Cribado de fragmentos covalentes mediante el ensayo cuantitativo de anclaje irreversible

Summary

El ensayo cuantitativo de anclaje irreversible (qIT) es un método basado en fluorescencia para identificar fragmentos covalentes que interactúan selectivamente con una proteína objetivo. Aquí, se describe un protocolo detallado para describir el ensayo qIT, con resultados de ejemplo incluidos.

Abstract

Los compuestos que forman enlaces covalentes con proteínas diana específicas ofrecen una variedad de ventajas como sondas químicas y agentes terapéuticos. Lo más común es que se empleen moléculas pequeñas electrofílicas ligeramente reactivas para formar enlaces covalentes con cadenas laterales de cisteína seleccionadas en proteínas específicas. Los enfoques electrófilos del descubrimiento de ligandos, en los que una biblioteca de moléculas pequeñas electrófilas se examinan contra una proteína objetivo, se han vuelto populares ya que evitan la necesidad de una instalación posterior de una ojiva electrofílica que requiere mucho tiempo. Sin embargo, este cribado es complicado, ya que los ligandos electrofílicos pueden exhibir una amplia gama de diferentes tasas de reacción espontánea con las cisteínas. El anclaje cuantitativo-irreversible (qIT) ofrece un método basado en fluorescencia para la identificación y el desarrollo de impactos que normaliza los datos de estas diferencias en la reactividad intrínseca de los compuestos. Se determinan las tasas de reacción de los compuestos individuales con una proteína objetivo y se comparan con la reactividad de los compuestos con el tripéptido no estructurado glutatión (que es un indicador de la reacción espontánea de los compuestos), lo que permite identificar los compuestos que reaccionan preferentemente con la proteína de interés. Esta metodología se ha aplicado con éxito para identificar fragmentos covalentes selectivos frente a varias dianas farmacológicas, como la proteasa principal del SARS-CoV-2, la quinasa 2 dependiente de ciclina y la RAP27A. Aquí, demostramos la aplicación de qIT a una proteína objetivo para generar un conjunto de datos cuantitativos y robustos, lo que permite la priorización de ligandos de impacto para el desarrollo futuro.

Introduction

Los ligandos covalentes dirigidos reactivos a la cisteína (moléculas que ejercen un efecto biológico al reaccionar con un residuo de cisteína seleccionado sobre una proteína específica) se han vuelto cada vez más populares como herramientas químicas y terapéuticas en las últimas décadas^1. Por lo general, consisten en un electrófilo ligeramente reactivo (como una acrilamida, cloroacetamida o vinil sulfona) agregado a un ligando con una alta afinidad por una proteína objetivo². Idealmente, la interacción ligando-proteína se produce a través de un mecanismo de dos pasos que involucra la unión inicial del ligando no covalente, seguida de la formación irreversible de enlaces covalentes entre la cisteína objetivo y el electrófilo³.

Varios ligandos covalentes dirigidos tempranos, incluido el inhibidor de la tirosina quinasa de Bruton, Ibrutinib, se desarrollaron proporcionando un ligando reversible previamente identificado con un mango electrofílico⁴. Sin embargo, este enfoque no siempre es exitoso, y otros intentos han encontrado que la instalación de electrófilos requiere una optimización significativa⁵. En cambio, los enfoques electrófilos primero, particularmente el uso de fragmentos electrofílicos, se han vuelto más populares en los últimos años. Por lo general, estos implican incubar una biblioteca de electrófilos con una proteína y luego seleccionar compuestos con una tasa mejorada de reacción hacia una cisteína, que se supone que es inducida por interacciones productivas no covalentes entre el ligando y el bolsillo de unión⁶. En particular, estos métodos se aplicaron con éxito durante el desarrollo del inhibidor de KRAS (G12C) Sotorasib¹.

