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Cuantificación de la respiración mitocondrial en células enteras de levadura

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DOI:

10.3791/67186

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8 de noviembre de 2024

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1School of Chemistry, Universidad Autónoma de Querétaro, 2Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico de Morelia, 3Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico Superior de Ciudad Hidalgo

En este artículo

Resumen

La respiración mitocondrial en células enteras de levadura es un indicador valioso de la bioenergética celular. En este trabajo se presenta un protocolo para cuantificar este fenotipo aplicable a diferentes especies de levaduras.

Resumen

El metabolismo está coordinado principalmente por la disponibilidad de energía celular y las condiciones ambientales. Los ensayos para conocer cómo las células adaptan el metabolismo energético a diferentes condiciones nutricionales y ambientales proporcionan información valiosa para dilucidar los mecanismos moleculares. La fosforilación oxidativa es la fuente principal de ATP en la mayoría de las células, y la actividad de la respiración mitocondrial es un componente clave de la fosforilación oxidativa, manteniendo el potencial de la membrana mitocondrial para la síntesis de ATP. La respiración mitocondrial a menudo se estudia en mitocondrias aisladas que carecen del contexto celular. Aquí, presentamos un método para cuantificar la respiración mitocondrial en células intactas de levadura. Este método se aplica a cualquier especie de levadura, aunque generalmente se ha utilizado para las células de Saccharomyces cerevisiae. Primero, se prueba el crecimiento de la levadura en condiciones específicas. Luego, las células se lavan y se resuspenden en agua desionizada con una proporción de 1:1 (p/v). A continuación, las células se colocan en una cámara de oxímetro con agitación constante y se utiliza un electrodo Clark para cuantificar el consumo de oxígeno. Algunas moléculas se colocan secuencialmente en la cámara y se seleccionan de acuerdo con este efecto en la cadena de transporte de electrones o síntesis de ATP. El inhibidor de la ATPasa, la oligomicina, se añade primero para medir la respiración acoplada a la síntesis de ATP. Posteriormente, se utiliza un desacoplador para medir la capacidad respiratoria máxima. Finalmente, se añade una mezcla de inhibidores de la cadena de transporte de electrones para descartar el consumo de oxígeno no relacionado con la respiración mitocondrial. Los datos se analizan mediante una regresión lineal para obtener la pendiente, que representa la tasa de consumo de oxígeno. La ventaja de este método es que es específico para la respiración mitocondrial de la levadura, manteniendo el contexto celular. Es fundamental destacar que los inhibidores utilizados en la cuantificación de la respiración mitocondrial podrían variar entre especies de levaduras.

Introducción

Las mitocondrias juegan un papel fundamental en la bioenergética celular ya que son la principal fuente de ATP para la mayoría de las células, y varias vías convergen y dependen de la actividad de las vías mitocondriales1. La fosforilación oxidativa es necesaria para la síntesis de ATP que combina el transporte de electrones a través de la cadena de transporte de electrones para reducir el oxígeno y la actividad de F1F 0-ATPasa, sintetizando ATP utilizando el potencial de membrana mitocondrial producido debido al flujo de electrones2. Así, la respiración mitocondrial forma parte de la fosforilación oxidativa3.

La cadena de respiración mitocondrial comprende cuatro complejos o, en algunos casos, deficiente en el complejo I de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae), tres complejos y tres proteínas deshidrogenasas4. Los complejos respiratorios se localizan en la membrana mitocondrial interna; algunas levaduras presentan la cadena de transporte de electrones canónica con complejo I (NADH deshidrogenasa) o tres NADH deshidrogenasa, ubiquinona (Co Q), complejo II (succinato ubiquinona oxidorreductasa), complejo III (ubiquinona citocromo oxidorreductasa), citocromo c (Cyt c) y complejo IV (citocromo c oxidasa)5,6. El transporte de electrones a través de los complejos permite el bombeo de protones desde la matriz mitocondrial hasta el espacio intermembrana, formando un potencial de membrana mitocondrial7. Los protones ubicados en el espacio intermembrana son bombeados a la inversa, hacia la matriz mitocondrial por F1F0 -ATPasa para sintetizar una molécula de ATP por cada cuatro protones bombeados8.

