Análisis electroforético de la replicación a través de repeticiones de ADN propensas a la estructura dentro del episoma humano basado en SV40

Summary

Aquí, describimos el procedimiento para analizar la progresión de la replicación a través de repeticiones patógenas propensas a la estructura utilizando electroforesis en gel bidimensional.

Abstract

La electroforesis bidimensional en gel neutro/neutro (2DGE) surgió como una técnica de referencia para analizar la replicación del ADN a través de impedimentos naturales. Este protocolo describe cómo analizar la progresión de la horquilla de replicación a través de repeticiones de ADN expandibles y propensas a la estructura dentro del episoma basado en el virus del simio 40 (SV40) en células humanas. En resumen, tras la transfección de plásmidos en células humanas, los intermedios de replicación se aíslan mediante el protocolo Hirt modificado y se tratan con la enzima de restricción DpnI para eliminar el ADN no replicado. A continuación, los intermedios son digeridos por enzimas de restricción apropiadas para colocar la repetición de interés dentro de la mitad distal de origen de un fragmento de ADN de 3-5 kb de largo. Los intermedios de replicación se separan en dos dimensiones perpendiculares, primero por tamaño y luego por forma. Después de la hibridación de Southern blot, este enfoque permite a los investigadores observar el estancamiento de la horquilla en varias repeticiones de formación de estructuras en la mitad descendente del arco Y de replicación. Además, este posicionamiento del sitio de pérdida permite la visualización de varios resultados del estancamiento de la horquilla mediado por repetición, como la inversión de la horquilla, el advenimiento de una horquilla convergente y el reinicio recombinante de la horquilla.

Introduction

Las repeticiones cortas en tándem (STR) son secuencias repetitivas de ADN pequeñas, normalmente de 2 a 9 pares de bases (bp), que constituyen alrededor del 3%^{del genoma humano}. Los STR juegan un papel importante en la regulación génica²; sin embargo, su composición repetitiva los hace propensos a la formación de estructuras secundarias de ADN no canónicas y a la posterior inestabilidad genética ^3,4. Desde las hélices levógiras hasta las horquillas/cruciformes, pasando por las hélices de tres y cuatro hebras, estas estructuras alternativas de ADN causan desafíos intrínsecos para el replisoma. Un requisito natural para la formación de estructuras secundarias es el desenrollado del ADN, que es un requisito previo para la replicación del ADN. Esto presenta un enigma único para el funcionamiento del genoma, ya que muchas de estas estructuras pueden formarse durante la replicación, lo que dificulta la progresión del replicación y, en última instancia, causa el estancamiento de la horquilla de replicación ^5,6,7 o, en casos graves, el colapso de la horquilla y la rotura del ADN ^8,9. Se ha demostrado que tanto el reinicio de las horquillas estancadas como las vías de reparación del ADN conducen a inestabilidad repetida, como expansiones repetidas^10,11 y reordenamientos complejos del genoma (CGR)^12,13. Estos eventos pueden resultar en el desarrollo de aproximadamente 60 enfermedades humanas conocidas como trastornos de expansión repetida, incluyendo el síndrome de X frágil, la enfermedad de Huntington, la ataxia de Friedreich y otras^14,15, así como enfermedades CGR, como el síndrome de Emmanuel¹⁶. Por lo tanto, para comprender mejor los mecanismos de las enfermedades humanas impulsadas por la inestabilidad de las repeticiones, es imperativo estudiar los detalles de la progresión de la horquilla de replicación a través de esas repeticiones.

Una técnica para estudiar la progresión de la replicación surgió a mediados de la década de 1980 cuando Brewer y Fangman buscaron proporcionar evidencia directa de que el inicio de la replicación en Saccharomyces cerevisiae ocurre en elementos de secuencia de replicación autónoma (comúnmente conocida como ARS)¹⁷. Al hacerlo, separaron las estructuras de los intermedios de replicación de la levadura en la agarosa, adaptando un método anterior de Bell y Byers conocido como electroforesis en gel neutra/neutro en 2 dimensiones (2DGE)¹⁸. Esta técnica utilizó el hecho de que el ADN no lineal viaja de manera diferente en gel de agarosa que su equivalente lineal de la misma masa. Más específicamente, en 2DGE, el ADN aislado se separa en dos dimensiones perpendiculares, primero principalmente por tamaño y luego principalmente por forma, para crear un mapa completo de la replicación en una región particular de interés. En su artículo original, Brewer y Fangman demostraron esto como un arco compuesto por estructuras "Y simples" o horquillas de replicación que unen el ADN no replicado con sus contrapartes replicadas. Además, describen otros intermedios observados como "burbujas" y "dobles Y", que representan orígenes de replicación y horquillas convergentes, respectivamente.

