Artículo de método

Incorporación de la flexibilidad y la dinámica de la estructura de la proteína diana en el descubrimiento computacional de fármacos mediante el análisis de acoplamiento basado en conjuntos

DOI:

10.3791/67174

⸱

20 de junio de 2025

 , 
1Bioinformatics Programme, Institute of Biological Sciences, Faculty of Science, Universiti Malaya, 2Centre of Research in Systems Biology, Structural Bioinformatics and Human Digital Imaging (CRYSTAL), Universiti Malaya

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los métodos computacionales son prometedores para acelerar el descubrimiento de fármacos, pero con frecuencia pasan por alto la naturaleza dinámica de las estructuras de las proteínas. Aquí, discutimos el análisis de acoplamiento basado en conjuntos para incorporar indirectamente la flexibilidad de las proteínas, lo que podría mejorar la precisión y la confiabilidad de los esfuerzos de descubrimiento de fármacos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El proceso de descubrimiento de fármacos es una operación rigurosa, lenta y costosa. El enfoque computacional en el descubrimiento de fármacos permite a los investigadores priorizar los compuestos más prometedores para realizar pruebas adicionales, lo que reduciría en gran medida los recursos necesarios, lo que llevaría a un aumento de la eficiencia general en las líneas de descubrimiento de fármacos. El descubrimiento de fármacos basado en la estructura es un enfoque común que requiere la información estructural de la proteína diana en un formato tridimensional. Sin embargo, la limitación actual de la mayoría de las estrategias de descubrimiento de fármacos asistidas por ordenador es su incapacidad para introducir la flexibilidad y la dinámica de la estructura de la proteína diana durante la simulación de acoplamiento ligando-proteína. Si bien tanto el acoplamiento de ajuste inducido como el acoplamiento basado en conjuntos tienen como objetivo abordar la flexibilidad de las proteínas en el procedimiento de acoplamiento, este último puede proporcionar una visión más completa del comportamiento dinámico de las proteínas mediante la incorporación de múltiples conformaciones a lo largo de la simulación. En este informe, demostramos y discutimos la aplicación de una técnica llamada análisis de acoplamiento basado en conjuntos que introduce indirectamente la flexibilidad y la dinámica de la estructura de la proteína objetivo en el proceso de acoplamiento molecular. La proteína y el ligando seleccionados para los estudios de acoplamiento basados en conjuntos fueron lisozima y Flovokawain B (FB), respectivamente. Se ha informado previamente que FB tiene actividad de unión con la lisozima. Se realizó una simulación de dinámica molecular (MD) en lisozima en presencia de agua, y se examinaron la energía total, la desviación cuadrática media (RMSD) y la fluctuación cuadrática media (RMSF). El agrupamiento de conformación se generó en función de varios valores de corte de agrupamiento y se eligió para un análisis de acoplamiento adicional con FB. El clúster n.º 2 proporciona la energía de enlace más baja a -29,37 kJ/mol. Se generaron imágenes de acoplamiento molecular para anticipar la presencia de fuerzas de unión. Al incorporar la dinámica estructural de la proteína, el enfoque de acoplamiento basado en conjuntos puede capturar mejor la gama de posibles escenarios de unión, lo que conduce a predicciones más confiables de los resultados de unión.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En el descubrimiento computacional de fármacos (CDD), las técnicas de la informática, la química, la biología y la física se integran para explorar un vasto espacio químico, predecir las interacciones entre fármacos y objetivos y optimizar los candidatos a fármacos con mayor eficiencia y menores costes en comparación con los métodos experimentales tradicionales por sí solos. Se trata de un potente enfoque que aprovecha los métodos computacionales y los algoritmos para acelerar el descubrimiento y la optimización de nuevos compuestos terapéuticos 1,2,3. La CDD ha revolucionado el descubrimiento de fármacos. Sin embargo, existen limitaciones asociadas con la dinámica de la estructura tridimensional (3D) de proteínas que pueden afectar la precisión y confiabilidad de las predicciones computacionales4. Las estructuras 3D de proteínas sirven como plantillas en CDD para el diseño u optimización de candidatos a fármacos en función de las interacciones proteína-fármaco objetivo. Si bien los modelos de cristalografía de rayos X de las estructuras de las proteínas proporcionan información estructural valiosa sobre las proteínas, es esencial reconocer la naturaleza dinámica de las estructuras de las proteínas y las limitaciones de los modelos estáticos 5,6,7. Además, los avances recientes en la criomicroscopía electrónica (crio-EM) y las predicciones computacionales como AlphaFold también han ampliado en gran medida la disponibilidad de datos estructurales para capturar el espectro completo de la flexibilidad y la dinámica de las proteínas 8,9,10,11,12.