Las mediciones de la respiración mitocondrial proporcionan información valiosa sobre la integridad mitocondrial, la bioenergética celular y la capacidad respiratoria mitocondrial9. La función de la respiración mitocondrial puede ser analizada in vitro o in situ utilizando diversas técnicas. Sin embargo, el análisis de la respiración mitocondrial en células intactas podría presentar una serie de ventajas, ya que comprende todo el metabolismo celular, ya que se consideran las interacciones de las células con su entorno y el metabolismo intracelular cuando se emplean células enteras10. Además, el uso de células intactas permite una fácil evaluación de diversas condiciones experimentales y detecta cambios mínimos que no se pudieron observar en mitocondrias aisladas10,11. Otra ventaja de la cuantificación de la respiración mitocondrial en células intactas es que se conservan los efectos de la proliferación y localización mitocondrial12.

La respiración de las mitocondrias de los mamíferos en células intactas ha sido descrita con gran detalle12, dejando de lado el estudio de otros organismos eucariotas, como las levaduras. En este trabajo se propone una técnica para cuantificar la respiración mitocondrial adaptada a levaduras a partir de protocolos de mamíferos. Por lo tanto, en esta técnica se han utilizado conceptos de la cuantificación de la respiración mitocondrial en mamíferos. Por ejemplo, esta técnica se divide en varias etapas según el protocolo de los mamíferos: 1) respiración basal (dependiente del sustrato), 2) respiración ligada al ATP (a través de la inhibición de la ATP sintasa), 3) capacidad respiratoria máxima (empleando un desacoplador que permite la permeabilidad de los protones a través de la membrana mitocondrial interna), 4) inhibición de la respiración mitocondrial (utilizando una mezcla de inhibidores de la cadena respiratoria para descartar el consumo de oxígeno por otras fuentes diferentes a respiración mitocondrial)11,13. Por lo tanto, este trabajo tiene como objetivo presentar un protocolo para cuantificar la respiración mitocondrial en levaduras.

Protocolo

1. Medios de cultivo y preparación de inóculo

  1. Prepare 100 mL de medio de extracto de levadura-peptona-dextrosa (YPD) agregando 1 g de extracto de levadura, 2 g de peptona de caseína y 2 g de glucosa en 95 mL de agua destilada. Distribuya 3 mL en tubos de ensayo de vidrio de 10 mL, esterilice a 121 °C y 1,5 psi durante 15 min.
    NOTA: El medio puede almacenarse a 4 - 8 °C durante un máximo de 1 mes.
  2. Inocular un tubo de ensayo de vidrio de 10 mL que contenga 3 mL de medio YPD con 250 μL de células de levadura conservadas con glicerol de -20 °C. Incubar durante la noche con agitación constante a 200 rpm y 30 °C.
    NOTA: La temperatura de incubación puede variar en algunas especies de levadura (por ejemplo, Kluyveromyces marxianus tiene una temperatura óptima de crecimiento de 37 °C).
  3. Llene una placa de Petri (60 x 15mm2) con agar YPD estéril al 2% (agregue 10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona de caseína, 20 g de glucosa y 20 g de agar bacteriológico a 950 mL de agua destilada) y raye la placa de Petri con las células de levadura cultivadas en el tubo de ensayo de vidrio de 10 mL usando un asa estéril. Incubar la placa de Petri a 30 °C hasta que aparezcan colonias aisladas.
  4. Prepare un preinóculo inoculando un tubo de ensayo de vidrio estéril de 10 mL que contenga 3 mL de medio YPD al 2% de glucosa con dos o tres colonias aisladas de levadura de la placa de Petri. Incubar durante la noche con agitación constante a 30 °C.