2DGE se puede utilizar para estudiar las poblaciones relativas de intermediarios de replicación del ADN en un momento dado. Por lo tanto, si una población de intermediarios es más prevalente que otra, esto sería evidente en la visualización. Esto hace que 2DGE sea una herramienta especialmente útil para estudiar la progresión de la replicación a través de secuencias desafiantes, como las repeticiones de formación de estructuras. Por ejemplo, si la región analizada contiene una secuencia capaz de inducir el estancamiento de la horquilla de replicación, esto se presentaría como una protuberancia en el arco (Figura 1A), lo que indica una acumulación de bifurcaciones de replicación en ese locus. Esto se puede ver con la replicación de las secuencias de repeticiones que forman horquillas en la levadura 19,20,21 y las repeticiones que forman triplex en células humanas 22,23,24. Además del estancamiento, el 2DGE se puede utilizar para observar estructuras de ADN que no se ajustan a los Ys simples estándar formados durante la replicación, como en el caso de los intermedios recombinantes²⁵. Estos intermedios tienen una estructura en forma de X más pesada y ramificada y, por lo tanto, viajan más lentamente tanto en la primera como en la segunda dimensión que las horquillas de replicación estándar. También se pueden observar resultados similares con respecto a la inversión de la horquilla de replicación 20,24,26. En respuesta al fuerte estrés de replicación, se ha demostrado que las células eucariotas utilizan la inversión de la horquilla de replicación para rescatar las horquillas estancadas. Estas horquillas invertidas tienen un peso molecular similar al de las horquillas estancadas; sin embargo, su estructura de pata de gallina da como resultado una movilidad electroforética más lenta en la segunda dimensión en relación con sus complementos en forma de Y, lo que resulta en una extensión hacia arriba y hacia afuera del arco.

Figura 1: Análisis de electroforesis en gel 2D de la replicación del ADN. (A) Esquema de un 2DGE típico que representa la replicación a través de una repetición de formación de estructura capaz de inducir el estancamiento de la horquilla. El tamaño y la estructura intermedios influirán en la movilidad electroforética. (B) Arco Y de muestra con brazos ascendentes y descendentes respectivamente etiquetados. Abreviatura: 2DGE = Electroforesis bidimensional en gel neutro/neutro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Naturalmente, uno de los aspectos más importantes de 2DGE se refiere a la calidad y cantidad de los intermedios de replicación. Sin embargo, la resolución del análisis 2DGE de la replicación a través de loci endógenos en células de mamíferos es insuficiente para una secuencia diana de una sola copia dentro del genoma humano diploide de 6 × 10⁹ pb, aunque se ha hecho para genes de múltiples copias, como el locus^{DHFR 27} fuertemente amplificado o el ARN ribosómico²⁸. La replicación basada en SV40 es un medio eficiente y bien caracterizado para estudiar la replicación en células eucariotas²⁹. Proporciona un modelo fiable de replicación eucariota que utiliza la mayor parte de la maquinaria de reploma del huésped para replicar el genoma viral, que se parcela en nucleosomas tras la infección^30,31. Dos excepciones notables del replisma de mamíferos son que el antígeno T (Tag), en lugar del complejo CMG del huésped, sirve como helicasa de ADN replicante, y la ADN polimerasa delta sintetiza tanto las hebras de ADN principales como las rezagadas³². Hemos aprovechado este sistema colocando tramos patogénicos de repeticiones formadoras de estructuras aguas abajo de un origen de replicación SV40 dentro de un plásmido que se creó originalmente en el laboratorio de Massimo Lopes²². Es importante destacar que este plásmido también contiene el gen que codifica para el propio Tag, lo que resulta en su replicación constitutiva y extremadamente potente tras la transfección en una variedad de células humanas cultivadas. Esta característica da lugar a una gran cantidad de productos, ideales para el análisis 2DGE de los intermedios formados durante y en respuesta a la replicación de repeticiones patógenas en células humanas. Aquí, describimos un método detallado para visualizar la replicación de repeticiones formadoras de estructuras dentro del episoma humano basado en SV40 utilizando electroforesis en gel bidimensional.