Las simulaciones de dinámica molecular (MD) simulan el movimiento y las interacciones de los átomos y las moléculas a lo largo del tiempo, proporcionando información sobre el comportamiento dinámico y la flexibilidad de la estructura 3D de las proteínas13,14. Las simulaciones MD se utilizan para generar estructuras 3D de proteínas que representan varios estados conformacionales, que sirven como entrada para el análisis de acoplamiento basado en conjuntos. A través del muestreo de diversas conformaciones de proteínas, el análisis de acoplamiento basado en conjuntos tiene en cuenta la flexibilidad y la dinámica inherentes de los objetivos biológicos, lo que permite una exploración más completa de los modos de unión y las interacciones de los ligandos3.

Comprender la flexibilidad de las proteínas es esencial, ya que influye en la forma en que los fármacos ejercen sus efectos biológicos, determina la ubicación y orientación de los sitios de unión y afecta la cinética de unión, el metabolismo y el transporte15,16. La captura de esta naturaleza dinámica puede mejorar significativamente la precisión y la fiabilidad de las predicciones de acoplamiento. En 1994, Kearsley et al. introdujeron una técnica de acoplamiento flexible, un marco que modela la flexibilidad tanto de los ligandos como de las proteínas. Este enfoque permite que la conformación de la proteína se ajuste durante el acoplamiento, mejorando las predicciones de las interacciones ligando-receptor al tener en cuenta la flexibilidad estructural17. De manera similar, en 1999, Carlson et al. informaron sobre el acoplamiento de conjuntos, que aplica el modelado de farmacoforos flexibles a modelos estáticos y dinámicos de la integrasa del VIH-1, destacando aún más la importancia de tener en cuenta la dinámica de las proteínas en los estudios de acoplamiento18. Además, Cavasotto et al. también informaron de la mejora de la precisión del acoplamiento del ligando mediante la incorporación de la flexibilidad del receptor en el proceso de acoplamiento mediante el análisis de modo normal19. Más recientemente, las técnicas basadas en conjuntos 20,21,22,23,24,25,26,27 han ampliado el descubrimiento de fármacos mediante la identificación de posibles nuevos sitios de unión al ligando y proporcionando estimaciones más precisas de la energía libre de unión al ligando-receptor. Estos avances se han aplicado a dianas como el ADN cuádruple-dúplex20, el factor de crecimiento endotelial vascular 165 (VEGF-165)21, la enzima diana22 del SARS-CoV-2, las enzimas 23 del citocromo P450 del hígado humano y las proteínas anticancerosas24.

Se ha documentado que la flavokawaína B (FB), clasificada como flavonoide, exhibe diversas propiedades farmacológicas 28,29,30. Con base en análisis experimentales y computacionales, se ha reportado que FB forma un complejo estable con lisozima (LYZ)31, una proteína ampliamente reconocida por su actividad antimicrobiana y también ha sido identificada como un transportador deligandos 32,33,34. En este informe, analizamos más a fondo la naturaleza de la interacción de FB con LYZ utilizando el análisis de acoplamiento basado en conjuntos para incorporar el impacto de la flexibilidad de las proteínas en la formación del complejo FB-LYZ. El objetivo de este método es proporcionar a los investigadores un proceso paso a paso y repetible para el análisis de acoplamiento basado en conjuntos. Además, es aconsejable que los investigadores seleccionen las estructuras proteicas del organismo objetivo para la investigación.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparación de la estructura del ligando Flavokawain B