El cribado electrófilo plantea varios desafíos únicos en comparación con el cribado tradicional de ligandos no covalentes, principalmente debido a la alta variabilidad en la reactividad dentro y entre las clases de ojivas⁷. La mayoría de los electrófilos reactivos a la cisteína, con el tiempo, reaccionarán con todos los residuos de cisteína expuestos al solvente, independientemente de cualquier interacción selectiva para la proteína objetivo. Por lo tanto, la ocupación del ligando aumentará con el tiempo para casi todos los electrófilos, y sin controlar la reactividad, la selección de impactos a menudo estará sesgada hacia fragmentos más reactivos que se acoplan a un objetivo^{más rápidamente.}

Además, los métodos de cribado electrófilos suelen utilizar la espectrometría de masas para detectar la formación de aductos proteína-ligando, cuyo rendimiento es limitado⁹. Se requiere un muestreo regular de la reacción durante un período de tiempo prolongado (horas a días) para caracterizar adecuadamente la cinética de reacción de una biblioteca de compuestos con electrofilicidad variada¹⁰. Por lo tanto, una pantalla de 300 fragmentos muestreados en 10 puntos de tiempo requerirá la realización de 3000 espectros de masas, superando el rendimiento de la mayoría de los sistemas de espectrometría de masas de proteínas. Por lo tanto, son deseables métodos de mayor rendimiento para monitorear la formación de aductos proteína-ligando.

El enfoque descrito aquí, el ensayo de anclaje cuantitativo irreversible (qIT), es un método de cribado electrófilo que controla la reactividad intrínseca y utiliza una lectura de fluorescencia simple⁷. La proteína, o glutatión (un tripéptido no estructurado que contiene tiol utilizado como control de la reactividad intrínseca) se incuba con una biblioteca de fragmentos electrofílicos, y se toman muestras regulares para su enfriamiento en una solución de CPM (7-dietilamino-3-(4'-maleimidilfenil)-4-metilcumarina, un agente fluorogénico de cuantificación de tiol). La formación de aductos entre la cisteína y el fragmento electrofílico reduce la cantidad de tiol disponible para la reacción con CPM, reduciendo la fluorescencia resultante en el enfriamiento. Por lo tanto, la fluorescencia CPM actúa como un proxy del tiol no reaccionado, lo que permite determinar la cinética de la reacción del tiol con cada fragmento electrofílico. Los fragmentos electrofílicos con una reactividad proteica significativamente mejorada sobre el glutatión se seleccionan como aciertos y se priorizan para un mayor desarrollo (Figura 1).

Figura 1: Esquema de qIT. Una visión general esquemática del ensayo qIT. (creado con BioRender). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La selección de aciertos mediante valores REF controla la reactividad intrínseca y garantiza que los fragmentos solo se seleccionen como aciertos si forman interacciones productivas no covalentes con una proteína diana. La simple lectura de fluorescencia también significa que el ensayo qIT es altamente escalable y no requiere métodos de monitoreo de reacción basados en espectrometría de masas.

Aquí, se describe un procedimiento completo para el ensayo qIT, con resultados de ejemplo incluidos para ilustrar el rendimiento del ensayo y la selección de aciertos.

Protocol

1. Construcción de bibliotecas de fragmentos

1. Diseña una biblioteca de fragmentos electrófilos y sintúralos o cómpralos. Las bibliotecas de fragmentos electrofílicos suelen consistir en electrófilos ligeramente reactivos (como acrilamidas, cloroacetamidas y sulfonamidas de vinilo) añadidos a una amplia gama de andamios químicos. Las bibliotecas de fragmentos electrofílicos están ampliamente disponibles a través de proveedores comerciales, y se revisan más detalles sobre su diseño y construcción en otra parte ^5,11.
2. Disuelva cada compuesto en DMSO a una concentración de 50 mM, luego dispense un compuesto diferente en cada pocillo de las columnas 3 a 22 de una placa de depósito de 384 pocillos, denominada placa de biblioteca de fragmentos.
   1. Dispense DMSO en cada pocillo de las columnas 1, 2, 23 y 24 para los controles positivos y negativos. La disposición de las placas puede variar en función del número de compuestos que se examinen (Figura 2). El volumen añadido a la placa de biblioteca dependerá del número de cribas a realizar, considerando que se requiere aproximadamente 1,8 μL de cada pocillo por criba qIT. Prepare esta placa de biblioteca de fragmentos con anticipación y guárdela a 4 °C.