Protocol

NOTA: El plásmido diseñado para nuestro análisis 2DGE descrito en células de mamíferos debe contener un origen de replicación SV40 varios kb aguas arriba de las repeticiones propensas a la estructura (Figura 2). Se debe tener en cuenta la síntesis inicial y retrasada al elegir qué orientación en relación con el origen deben clonarse las repeticiones en el plásmido.

Figura 2: Digestión de plásmido que contiene repeticiones para el análisis 2DGE. Las repeticiones propensas a la estructura se representan varios kb aguas abajo de la bifurcación de replicación que se mueve a la derecha. La digestión con los cortadores únicos 1 y 2 colocará la secuencia de repetición en el brazo descendente del arco Y, dada la secuencia más allá del punto medio del fragmento digerido. Abreviatura: 2DGE = Electroforesis bidimensional en gel neutro/neutro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Transfección de plásmidos en células de mamíferos

1. Siembrar 600.000 células HEK293T en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm antes de la transfección. Deje que las células se recuperen a 37 °C durante la noche.
   NOTA: Se pueden utilizar muchas líneas celulares para este experimento, aunque se recomiendan las celdas que contienen la etiqueta SV40 para obtener resultados óptimos. PRECAUCIÓN: HEK293T células se consideran BSL-2 y todo el trabajo de cultivo debe realizarse en una cabina de bioseguridad utilizando una técnica aséptica adecuada y un EPP adecuado.
2. Cuando las células alcancen el 60% de confluencia, transfecte 8 μg de ADN plásmido que contenga repeticiones en las células sembradas utilizando los reactivos de transfección adecuados de acuerdo con el protocolo del fabricante.
3. Si no aísla los intermedios en este momento, aspire los medios viejos y reemplácelos con 10 ml de medios nuevos después de 24 h.
4. Comience a recolectar células 24-48 h después de la transfección.
   1. Aspire los medios y lávelos cuidadosamente con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Separe y recoja las células con 0,5 ml de tripsina y centrifuga a 340 × g durante 4 min.
   2. Aspirar el sobrenadante y lavar los pellets de la célula con PBS. Volver a centrifugar a 340 × g durante 4 min y aspirar el sobrenadante.
      NOTA: El experimento puede detenerse aquí congelando gránulos de celda a -80 °C. Hemos encontrado los intermedios de replicación que aíslan la mejor resolución 48 h después de la transfección; sin embargo, 24 h ha dado resultados viables.