  1. Abre el sitio web de PubChem. Buscar a Flavokawain B. Seleccione Descargar y seleccione Guardar para la estructura 2D de SDF como SDF Structure2D_COMPOUND_CID_5356121.MDL.
  2. Abra el software Avogadro. Mueva el archivo SDF al espacio vacío del software. Haga clic en Sí.
    NOTA: El software Avogadro construirá automáticamente una geometría tridimensional (3D).
  3. En la pestaña, haga clic en el icono, como se muestra en la figura 1. En la pestaña del menú de la izquierda, cambie el campo de fuerza a MMFF9435,36. Ajuste los pasos por actualización a 15. Establezca el algoritmo en Descenso más pronunciado y haga clic en Iniciar.
    NOTA: No mueva ningún átomo mientras la rotación está en curso. Una vez que haya terminado, haga clic en Detener. MMFF94 es adecuado para una amplia gama de ligandos de moléculas pequeñas (incluidos neutros y cargados) y se usa ampliamente para la minimización de energía y el modelado molecular37. El método de descenso más pronunciado se elige para la minimización inicial de la energía porque es sencillo, computacionalmente eficiente y eficaz para eliminar grandes tensiones estructurales y lograr un estado de minimización básico 38,39,40.
  4. En la pestaña del menú, vaya a Archivo y haga clic en Guardar como. Cuando aparezca la carpeta Guardar molécula como , escriba el nombre del archivo como ligando.pdb y haga clic en Guardar.

2. Preparación de la estructura de la proteína lisozima

  1. Abra el sitio web del banco de datos de proteínas RCSB. Búsqueda de lisozima, código: 1LYZ. Haga clic en Descargar archivos y seleccione Formato PDB. Guardar como 1lyz.pdb.
  2. Abre el software Chimera. En la pestaña, haga clic en Archivo y Abrir. En la carpeta, seleccione el archivo 1lyz.pdb .
    NOTA: Se construirá una estructura 3D de lisozima utilizando software.
  3. En la pestaña, haga clic en Seleccionar > residuo > HOH. A continuación, haga clic en Acciones > Átomo/Enlaces > Eliminar. Haga clic en Seleccionar y borrar selección.
    NOTA: Esto eliminará el agua de la proteína.
  4. En la pestaña, haga clic en Seleccionar > cadena > A. A continuación, haga clic en Herramientas > Edición de estructuras > AddH. Aparecerá un cuadro de parámetros y lo dejará como predeterminado. Haga clic en Aceptar. Haga clic en Seleccionar y borrar selección (Figura 2).
    NOTA: Esto agregará hidrógeno a la proteína. El residuo de histidina también se protona para crear un sistema neutro. El software puede realizar cálculos de pKa integrando PROPKA41,42.
  5. En la pestaña, haga clic en Herramientas, Edición de estructura y Agregar cargo. Aparecerá un cuadro de parámetros; seleccione Gasteiger. Haga clic en Aceptar. NOTA: Esto agregará cargas parciales a la proteína.
  6. Para guardar el archivo, en la pestaña, haga clic en Archivo > Guardar PDB. Guardar como proteína.pdb.
    NOTA: En este estudio, se eligió la estructura de la lisozima para compararla con el resultado31 reportado previamente. Se aconseja a los lectores que seleccionen cuidadosamente las estructuras de proteínas del organismo objetivo de su interés.

3. Simulación MD de lisozima en agua

NOTA: Los ordenadores personalizados para la simulación de dinámica molecular (MD) utilizados en este estudio son Intel CORE i7de 11ª generación para CPU, NVIDIA Geforce RTX 2060 para GPU y DDR4 de 128 GB de memoria. El sistema operativo es Ubuntu 22.04.4 LTS. La simulación de MD se realiza utilizando el software GROMACS. El soporte de GPU es CUDA.