2. Condiciones de crecimiento y diseño del experimento

  1. Inocular un matraz Erlenmeyer de 500 mL que contiene 100 mL de medio sintético completo estéril (medio SC; 0,18 g de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos, 0,5 g de sulfato de amonio, 0,2 g de fosfato dipotásico, 1 g de suplementos de abandono sintético de levadura y glucosa según el diseño experimental, en 98,02 mL de agua destilada) con cultivo de levadura a DO inicial600 ~ 0,1, es decir, aproximadamente 3 mL del preinóculo durante la noche (OD600 ~ 3). Establezca la condición ambiental o complemente con el desafío químico que se probará en la respiración mitocondrial (por ejemplo, agregando 100 μM de resveratrol). Prepare un control del vehículo en un matraz separado para el desafío químico. Pruebe al menos tres réplicas biológicas.
    NOTA: Se recomienda utilizar un medio mínimo para descartar el ruido nutrimental en el ensayo, y el medio mínimo propuesto en este punto se utiliza para S. cerevisiae y podría diferir para otras especies de levadura. Por último, la concentración de glucosa suplementada en los medios de cultivo es fundamental para evitar la represión de la glucosa o el efecto Crabtree que inhibe la respiración mitocondrial; concentraciones inferiores al 0,5% (p/v) dieron buenas respuestas en la respiración mitocondrial acompañadas de altas tasas de crecimiento en S. cerevisiae. En las levaduras Crabtree negativas, las altas concentraciones de glucosa no afectaron la respiración mitocondrial (por ejemplo, K. marxianus).
  2. Pese un tubo cónico vacío de 50 mL y utilícelo para recolectar células en la fase de registro medio (OD600 ~ 0,5) por centrifugación a 4000 x g durante 5 min.
    NOTA: La fase mid-log se recomienda para probar la respiración mitocondrial, ya que es la fase de crecimiento en la que el metabolismo energético está más activo.
  3. Deseche el sobrenadante y lave el pellet 3 veces con 25 mL de agua desionizada. Pesar el tubo cónico con las celdas de pellets (peso húmedo) y restar el peso del tubo cónico para obtener el peso húmedo celular.
  4. Vuelva a suspender el pellet en 2 mL de agua desionizada.
  5. Registre la concentración celular dividiendo el peso húmedo por 2 para obtener mg de células/mL. Este valor es esencial para determinar cuánto volumen se debe agregar para tener 50 mg de células para el ensayo.

3. Ensayo de consumo de oxígeno (polarografía)

  1. Emplee un electrodo de oxígeno tipo Clark conectado a un monitor de YSI5300A y una computadora para la adquisición de datos.
    1. Colocar 5 mL de ácido morfoetanol sulfónico ajustado a pH 6 con trietanolamina (tampón MES-TEA; 10 mM) y 50 mg de células (peso húmedo) en la cámara del polarógrafo. Coloque suavemente el electrodo, teniendo cuidado de que no haya burbujas.
    2. Encienda el monitor de YSI5300A, la computadora para la adquisición de datos y la cámara para agitar. Configure el monitor YSI5300A seleccionando el dial de configuración del canal 1 en AIR. Ajuste el canal 1 al 100% con el dial de calibración del canal 1 y estabilice la señal durante 5 minutos al 100%.
    3. Comience a registrar datos en la computadora y a medir el tiempo con un cronómetro.
      NOTA: El monitor YSI5300A no tiene una computadora o programa de adquisición de datos; Esto puede ser implementado externamente por el usuario.
    4. Utilice la canalización lateral del electrodo en la cámara del oxímetro para agregar el sustrato oxidable, la oligomicina, el desacoplador y la mezcla de inhibidores de la cadena respiratoria secuencialmente.
  2. Añadir el sustrato oxidable (glucosa, glicerol, L-lactato u otra fuente de carbono según el diseño experimental) hasta una concentración final de 10 mM con una jeringa de cromatografía. Mantenga la cámara cerrada todo el tiempo y con agitación constante. Registre el consumo porcentual de aire durante 2-3 minutos para determinar la respiración basal.
    NOTA: La glucosa, el glicerol y el L-lactato se utilizan para analizar la cadena de transporte de electrones en diferentes sitios de la cadena respiratoria: el metabolismo de la glucosa reduce el NAD+ para formar NADH y se utiliza para analizar toda la cadena respiratoria; el glicerol transfiere electrones a la ubiquinona y se utiliza para evaluar la cadena respiratoria de la ubiquinona; finalmente, el L-lactato cede sus electrones al citocromo c y se emplea para determinar el efecto del citocromo c14. Estos sustratos pueden variar en función de la capacidad enzimática de las especies de levadura.
  3. Añadir oligomicina para obtener una concentración final de 0,01 mM en la cámara del oxímetro utilizando una jeringa de cromatografía para evaluar la respiración ligada al ATP y registrar el consumo porcentual de aire durante 2-3 min.
  4. Complemente el desacoplador, cianuro de carbonilo de 3-clorofenilhidrazona (CCCP) para obtener una concentración final de 0,015 mM en la cámara del oxímetro con una jeringa de cromatografía para determinar la capacidad respiratoria máxima y registrar el consumo porcentual de aire durante 2-3 min.
  5. Utilice una jeringa de cromatografía para añadir los inhibidores de la cadena de transporte de electrones: primero, 2-tenoiltrifluoroacetona (TTFA) y luego, antimicina A (AA) a concentraciones finales de 1 mM y 1 mg/mL, respectivamente. Mida cada inhibidor durante 2-3 min.
    NOTA: Los inhibidores de la cadena de transporte de electrones pueden diferir entre las especies de levadura; Esto debe tenerse en cuenta en este paso.
  6. Examine cada fuente de carbono de forma independiente (es decir, glucosa, glicerol o L-lactato). Repita los pasos 3.3 a 3.5 para cada fuente de carbono. Lave la cámara 3 veces con etanol al 70% y 3 veces con agua desionizada después de cada uso.

