una mano, haga que la piel del dorso del ratón esté ligeramente tensa en la dirección transversal. Con la otra mano, coloque el dispositivo HTS en el dorso del ratón de manera que la incisión quede equidistante de cada brazo del dispositivo HTS, centrando así el dispositivo sobre la incisión. Asegúrese de que la piel entre los brazos del dispositivo HTS esté uniformemente tensa. Sostenga el dispositivo en su lugar hasta que el pegamento se haya secado (~ 30 s), como se ve en la Figura 2A.
    NOTA: Es importante mantener la piel uniformemente tensa para garantizar que se coloquen cantidades iguales de tensión en la incisión con el dispositivo. Deje las suturas intactas durante este proceso porque el proceso de colocación del dispositivo agrega tensión mecánica a la piel, lo que puede reabrir la incisión de curación. Las suturas permanecen en su lugar hasta el primer día de estiramiento para asegurar que la herida permanezca cerrada.
  7. Asegure cuatro suturas alrededor de cada brazo y a través de la piel como se muestra en la Figura 2B. Durante la sutura, asegúrese de que la aguja salga de la piel hacia la incisión.
    NOTA: La inserción de la aguja desde el lado de la incisión del dispositivo a veces puede desgarrar la incisión debido a la fuerza necesaria para perforar la piel.
  8. Ahora coloque tres grapas alrededor de los brazos y a través de la piel, asegurando el dispositivo HTS a la piel como se muestra en la Figura 2B.
  9. Venda el ratón siguiendo los pasos 2.17 y 2.18.
  10. Repita el procedimiento con todos los ratones, independientemente del grupo experimental.
    NOTA: Todos los ratones reciben la misma preparación; sin embargo, se asignan aleatoriamente en cada grupo experimental (por ejemplo, control, estiramiento) para garantizar una distribución imparcial de los ratones en el diseño experimental. En concreto, tanto los ratones de control como los de estiramiento tendrán el dispositivo unido a su dorso. Los dispositivos de los ratones de control permanecerán intactos, mientras que los ratones estirados se someterán a los siguientes pasos.

4. Estiramiento inicial del dispositivo de carga biomecánica HTS (POD 5)

NOTA: Limpie y autoclave varios juegos de instrumentos quirúrgicos (por ejemplo, tijeras de disección, bisturí, pinzas Adson, destornillador de agujas) antes de la cirugía. [Opcional] Si dispone de un extractor de humos de sobremesa, coloque el cono cerca del espacio de trabajo y encienda la succión.

  1. Asigne aleatoriamente cada ratón a través de una marca auricular al grupo deseado. Para los ratones de control, simplemente retire las suturas de la incisión y cambie los apósitos de las heridas (pasos 1-6 y luego 8-9). Si lo desea, retire el dispositivo en el momento del estiramiento y tome una foto con un implemento de medición a escala para rastrear el tamaño de la cicatriz.
  2. Prepare el área quirúrgica, anestesiar al ratón y retire el apósito realizando los pasos 3.1-3.4.
    NOTA: Tenga cuidado de no arrancar el vendaje ni alterar la incisión en proceso de curación. Si un brazo del dispositivo HTS se ha desprendido de la piel, péguelo ligeramente en su lugar y agregue una grapa o sutura para la piel según el tamaño del desprendimiento.
  3. Retire las suturas de la herida con tijeras de disección u otro método de elección.
  4. Inserte la llave del dispositivo HTS en el dispositivo y gírela para expandir el dispositivo hasta que la piel esté tensa pero sin riesgo de desgarrarla, como se ve en la Figura 2C.
    NOTA: Esta distracción inicial puede tomar alrededor de 4-8 vueltas completas de la llave, ya que la piel puede estar suelta entre los brazos del dispositivo.
  5. Venda el ratón realizando los pasos 2.17 y 2.18.

