Cuantificación de los fenotipos oculares de Drosophila melanogaster : un enfoque computacional que integra ilastik y flynotyper

Resumen

El sistema ocular de Drosophila es una herramienta útil para estudiar diversos procesos biológicos, en particular las enfermedades neurodegenerativas humanas. Sin embargo, la cuantificación manual de los fenotipos de ojos ásperos puede ser sesgada y poco fiable. Aquí describimos un método por el cual ilastik y Flynotyper se utilizan para cuantificar el fenotipo del ojo de una manera imparcial.

Resumen

El ojo compuesto de Drosophila melanogaster es una gama bien estructurada y completa de alrededor de 800 omatidios, que exhiben un patrón simétrico y hexagonal. Esta regularidad y facilidad de observación hacen del sistema ocular de Drosophila una poderosa herramienta para modelar diversas enfermedades neurodegenerativas humanas. Sin embargo, las formas de cuantificar los fenotipos anormales, como la clasificación manual de las puntuaciones de gravedad ocular, tienen limitaciones, especialmente cuando se clasifican las alteraciones débiles en la morfología del ojo. Para superar estas limitaciones, se han desarrollado enfoques computacionales como Flynotyper. El uso de un anillo de luz permite obtener mejores imágenes cualitativas accediendo a la integridad de los omatidios individuales. Sin embargo, estas imágenes no pueden ser analizadas por Flynotyper directamente debido a las sombras en los omatidios introducidas por el anillo de luz. Aquí, describimos una forma imparcial de cuantificar los fenotipos de ojos ásperos observados en modelos de enfermedad de Drosophila mediante la combinación de dos software, ilastik y Flynotyper. Al preprocesar las imágenes con ilastik, se puede lograr una cuantificación exitosa del fenotipo del ojo rugoso con Flynotyper.

Introducción

El genoma de Drosophila melanogaster contiene ~75% de ortólogos genéticos relacionados con enfermedades humanas. Además, durante el desarrollo del ojo de Drosophila, se expresan aproximadamente dos tercios de los genes del genoma, lo que convierte al ojo de Drosophila en un sistema genético excepcional para investigar diversas funciones moleculares y celulares, desarrollo y modelos de enfermedades ^1,2. Por lo tanto, el sistema ocular de Drosophila es una herramienta experimental útil para estudiar diversos procesos biológicos.

El ojo compuesto de Drosophila es una matriz bien estructurada y completa de ~ 800 omatidios que exhiben un patrón simétrico y hexagonal³. La regularidad de este patrón hexagonal se puede utilizar para estimar el efecto de la introducción de mutaciones y cambios en la expresión génica en la morfología del ojo⁴. Los estudios previos que requieren la evaluación de la morfología del ojo se han basado en gran medida en la clasificación manual de la gravedad de los fenotipos del ojo detectados a simple vista. Para clasificar los fenotipos oculares, las imágenes de la morfología externa del ojo se toman con un microscopio estereoscópico ^5,6. El fenotipo ocular de cada grupo se evalúa dividiendo el ojo externo en cuatro áreas y calculando la proporción de degeneración en cada área ^5,6. A continuación, los valores se utilizan para calcular promedios que se comparan con los valores obtenidos de las moscas de control⁷. La puntuación se basa en el grado de fusión, la pérdida de omatidios y la organización de las cerdas ^7,8. Las fotos de ojo de mosca tomadas con un microscopio estereoscópico son adquiridas por un investigador, y el análisis del fenotipo del ojo es realizado por otro investigador con conjuntos de triple validación ^7,8.

A simple vista se trata de clasificar las alteraciones débiles en la morfología del ojo, existen limitaciones⁴. Para superar estas limitaciones, se han desarrollado enfoques computacionales como FLEYE y Flynotyper ^1,9. Flynotyper es un nuevo método computacional para estimar cuantitativamente los cambios morfológicos en el sistema ocular de Drosophila¹. Detecta automáticamente el ojo de Drosophila y el omatridio individual, calculando las puntuaciones fenotípicas (puntuaciones P) en función de la irregularidad delojo¹. Una puntuación P más alta indica que el ojo de la mosca está más degenerado. Este software se utilizó con éxito para cuantificar la anormalidad de los ojos de Drosophila ¹⁰. Aunque Flynotyper garantiza un proceso automatizado, todavía no se puede aplicar con éxito a algunas imágenes oculares tomadas por varios métodos de microscopía óptica.