  1. Descargue todos los documentos requeridos desde este enlace: http://www.mdtutorials.com/gmx/lysozyme/01_pdb2gmx.html (Tutorial de GROMACS, lisozima en agua)43.
    NOTA: Los documentos necesarios son em.mdp, ions.mdp, md.mdp. npt.mdp, nvt.mdp, charmm36 ff y protein.pdb (del paso 2.5). Para la configuración del sistema, em.mdp es para la minimización de energía, e ions.mdp es para agregar iones y neutralizar el sistema. Para el equilibrio, nvt.mdp es para el equilibrio de la temperatura, mientras que npt.mdp es para el equilibrio de la presión. Para producción, md.mdp es para simulación. Charmm36 ff es para la topología.
  2. Haga clic con el botón derecho en el espacio vacío de la carpeta (el directorio de trabajo) y haga clic en Abrir terminal. Escriba gmx para abrir el software GROMACS. NOTA: GROMACS no tiene una interfaz gráfica de usuario; Todo es del comando escrito en la terminal.
  3. Para la generación de topología de proteínas, escriba gmx pdb2gmx -f protein.pdb -o protein.gro –ignh. Se proporciona una lista de campos de fuerza, y el tipo 1 para el campo de fuerza de átomosCHARMM 44, seguido del tipo 1 para TIP3P para el modelo de agua.
    NOTA: La versión actualizada, CHARMM36, también está disponible y se puede descargar a partir de http://mackerell.umaryland.edu/charmm_ff.shtml45.
  4. Defina una caja cúbica para cubrir toda la estructura de la proteína. Escriba gmx editconf -f complex.gro -o newbox.gro -c -d 1.0 -bt cubic. NOTA: La proteína se coloca al menos a 1 nm del borde de la caja. Asegúrese de que el tamaño de la caja de agua sea lo suficientemente grande para proteínas, solventes e iones. Además, la caja de agua debe ser adecuada para evitar interacciones entre imágenes periódicas de la proteína. La distancia mínima recomendada entre la proteína y el borde de la caja es de al menos 1,0-1,5 nm.
  5. Para la configuración de disolvente46, escriba gmx solvate -cp newbox.gro -cs spc216.gro -p topol.top -o solv.gro.
  6. Agregue iones como sodio y/o cloruro escribiendo gmx solvate -cp newbox.gro -cs spc216.gro -p topol.top -o solv.gro.
    NOTA: Los iones de sodio y/o cloruro se utilizan para neutralizar el sistema.
  7. Neutralice el sistema escribiendo gmx genion -s ions.tpr -o solv_ions.gro -p topol.top -pname NA -nname CL -neutral. Seleccione 13 para el grupo SOL.
    NOTA: Para la lisozima, 8 moléculas de soluto han sido reemplazadas por iones de cloruro (Figura 3).
  8. En el archivo CHARMM 36, busque la carpeta ions.itp . La abreviatura de ion cloruro es CLA.
  9. Abra topol.top archivo, agregue CLA y el número 8 como se muestra en la figura 4.
  10. Abra el archivo solv_ions.gro e intercambie todos los CL en CLA.
    NOTA: Asegúrese de que los archivos solv_ions.gro y topol.top tengan la misma abreviatura de los iones respectivos, o de lo contrario aparecerá una advertencia. El cambio de nombre del ion está de acuerdo con la versión del archivo CHARMM 36 ff. Dado que la abreviatura de cloruro ya es CL, no es necesario cambiar el nombre de los iones en la versión anterior. Sin embargo, siempre verifique la abreviatura de iones.
  11. Relaje la estructura de la proteína minimizando la energía del descenso más pronunciado con el número máximo de 50.000 pasos. Para ello, escriba gmx grompp -f em.mdp -c solv_ions.gro -p topol.top -o em.tpr seguido de gmx mdrun -v -deffnm em.
    NOTA: El disolvente y los iones se equilibran alrededor de la proteína en dos fases: (i) el número de partículas (N), el volumen del sistema (V) y la temperatura (T) son constantes (NVT), y (ii) el número de partículas (N), la presión del sistema (P) y la temperatura (T) son constantes (NPT). El acoplamiento de temperatura (fase NVT) se establece en 300 K basado en un termostato Berendsen modificado, mientras que el acoplamiento de presión (fase NPT) se establece en 1 bar basado en Parrinello-Rahman. Las interacciones electrostáticas de largo alcance y la búsqueda del vecino más cercano se calculan automáticamente utilizando el método de Ewald de malla de partículas (PME) y el algoritmo de Verlet, respectivamente.
  12. Para el equilibrio de NVT, escriba gmx grompp -f nvt.mdp -c em.gro -r em.gro -p topol.top -n index.ndx -o nvt.tpr seguido de gmx mdrun -v -deffnm nvt.
    NOTA: El tiempo necesario para el equilibrio de la temperatura es de unos 5 minutos, dependiendo de la CPU y la GPU. Para el equilibrio del sistema, el tiempo de simulación es de 100 ps.
  13. Para el equilibrio de NPT, escriba gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -r nvt.gro -t nvt.cpt -p topol.top -o npt.tpr seguido de gmx mdrun -v -deffnm npt.
    NOTA: El tiempo necesario para el equilibrio de la presión es de unos 5 minutos, dependiendo de la CPU y la GPU. Para el equilibrio del sistema, el tiempo de simulación es de 100 ps.
  14. Haga que el sistema pase por ciclos de equilibrio durante 1 ns seguidos de la ejecución de producción utilizando la función mdrun con una duración de 100 ns. Abra el archivo md.mdp. En n pasos, cambie a 50000000; 2 ' 50000000 = 100000 ps (100 ns).
  15. Para la producción de dinámica molecular, escriba gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -o md.tpr seguido de gmx mdrun -v -deffnm md.
    NOTA: El tiempo para esto es de alrededor de ~ 2 días. Los fotogramas de trayectoria generados a partir de la simulación MD se capturan a intervalos de 10 ps y se utilizan para el análisis de agrupamiento basado en la desviación cuadrática media (RMSD).