5. Estiramiento posterior del dispositivo de carga biomecánica HTS (POD 7, 9, 11, 13, 15, 17)

NOTA: Limpie y autoclave varios juegos de instrumentos quirúrgicos (por ejemplo, tijeras de disección, bisturí, pinzas Adson, destornillador de agujas) antes de la cirugía. [Opcional] Si dispone de un extractor de humos de sobremesa, coloque el cono cerca del espacio de trabajo y encienda la succión.

  1. Para los ratones de control, simplemente cambie los apósitos de las heridas (pasos 1-5 y luego pasos 13-14). Si lo desea, retire el dispositivo en el momento del estiramiento y tome una foto de la cicatriz con un implemento de medición para que la escala rastree el tamaño de la cicatriz.
  2. Prepare el área quirúrgica, anestesiar al ratón y retire el apósito siguiendo los pasos 3.1-3.4.
    NOTA: Si un brazo de un dispositivo HTS se ha desprendido de la piel, péguelo en su lugar y agregue una grapa o sutura para la piel según el tamaño del desprendimiento.
  3. Inserte la llave del dispositivo HTS en el dispositivo y gírela para expandirlo hasta que la piel esté tensa pero sin riesgo de desgarrarla.
    NOTA: Esto puede tomar aproximadamente 4 vueltas o ~ 2 mm de distracción total. Si el dispositivo ha alcanzado la extensión máxima y no se puede extender más, realice los pasos 5.4-5.7 para quitar y volver a conectar un nuevo dispositivo. De lo contrario, venda el mouse realizando los pasos 2.17 y 2.18.
  4. Si el dispositivo ha alcanzado la extensión máxima, retire el dispositivo del dorso del mouse quitando las grapas con un removedor de grapas o tijeras haciendo palanca para abrir las puntas de las grapas. A continuación, retire las suturas y retire con cuidado el dispositivo.
  5. Limpie el dispositivo con un bisturí, hisopos con alcohol y toallas de papel. Remoje el dispositivo en etanol al 70% durante ~ 20 minutos para ayudar en la limpieza. Luego, use la llave para contraer el dispositivo a su forma más delgada.
  6. Vuelva a conectar el dispositivo HTS siguiendo los pasos 3.5-3.8.
  7. Venda el ratón siguiendo los pasos 2.17 y 2.18.

6. Recolección del tejido HTS (POD 19)

NOTA: La recolección de tejido puede tener lugar en cualquier punto del proceso. Hemos recolectado tejido después de solo 4 días de estiramiento para examinar los primeros puntos de tiempo; sin embargo, el tejido se recolecta de manera más consistente en el POD 19 (2 semanas después de que se inició la cepa). Limpie y autoclave varios juegos de instrumentos quirúrgicos (por ejemplo, tijeras de disección, bisturí, pinzas de Adson) antes de la cirugía. Para obtener fotos de la cicatriz a lo largo del tiempo, el dispositivo se puede quitar antes de cada paso de estiramiento para tomar una foto de la cicatriz antes de volver a aplicar el dispositivo y reiniciar la tensión mecánica. [Opcional] Si dispone de un extractor de humos de sobremesa, coloque el cono cerca del espacio de trabajo y encienda la succión. El extractor de humos de sobremesa puede apagarse cuando ya no se utilice el gas isoflurano.

  1. Prepare el área quirúrgica, anestesiar al ratón y retire el apósito siguiendo los pasos 3.1-3.4.
  2. Sacrificar al ratón por luxación cervical.
    NOTA: Tenga cuidado de no tirar de la piel y rasgar el dorso del ratón.
  3. Use tijeras de disección o un removedor de grapas para la piel para quitar las grapas de la piel. Corta las suturas. Retire suavemente el dispositivo HTS, teniendo cuidado de no rasgar la piel.
  4. Con un bisturí o unas tijeras, corte la piel que rodea la cicatriz HTS. Preservar la piel para el análisis histológico de la manera deseada.
    NOTA: Si la piel se va a utilizar para análisis transcriptómicos o de proteínas (por ejemplo, qPCR, Western blot, análisis de una sola célula), asegúrese de extirpar solo el tejido cicatricial HTS para minimizar la cantidad de tejido sano circundante. Esto asegurará que el análisis solo capture el tejido cicatricial.
  5. Raspe los dispositivos HTS con un bisturí. Coloque los dispositivos en un vaso de precipitados con etanol al 70% para ablandar cualquier adhesivo o tejido restante.
    NOTA: Después de remojar en etanol al 70%, es posible que los dispositivos requieran una mayor limpieza, raspado y limpieza antes de esterilizarlos en autoclave.