2. Aislamiento de intermedios de replicación

1. Vuelva a suspender las células en 1,5 mL de tampón de lisis Hirt modificado [10 mM de tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)] en tubos cónicos de 50 mL y comience la lisis celular.
   1. Añadir dodecil sulfato de sodio (SDS) a una concentración final de 0,6% (aproximadamente 650 μL de stock 2% SDS) y proteinasa K a una concentración final de 100 μg/mL (aproximadamente 10 μL de stock 20 mg/mL de proteinasa K) para eliminar las nucleasas.
   2. Mezclar suavemente pipeteando hasta que quede homogénea e incubar la mezcla a 37 °C durante al menos 90 min.
2. Aumente la concentración de NaCl a 1 M (aproximadamente 540 μL de NaCl calzante 5 M) y mezcle suavemente hasta que quede homogéneo. Incubar durante la noche (18-24 h) a 4 °C para permitir la precipitación de restos celulares, ARN y proteínas mediante salado.
   NOTA: La mezcla será muy viscosa, así que tenga cuidado y tenga paciencia mientras mezcla bien.
3. Al día siguiente, separe el ADN de los restos celulares, el ARN y la proteína.
   1. Centrifugar la mezcla a 29.500 × g durante 45 min a 4 °C.
   2. Transfiera el sobrenadante que contiene ADN, agregue un volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico 25:24:1 (v/v) y mezcle brevemente hasta que quede homogéneo.
      PRECAUCIÓN: El fenol:cloroformo:alcohol isoamílico es un material peligroso y debe manipularse con el EPP adecuado en una campana extractora química.
   3. Centrifugar de nuevo a 15.000 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Transfiera la capa acuosa a un nuevo tubo cónico.
4. Precipitar y lavar el ADN aislado.
   1. Agregue un volumen de isopropanol puro e incube a temperatura ambiente durante al menos 5 minutos. Centrifugar el ADN a 15.000 × g durante 30 min a 4 °C.
   2. Decantar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol frío al 70% para eliminar el exceso de sal.
   3. Centrifugar una vez más a 15.000 × g durante 30 min a 4 °C, secar al aire y resuspender suavemente el pellet en el tampón Tris-EDTA (TE) (10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA).
      NOTA: El experimento se puede pausar aquí y las muestras se pueden congelar a -20 °C; sin embargo, debe evitarse el ciclo de congelación/descongelación, ya que esto puede disminuir la calidad de los intermediarios de replicación del ADN.

3. Preparación de la muestra y electroforesis en gel bidimensional

1. Digiere los intermedios aislados de la replicación de plásmidos.
   1. Agregue 100 unidades de las enzimas de restricción apropiadas a la muestra para digerir el ADN plasmídico, colocando específicamente la secuencia que contiene repeticiones en la mitad distal de origen del fragmento lineal (Figura 2). Además, agregue DpnI para cortar el ADN metilado, eliminando así cualquier ADN plásmido que no se haya replicado completamente en células humanas cultivadas.
      NOTA: Para obtener los mejores resultados, las enzimas de restricción deben ser cortadores únicos que produzcan un fragmento de 3-5 kb que coloque la secuencia propensa a la estructura en el brazo descendente del arco Y.
   2. Incubar las muestras a 37 °C durante 6-10 h para permitir la digestión completa del plásmido.
   3. Precipitar el ADN con 2,5 volúmenes de etanol puro frío e incubar a -20 °C durante la noche, o añadir un volumen de isopropanol e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
   4. Centrifugar las muestras digeridas y precipitadas a 15.000 × g durante 30 min a 4 °C.
   5. Decantar el sobrenadante y lavar la muestra con etanol frío al 70%. Volver a centrifugar a 15.000 × g durante 30 min a 4 °C.
   6. Decantar el sobrenadante, secar al aire durante 10 min y volver a suspender las muestras en 15 μL de tampón TE.
2. Prepare el gel de agarosa de primera dimensión al 0,4-0,5% en 1x Tris-borato-EDTA (TBE) (89 mM de tris base, 89 mM de ácido bórico, 2 mM de EDTA). Deje que la solución se solidifique durante al menos 1 hora.
3. Comience a cargar las muestras en la primera dimensión.
   1. Cargue la escalera dentro de los primeros 3 cm en relación con el borde más a la izquierda del gel. A continuación, cargue la totalidad de las muestras preparadas, dejando 3 cm entre cada par.
   2. Pasar el gel en 1x TBE durante 19-24 h a 0,85 V/cm para separar los intermedios con respecto a su tamaño. Asegúrese de que la cámara esté cubierta para proteger las muestras de la luz, que puede causar daños al ADN.
4. Al día siguiente, retire el gel del tampón y estime la ubicación del fragmento lineal digerido con una regla.
   1. Extirpar los primeros 3 cm del gel que contiene la escalera y teñir el segmento de gel con 1x TBE que contenga 0,3 μg/mL de bromuro de etidio durante 10-15 min. Visualice la escalera utilizando un sistema de documentación de gel.
   2. Agregue 1,3 cm a la ubicación estimada, obteniendo el valor a. Luego, resta 7,5 cm del valor a, obteniendo el valor b. Alinee la regla contra el gel de primera dimensión y corte horizontalmente en los valores a y b. A continuación, corte verticalmente el espacio de 3 cm reservado para cada muestra. Consulte la Figura 3 para obtener un esquema visual.
   3. En una nueva bandeja de fundición, gire los segmentos en el sentido de las agujas del reloj y colóquelos en la posición de los pocillos de muestra (Figura 3).
5. Prepare el gel de agarosa de segunda dimensión a una concentración de 1-1,3% en 1x TBE a 0,3 μg/mL de bromuro de etidio.
   1. Después de enfriar a aproximadamente 55 °C, vierta el gel de segunda dimensión sobre los segmentos de primera dimensión girados y deje que se solidifique durante al menos 1 h.
   2. Transfiera la segunda dimensión a una cámara con 1x TBE a 0,3 μg/mL de bromuro de etidio y deje que el gel se equilibre durante al menos 30 minutos.
   3. Pasar el gel, de nuevo tapado, durante 9-10 h a 4,23 V/cm a 4 °C para separar los intermedios con respecto a su forma.

