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Artículo de método

Producción de colágeno con patrones nanofibrilares para la ingeniería de tejidos

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DOI:

10.3791/67165

⸱

20 de septiembre de 2024

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Oregon Health & Science University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El siguiente protocolo presenta un método de extrusión basado en cizallamiento para la fabricación de hidrogeles de colágeno con fibrillas con patrones a nanoescala, que se puede aplicar a una amplia gama de aplicaciones de ingeniería de tejidos.

Resumen

Los biomateriales regenerativos están diseñados para facilitar las interacciones célula-material para guiar la reparación de tejidos y órganos dañados. Estos materiales están diseñados para emular las propiedades biofísicas del tejido nativo, proporcionando una guía fenotípica y morfológica celular que contribuye a la restauración del nicho de tejido regenerativo. El colágeno, una proteína de la matriz extracelular prevalente, es un componente común de estos biomateriales regenerativos debido a su biocompatibilidad y otras propiedades favorables. El estudio actual describe un método novedoso y sencillo para la fabricación de colágeno nanofibrilar diseñado con patrones de fibrillas dirigidos. A través de la manipulación del esfuerzo cortante, la temperatura y el pH, la fibrilogénesis y la alineación del colágeno se controlan con precisión sin necesidad de equipos especializados. Este enfoque permite la creación de biomateriales de colágeno nanofibrilar que imitan la estructura nativa de los tejidos que exhiben características anisotrópicas o isotrópicas. La flexibilidad en el patrón de nanofibrillas de colágeno no solo facilita el estudio del patrón a nanoescala en el comportamiento celular, sino que también ofrece diversas posibilidades para aplicaciones de ingeniería de tejidos con patrones.

Introducción

El objetivo de la medicina regenerativa es mejorar la regeneración y curación de tejidos mediante la aplicación de terapias de ingeniería. Un enfoque implica la fabricación de construcciones de biomateriales que emulan de cerca la composición y la estructura de los tejidos nativos. Al diseñar estos constructos, una consideración crítica es la matriz extracelular subyacente (MEC) nativa, que proporciona pistas instructivas para la proliferación, migración y diferenciación celular, lo que en última instancia impulsa la regeneración de tejidos 1,2. La MEC nativa está compuesta predominantemente por colágeno fibrilar 3,4. En tejidos altamente organizados, como el músculo esquelético y el tendón, estas MEC exhiben un patrón alineado, que es clave para apoyar la transmisión de fuerza a través del tejido, así como la función motora 5,6.

La utilidad del colágeno como biomaterial para aplicaciones de ingeniería de tejidos se extiende más allá de su amplia prevalencia en tejidos nativos, ya que también muestra buena biocompatibilidad, biodegradabilidad y afinidad celular 7,8,9. Los avances recientes en el desarrollo de biomateriales a base de colágeno se han centrado en el refinamiento de las propiedades biofísicas para guiar mejor las señales mecánicas y bioquímicas que son esenciales para la regeneración de tejidos específicos. La creación de biomateriales de colágeno con estructura fibrilar in vitro es relativamente sencilla, ya que las moléculas de colágeno solubles en ácido son capaces de autoensamblarse en nanofibrillas cuando se exponen a temperaturas cálidas y pH neutro10,11. Sin embargo, sin manipulación guiada, estas fibrillas se formarán en redes aleatorias, lo que las hace inadecuadas para aplicaciones de ingeniería de tejidos anisotrópicos. Las técnicas capaces de producir fibrillas alineadas incluyen el electrohilado y el hilatura húmeda, junto con otras técnicas de extrusión en solución12,13, liofilización14, fabricación electroquímica o magnética15,16, deposición por flujo de cizallamiento17, cristalización inducida por flujo18, extrusión de gel19, alineación inducida por deformación20 y alineación guiada por fuerza a través de la manipulación de fluido caudal 21,22. Sin embargo, muchos de estos métodos no son altamente compatibles con el colágeno, producen alineación a microescala pero no a nanoescala, requieren pasos adicionales de posprocesamiento para inducir la alineación y la estabilidad o requieren equipos y reactivos altamente especializados, lo que dificulta su adopción generalizada.