4. Tratamiento de datos

  1. Utilice curvas de consumo de oxígeno (trazando el porcentaje de aire en función del tiempo) para calcular las pendientes del sustrato oxidable (respiración basal), oligomicina (respiración ligada al ATP), CCCP (respiración máxima), AA y TTFA (no respiración mitocondrial; Figura 1). Calcule las pendientes individuales para cada compuesto suplementado utilizando la regresión lineal como se describe a continuación.
    1. Cree un nuevo archivo de proyecto en el software estadístico. Elija XY en la sección Crear. Seleccione la opción Introducir o Importar datos en una nueva tabla en la sección Tabla de datos.
    2. Seleccione Números en la subsección X de la sección Opciones. Haga clic en Introducir 3 valores replicados en subcolumnas en paralelo en la subsección Y de la sección Opciones.
      NOTA: El formato de tabla tiene una columna X y varias columnas Y, cada una con 3 subcolumnas denominadas A: Y1 y A: Y2.
    3. Introduzca los datos de tiempo en X columnas (por ejemplo, 0, 2, 4, 6, 8 s o 0, 1, 2, 3 min). Escribe el porcentaje de aire en las columnas Y.
    4. Realice una aptitud de regresión lineal. Haga clic en Analizar en la barra de menú. En la opción Análisis, seleccione Regresión lineal simple en análisis XY y haga clic en Aceptar.
    5. Obtenga el valor de la pendiente de las tablas Resultados en datos en la parte izquierda de la pantalla.
  2. Escriba los valores de pendiente en una hoja de datos y reste el valor de pendiente obtenido de la mezcla de inhibidores respiratorios (AA y TTFA) de las pendientes obtenidas del sustrato oxidable, oligomicina y CCCP para descartar el consumo de oxígeno de fuentes diferentes a la respiración mitocondrial.
  3. Multiplique los valores obtenidos por 237 μM deO2. Este valor se considera la solubilidad deO2 en un medio mitocondrial tamponado equilibrado con aire (20,9%O2) a 25 °C; Este valor varía según la temperatura, la altitud y la zona de influencia empleada.
  4. Convertir a minuto; los valores obtenidos son μM de O2 por tiempo, dependiendo de cómo se represente el tiempo, para obtener μM de O2 / min.
  5. Dividir por 50, es decir, los mg de células utilizadas; El mg celular puede variar según el diseño experimental. Por último, el consumo de oxígeno se expresa como μM de O2/mg de células x min