4. Análisis de agrupamiento basado en RMSD

  1. Después de la simulación MD, continúe con el análisis de comandos. La proteína se difundirá a través de la celda unitaria y puede aparecer "rota" o "saltar" al otro lado de la caja. Escriba gmx trjconv -s md.tpr -f md.xtc -o md_center.xtc -center -pbc mol -your compact. Tipo 1 para centrar la proteína y 0 para la salida del sistema. Escriba vmd em.gro para visualizar la proteína.
  2. Para el análisis de energía total, escriba gmx energy -f md.edr -o totalenergy.xvg y continúe hasta el tipo 14 para la energía total.
    NOTA: El monitoreo de la energía total es fundamental para garantizar la confiabilidad y exactitud de las simulaciones MD47,48.
  3. Para el análisis RMSD, escriba gmx rms -s md.tpr -f md_center.xtc -o rmsd.xvg -tu ns. Continúe escribiendo 3 para el C-alfa de los mínimos cuadrados ajustados y 3 para el C-alfa del cálculo RMSD (Figura 5).
  4. Para el análisis RMSF, escriba gmx rmsf -s md.tpr -f md_center.xtc -o rmsf.xvg –res. Continúa con el tipo 1 para obtener proteínas.
  5. Para usar grace, escriba este comando xmgrace totalenergy.xvg. Ajuste los ejes haciendo doble clic en la línea del cuadro del gráfico. Aparecerá un cuadro de Gracia: Hachas . Haga clic en Aceptar.
  6. En el menú de pestañas, haga clic en Archivo y Print_setup. Aparecerá Grace: Configuración del dispositivo . Cambie el dispositivo de PostScript a JPEG. Haga clic en Aceptar. Ahora haga clic en Imprimir en el menú de archivos. Guardar como totalenergy.jpg.
  7. Repita los pasos 4.5 y 4.6 para xmgrace rmsd.xvg y xmgrace rmsfxvg.
  8. Para el análisis de conglomerados, escriba gmx cluster –s md.tpr –f md_center.xtc –g cluster.log –sz cluster-size.xvg –clid clus-id.xvg –cl cluster.pdb –cutoff 1.0. Continúe hasta el tipo 1 (grupo de proteínas) para calcular el ajuste de mínimos cuadrados y RMSD y el tipo 1 (grupo de proteínas) para la salida del sistema.
    NOTA: Ajuste el valor de corte de acuerdo con el resultado de la agrupación en clústeres. El comando -cl representa las salidas del promedio de cada clúster.
  9. Abra cluster-size.xvg.
    1. En función de la información proporcionada, aumente el valor de corte de RMSD si el número de clústeres es bajo o disminuya el valor de corte de RMSD si el número de clústeres es alto.
  10. Repita el paso 4.8 con diferentes valores de corte.
    NOTA: Agrupación con diferentes valores de corte hasta que se haya determinado un valor de corte RMSD óptimo en función de los siguientes criterios: (1) El número total de clústeres debe limitarse a menos de 30. (2) Es preferible minimizar la presencia de clústeres con un solo miembro. (3) Es deseable que más del 90% de la trayectoria esté representada en menos de 10 clústeres.
  11. Abra el software Chimera y busque cluster.pdb.
    NOTA: cluster.pdb contiene un promedio para cada grupo de clústeres.
  12. Haga clic en Presenta y Publicación 1 (silueta, cinta redondeada).
  13. A continuación, ve a Archivo > Guardar imagen > Guardar.
  14. Haga clic en Seleccionar > cadena > (sin ID) > cluster.pdb . Haga clic en Seleccionar > Invertir (todos los modelos). Haga clic en Acciones > Átomos/Enlaces > eliminar.
    NOTA: Esto eliminará todos los clústeres de grupo excepto el clúster 1.
  15. A continuación, vaya a Archivo > guardar PDB > guardar. Guardar como clúster1.pdb.
  16. Repita los pasos 4.11 a 4.15 para diferentes clústeres. Guardar como cluster2.pdb, cluster3.pdb y cluster4.pdb.
    NOTA: Dado que el número total de los 4 clústeres principales es más del 90% de las trayectorias totales, cada representante de los 4 grupos principales se extrae y se somete a un análisis de acoplamiento molecular utilizando Chimera (ver Figura 6).