7. Medición de la anchura media de la cicatriz

NOTA: Esto se logró con el software de análisis de imágenes ImageJ, y la información se registró en una hoja de cálculo.

  1. Abra imágenes en ImageJ. Traza los bordes de la cicatriz con la herramienta polígono . Haga clic en analizar | medir para medir esta área.
    NOTA: La cicatriz se puede identificar por su decoloración y falta de folículos pilosos.
  2. Mida la longitud de la cicatriz de extremo a extremo con la herramienta de segmento . Haga clic en analizar | medir para medir esta longitud.
  3. Mida la longitud de 1 cm o cualquier otra unidad de longitud estandarizada en la imagen, utilizando la herramienta de segmento . Haga clic en analizar | medir para medir esta longitud.
  4. Usando la hoja de cálculo, toma el Área de la cicatriz (en píxeles; px) y divídela por la Longitud de la cicatriz (longitud px ). Ese resultado da el ancho promedio de la cicatriz en píxeles.
  5. Divide ese resultado por la unidad de longitud estándar medida (px longitud). El resultado será el ancho promedio de la cicatriz en la unidad de la unidad estándar de longitud (por ejemplo, cm) utilizada para el experimento.

Resultados

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Para demostrar claramente el uso efectivo del protocolo HTS e identificar resultados "positivos" exitosos, se estableció el modelo como se muestra en la Figura 3A. En el estudio representativo, hubo dos grupos: No Stretch Control (n = 6) y el grupo Mechanical Stretch HTS (n = 6) donde se indujeron niveles de tensión mecánica similares a los humanos a través de la incisión para generar un HTS, como se ve en la Figura 3B, C. Dentro del plan experimental dado en la Figura 3A-C, se tomó una fotografía macroscópica de la cicatriz en las vainas 5, 9, 15 y 19. Las cicatrices se trazaron con ImageJ y se analizó para determinar el ancho promedio de las cicatrices en los diferentes puntos de tiempo (Figura 3D). Los anchos promedio de las cicatrices se graficaron en función del tiempo y entre los grupos de la Figura 3E. Después de la aplicación de tensión mecánica en el POD 5, donde las cicatrices no fueron significativamente diferentes entre el Estiramiento y el Control, el Grupo de Estiramiento exhibió cicatrices significativamente más anchas que el Control, alcanzando un ancho de pico de 0,99 mm en el POD 9 (p = 0,045). Este ancho de cicatriz significativamente mayor en comparación con el control continuó en POD 15 (p = 0,043) y 19 (p = 0,045). Se recomienda que la fotografía macroscópica solo se tome en los días en que se debe quitar el dispositivo HTS (es decir, el dispositivo HTS ha alcanzado la expansión máxima y debe volver a colocarse o durante la explantación) ya que el dispositivo bloquea la fotografía adecuada de la cicatriz. En este protocolo, las imágenes y los análisis de la anchura de la cicatriz en múltiples puntos de tiempo ofrecen al lector una visión más clara de la progresión de la herida del modelo.