Cualitativamente, preferimos una fuente de luz anular en comparación con una fuente de luz de un solo punto, ya que ofrece una representación más precisa de cada omatidio. Sin embargo, cuando se utiliza el anillo de luz, genera una sombra en forma de anillo en la parte superior de cada omatidio debido a la forma semiesférica del omatidio. Esta sombra en forma de anillo inhibe la detección omatidial precisa por parte de Flynotyper, lo que lleva a un cálculo incorrecto de las puntuaciones P.

Para superar estos problemas, implementamos ilastik, una herramienta basada en el aprendizaje automático para varios análisis, para clasificar omatidios en imágenes de ojo de mosca¹¹. A continuación, introducimos las imágenes generadas por ilastik en Flynotyper para calcular las puntuaciones P. Esto nos permite cuantificar los defectos morfológicos del ojo de Drosophila de forma imparcial¹.

Protocolo

1. Preparación para la cuantificación

1. Descargue e instale ilastik¹¹, ImageJ y el complemento ImageJ Flynotyper¹. Consulte la Tabla de materiales para ver los enlaces del sitio web a la instalación. Descargue los paquetes apropiados de acuerdo con el sistema operativo de la computadora (Mac, Windows, Linux, etc). Siga las instrucciones de instalación exactamente como se indica.
   NOTA: Es imperativo seguir las instrucciones exactamente como se indica en los enlaces proporcionados. La computadora utilizada necesita un sistema operativo de 64 bits; de lo contrario, no se requieren otras especificaciones. Consulte la Tabla de materiales para conocer las especificaciones informáticas del sistema utilizado para este protocolo.
2. Use una imagen estándar para entrenar el modelo de aprendizaje automático. Tome una imagen de un ojo de mosca sano usando un microscopio óptico con un anillo de luz (como w1118 x GMR-GAL4), usando el centro del ojo como punto focal. Analice a los hombres y a las mujeres por separado; Por lo tanto, adquiera una imagen estándar para hombres y para mujeres.
   NOTA: Los ajustes variarán ampliamente según el microscopio y la cámara. Consulte el segundo párrafo de la discusión para obtener información más general sobre la preparación de moscas y la adquisición de imágenes.
3. Tome imágenes de los ojos de mosca experimentales utilizando la misma configuración utilizada para la adquisición de imágenes estándar.
   NOTA: Una buena orientación es primordial para una cuantificación precisa. Consulte la Figura 4 como ejemplo para obtener una orientación adecuada.