El presente estudio presenta un método fácil basado en cizallamiento para la fabricación de colágeno nanofibrilar, con patrones de fibrillas alineados u orientados aleatoriamente, sin la necesidad de equipos especializados como bombas de jeringa o electrospinadores. Esta técnica aprovecha la dependencia del pH de la fibrilogénesis del colágeno. La aplicación de fuerza de cizallamiento al colágeno monomérico ácido dentro de un tampón neutralizante promueve la fibrilogénesis alineada a lo largo de la dirección del cizallamiento. Del mismo modo, se puede inducir al colágeno a sufrir fibrilogénesis en ausencia de cizallamiento, lo que produce fibrillas con patrones aleatorios. Las tiras de colágeno 3D resultantes, compuestas por colágeno nanofibrilar alineado o con patrones aleatorios, pueden servir como herramientas para estudiar los efectos del patrón a nanoescala en el comportamiento celular. Además, ofrecen diversas posibilidades para aplicaciones de ingeniería de tejidos anisotrópicos e isotrópicos 23,24,25,26,27. El patrón se puede personalizar para que coincida con la estructura del tejido nativo de interés. Las tiras de colágeno también se pueden combinar en paquetes de varios tamaños para servir como un tratamiento de ingeniería trasplantado en diversos tamaños y formas de lesiones.

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Protocolo

1. Preparación del colágeno dializado (Figura 1)

  1. Corte el tubo de diálisis a una longitud de aproximadamente 3 pulgadas. Utilice tubos con las siguientes especificaciones: 32 mm de ancho plano, 20 mm de diámetro inflado y 4,8 nm de tamaño de poro.
  2. Rehidrate los tubos de diálisis en agua ultrapura.
  3. Sujete un extremo del tubo con un clip para tubo de diálisis.
  4. Transfiera 5-6 mL de colágeno de cola de rata tipo I (concentración: 9-10 mg/mL en ácido acético 0,02 N) al tubo utilizando una jeringa de 10 mL equipada con una aguja de 18 G. Sujete el otro extremo del tubo para cerrarlo.
  5. Coloque una capa de 0,5-1 cm de espesor de escamas de polietilenglicol (PEG) en el fondo de un plato de vidrio y luego coloque el tubo de diálisis lleno de colágeno encima de la capa de PEG.
    NOTA: Un plato de vidrio de 13 pulgadas x 9 pulgadas x 2 pulgadas generalmente puede acomodar una fila de 4-5 tubos llenos de colágeno. El tamaño del plato se puede ajustar en función del volumen de colágeno necesario.
  6. Agregue más copos de PEG para cubrir completamente el tubo y coloque la bandeja en un refrigerador a 4 ° C.
  7. Cada 10-15 minutos, retire las escamas de PEG húmedas de la superficie del tubo de diálisis y vuelva a cubrir el tubo con una capa nueva de PEG seco. Regrese el plato a la nevera a 4 °C.
  8. Repita el paso 1.7 dos veces más y, después de 30-35 minutos, enjuague las escamas de PEG húmedas con agua del grifo.
  9. Enjuague el tubo una vez más con agua ultrapura y seque el tubo con un pañuelo de papel.
  10. Suelte un extremo del tubo y transfiera el colágeno dializado (concentración final: ~ 30 mg / mL) a tubos de microcentrífuga. Centrifugar brevemente las burbujas de aire del colágeno con una minicentrífuga (2.000 x g, ≤30 s, temperatura ambiente [RT]) y almacenar a 4 °C para su uso posterior.
  11. Un día antes de usar, cargue el colágeno en jeringas.
    1. Con una aguja de calibre 16, extraiga ~ 1 mL de colágeno dializado en una jeringa de 1 mL.
      NOTA: El colágeno es una sustancia viscosa. Es posible que sea necesario precargar la cabeza de la aguja con colágeno antes de extraer más colágeno. Retire la cabeza de la aguja y expulse las bolsas de aire grandes según sea necesario
    2. Retire la aguja y envuelva la cabeza de la jeringa con parafilm.
    3. Guarde la jeringa llena de colágeno en posición vertical a 4 ° C durante la noche para permitir que salgan pequeñas burbujas de aire.

2. Preparación de virutas de vidrio (Figura 1)

PRECAUCIÓN: Utilice protección ocular para esta parte del protocolo.

NOTA: Los portaobjetos de vidrio hidrófobo con recubrimiento especial se utilizan para experimentos de cultivo celular. Los portaobjetos deben manipularse por los bordes para evitar la eliminación del revestimiento de la superficie. Realice el procedimiento de corte de vidrio en una superficie de corte adecuada.