El análisis del tejido HTS se puede realizar de varias maneras, como la tinción de IHC para marcadores fibróticos, la tinción de H&E y tricrómico para examinar las áreas histológicas de la cicatriz, la tinción de rojo picrosirius para evaluar la arquitectura de colágeno de las cicatrices y otros métodos para el análisis de heridas, todos los cuales han sido utilizados por el laboratorio históricamente6, 8,21,24,25,27,28 (Figura 4). La Figura 4 muestra las características histológicas del tejido HTS, como tejido cicatricial elevado (Figura 4A), pérdida de estructuras anexiales y folículos pilosos (Figura 4B), alineación de las fibras de colágeno en la dirección de la carga mecánica (Figura 4C) y verticilos de colágeno (Figura 4F). La Figura 4 también muestra la tinción inmunohistoquímica de la densidad y la vasculatura de mastocitos del HTS murino y lo compara con el tejido humano de HTS (Figura 4D, E, G, H). Además, el análisis de la cicatriz HTS se puede realizar con análisis de una sola célula si el tejido se recolecta, se prepara y se lleva a un núcleo bioinformático inmediatamente después de la escisión.

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Figura 1: Preparación del dispositivo HTS y del dorso del ratón. (A) Proceso de modificación de un expansor palatino de 13 mm para crear el dispositivo HTS, (1) mostrando la estructura inicial del expansor, (2) flexión de los brazos 90° hacia arriba para los brazos superiores y hacia abajo para los brazos inferiores cuando el dispositivo está plano, (3) resultado de la flexión inicial, donde los brazos ahora están perfectamente paralelos con el cuerpo del dispositivo, (4) flexión de los brazos para formar el dispositivo final con mediciones; Cada uno de los brazos debe doblarse 90° en la página como se ve en el (5) dispositivo final. (B) El dispositivo HTS completamente ensamblado desde varios ángulos, tanto no extendido como extendido. (C) Pasos secuenciales para preparar el dorso del ratón: (1) estado inicial con pelaje, (2) después del afeitado y (3) después de la aplicación de pasta depilatoria. (D) Procedimiento para crear la incisión dorsal: (1) marcar el sitio de la incisión con una guía de 2 cm, (2) hacer la incisión, (3) suturar la herida, (4) aplicar la gasa Telfa y (5) asegurar con apósito adhesivo. (E) Fotografía macroscópica de (1) incisión, y (2) después de suturar la incisión cerrada. Abreviatura: HTS = cicatrización hipertrófica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Posicionamiento y estiramiento del dispositivo HTS. (A) Ilustración de la posición correcta del dispositivo HTS en el dorso del ratón, asegurando una alineación adecuada con el sitio de la incisión. La imagen de la izquierda muestra la ubicación del dispositivo vista desde una posición posterior. La imagen de la derecha muestra la ubicación del dispositivo vista lateralmente. (B) Ilustración de la fijación del dispositivo HTS: (1) colocación inicial, (2) ubicación de las suturas, (3) ubicación de las grapas cutáneas. (C) Demostración de estiramiento del dispositivo HTS con la clave de dispositivo HTS etiquetada: (1) configuración inicial, (2) aplicación de tensión, (3) el estado expandido final diseñado para aplicar una tensión mecánica constante a través de la incisión en curación para promover la formación de cicatrices hipertróficas, 2 mm de expansión aplicada. (D) Fotografía macroscópica de la aplicación de tensión al dispositivo HTS, con la llave del dispositivo HTS etiquetada. (E) Fotografía macroscópica del ratón completamente vendado. Abreviatura: HTS = cicatrización hipertrófica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Aplicación de tensión mecánica para desarrollar cicatrices. (A) Cronología del procedimiento experimental desde la creación de la incisión (POD 0) hasta la aplicación de tensión mecánica (POD 4) y a través del período de estiramiento (POD 5 a POD 19), culminando con la explantación de tejido (POD 19). (B) Ilustración de los dos grupos: grupos No Stretch Control y Mechanical Stretch HTS. (C) Esquema transversal que representa la diferencia en la respuesta del tejido entre los grupos No Stretch Control y Stretch HTS. (D) Imágenes macroscópicas representativas de las cicatrices de los grupos No Stretch Control y Stretch HTS en los días postoperatorios (POD 5, 9, 15 y 19), con las cicatrices hipertróficas trazadas en una línea punteada