5. Acoplamiento basado en conjuntos

  1. Haga doble clic en el software Autodock Tools .
    NOTA: Para el acoplamiento, en este estudio se utilizaron AutoDock y el software de herramientas AutoDock 13,49,50,51.
  2. Coloque los archivos cluster1.pdb y ligand.pdb en una nueva carpeta.
  3. En el menú, haga clic en Archivo > Preferencias > Establecer. Aparecerá un cuadro Establecer preferencias de usuario . Copie la dirección de la "nueva carpeta" como texto. Pegue la dirección en el Directorio de inicio en el cuadro Establecer preferencias de usuario . Haga clic en Establecer.
    NOTA: Este es un paso importante si utiliza el sistema operativo Windows.
  4. Haga clic en la imagen de la carpeta azul. Aparecerá una carpeta de lectura de moléculas . Seleccione cluster1.pdb.
    NOTA: Las herramientas de acoplamiento automático leerán la estructura molecular de la proteína.
  5. Haga clic en Editar > cargos > Agregar cargos de Kollman. A continuación, haga clic en Aceptar. Haga clic en Editar > Hidrógenos > Fusionar no polar.
    NOTA: Las cargas de Kollman se añaden a la proteína.
  6. Haga clic en Cuadrícula > Macromoléculas > seleccione. Aparecerá un cuadro Elegir macromoléculas . Seleccione cluster1 y haga clic en Seleccionar moléculas. Haga clic en Aceptar. Aparecerá un archivo de macromolécula AutoDock4 modificado . Guardar como cluster1.pdbqt.
  7. Vacíe el espacio de trabajo haciendo clic en Editar > Eliminar > Eliminar todas las moléculas. Haga clic en Continuar.
  8. Haga clic en Ligando > entrada > Abrir.  Aparecerá un archivo Ligand para la carpeta Autodock4 . Elija Todos los archivos, seleccione ligand.pdb y haga clic en Abrir. Haga clic en Aceptar.
    NOTA: El ligando de configuración incluirá la incorporación de cargas Gasteiger y la fusión de hidrógeno no polar.
  9. Haga clic en Ligando > árbol de torsión > Detectar raíz.
  10. Haga clic en Ligando > salida > Guardar como PDBQT. Aparecerá una carpeta Formatted Autotors Moles . Guardar como ligando.pdbqt.
  11. Vacíe el espacio de trabajo haciendo clic en Editar > Eliminar > Eliminar todas las moléculas. Haga clic en Continuar.
    NOTA: Siga el mismo procedimiento que se describe en el paso 5.6.
  12. Haga clic en Cuadrícula > Macromoléculas > Abrir. Seleccione cluster1.pdbqt y haga clic en Abrir. Haga clic en Sí. Haga clic en Aceptar.
  13. Haga clic en Cuadrícula > Establecer tipos de mapa > Abrir ligando. Seleccione ligand.pdbqt y haga clic en Abrir.
    NOTA: En el espacio de trabajo, hay proteínas y ligandos.
  14. Haga clic en Cuadrícula y cuadro de cuadrícula. Aparecerá un cuadro de opciones de cuadrícula . En Número de puntos en la dimensión x, ajuste el parámetro a 120 y establezca Número de puntos en la dimensión y en 120, establezca Número de puntos en la dimensión z en 120. Establezca el espaciado (angstrom) en 0,375. Deje los parámetros de Cuadro de cuadrícula central como predeterminados. Haga clic en Archivo y cierre Guardar actual.