  1. Mida y marque las dimensiones deseadas de la viruta de vidrio con un rotulador permanente
    1. Si va a crear andamios de 8 tiras, marque incrementos de aproximadamente 1 cm a lo largo del borde largo del portaobjetos. Ajuste las dimensiones según sea necesario en función del tamaño de andamio deseado.
  2. Con un borde recto (es decir, un borde de placa de 6 pocillos), deslice el cortador de vidrio a lo largo de la primera medición para marcar el vidrio.
  3. El portaobjetos se romperá a lo largo de la línea marcada por sí solo o volteará el portaobjetos sobre un pañuelo de papel (con el lado hidrofóbico hacia abajo) y aplicará presión manualmente a la región marcada.
  4. Marque el lado recubierto del portaobjetos de vidrio hidrofóbico con un rotulador de etanol.
  5. Enjuague la viruta de vidrio con agua ultrapura para eliminar el polvo de vidrio residual.
  6. Seque las virutas de vidrio usando una boquilla de sobremesa para aire presurizado o apilándolas en ángulo en la campana extractora.
  7. Repita según sea necesario para el número requerido de fichas. Guarde las fichas en RT. Para obtener los mejores resultados de cultivo celular, use chips preparados dentro de los 7 días.

3. Preparación de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10x

  1. Llena una botella de vidrio con 500 ml de agua ultrapura.
  2. Agregue 10 tabletas de PBS al frasco.
    NOTA: Este protocolo supone que la proporción de comprimidos para 1x PBS es de 1 comprimido por 500 ml. Ajuste la cantidad de tabletas según sea necesario si usa un tamaño o marca de tableta diferente.
  3. Agregue una barra para remover a la botella y colóquela en una placa para remover hasta que las tabletas se disuelvan.
  4. El día de la fabricación del hidrogel, transfiera el volumen necesario de 10x PBS a tubos cónicos de 50 mL.
  5. Coloque los tubos llenos de PBS en un baño de agua a 37 °C durante al menos 15 minutos antes de la fabricación de colágeno.

4. Fabricación de nanofibrillas de colágeno alineadas (Figura 2)

  1. Saca una jeringa de colágeno de la nevera y coloca una aguja roma de 22 G.
  2. Coloque un portaobjetos de vidrio en la tapa de un plato de 4 pocillos.
  3. Cubra el portaobjetos con suficiente PBS calentado a 37 °C 10x para sumergirlo (30-50 mL).
  4. Sosteniendo la jeringa en un ángulo de aproximadamente 30-45°, extruya manualmente tiras delgadas de colágeno en el chip de vidrio usando una velocidad de ~340 mm/s y un caudal de ~3.2 mL/min.
    NOTA: Complete la extrusión de colágeno dentro de los 30-60 segundos posteriores a la adición del PBS calentado para garantizar que el PBS no se enfríe excesivamente.
  5. Espere 1-2 minutos para permitir que el colágeno complete la fibrilogénesis o hasta que el colágeno adquiera un color blanco opaco.
  6. Use fórceps para cortar las tiras de colágeno a la medida. Asegúrese de que las tiras sean lo suficientemente largas para que se puedan doblar de 3 a 5 mm por debajo de cada extremo del chip.
  7. Una a la vez, coloque suavemente las tiras de colágeno a lo largo (paralelas a la región marcada) sobre una viruta de vidrio preparada. Mete los bordes debajo del chip.
  8. Continúe colocando tiras de colágeno hasta lograr las dimensiones deseadas.
  9. Coloque el hidrogel de colágeno recién formado en dos pocillos de una placa de 12 pocillos. Esto permite el flujo de aire durante el proceso de secado y evita que los extremos de la cola del colágeno se adhieran a superficies no deseadas.
  10. Deje secar los hidrogeles en la mesa de trabajo durante 1-3 h o hasta que los cristales de sal de PBS cubran el 50%-90% de la superficie del hidrogel.
    NOTA: El tiempo de secado variará según el tamaño del hidrogel y la presencia de exceso de líquido.
  11. Sumerja cada hidrogel en 1x PBS durante unos 30-60 s o hasta que los cristales de sal se disuelvan.
  12. Frote suavemente el exceso de PBS con un pañuelo de papel.
  13. Vuelva a colocar los hidrogeles en la placa del pocillo y déjelos secar en una campana extractora durante la noche.
  14. Almacene los hidrogeles secos en RT durante aproximadamente 1 semana.