Resultados

Esta técnica de respiración mitocondrial se puede utilizar para otras especies de levaduras distintas a S. cerevisiae, como Scheffersomyces stipitis15 y K. marxianus16. Sin embargo, para fines representativos, solo presentamos resultados de S. cerevisiae. Es bien sabido que S. cerevisiae presenta un metabolismo respiratorio predominante en bajas concentraciones de glucosa (por debajo de 0,8 mM)17,18. Así, para corroborar el fenotipo respiratorio de S. cerevisiae, se cultivó en dos concentraciones de glucosa para estimular (0,5% de glucosa) y limitar (5% de glucosa) la respiración mitocondrial18,19. Como se esperaba, los resultados obtenidos en la respiración basal (sustrato oxidable), la respiración ligada a ATP (oligomicina) y la capacidad respiratoria máxima (CCCP) validan el metabolismo energético característico de S. cerevisiae (Figura 2). Observamos valores más altos de consumo de oxígeno (respiración basal, respiración ligada a ATP y capacidad respiratoria máxima) en las células cultivadas con 0,5% de glucosa en comparación con los valores obtenidos en las células cultivadas con 5% de glucosa (Figura 2).

Además, los ensayos utilizaron tres sustratos: glucosa, glicerol y L-lactato. El objetivo de emplear diversos sustratos es evaluar diferentes partes de la cadena respiratoria mitocondrial. En estas condiciones, la respiración mitocondrial no mostró cambios significativos dependientes del sustrato, ya que no se añadió ningún tratamiento para alterar la cadena respiratoria (Figura 2).

Utilizamos quercetina para evaluar la capacidad de la técnica, un compuesto que influye negativamente en la respiración mitocondrial20. Los datos obtenidos mostraron que la quercetina disminuyó significativamente la respiración mitocondrial en células cultivadas en medios suplementados con glucosa al 0,5% (Figura 3). Por otro lado, las células cultivadas en medios suplementados con glucosa al 5% no presentaron una influencia negativa significativa de la quercetina (Figura 4).

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Figura 1: Curva representativa de consumo de oxígeno. Curva de consumo de oxígeno obtenida en células de S. cerevisiae cultivadas en medio SC (0,5% de glucosa). Los colores representan las diferentes pendientes obtenidas en el sustrato, los desacopladores y la suplementación con inhibidores. Verde: El sustrato utilizó glucosa y respiración basal correspondiente a la pendiente. Azul: oligomicina, inhibidor de la ATP sintasa, pendiente empleada para la determinación de la respiración ligada al ATP. Amarillo: CCCP, desacoplador, pendiente utilizada para evaluar la respiración máxima. Gris y rojo: complejo inhibidor II y III, respectivamente; Pendiente empleada para determinar el consumo de oxígeno no dependiente de las mitocondrias. Abreviaturas: CCCP = cianuro de carbonilo de 3-clorofenilhidrazona; TTFA = 2-tenoiltrifluoroacetona; AA = antimicina A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Ensayos de consumo de oxígeno en células de S. cerevisiae cultivadas al 0,5% y al 5% de glucosa. La respiración mitocondrial se evalúa a través del consumo de oxígeno medido en la respiración basal, la capacidad respiratoria máxima y la respiración ligada a ATP en células de S. cerevisiae cultivadas en SC suplementadas con 0,5% y 5% de glucosa. Se utilizaron tres sustratos para evaluar su influencia específica en la cadena de transporte de electrones: glucosa (NADH deshidrogenasas), glicerol (pool de ubiquinona) y L-lactato (citocromo c). (A) Respiración basal al 5% y 0,5% de glucosa con glucosa, glicerol y L-lactato como sustratos; (B) respiración máxima al 5% y 0,5% de glucosa con glucosa, glicerol y L-lactato como sustratos; (C) Respiración ligada a ATP al 5% y 0,5% de glucosa con glucosa, glicerol y L-lactato como sustrato. Los resultados se presentan como media ± S.D. de tres experimentos independientes, cada uno de los cuales tiene dos repeticiones técnicas. ANOVA de un factor seguido de la prueba de Tukey (p ≤ 0,05; diferentes letras: diferencia significativa, mismas letras: sin diferencia significativa) para el análisis estadístico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Quercetina limitó la respiración mitocondrial en baja concentración de glucosa en células de S. cerevisiae cultivadas. La medición del consumo de oxígeno se realizó a la respiración basal, la capacidad respiratoria máxima y la respiración ligada a ATP en células de S. cerevisiae cultivadas en medio SC (0,5% de glucosa) con quercetina suplementada (100 μM). Se utilizó etanol para disolver la solución de quercetina. Los resultados se presentan como media ± S.D. de tres experimentos independientes, cada uno de los cuales tiene dos repeticiones técnicas. El análisis estadístico se realizó mediante una prueba t de student pareada (*, ** p ≤ 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: La quercetina no afecta la respiración mitocondrial en alta concentración de glucosa en S. cerevisiae. El consumo de oxígeno se midió a la respiración basal, la capacidad respiratoria máxima y la respiración ligada al ATP en células de S. cerevisiae cultivadas en medio SC (5% de glucosa) con quercetina suplementada (100 μM). El etanol se utiliza para disolver la solución de quercetina. Los resultados muestran la media ± S.D. de tres experimentos independientes, cada uno con dos repeticiones técnicas. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student pareada (p ≤ 0,05; ns: no significativa). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La fosforilación de la respiración mitocondrial juega un papel fundamental en varias vías que dependen del potencial de la membrana mitocondrial y mantienen los niveles de ATP a través de la fosforilación oxidativa. Comprender cómo las condiciones ambientales y nutricionales afectan la respiración mitocondrial de las levaduras sirve como herramienta para dilucidar los mecanismos moleculares.