amarilla. (E) Análisis cuantitativo del ancho promedio de la cicatriz a lo largo del tiempo, demostrando diferencias significativas en el desarrollo de la cicatriz entre los grupos Sin estiramiento y Estiramiento, con barras de error que representan la desviación estándar. Las diferencias significativas están marcadas con asteriscos (*). El análisis estadístico se realizó mediante análisis de varianza de dos vías (ANOVA). Los valores de *p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Abreviaturas: HTS = cicatrización hipertrófica; POD = día postoperatorio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Histología de la cicatriz. Esta histología de cicatriz murina ha sido recolectada después de 2 semanas de estrés mecánico en nuestro trabajo previamente publicado9,26. (A) La imagen más grande muestra la imagen histológica de H&E de la sección transversal de la cicatriz, mientras que la parte inferior derecha es una imagen histológica tricrómica de la sección transversal de la cicatriz, que muestra cómo se eleva la región de la cicatriz. (B) La imagen más grande muestra imágenes histológicas de H&E de la sección transversal de la cicatriz, mientras que la parte inferior derecha es una imagen histológica tricrómica de la sección transversal de la cicatriz, que muestra cómo la región de la cicatriz demuestra una pérdida de estructuras anexiales y folículos pilosos. (C) La imagen más grande muestra una imagen roja picrosirius de la sección transversal de la cicatriz, mientras que la parte inferior derecha es una imagen histológica tricrómica de la sección transversal de la cicatriz, que muestra fibras de colágeno alineadas en la dirección de la carga mecánica. (D) La imagen más grande muestra imágenes de la inmunohistoquímica de CD117 en tejido murino de HTS, mientras que la parte inferior derecha es imágenes de la inmunohistoquímica de CD117 en tejido humano, lo que demuestra una densidad de mastocitos comparable a la del tejido humano de HTS. (E) La imagen más grande muestra imágenes de la inmunohistoquímica CD31 de la vasculatura en tejido murino de HTS, mientras que la parte inferior derecha es imágenes de la inmunohistoquímica de CD117 en tejido humano, lo que demuestra una densidad de mastocitos comparable a la del tejido HTS humano. (F) Los verticilos de colágeno, que se ven en cicatrices hipertróficas humanas maduras en la imagen de la parte inferior derecha, también se ven en cicatrices murinas cargadas después de 24 semanas en la región encerrada en círculos en las imágenes murinas de H&E. (G) Imágenes macroscópicas representativas de las cicatrices de un grupo de control (Incisión + Sin estiramiento), un grupo de control de estiramiento (Sin incisión + Estiramiento) y un grupo de estiramiento HTS. (H) Muestra inmunohistoquímica comparando el grupo de control (incisión + sin estiramiento) y el grupo de estiramiento HTS. Utilizando una tinción conjunta para los marcadores fibróticos pEPF, aSMA y YAP con DAPI, se produce un aumento de los marcadores fibróticos en el grupo HTS. A-F han sido adaptados de Aarabi, S. et al.9. G,H han sido adaptados de Mascharak, S. et al. Reimpreso con permiso de FASEB26. Abreviaturas: HTS = cicatrización hipertrófica; H&E = hematoxilina y eosina; pEPF = Fibroblasto engrailed-positivo; aSMA = actina del músculo liso alfa; YAP = Proteína asociada a Yes; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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El modelo de ratón HTS es un método rentable y altamente reproducible para inducir HTS a través de la mecanotransducción y desarrollar posibles terapias. Si bien existe una curva de aprendizaje inicial para usar el modelo de manera efectiva, el protocolo puede, con la práctica, ser realizado por cualquier investigador sin capacitación quirúrgica. El uso de este modelo permite a los investigadores comprender mejor la formación de HTS y el papel de la mecanotransducción en la cicatrización de heridas, lo que puede conducir a mejoras tangibles en el cuidado de las heridas de los pacientes. Idealmente, la demostración en video que acompaña a este protocolo reducirá la curva de aprendizaje para los investigadores y facilitará la implementación fluida de este modelo en estudios futuros. Sin embargo, hay una serie de pasos críticos en el protocolo que podrían beneficiarse de una explicación más detallada para mejorar la claridad para los usuarios.