2. Uso de ilastik para detectar omatidios a partir de imágenes de ojo de mosca

1. Antes de comenzar el análisis, asegúrese de que todos los grupos experimentales, independientemente de la condición experimental, estén en la misma carpeta de archivos para facilitar los siguientes procesos. Asegúrese de que los archivos tengan un nombre adecuado para identificar grupos experimentales y distinguir entre machos y hembras.
   NOTA: Recomendamos imprimir el protocolo y usar la computadora para acercar las figuras, ya que este protocolo se sigue visualmente más fácilmente.
2. Abra el software.
   NOTA: Se recomienda no tener otras aplicaciones abiertas mientras se ejecuta el software; De lo contrario, el equipo podría funcionar muy lentamente, especialmente en sistemas más antiguos o menos robustos.
3. Haga clic en Crear nuevo proyecto | Otros flujos de trabajo, elija Recuento de densidad de celdas y seleccione una ubicación para guardar el archivo de proyecto (Figura 1A).
4. Haga clic en 1. Datos de entrada | Agregar nuevo | Agregue imágenes separadas. Elija la imagen estándar (Figura 1B).
5. Haga clic en 2. Selección de características y selección de características para usar. Seleccione las características que se muestran en la Figura 1C; Elija más valores Sigma para aumentar la sensibilidad (es decir, 10, 15, 20, etc.).
   NOTA: Si se marcan demasiadas casillas, es posible que el programa se ejecute durante mucho tiempo.
6. Haga clic en 3. Contando y establezca el valor sigma de primer plano en 5,00. Marque 50 o más omatridios individuales con la herramienta Primer plano en la imagen estándar.
   NOTA: Cincuenta marcas suelen ser adecuadas para el análisis; sin embargo, cuanto más omatidios estén marcados, más precisos serán los resultados (Figura 1D).
7. Haga clic en 3. Conteo y use la herramienta Fondo para marcar el exterior de los omatidios (Figura 1E). Dibuja líneas verdes en forma de celosía alrededor de los omatidios.
   NOTA: Al igual que con más marcas en los omatidios, cuantas más líneas verdes se dibujen, más precisos serán los resultados.
8. Haga clic en 4. Exportación de densidad | Elija Export Image Settings (Exportar configuración de imagen ) para establecer la configuración de la imagen (Figura 1F). Haga clic en Información del archivo de salida | seleccione Formato y tif para un análisis más detallado en Flynotyper.
9. Haga clic en 5. Procesamiento por lotes | Seleccione Archivos de datos sin procesar y seleccione todas las fotos de moscas experimentales que se analizarán (Figura 1G). La lista de imágenes importadas que se van a analizar se ve en Seleccionar archivos de datos sin procesar (Figura 1H). Haga clic en Procesar todos los archivos en la parte inferior de la 5. Sección de Procesamiento de Lotes .
   NOTA: Como recordatorio, los análisis masculinos y femeninos deben realizarse por separado. Dependiendo del equipo utilizado, este paso puede tardar 10 minutos o más, especialmente si hay muchas imágenes importadas.
10. Una vez finalizado el software, compruebe la misma carpeta de archivos que contiene las imágenes experimentales de ojo de mosca; habrá imágenes negras denominadas "YourSampleName_Probabilities" (Figura 1I).

3. Usar ImageJ para preparar fotos para Flynotyper

1. Abra el archivo .tif generado por ilastik (las cajas negras) en ImageJ.
   NOTA: Cada archivo de .tif generado por ilastik debe manejarse por separado.
2. Utilice la herramienta Selección de rectángulo para crear un rectángulo alrededor solo del ojo. Una vez que se haya dibujado el rectángulo, recorte el área eligiendo Ctrl + X o Ctrl + C (Figura 2A). Espera a que aparezca un cuadro negro con la forma del contorno del rectángulo.
   NOTA: El sistema operativo de la computadora determinará si usar 'Ctrl + X' o 'Ctrl + C'. Por lo general, 'Ctrl + X' es para Windows y 'Ctrl + C' se usa para Mac.
3. Abra el ojo de mosca ahora cortado con ImageJ; haga clic en Archivo | Nuevo | Portapapeles interno (Figura 2B).
4. Guarde el ojo de mosca cortado como JPEG haciendo clic en Archivo | Guardar como | JPEG. Las imágenes cortadas están ahora en la misma carpeta de archivos que las imágenes experimentales originales.
   NOTA: Para facilitar el siguiente paso, se recomienda crear una nueva carpeta de archivos llamada 'cortar' y colocar todas las imágenes cortadas en esa carpeta.

4. Uso de Flynotyper para calcular las puntuaciones fenotípicas

1. Abra Flynotyper como un complemento de ImageJ haciendo clic en Complementos | Flynotyper.
2. Seleccione Agregar genotipos y abra la carpeta que contiene las imágenes de ojo de mosca cortadas (carpeta de archivos de corte). El nombre de la carpeta aparecerá en Genotipos (Figura 2C).
3. Marque las casillas Microscopio óptico y Verticalmente, pero ajústelo en consecuencia si es necesario. Marque las casillas Estabilidad y Distancia al centro en Clasificar omatidios por: (Figura 2C).
4. En Número de omatidios clasificados considerados, ingrese 200.
   NOTA: En general, 200 es un buen número, pero ajústelo según sus preferencias.
5. Haga clic en Ejecutar y espere a que aparezcan los resultados del análisis (Figura 2D).
   NOTA: Este paso puede tardar 5 minutos o más (o menos) dependiendo de la potencia de procesamiento de la computadora utilizada.
6. Copie y pegue el archivo de muestra y la puntuación P en el software estadístico para su posterior análisis.

