Aquí, describimos el procedimiento para analizar la progresión de la replicación a través de repeticiones patógenas propensas a la estructura utilizando electroforesis en gel bidimensional.
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Artículo de método
Análisis electroforético de la replicación a través de repeticiones de ADN propensas a la estructura dentro del episoma humano basado en SV40
En este artículo
Resumen
Resumen
La electroforesis bidimensional en gel neutro/neutro (2DGE) surgió como una técnica de referencia para analizar la replicación del ADN a través de impedimentos naturales. Este protocolo describe cómo analizar la progresión de la horquilla de replicación a través de repeticiones de ADN expandibles y propensas a la estructura dentro del episoma basado en el virus del simio 40 (SV40) en células humanas. En resumen, tras la transfección de plásmidos en células humanas, los intermedios de replicación se aíslan mediante el protocolo Hirt modificado y se tratan con la enzima de restricción DpnI para eliminar el ADN no replicado. A continuación, los intermedios son digeridos por enzimas de restricción apropiadas para colocar la repetición de interés dentro de la mitad distal de origen de un fragmento de ADN de 3-5 kb de largo. Los intermedios de replicación se separan en dos dimensiones perpendiculares, primero por tamaño y luego por forma. Después de la hibridación de Southern blot, este enfoque permite a los investigadores observar el estancamiento de la horquilla en varias repeticiones de formación de estructuras en la mitad descendente del arco Y de replicación. Además, este posicionamiento del sitio de pérdida permite la visualización de varios resultados del estancamiento de la horquilla mediado por repetición, como la inversión de la horquilla, el advenimiento de una horquilla convergente y el reinicio recombinante de la horquilla.
Introducción
Las repeticiones cortas en tándem (STR) son secuencias repetitivas de ADN pequeñas, normalmente de 2 a 9 pares de bases (bp), que constituyen alrededor del 3%del genoma humano. Los STR juegan un papel importante en la regulación génica2; sin embargo, su composición repetitiva los hace propensos a la formación de estructuras secundarias de ADN no canónicas y a la posterior inestabilidad genética 3,4. Desde las hélices levógiras hasta las horquillas/cruciformes, pasando por las hélices de tres y cuatro hebras, estas estructuras alternativas de ADN causan desafíos i....
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Protocolo
NOTA: El plásmido diseñado para nuestro análisis 2DGE descrito en células de mamíferos debe contener un origen de replicación SV40 varios kb aguas arriba de las repeticiones propensas a la estructura (Figura 2). Se debe tener en cuenta la síntesis inicial y retrasada al elegir qué orientación en relación con el origen deben clonarse las repeticiones en el plásmido.
Figura 2: Digestión de plásmido que contiene repe....
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Resultados
Si tiene éxito, tras la visualización, se puede observar un arco agudo de horquillas de replicación que se extiende hacia arriba y hacia afuera desde el punto masivo 1n (Figura 5A). El tamaño de un fragmento, o el porcentaje que se replica, determina la movilidad del fragmento en la primera dimensión. A medida que los intermedios desarrollen una estructura más articulada, comenzarán a viajar más lentamente en la segunda dimensión. Por lo tanto, si un intermediario ha viajado lentamente en am.......
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Discusión
2DGE proporciona una imagen semicuantitativa y completa de las poblaciones relativas de intermedios que surgen durante la replicación de una secuencia particular. Dado que las frágiles estructuras moleculares de las horquillas de replicación deben mantenerse durante todo este procedimiento, se debe tener mucho cuidado para evitar el cizallamiento físico y la desnaturalización química. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente evitar cualquier tratamiento alcalino durante el aislamiento.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Jorge Cebrian y Anastasia Rastokina que comenzaron a desarrollar este enfoque en nuestro laboratorio, a Massimo Lopes por proporcionarnos el plásmido pML113 y consejos invaluables, a Ylli Doksani por las discusiones perspicaces y a los miembros del laboratorio Mirkin por su apoyo. El trabajo en el laboratorio de Mirkin cuenta con el apoyo del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales [R35GM130322] y NSF-BSF [2153071].
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10x Tampón TBE | Bio Rad | 1610733 | |
| 20x Tampón SSC | Fisher Scientific | BP1325-1 | |
| 293T celdas | ATCC | CRL-3216 | |
| a-32P dATP, 3000 Ci/mmol | Revvity | BLU512H250UC | |
| Agarosa | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Amersham Hybond-N+ | Fisher Scientific | RPN303B | |
| Cribas de fósforo BAS | Fisher Scientific | 28956482 | |
| Church y el tampón de hibridación de Gibert | Fisher Scientific | 50-103-5408 | |
| Marcaje de ADN DecaLabel kit | ThermoFisher Scientific | K0622 | |
| DMEM, alto contenido de glucosa, Suplemento GltaMAX, piruvato | ThermoFisher Scientific | 10569010 | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | También será necesario comprar enzimas de restricción adicionales |
| EDTA 0,5 M, pH 8 | Fisher Scientific | BP2482500 | |
| etanol, 70% | Fisher Scientific | ||
| Suero Fetal Bovino | VWR | 97068-085 | |
| Solución de ácido clorhídrico, 12 M | Millipore Sigma | 13-1683 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| reactivo de transfección de ADN y siRNA jetPRIME con tampón | VWR | 101000027 | |
| MycoZap Plus-CL | VWR | 75870-448 | |
| NaCl | Millipore Sigma | 746398-500G | |
| Tubos de centrífuga de alta velocidad Oak Ridge | Nalgene ThermoFisher Scientific | 3139-0050 | |
| Tampón de fosfato solución salina, pH 7,4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Tampón de fosfato solución salina, pH 7,5 | ThermoFisher Scientific | 10010024 | |
| Proteinasa K | ThermoFisher Scientific | EO0491 | |
| Proteinasa K | ThermoFisher Scientific | EO0492 | |
| Papel de cromatografía de celulosa pura | Fisher Scientific | 05-714-4 | |
| Papel de cromatografía de celulosa pura | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Regla | Fisher Scientific | 09-016 | |
| Bisturí | Fisher Scientific | 12-460-451 | |
| Dodecil sulfato | de sodioMillipore Sigma | 436143-25G | |
| Hidróxido de sodio | Fisher Scientific | S25548 | |
| Sorval LYNX 4000 Superspeed ThermoFisher | Scientific | 75006580 | |
| Sistema de electroforesis horizontal de subcelda | Bio Rad | 1704401 | |
| TH13-6 x 50 Rotor de cubeta oscilante | ThermoFisher Scientific | 75003010 | |
| Tris-HCl 1 M, pH 7,5 | Fisher Scientific | BP1757-500 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%), rojo fenol | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
Referencias
- Liao, X., et al. Repetitive DNA sequence detection and its role in the human genome. Commun Biol. 6 (1), 1-21 (2023).
- Fotsing, S. F., et al. The impact of short tandem repeat variation on gene expression. Nat Genet. 51 (11), 1652-1659 (2019).
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Reimpresiones y permisos