Progresando cronológicamente desde el inicio del protocolo, el primer paso clave es cerrar la incisión quirúrgica en el día postoperatorio 0 (POD 0). Es imperativo que la incisión se cierre completamente con las capas de piel en perfecta aposición29. Esto es para asegurar que la incisión cicatrice correctamente y no se abra una vez que se coloque el dispositivo y se induzca la tensión a través de la herida. Si la herida se abre (dehiscencia), el animal no debe ser utilizado para más experimentos.

Al colocar el dispositivo HTS en POD 4, es crucial asegurar cantidades iguales de tensión en el dorso del ratón. Con la colocación adecuada del dispositivo, la tensión ejercida será uniforme a lo largo de toda la incisión, mitigando el riesgo de aplicación de fuerza variable que podría dar lugar a resultados experimentales subóptimos (cicatrices no uniformes). Si el dispositivo se coloca incorrectamente, partes de la incisión no recibirán igualmente el promedio de 2 mm de distracción cada dos días para inducir HTS. La expansión del dispositivo debería eliminar la holgura de la piel y hacerla tensa. Al mismo tiempo, se debe tener cuidado para evitar la sobreextensión del dispositivo, lo que podría hacer que la herida se dehisce. Si los dispositivos se utilizan para varias rondas de experimentos, el engranaje giratorio en el que se coloca la llave para expandir y contraer el dispositivo puede aflojarse. Si esto sucede, se debe fabricar un nuevo dispositivo y descartar el dispositivo anterior.

Cuando se inicia la tensión en el POD 5, se debe comenzar a administrar cualquier terapia destinada a la prevención de cicatrices. Las terapias, como los ungüentos tópicos, generalmente se administran cada dos días cuando se inicia la tensión al extenderse sobre el sitio de la incisión. Los hidrogeles se colocan de manera similar sobre el sitio de la incisión. Las terapias sistémicas pueden inyectarse en el torrente sanguíneo a través de la vena de la cola o por vía retroorbital.

Es aconsejable afeitar y/o aplicar ligeramente pasta depilatoria en el dorso del ratón alrededor de la cicatriz en POD 19 o antes de fotografiar la cicatriz. Esto mejora la visibilidad y el análisis posterior del tamaño de la cicatriz con ImageJ. Además, cuando use pasta depilatoria, opte por menos pasta y menos tiempo. La sobreexposición del dorso del ratón a la pasta puede causar quemaduras químicas que pueden interferir con el proceso de cicatrización de la herida. La piel del ratón es más delgada que la piel humana y es más propensa a las quemaduras químicas30.

El modelo de ratón HTS es inherentemente limitado, ya que no utiliza piel humana y, por lo tanto, no puede recapitular completamente el HTS humano. Sin embargo, tiene un número significativo de ventajas logísticas sobre otros modelos animales; Si se realiza correctamente, este modelo de mouse HTS es confiable, económico y fácil de realizar. Biológicamente, el HTS es inducido a través de aumentos físicos en la señalización mecánica. Otros modelos de HTS en conejos inducen HTS en la oreja o el dorso utilizando lesiones térmicas y químicas 30,31,32. La piel de la cara ventral de la oreja del conejo no involucra muchas células aparte de las células de la piel durante la cicatrización, como los condrocitos 1,30. Otro método es un modelo HTS de combustión en piel porcina33, pero puede ser un desafío logístico en términos de costo y manejo. El modelo porcino es probablemente el más similar en la recapitulación del HTS humano; Sin embargo, es un método costoso para recopilar resultados iniciales. Un último modelo de HTS es el xenoinjerto de piel humana HTS extirpada en ratones, pero esto podría desencadenar una respuesta inmunitaria y no explora la formación de nuevas cicatrices34.