Figura 2: Disposición de las placas. Una descripción general del diseño de la placa de 384 pocillos del ensayo qIT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Configuración del ensayo (Figura 3)

1. Prepare las siguientes soluciones: solución de proteína recombinante (proteína objetivo en cualquier tampón), tampón de ensayo qIT (150 mM de NaCl, 25 mM de Hepes (pH 8)), tampón de enfriamiento del ensayo qIT (150 mM de NaCl, 25 mM de Hepes (pH 7,5)) y soluciones madre compuestas (fragmento electrofílico (50 mM) en DMSO).
   NOTA: Se utiliza un pH de 8 en el tampón de reacción para acelerar la reacción entre el residuo de cisteína objetivo y los fragmentos, lo que permite medir la velocidad de reacción incluso para fragmentos extremadamente reactivos suavemente. Se utiliza un pH ligeramente más bajo de 7,5 en el tampón de enfriamiento, ya que el enlace tioéter formado entre la maleimida de CPM y el tiol de cisteína es propenso a la hidrólisis a pH más básicos (por ejemplo, trabajos anteriores encontraron que los conjugados de cisteína-maleimida son mucho más estables a pH 7,3 que a pH 8¹²).
2. Retire las soluciones madre de fragmentos de DMSO del almacenamiento y déjelas a temperatura ambiente durante un mínimo de 2 horas para permitir que las existencias compuestas se descongelen.
3. Desgasifique el tampón de ensayo qIT burbujeando con gas argón durante aproximadamente 30 min.
4. Intercambie completamente la solución de proteína objetivo en tampón de ensayo qIT desgasificado. Fundamentalmente, los agentes reductores como el DTT y el TCEP deben eliminarse completamente a concentraciones < 100 nM, ya que interferirán con la cuantificación del tiol. Este paso se puede realizar a través de una serie repetitiva de intercambios de búfer, como se describe a continuación.
   1. Diluir la solución de proteínas en exceso del tampón de ensayo qIT desgasificado en una unidad de filtro de centrifugación, concentrar mediante centrifugación (4000 x g, 4 °C, 15 min) y repetir. Por lo general, se requieren 4 rondas de diluciones de 1 en 15 para eliminar suficientemente DTT (1 mM) de 1 mL de solución de proteína recombinante, aunque este paso se puede ajustar dependiendo de la concentración del agente reductor en la solución de proteína recombinante original.
      NOTA: Alternativamente, la diálisis de la solución de proteína diana contra un gran exceso de tampón de ensayo qIT desgasificado puede lograr el mismo resultado.
5. Diluir la solución de proteína objetivo (producida en el paso 2.1) hasta una concentración de proteína de 15 μM en tampón de ensayo qIT desgasificado. Se requieren aproximadamente 9 mL de solución de proteína objetivo para llenar una placa de 384 pocillos con suficiente volumen muerto.
6. Prepare una suspensión al 1,5% (v/v) de TCEP-agarosa en tampón de ensayo qIT desgasificado. Se requieren aproximadamente 9 mL de suspensión de TCEP-agarosa por placa de cribado.
7. Dispensar 20 μL de solución de TCEP-agarosa en cada pocillo de dos placas de 384 pocillos.
8. Prepare un caldo de glutatión de 15 μM en tampón de ensayo qIT desgasificado. Esto debe prepararse inmediatamente antes de la siembra, ya que el glutatión se oxida rápidamente en solución sin agente reductor.
9. Dispense 20 μL de tampón de ensayo qIT en las columnas 1 y 2 de ambas placas de 384 pocillos.
10. Dispense 20 μL de 15 μM de proteína o solución de glutatión (de acuerdo con la placa prevista) en las columnas 3-24 de la placa de 384 pocillos. Estos se denominan placa de reacción de proteínas y placa de reacción de glutatión. Dejar reducir a RT durante 1 h.
11. Dispense 58,2 μL de tampón de ensayo qIT desgasificado en cada pocillo de una placa de 384 pocillos, luego transfiera 1,8 μL de cada pocillo correspondiente de la placa de biblioteca de fragmentos para crear una placa de dilución de compuestos, donde cada compuesto se diluye a una concentración de 1,5 mM en tampón de ensayo qIT más 3% de DMSO.
    NOTA: Este paso se facilita con una estación de pipeteo 384, que permite transferir las existencias compuestas para cada pozo en una sola operación.
12. Después de 1 h de incubación de proteína y glutatión con TCEP-agarosa, transfiera 20 μL de solución compuesta de cada pocillo de la placa de dilución compuesta a las placas de reacción de proteína y glutatión para comenzar el ensayo. Este paso también se facilita con una estación de pipeteo 384. Los pasos del ensayo se resumen en la Figura 3.
    NOTA: La concentración de fragmentos se puede variar según sea necesario, y los ensayos qIT se pueden repetir para los golpes a concentraciones más bajas, si se desea, para confirmar que la afinidad de la proteína no es un artefacto de la alta concentración de fragmentos. La concentración de fragmentos relativamente alta se utiliza para elevar el k_pro y el k_GSH para garantizar que se puedan determinar tasas precisas para compuestos ligeramente reactivos (que pueden mostrar t_1/2 (GSH) > 24 h en las condiciones de ensayo). Además, aunque una concentración de fragmentos de 500 μM es alta, se han utilizado concentraciones altas de μM a bajas mM en el cribado de fragmentos, por ejemplo¹³.
13. Inicie un temporizador: el ensayo ha comenzado y los enfriamientos deben realizarse en puntos de tiempo regulares de acuerdo con la sección a continuación.