Resultados

En un estudio previo, utilizamos este protocolo para determinar modificadores genéticos de la proteína VCP mutante relacionada con la esclerosis lateral amiotrófica con demencia frontotemporal (ELA-FTD)¹². Además, este método también se utilizó en otro artículo para evaluar la toxicidad de CHCHD10 ALS-FTD mediada por^S59L, incluso cuando se utilizó un microscopio estereoscópico más antiguo¹³. Para validar aún más estos resultados, utilizamos ilastik y Flynotyper en la misma mutación de la enfermedad ELA-DFT que Baek et ^al.13; Sin embargo, un personal de laboratorio no capacitado realizó el experimento y obtuvo resultados similares. Por lo tanto, la combinación de ilastik y Flynotyper es un método robusto para puntuar de forma imparcial la degeneración de Drosophila ommatidia.

Preferimos el uso de un anillo de luz porque permite mejores evaluaciones cualitativas (Figura 3). Sin embargo, el uso de un anillo de luz provoca una sombra que Flynotyper no puede analizar directamente. Para superar esto, preprocesamos las imágenes en ilastik antes de cuantificar las puntuaciones P con Flynotyper. En general, las puntuaciones P del ojo de mosca no degenerado (GMR-GAL4) fueron significativamente más bajas en comparación con un ojo moderadamente degenerado (2x_S81L) y un ojo severamente degenerado (3x_S81L) (Figura 4A, B y Tabla 1). Este es el resultado esperado, ya que las puntuaciones P más altas generadas a partir de Flynotyper indican un ojo más degenerado¹. Cuando no se utilizó ilastik, hubo diferencias insignificantes en las puntuaciones P entre un ojo no degenerado y un ojo moderadamente degenerado (Figura 4C y Tabla 1). Esto sugiere que Flynotyper tiene dificultades para identificar con precisión los patrones de omatidios en condiciones de luz anular sin usar ilastik. Esto se debe a que Flynotyper está diseñado para utilizar imágenes tomadas con una luz de doble punto que se convierte en escala de grises con ajustes adicionales para identificar el centro omatidianal¹. Ilastik replica este proceso incorporando un punto en el centro de cada omatidio, lo que permite la cuantificación dentro de Flynotyper.

Figura 1: Ejemplo de flujo de trabajo de ilastik. (A) Creación de un nuevo proyecto en ilastik. (B) Elección de la imagen estándar. (C) Selección de valores sigma en Selección de características. (D) Marcar el primer plano de los omatidios para la sensibilidad. (E) Marcar el fondo de los omatidios para la sensibilidad. (F) Seleccionar cómo el software exportará los archivos procesados. (G) Elegir qué imágenes experimentales de ojo de mosca se analizarán. (H) Mostrar qué imágenes experimentales de ojo de mosca se analizarán. (I) Producto terminado después de ejecutar el software. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ejemplo de flujo de trabajo de Flynotyper. (A) Seleccionar solo el ojo de la mosca para su posterior análisis. (B) Abrir la imagen del ojo cortado en una nueva ventana. (C) Seleccionar las imágenes cortadas que se van a analizar y los parámetros que se van a comprobar para el análisis. (D) Ejemplos de resultados. Las puntuaciones fenotípicas se presentan en el extremo derecho. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes cualitativas del ojo de Drosophila . El mismo ojo de mosca tomado con una luz anular (izquierda) y tomado con una luz de doble punto (derecha) en condiciones no degeneradas (arriba) y degeneradas (abajo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Uso de ilastik antes de Flynotyper para una cuantificación precisa del fenotipo de ojo rugoso en Drosophila. (A) Imágenes representativas del ojo de Drosophila de un ojo no degenerado (GMR-GAL4), un ojo moderadamente degenerado (2x_S81L) y un ojo severamente degenerado (3x_S81L). (B) Resultados de cuantificación de Flynotyper después de usar ilastik. Se calcularon los valores p de una prueba t de permutación bilateral para facilitar la interpretación de los resultados (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0) (C) Resultados de cuantificación de Flynotyper sin usar ilastik. Se calcularon los valores p de una prueba t de permutación bilateral para facilitar la interpretación de los resultados (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0,597, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0,687). N = 3 para cada grupo. Los puntos de datos se desplazan o apilan en el eje x para mayor claridad visual. La línea horizontal continua representa el promedio. Las barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