Los métodos anteriores de inducción de HTS en modelos animales no desencadenan adecuadamente la respuesta curativa natural del cuerpo de la misma manera que se forman las cicatrices humanas de HTS. Por el contrario, el modelo HTS de ratón basado en mecanotransducción emplea una tensión mecánica para iniciar la cicatrización hipertrófica, lo que refleja de cerca el HTS humano 1,9,21. Este método se basa en el proceso fisiológico de la señalización de la mecanotransducción para capturar la biomecánica de los tejidos subyacentes y los impulsores de la población celular detrás de la fibrosis. Este modelo es óptimo para estudiar dianas biológicas que inhiban o incluso induzcan vías de mecanotransducción, lo que podría conducir al descubrimiento de nuevas terapias traslacionales.

Divulgaciones

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Los autores no tienen intereses contrapuestos ni otros conflictos asociados con el contenido de este artículo.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el Centro de Premios del Proyecto Traslacional Interdisciplinario del Centro de Regeneración de Órganos y Tejidos Dentales, Orales y Craneofaciales respaldados por el Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (U24 DE026914) (G.C.G) y la Beca de Investigación Traslacional de la Fundación de Cirugía Plástica (837107) (K.C.).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Vaso de precipitados PYREX Griffin de 100 mLMilipore SignmaCLS1000100
Aesculap Exacta mini recortadora Aesculap
AutoClip SystemFine Surgical Instruments12020-00
BD marca BD hisopos con alcohol isopropílicoFisher Scientific13-680-63
Buprenorfina SR (0,5 mg/mL)Buprenex, Indivior Inc.12496-0757-1
C57/BL6 hembras (6– 8 semanas de edad)The Jackson Laboratory000664
Gasa estéril CovidienFisher Scientific2187
Covidien TelfaTM almohadillas no adherentesFisher Scientific, Covidien1961
Regla quirúrgica dentalDoWell Dental ProductsS1070
Crema depilatoria (Nair Hair Remover Lotion)Church& Dwight, CVS339823
Etanol 70% soluciónFisher Scientific64-17-5
ExcelMicrosoft CooperationMicrosoft.comprograma de software 
ImageJImageJ, Wayne Rasbandimagej.netprograma de software 
Sistema de anestesia inhalatoriaVetEquip922130
Tijeras de iris 4½ pulg. inoxidableMcKesson43-2-104
Isoflurano, USPDechra Productos Veterinarios17033-094-25
Kaka industrial MUB-1Kaka Industrial 173207Solo es necesario si no hay un espacio de fabricación o un taller de fabricación disponible 
Expansor Palatino Rápido Leone - 13 mmGreat Lakes Dental Technologies125-004La llave necesaria para expandir y ajustar el dispositivo vendrá con este producto en la caja
Paño repelente a líquidos 75 x 90 cm con orificio adhesivo 6 x 9 cmOmnia S.p.A.12.T4362
Medequip Depot Seda Negra Trenzada Sutr 6-0 RxMedequip Depot D707N, Fisher ScientificNCO835822
Portaagujas de 5 pulgadas con mordazas dentadasMcKesson43-2-842
Prisma 9GraphPad Holdings, LLCgraphpad.comprograma de software 
Pomada oftálmica PuralubeDechra, NDC17033-211-38
R studio DesktopRStudio PBCrstudio.comprograma de software 
Rotulador cutáneo quirúrgicoMcKesson19-1451_BX
Tegaderm, 3 MVWR56222-191apósito adhesivo de espuma 
Almohadilla térmica Thermo-peepK& H, pinza de tejido amazónico
4¾ pulg. inoxidable 1 x 2 dientesMckesson43-2-775
Vetbond (3 M)Saint Paul, MN1469SB

Referencias

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