Figura 3: Resumen del ensayo qIT. Un resumen que ilustra los pasos clave de la configuración del pozo de reacción del ensayo qIT. (creado con BioRender). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Enfriamiento CPM

NOTA: Los enfriamientos de CPM se realizan para cuantificar la cantidad de tiol no reaccionado que queda en las placas de reacción de proteínas y glutatión. Estos deben realizarse en puntos de tiempo discretos (por ejemplo, se utilizan normalmente los siguientes puntos de tiempo: 7, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 1220 y 1440 min) para permitir que se monitoree la cinética de la reacción.

1. Prepare soluciones madre de CPM (500 μM) en DMSO, dispense en alícuotas de 111,2 μL en tubos de microcentrífuga y guárdelas a -20 °C. Estas existencias de CPM se pueden preparar con anticipación y se requerirá 1 alícuota por punto de tiempo de enfriamiento.
2. Prepare la solución de enfriamiento de CPM (1,4 μM) descongelando una solución madre de CPM congelada (500 μM) y añadiéndola a 40 ml de tampón de enfriamiento para ensayos qIT.
3. Dispensar 27 μL de solución de enfriamiento de CPM en cada pocillo de dos placas de 384 pocillos: se requieren dos para enfriar las placas de reacción de proteínas y glutatión. Estas se denominan placas de enfriamiento CPM, prepárelas un máximo de 30 minutos antes de usarlas.
4. Centrifugar la placa de reacción de proteínas a 200 x g durante 3 minutos para asegurarse de que se pegue el TCEP-agarosa.
5. En puntos de tiempo predeterminados, transfiera 3 μL de muestra de cada pocillo de la placa de reacción de proteínas a una placa de enfriamiento CPM precargada. Este paso también se simplifica utilizando una estación de pipeteo 384.
6. Mezcle la placa de enfriamiento CPM aspirando y dispensando 3 x 25 μL. Es importante extraer la muestra de la parte superior del pocillo para evitar aspirar el TCEP-agarosa en el fondo, lo que interferirá con el enfriamiento de CPM.
7. Repita los pasos 3.4-3.6 con la placa de reacción de glutatión.
8. Incubar las placas de enfriamiento CPM (preparadas en 3.4-3.6) a temperatura ambiente durante 1 h.
9. Mida la intensidad de fluorescencia de la placa de enfriamiento CPM (excitación a 384 nm y emisión a 470 nm).