GMR-GAL4		2x_S81L		3x_S81L
Con ilastik	Sin ilastik	Con ilastik	Sin ilastik	Con ilastik	Sin ilastik
26.7	55.7	52.5	51.2	59.9	55.6
17.4	53.5	50	54.9	60.7	52
22.8	55.5	56.8	55.2	60.1	55.1

Tabla 1: Puntuaciones P cuando se utiliza Flynotyper con ilastik y cuando se utiliza Flynotyper solo.

Figura suplementaria S1: Montura de cabeza de mosca configurada para la adquisición de imágenes. Este es un ejemplo de cómo configurar la adquisición de imágenes utilizando varias hojas de papel. Sin embargo, se puede utilizar cualquier método que asegure la orientación adecuada de la cabeza y el ojo de la mosca. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: Resultados cuantitativos de ilastik y Flynotyper cuando se utiliza un valor sigma de 2,5 en la selección de características. El uso de un valor sigma distinto de 5.0 en la selección de características en ilastik puede resultar en una cuantificación inexacta. En concreto, un valor sigma de 2,5 provoca una pérdida de sensibilidad. Se calcularon los valores p de una prueba t de permutación bilateral para facilitar la interpretación de los resultados (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0,192, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0). N = 3 para cada grupo. Los puntos de datos se desplazan o apilan en el eje x para mayor claridad visual. La línea horizontal continua representa el promedio. Las barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S3: Pérdida de sensibilidad y puntuaciones P inexactas debido a parches necróticos. Las flechas blancas apuntan a segmentos de parches necróticos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria S1: Puntuaciones P cuando se utiliza un valor sigma de 2,5 en la selección de características. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Los omatidios de Drosophila constituyen un sistema útil para el estudio de diversas funciones biológicas y enfermedades genéticas. La regularidad de los omatidios es una buena medida para examinar el efecto de las mutaciones genéticas⁴. Aunque existen varios métodos para calcular la regularidad omatidial, como la clasificación manual, estos métodos pueden estar muy sesgados. Para superar este enfoque sesgado, se han desarrollado herramientas semiautomáticas ^1,11.

Para una cuantificación ocular precisa, se debe optimizar la preparación y configuración de las moscas. Si bien entendemos que cada laboratorio tendrá su configuración, proporcionamos la siguiente configuración en nuestro laboratorio para dar a los lectores una idea de cómo preparar moscas para la adquisición de imágenes. Las moscas se congelan y se almacenan a -80 °C. Utilizamos un tamaño de muestra de 3 porque, en nuestra experiencia, cuando se combina GMR-GAL4 con la mutación S81L, hay muy poca variación entre la población. Sin embargo, tenga en cuenta que el tamaño de la muestra debe ajustarse para realizar pruebas de significación de hipótesis nulas. Para montar las moscas para la adquisición de imágenes, la cabeza de la mosca descansa sobre una hoja de papel muy pequeña que actúa como una almohada, de modo que el centro del ojo es aproximadamente el plano focal (Figura suplementaria S1). Nuestro laboratorio utiliza un microscopio y una cámara de pila Z (consulte la Tabla de materiales), ya que esto produce imágenes más claras en general, lo que permite la mejor visualización de todo el ojo, ya que el ojo de la mosca tiene forma de cúpula. Sin embargo, la función de pila Z no es un requisito para este protocolo, ya que utilizamos con éxito este método con un microscopio estereoscópico más antiguo sin la función de pila Z¹³. El dial de luz anular para el brillo no se gira más de 1/4 del camino hacia arriba para evitar la sobreexposición. El espesor total de nuestras muestras oscila entre 300 y 450 micras.