    NOTA: La caja de rejilla cubre toda la proteína, lo que significa que es un acoplamiento ciego.
  15. Haga clic en Cuadrícula > salida > Guardar GPF. Aparecerá un archivo de salida de parámetros de cuadrícula . En el nombre del archivo, escriba grid.gpf y haga clic en Guardar.
  16. Haga clic en Ejecutar y Ejecutar AutoGrid. Aparecerá un cuadro Ejecutar AutoGrid . En la pestaña Nombre de archivo de parámetro , haga clic en Examinar. Aparecerá un archivo de parámetros de Autogrid . Seleccione grid.gpf. Haga clic en Abrir. En Nombre de la ruta del programa > examinar. Aparecerá un archivo autogrid4 . Busque autogrid4.exe y haga clic en Abrir > iniciar.
    NOTA: Asegúrese de que el nombre de la carpeta no contenga espacios, ya que esto puede provocar un error durante la ejecución. La carpeta autogrid4.exe se puede instalar desde https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/.
  17. Haga clic en Acoplamiento > macromoléculas > Establecer nombres de archivo rígidos. Aparecerá un archivo PDBQT Macromoles . Seleccione cluster1.pdbqt y haga clic en Abrir.
  18. Haga clic en Acoplamiento > ligando > seleccione. Aparecerá el cuadro Elegir ligandos . Seleccione el ligando y haga clic en Seleccionar ligando. Aparecerá un cuadro de parámetros de ligando AutoDpf4 . Haga clic en Aceptar.
  19. Haga clic en Acoplamiento > Parámetro de búsqueda > algoritmo genético. Aparecerá un cuadro de parámetros del algoritmo genético . Cambie el número de ejecuciones de GA a 100. Deje los parámetros restantes como predeterminados. Haga clic en Aceptar.
  20. Haga clic en Acoplamiento > salida > Lamarckian GA(4.2). Aparecerá un archivo de salida de parámetros de acoplamiento GALS de Autodock4.2 . Para el nombre del archivo, escriba docking.dpf y haga clic en Guardar.
  21. Haga clic en Ejecutar > en Ejecutar AutoDock. Aparecerá un cuadro Ejecutar acoplamiento automático . En Nombre de archivo de parámetro, haga clic en Examinar. Aparece un archivo de parámetros autodock4 . Seleccione docking.dpf. Haga clic en Abrir. En Nombre de la ruta del programa, haga clic en Examinar. Aparecerá un archivo autodock4 . Busque autodock4.exe y haga clic en Abrir. Haga clic en Iniciar.
    NOTA: Asegúrese de que el nombre de la carpeta no contenga espacios, ya que esto puede provocar un error durante la ejecución. El tiempo empleado es de ~ 30 min. La carpeta autodock4.exe se puede instalar mediante el enlace: https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/.
  22. Elimine todas las moléculas como se describe en el paso 5.7.
  23. Repita los pasos de 5.1 a 5.22 para cluster2.pdb, cluster3.pdb y cluster4.pdb.
    NOTA: Los 4 grupos de acoplamiento se utilizarán para el análisis.