4. Análisis de datos y selección de aciertos

1. Para cada enfriamiento, calcule Z' como una medida de la calidad del ensayo. Cualquier enfriamiento de CPM con Z' < 0.5 debe ser ignorado.
   Z' = 1 - ((3σ_{control positivo} + 3σ_{control negativo}) / (μ_{control positivo} -_{μ control negativo}))
   Donde σ = intensidad de fluorescencia, desviación estándar y μ = intensidad de fluorescencia, media
2. Calcule los valores medios de fluorescencia para los pocillos de control negativo y positivo (columnas 1 y 2, y 23 y 24, respectivamente).
3. Normalice bien cada reacción a los valores medios de fluorescencia de los controles positivos y negativos:
   % modificado = 100 x (fluorescencia de pozo compuesto - fluorescencia de control negativo) / (fluorescencia de control positivo - fluorescencia de control negativo)
4. Grafique por separado el porcentaje modificado en función del tiempo para cada compuesto que reacciona con el glutatión y con la proteína objetivo.
5. Ajuste los datos normalizados de % modificados en función del tiempo a un modelo de decaimiento exponencial monofásico tanto para la reacción con proteína como con glutatión utilizando la ecuación:
   % Modificado = ae ^{- kt + c}
   Donde a = el rango de % de valores modificados, k = velocidad de reacción, t = tiempo, c = % de valor modificado en tiempo infinito. El ajuste de curvas y la determinación de parámetros se pueden realizar utilizando software comercial (como Graphpad).
6. Utilice la velocidad a la que los fragmentos reaccionan con la proteína (k_pro) y el glutatión (k_GSH) para calcular el valor del factor de mejora de la tasa (REF) para cada fragmento:
   REF = k_pro / k_GSH
7. Utilice los valores REF para seleccionar fragmentos de visita. Esto se puede realizar estableciendo un umbral REF (por ejemplo, REF > 3), una tasa de aciertos arbitraria (por ejemplo, 2% superior) o seleccionando fragmentos con desviaciones estándar REF 3 mayores que la media geométrica.

Results

El ensayo qIT se utiliza aquí para identificar fragmentos covalentes para una proteína de cisteína única sin nombre. Se añadió MgCl₂ (10 mM) a los tampones de reacción, ya que se sabe que la proteína objetivo se une a los iones Mg²⁺ . El cribado se realizó por triplicado y se determinó la velocidad a la que cada fragmento reaccionó tanto con la proteína diana (k_pro) como con el glutatión (k_GSH). Los valores de Z' fueron superiores a 0,5 para todas las placas de enfriamiento y promediaron 0,75 para los enfriamientos con proteínas y 0,79 para los enfriamientos con glutatión, lo que indica un excelente rendimiento del ensayo. A continuación, se calcularon los valores de REF para cada fragmento y se seleccionaron las visitas en las que REF > 3.

Los resultados representativos (Figura 4) proporcionan un ejemplo de selección de aciertos utilizando el ensayo qIT. El compuesto 1 reaccionó a una velocidad 6,0 veces mayor con el residuo de cisteína en la proteína objetivo que con el glutatión y, utilizando un criterio de REF > 3, se seleccionó como un éxito (Figura 4B). Esta aceleración de la velocidad indica la presencia de un efecto de plantilla, por el cual las interacciones no covalentes colocan a 1 en la orientación correcta para que la cisteína en la proteína objetivo reaccione con la ojiva de cloroacetamida. Por el contrario, 2 es un ejemplo de un fragmento no golpeado, ya que la reacción entre 2 y el residuo de cisteína objetivo no se acelera en relación con la reacción entre 2 y glutatión. La falta de aceleración de la velocidad indica que no hay interacciones no covalentes productivas, posicionando a 2 en la orientación correcta para reaccionar con el residuo de cisteína objetivo.

Figura 4: Resultados representativos. Los resultados muestran el monitoreo de la reacción de proteínas y glutatión mediante qIT para (A) una alta reactividad intrínseca, un posible fragmento de golpe falso positivo y (B) un fragmento de golpe. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El ensayo qIT proporciona una plataforma eficaz y cómoda para el cribado de fragmentos electrofílicos reactivos a la cisteína frente a una proteína objetivo. Sin embargo, existen consideraciones críticas que pueden obstaculizar el rendimiento del ensayo si no se tienen en cuenta adecuadamente. En particular, las proteínas objetivo solo deben incluir una única cisteína expuesta a la superficie para que sean adecuadas para el cribado de qIT, ya que otros residuos de cisteína reaccionarán con CPM e interferirán con las mediciones de fluorescencia. En casos anteriores en los que las proteínas diana contienen múltiples cisteínas expuestas a la superficie (como la proteasa principal del SARS-CoV-2, la pequeña GTPasa RAP27A y la quinasa 2 dependiente de ciclina), las construcciones de cribado con residuos interferentes eliminados se han utilizado previamente con éxito. Sin embargo, la efectividad de esta estrategia variará dependiendo de la proteína 10,14,15.