5. Fabricación de nanofibrillas de colágeno aleatorias (Figura 3)

  1. Saca una jeringa de colágeno de la nevera y coloca una aguja roma de 22 G.
  2. Extruya el colágeno a ~3,2 mL/min sobre una viruta de vidrio seca. Extruya suficiente colágeno para obtener dimensiones similares a los hidrogeles de colágeno alineados. Evite la acumulación de burbujas de aire según sea necesario.
  3. Extruye colágeno adicional para envolver los bordes del chip de vidrio. Esto minimiza el riesgo de desprendimiento accidental.
  4. Use pinzas para sumergir el colágeno extruido en un tubo de 50 ml de PBS 10x calentado.
  5. Espere 45-60 s para que el colágeno complete la fibrilogénesis o hasta que el colágeno adquiera un color blanco opaco.
  6. Frote suavemente el exceso de PBS con un pañuelo de papel.
  7. Complete los pasos 4.9-4.14 para enjuagar y secar los hidrogeles

6. Esterilización y rehidratación

NOTA: Complete todos los siguientes pasos en un gabinete de bioseguridad

  1. Esterilice los hidrogeles de colágeno y la placa de pocillo circundante en etanol al 70% durante 15 min.
    1. Eleve brevemente los hidrogeles a la mitad de la esterilización con pinzas para asegurarse de que tanto la parte inferior del chip de vidrio como el hidrogel estén en contacto con el etanol.
  2. Retire el etanol y deje que los hidrogeles se sequen al aire durante 10 minutos.
  3. Lave los hidrogeles 3 veces en 1x PBS estéril, durante 10 minutos cada uno, para eliminar el etanol residual y rehidratar los hidrogeles. Los hidrogeles ya están listos para su uso (cultivo celular, etc.). Los hidrogeles pueden dejarse brevemente en PBS después del paso de lavado final si no están listos para su uso inmediato.

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Resultados

Este protocolo describe una técnica sencilla de extrusión basada en cizallamiento para la fabricación de hidrogeles de colágeno compuestos por nanofibrillas alineadas (Figura 2) o aleatorias (Figura 3). El patrón de nanofibrillas se basa en el control preciso de las fuerzas de cizallamiento, que se logra a través de la modulación combinada de la velocidad de la jeringa y la tasa de extrusión de colágeno. Los valores óptimos para inducir la alineación de las fibr...

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Discusión

Los pasos críticos del protocolo se pueden resumir en tres partes principales: 1) fibrilogénesis del colágeno, 2) montaje de hidrogel y 3) lavado. El proceso de fibrilogénesis del colágeno ocurre espontáneamente en condiciones neutralizantes y se basa en el autoensamblaje de moléculas individuales de colágeno en estructuras fibrilares estabilizadas más grandes10,11. Esto se logra mediante la aplicación de un medio tamponado neutr...

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Divulgaciones

No hay conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada en parte por la Alianza para la Investigación y Capacitación en Rehabilitación Regenerativa, MTF Biologics, la Fundación de la Universidad de Salud y Ciencia de Oregón y el Collins Medical Trust. K.M.H. contó con el apoyo de la Beca de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias (DGE-1937961) y la Beca de Investigación de Aprendizaje y Experiencia de los Estudiantes de Oregón (OSLER) (5TL1TR2371-8). K.H.N. recibió el apoyo de subvenciones de los NIH/NHLBI (R00HL136701) y NIH/NIAMS (R01AR080150).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microscopio de colágeno I, alta concentración, colarata CorningCB354249
Eclipse TE-2000-UNikonTE-2000-U Microscopio invertido
Portaobjetos de microscopio extra gruesosFisher Scientific22-267-005Funciona bien para la superficie de extrusión de colágeno
FEI Helios G3 NanoLab DualBeamThermo Fisher ScientificN/AMicroscopio electrónico de barrido
Juego de herramientas de corte de vidrio 2 mm-20 mm Punta de carburo de alimentación de aceite estilo lápizAmazon/MOARMORB07Y1D243Hopción para un cortador de vidrio
Agujas de punta roma Hamilton Kel-F Hub (Luer Lock, 22 G)Fisher Scientific14-815-574Agujas para extrusión de colágeno
Nexterion Slide H 3-DSchottNC0782819Portaobjetos hidrofóbicos
PBS TabletasThermo Fisher Scientific18912014
Polietilenglicol 8000Fisher BioReagentsBP233-1
Tubos de diálisis de celulosa sin costura Fisher ScientificS25645G
SnakeSkin Clips de diálisisThermo Fisher ScientificPI68011
Synthware Cortador de vidrioSynthware31-501-927Opción para un cortador de vidrio
de

Referencias

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