6. Análisis de acoplamiento basado en conjuntos

  1. Utilice el software AutoDock Tools para continuar con el análisis. Haga clic en Analizar > acoplamiento > abrir. Aparecerá un archivo de registro de acoplamiento . Seleccione docking.dlg y haga clic en Abrir. A continuación, haga clic en Aceptar.
  2. Haga clic en Analizar > macromoléculas > abrir.
  3. Haz clic en Analizar > conformaciones > jugar, clasificadas por energía. Aparecerá una caja de ligandos .
  4. En la nueva carpeta, abra la carpeta docking.dlg con un bloc de notas. Búsqueda de análisis de conglomerados de conformación. A partir de la información proporcionada, busque la ejecución de conformación (indicada como ejecución), que tiene la energía de enlace más baja.
    NOTA: Dado que se ejecutan 100 conformaciones, solo una tiene la afinidad de unión más fuerte entre el ligando y la proteína. El término para la energía de enlace más baja se define como que tiene una afinidad de enlace más fuerte 52,53,54.
  5. Desde el paso 6.3 (caja de ligandos ), introduzca la ejecución de conformación (desde el paso 6.4) y pulse Intro.
    NOTA: El ligando se posicionará en consecuencia dentro de la proteína.
  6. En el cuadro de ligando , haga clic en el botón abrir panel para cambiar la opción de reproducción. Aparecerá un cuadro Establecer opción de juego. Haga clic en Escribir complejo. Aparecerá un complejo de escritura de la carpeta del receptor . Guardar como complex.pdb.
    NOTA: Dado que hay 4 grupos de clústeres, el archivo complex.pdb se puede nombrar en consecuencia, como complex1.pdb para el grupo de clústeres 1.
  7. Abra el software Chimera y busque complex.pdb (como en el paso 6.6).
  8. Haga clic en Ajustes preestablecidos > Interactivo 1 (cintas) > Publicación 1 (silueta, cinta redondeada).
  9. A continuación, ve a Archivo y haz clic en Guardar imagen.
    NOTA: La imagen guardada es la estructura de cinta del complejo FB-LYZ.
  10. Haga clic en Ajustes preestablecidos > Interactivo 3 (superficie de hidrofobicidad) > Publicación 1 (silueta, cinta redondeada).
    NOTA: La imagen guardada es la estructura del globo del complejo FB-LYZ.
  11. Abre el software Discovery Studio.
  12. Arrastre el archivo complex.pdb al espacio vacío del software.
  13. Haga clic en la pestaña Herramientas y seleccione Mostrar diagrama 2D.
    NOTA: El software generará automáticamente la estructura 2D del complejo (Figura 7).
  14. Haga clic en Archivo y Guardar como. Escriba el nombre del archivo y haga clic en Guardar.

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Resultados

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La estructura química y la representación estructural 3D de FB después de la optimización se muestran en la Figura 8A. La Figura 8B muestra la estructura 3D de la lisozima con el código pdb 1LYZ en el estado inicial antes de la simulación MD. Con el fin de estudiar la dinámica y flexibilidad de la estructura 3D de lisozima, se realizó una simulación MD para 100 ns. La energía total de la estructura de la proteína fue estable dura...

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Discusión

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La aplicación basada en conjuntos en el descubrimiento computacional de fármacos implica la utilización de numerosos conjuntos conformacionales derivados de estructuras cristalinas, estudios de resonancia magnética nuclear (RMN) o simulaciones de dinámica molecular26. La explotación de múltiples conformaciones computacionales permitiría que el análisis incorpore la dinámica y la flexibilidad de la estructura de una proteína, lo que llevaría a una mejora de la prec...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros o relaciones personales contrapuestas que puedan haber influido en el trabajo reportado en este artículo.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por la Beca RMF de la Universiti Malaya, Número de Proyecto RMF1392-2021 de la Universiti Malaya.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AutoDockEl Instituto de Investigación Scripps, EE. UU.Versión 4.2.6
Herramientas AutoDockEl Instituto de Investigación Scripps, EE. UU.Versión 1.5.6
AvogadroGeoffrey R Hutchison, Departamento de Química, Universidad de Pittsburgh, Pittsburgh, EE. UU.Versión 1.95
Discovery StudioDassault Systè mes, Massachusetts, EE. UU.Versión 2021
GROMACsUniversidad de Groningen
Real Instituto de Tecnología
Universidad de Uppsala, Suecia		Versión 2023
UCSF ChimeraResource for Biocomputing, Visualization, and Informatics
University of California		Versión 1.16

Referencias

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Ensemble Based DockingProtein Structure FlexibilityMolecular Dynamics SimulationStructure Based Drug DiscoveryProtein Conformation ClusteringLigand DockingRoot Mean Square DeviationFlavokawain B BindingElectrostatic Surface MappingComputational Drug Discovery

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