En este estudio, demostramos que el análisis de los ojos de mosca con ilastik y Flynotyper genera resultados de cuantificación de omatidios imparciales y confiables. Analizamos los patrones de omatidios de Drosophila utilizando ilastik, una herramienta de análisis de bioimágenes basada en aprendizaje automático, para marcar omatidios, y luego Flynotyper, un método computacional utilizado para medir la regularidad de los omatidios ^1,11. Preferimos utilizar un anillo de luz para obtener imágenes para una mejor evaluación cualitativa. Sin embargo, este enfoque no permite a Flynotyper producir resultados cuantitativos utilizando estas imágenes. Por lo tanto, ilastik se implementa para preprocesar estas imágenes, y estas imágenes procesadas se utilizaron con éxito con Flynotyper para producir resultados cuantitativos. Cuando las imágenes no se preprocesaron con ilastik antes de Flynotyper, las puntuaciones P generales fueron similares entre los ojos no degenerativos y los degenerativos. Esto pone de manifiesto la importancia de utilizar ilastik primero cuando se implementa un anillo de luz para obtener resultados cuantitativos.

Existen algunas limitaciones en nuestros métodos. La configuración de ilastik puede variar mucho y puede dar lugar a datos no significativos. Por ejemplo, realizamos otro conjunto de análisis utilizando las mismas imágenes, pero ajustamos el valor sigma del primer plano en ilastik a 2,5 en lugar de 5. Esto resultó en una pérdida de sensibilidad en fenotipos moderadamente degenerativos (Figura Suplementaria S2 y Tabla Suplementaria S1). Otra limitación es la pérdida de sensibilidad en los ojos con demasiada degeneración. En comparación con un ojo 3x_S81L, un ojo con parches necróticos está cualitativamente mucho más degenerado. Sin embargo, la puntuación P media para 3x_S81L ojos fue de 60,2, mientras que la puntuación P media para los ojos con parches necróticos fue de 60,9. Por lo tanto, los ojos con demasiada degeneración, como los parches necróticos, también pueden provocar pérdida de sensibilidad (Figura suplementaria S3).

Un paso crítico de este protocolo es la selección de una imagen estándar apropiada, que se utiliza para entrenar ilastik. Una imagen estándar no degenerada con un contraste distintivo entre los omatidios y las células pigmentarias circundantes, como los ojos rojos o naranjas, dará como resultado una cuantificación más precisa en Flynotyper. Otro paso crítico es la selección de características en ilastik, donde la sensibilidad, representada como valores sigma, se seleccionan para ajustar el software de aprendizaje automático (Figura 1D). La selección de muy pocas características puede reducir la sensibilidad de ilastik, lo que lleva a un marcado inexacto de los omatidios. La selección de demasiadas características aumentará el tiempo y la potencia de procesamiento necesarios para generar resultados, lo que reducirá la eficiencia del procedimiento. Alternativamente, si hay una degeneración cualitativa notable del ojo, pero los resultados del análisis no son estadísticamente significativos, el aumento del valor sigma de las características seleccionadas sería una posible solución. Sin embargo, las selecciones de características proporcionadas en este protocolo producen regularmente resultados precisos. Seguir los pasos críticos tal como están escritos ayudará a mitigar los problemas más comunes y a solucionarlos en el futuro.

En resumen, este método proporciona mejores imágenes cualitativas al mismo tiempo que produce una cuantificación imparcial y confiable del sistema ocular de Drosophila . En consecuencia, este método podría mejorar la utilidad de la degeneración ocular como una poderosa herramienta para modelar enfermedades degenerativas en el futuro.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Especificaciones			Ryzen 5, 16 GB de RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Descargue el software aquí: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Software de código abierto. No utilice Flynotyper 2.0. En el momento de la publicación, 2.0 era bastante nuevo y este protocolo está optimizado para la versión original de Flynotyper.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Descargue el software aquí: https://www.ilastik.org/download.html	Software de código abierto. Descargue la versión 1.4.0.post1 en Compilaciones regulares correspondientes al sistema operativo de su computadora.
ImageJ		Descargue el software aquí: https://imagej.net/ij/download.html	Software de código abierto. Se utilizaron las versiones 1.53 y 1.54. 1.54 es la versión actualizada y es la descarga predeterminada.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	Sistema y software utilizados para la adquisición de z-stack.
Microscopio Leica Z16 APO con cámara DMC2900	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Denominado microscopio y cámara Z-stack en el texto. Este producto ya está archivado.