Además, dado que el ensayo qIT mide la disminución del tiol disponible para reaccionar con el CPM a lo largo del tiempo, cualquier factor que reduzca la proporción de tioles disponibles, como la oxidación del tiol o la agregación de proteínas, puede obstaculizar el rendimiento del ensayo. La desgasificación del tampón y el uso de un agente reductor inmovilizado (TCEP-agarosa) garantizan que la oxidación del tiol sea lenta, y cualquier oxidación restante debe mitigarse normalizando las mediciones de fluorescencia a las de los pozos de control positivo. Sin embargo, pueden surgir problemas cuando una distribución desigual de TCEP-agarosa entre los pocillos provoca una oxidación no uniforme del tiol. Por lo tanto, la placa de TCEP-agarosa es esencial para el rendimiento del ensayo, que puede ser un desafío a medida que las partículas de TCEP-agarosa se hunden en los depósitos de pipeteo.

La agregación de proteínas también puede ser un problema, ya que las condiciones del ensayo (24 h de incubación a temperatura ambiente) son relativamente duras. Las estrategias de resolución de problemas, como la fusión de proteínas objetivo para solubilizar etiquetas, alterar los tampones de reacción o realizar el ensayo a temperaturas más bajas, pueden reducir la agregación y resolver problemas de estabilidad de proteínas. Ciertos fragmentos también pueden inducir la agregación de proteínas, lo que a su vez reduce la proporción de tiol disponible para reaccionar con CPM y crea falsos positivos. La validación ortogonal de aciertos mediante espectrometría de masas de proteínas intactas es un método eficaz para detectar estos casos, ya que los aciertos falsos positivos crearán una población pequeña o inexistente de especies marcadas cuando se incuben con una proteína objetivo.

Cuando se controlan estas consideraciones, el ensayo qIT tiene algunas ventajas claras sobre otros métodos de cribado de fragmentos covalentes. La selección de aciertos mediante REF garantiza que los aciertos solo se seleccionen si forman interacciones productivas no covalentes con la proteína objetivo. La electrofilicidad de los fragmentos varía a grandes distancias, tanto entre diferentes ojivas como dentro de las clases de ojivas; Por ejemplo, trabajos anteriores han encontrado variaciones de varios cientos de veces en la tasa de reactividad del glutatión entre las acrilamidas¹⁰. Este amplio rango de electrofilicidad puede dificultar la distinción de fragmentos con altos valores _{de k pro} debido a un efecto de plantilla de aquellos que son simplemente altamente reactivos, lo que puede llevar a que los fragmentos altamente reactivos se seleccionen como falsos positivos. Por ejemplo, 2 reaccionó con el residuo de cisteína objetivo más rápidamente que 1 y, sin tener en cuenta la reactividad intrínseca, puede seleccionarse como un acierto. Sin embargo, 2 no reacciona con el residuo de cisteína objetivo a una velocidad mayor que con el glutatión, lo que indica que el mayor k_pro de 2 en relación con 1 se debe a una mayor reactividad intrínseca del fragmento, y no a un efecto de plantilla.

La lectura de fluorescencia simple utilizada por el ensayo qIT para cuantificar el tiol restante también es muy ventajosa. Otros métodos de cribado de fragmentos covalentes utilizan la espectrometría de masas de proteínas intactas para determinar la velocidad a la que los fragmentos reaccionan con una proteína objetivo y la LC-MS para determinar la velocidad a la que el glutatión reacciona con los fragmentos, los cuales requieren equipos especializados y carecen de rendimiento ^8,16. La conveniente lectura de fluorescencia hace que el ensayo qIT sea altamente escalable y solo requiere equipos de laboratorio comúnmente disponibles.

Combinadas, estas innovaciones crean un método robusto y escalable de cribado de fragmentos covalentes, que elimina la necesidad de equipos de espectrometría de masas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gas argón	BOC	I1149
Corning 384 pocillos, brida baja, placas de ensayo de fondo plano	Corning	3575
CPM	Invitrogen	D346
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
TCEP-agarosa inmovilizado	Pierce	77712
Micro lector de placas	CLARIOstar
Sellos de placa de PCR	BioRad	MSA5001
L-glutatión reducido	Sigma-Aldrich	G4251
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S9888
Hepes de sodio	Sigma-Aldrich	RES6007H-A7