Figura 3: Escisión de intermedios de primera dimensión antes de la separación de segunda dimensión. Después de la visualización de la escalera, se puede estimar la movilidad de los fragmentos no replicados. (I) Este valor se puede utilizar para determinar los sitios de corte apropiados (a y b) para extirpar y sus contrapartes replicadas (II). A continuación, se debe rotar la sección del gel y colocarla en la posición de pocillos para la separación en segunda dimensión. Abreviatura: CW = en el sentido de las agujas del reloj. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Southern blot e hibridación con sonda radiomarcada

1. Retire el gel de segunda dimensión de la cámara y depurine los fragmentos de ADN durante 10 minutos en una solución de HCl de 0,24 M con un balanceo suave. Enjuague el gel con agua desionizada y sumérjalo en NaOH 0,4 M durante 10-15 min.
   PRECAUCIÓN: El HCl y el NaOH son corrosivos y deben manipularse con el EPP adecuado en una campana de gases químicos.
2. Comience a ensamblar el Southern blot para facilitar la transferencia de los intermedios separados del gel a la membrana. Consulte la Figura 4 para obtener un esquema completo.
   1. Llene un recipiente de tamaño suficiente con 1 L de NaOH de 0,4 M.
   2. Alinee una hoja de vidrio larga a través del recipiente y doble (a lo largo) dos hojas largas de papel de cromatografía perpendiculares a la hoja de vidrio, extendiéndolas hacia el recipiente de NaOH.
   3. Humedece la parte superior del papel con NaOH y retira con cuidado las burbujas de aire que queden debajo de su superficie.
   4. Remoja tres hojas de papel de cromatografía con NaOH y colócalas sobre el papel doblado, eliminando de nuevo las burbujas.
   5. Dale la vuelta al gel de segunda dimensión y transfiérelo sobre los papeles.
   6. Humedece una membrana de nailon cargada positivamente (tamaño de poro de 0,45 μm) con agua desionizada y colócala sobre el gel.
   7. Finalmente, agregue tres hojas más de papel, mojadas con agua desionizada, sobre la membrana.
   8. Cubra cualquier NaOH expuesto en el recipiente inferior con una envoltura de plástico para evitar la evaporación. Coloque una pila de servilletas o toallas de papel sobre la mancha, asegurándose de que tenga entre 0,3 y 0,5 m de altura. Coloque un peso en la parte superior, comprimiendo toda la mancha para facilitar la acción capilar apretada. Espere al menos 2 días para que el ADN se transfiera a la membrana.
      NOTA: La longitud y el ancho del papel de cromatografía y la membrana dependen del tamaño del gel de agarosa utilizado para la segunda dimensión. Para una transferencia más eficiente, utilice papel y membrana con las mismas dimensiones que las del gel.
3. Después de la transferencia, entrecruza el ADN con la membrana utilizando un reticulante UV a 120 μJ/^cm2 durante 1 min.
   NOTA: El experimento puede detenerse aquí colocando la membrana en un protector de hoja hermético, seco y limpio a temperatura ambiente.
4. Lave la membrana 2 veces durante 5 minutos con 2 citrato de sodio salino (tampón SSC) (0,3 M de NaCl, 0,03 M de citrato de sodio).
5. Prehibridar la membrana con 0,18 mL/^cm2 de tampón de hibridación de Church & Gilbert [1 mM EDTA, 1% albúmina sérica bovina (BSA), 0,5 M fosfato sódico, 7% SDS] a 65 °C, rotando en una incubadora de hibridación durante al menos 2 h.
   NOTA: La membrana puede prehibridarse durante varios días.