Es esencial tener en cuenta los siguientes pasos críticos para obtener resultados fiables de este método. La agitación >200 rpm es fundamental para obtener suficiente biomasa en condiciones de crecimiento respiratorio para probar la respiración mitocondrial; Las condiciones de agitación inferiores a 200 rpm provocan un crecimiento y una formación de biomasa deficientes, tardando más en alcanzar la fase de crecimiento logarítmico medio y podrían afectar a las tasas de consumo de oxígeno, ya que las células sobreviven en un entorno menos oxigenado. La concentración de glucosa en el medio se establece de acuerdo con el fenotipo de la levadura (Crabtree-positivo o negativo); esto es crítico en el caso de las levaduras Crabtree positivas, ya que las concentraciones altas de glucosa inhiben la respiración mitocondrial y podrían ejercer un sesgo en la interpretación de los datos. Por ejemplo, en S. cerevisiae, la glucosa provoca represión catabólica, inhibiendo la respiración mitocondrial a altas concentraciones de glucosa21,22. Con base en esta evidencia, se obtienen valores más bajos en la respiración basal, la respiración ligada a ATP y la respiración máxima de las células cultivadas a alta concentración de glucosa (5%) en comparación con las células de levadura cultivadas a baja concentración de glucosa (0,5%). Los inhibidores de la cadena respiratoria deben seleccionarse cuidadosamente de acuerdo con la susceptibilidad de la levadura; Esto es fundamental para descartar otras fuentes de consumo de oxígeno celular que no sean la respiración mitocondrial.

Los sustratos, desacopladores mitocondriales e inhibidores se utilizan para determinar diferentes parámetros de la respiración mitocondrial en células intactas. Sin embargo, su uso tiene algunas limitaciones. Por ejemplo, se deben considerar los objetivos inespecíficos fuera de las mitocondrias de los inhibidores y desacopladores mitocondriales en células intactas para evitar sesgos en la interpretación del consumo de oxígeno. Además, el uso de fuentes alternativas de carbono para detectar el sitio de acción en la cadena respiratoria debe probarse con más detalle, ya que los subproductos del metabolismo del glicerol o del L-lactato podrían oxidarse para reducir el NAD+ o el FAD+, que cede electrones y activa la cadena respiratoria desde el NADH deshidrogenasas y el Complejo II, respectivamente. Finalmente, S. cerevisiae y otras levaduras albergan transportadores de PDR como Yor1p (proteína de resistencia a la oligomicina de la levadura), lo que sugiere la salida de oligomicina de las células23. Además, se necesitan ensayos con células deficientes en PDR, por ejemplo, la cepa AD1-8, que tiene los principales transportadores de PDR y los factores de transcripción PDR1/PDR3 eliminados, para validar el uso de oligomicina en S. cerevisiae para la cuantificación de la respiración mitocondrial.

El uso de células intactas para la cuantificación de la respiración mitocondrial mantiene el contexto celular, proporcionando una técnica más robusta para conocer los efectos nutrimentales o ambientales sobre la bioenergética de la levadura. Además, el uso de células intactas de levadura para la cuantificación de la respiración mitocondrial es más económico y, a nivel técnico, más fácil que las mitocondrias aisladas. Además, al igual que en los ensayos de mitocondrias aisladas, diversas fuentes de carbono indican el sitio de acción en la cadena respiratoria de algunas moléculas. Como prueba de concepto, esta técnica corrobora que la suplementación con resveratrol afecta la cadena respiratoria a nivel de NADH deshidrogenasa, ya que la inhibición del resveratrol en la respiración basal solo se observa con glucosa y no con glicerol o L-lactato24. Los estudios in vitro con el complejo I solubilizado demostraron que el resveratrol compite con el NAD+, afectando la actividad del complejoI 25. Esto corrobora el fenotipo observado en células intactas con la técnica aquí presentada. Además, esta técnica también es fiable para explorar los efectos negativos de los productos químicos en la respiración mitocondrial de la levadura. Por ejemplo, la quercetina es un polifenol ampliamente estudiado en las últimas décadas. Entre las evidencias primarias encontradas, se ha demostrado que limita la respiración mitocondrial en células intactas, lo que ha sido validado por la actividad de la cadena respiratoria compleja26,27. Es importante destacar que diversas investigaciones han reportado efectos inhibidores de la quercetina en la respiración mitocondrial en diferentes estudios de modelos28.

Es importante tener una descripción detallada del metabolismo de la levadura, incluyendo la bioenergética, ya que estos microorganismos podrían ser patógenos animales, incluyendo humanos, y también se utilizan como fábricas de células o en aplicaciones biotecnológicas.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo del Tecnológico Nacional de México (Subvención 20026.24-PD) otorgado a LAMP.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-tenoiltrifluoroacetona (TTFA)MerckT27006Inhibidor del complejo II
3-clorofenilhidrazona, cianuro de carbonilo (CCCP)MerckC2759Desacoplador de la respiración mitocondrial   
Etanol AbsolutMerck 107017Para disolver quercetina 
AgarMerckA1296YPD preparación de agar
Sulfato de amonio granular (NH4)2SO4J.T. Baker0792-05SC preparación de caldo
Antimicina A (AA)MerckA8674Inhibidor complejo III
aYSI5300A--------Monitor 
CentrífugaHermleZ 206 APara centrifugación
de células de oxígeno--------Electrodo tipo Clark 
Computadora--------Para la adquisición de datos 
Fosfato dipotásico K2HPO4J.T. Baker3252-05SC preparación de caldo
GlucosaMerckG7021YPD preparación de caldo
GlicerolMerckG5516Suplementación con sustrato y medio 
LactatoMerckL1250Suplementación con sustrato medio 
Oligomicina de Streptomyces diastatochromogenesMerckO4876Inhibición de la ATP sintasa mitocondrial
Agitador orbitalThermo FisherSHKE6000Incubación de inóculo tubos de vidrio y matraz
Peptona de caseína, digesto enzimáticoMerck82303YPD preparación de caldo
Quercetina Merck337951Para disminuir la respiración mitocondrial
Uracil Preparación de caldoMerckU0750
Extracto de levadura PreparaciónMerckY1625YPD
Base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos ni sulfato de amonioPreparación de caldoMerckY1251
Levadura sintética Suplementos de medio de abandono sin uraciloPreparación de caldoMerckY1501
; SC de caldo SC SC

Referencias

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