6. Prepare la sonda radiomarcada con ^α-32P dATP o dCTP y un kit de etiquetado de ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   PRECAUCIÓN: Los dNTP radiomarcados son peligrosos y se debe usar el EPP adecuado al manipularlos. Todo el trabajo radiactivo debe realizarse detrás de un blindaje, y las personas capacitadas deben ser monitoreadas para determinar la absorción de radiación mediante dosímetros.
   1. Diseñar un fragmento de ADN lineal de 400-900 pb complementario a la secuencia digerida de restricción (Figura 2) y amplificar el fragmento mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
      NOTA: Recomendamos tener un fragmento de PCR en stock de 50-100 ng/μL
   2. Combine 100 ng del fragmento de PCR complementario con ADN Pol I, tampón de fragmento de Klenow (3' 5' exo-) y oligonucleótidos de decanucleótidos aleatorios.
   3. Desnaturalizar el fragmento a 100 °C durante 10 min.
   4. Añadir a la muestra 5 unidades de ADN Pol I, fragmento de Klenow (3' 5' exo-), 50 μCi de dNTP ^α-32P y 30-50 μmol de mezcla de dNTP deficiente en el tipo dNTP radiomarcado.
   5. Incubar a 37 °C durante 10 min para permitir la polimerización y la incorporación de dNTP radiomarcado.
   6. Añada 30-50 μmol de tipo dNTP previamente ausente a la muestra e incube a 37 °C durante 10 min.
   7. Purifique el fragmento radiomarcado utilizando una columna de centrifugación a 3.000 × g durante 2 min.
7. Añada la sonda radiomarcada a 50 mL de tampón de hibridación e incube con la membrana durante la noche a 65 °C rotando en una incubadora de hibridación.
8. Al día siguiente, retire la sonda y lave la membrana 2 veces con tampón de lavado 1 (0,1x SSC, 0,1% SDS) a 42 °C y 2x con tampón de lavado 2 (2x SSC, 0,1% SDS) a 65 °C.
   NOTA: Todos los lavados deben realizarse con rotaciones rápidas durante 15 min en la incubadora.
9. Seque la membrana durante 10 minutos y colóquela en un protector de lámina delgada y transparente. Guarde la membrana sellada en un casete controlado y resistente a la radiación con una pantalla sensible al fósforo. Deje que la membrana esté expuesta a la pantalla durante 1-10 días.
10. Visualice los resultados utilizando un generador de imágenes biomoleculares configurado para imágenes de fósforo. Lavar y volver a exponer si es necesario.

Figura 4: Ensamblaje de Southern blot. Esquema completo de un aparato típico utilizado para la transferencia de transferencia de intermedios de la segunda dimensión a una membrana de nailon. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Results

Si tiene éxito, tras la visualización, se puede observar un arco agudo de horquillas de replicación que se extiende hacia arriba y hacia afuera desde el punto masivo 1n (Figura 5A). El tamaño de un fragmento, o el porcentaje que se replica, determina la movilidad del fragmento en la primera dimensión. A medida que los intermedios desarrollen una estructura más articulada, comenzarán a viajar más lentamente en la segunda dimensión. Por lo tanto, si un intermediario ha viajado lentamente en ambas dimensiones, se puede afirmar que es una molécula altamente replicada con una variación de unión significativa con respecto a las horquillas de replicación convencionales. En el caso de la síntesis de hebras rezagadas de la repetición (GAA)₁₀₀ , el estancamiento de la horquilla se indica mediante un punto definido oscurecido en el arco (I), que representa una acumulación de horquillas de replicación al encuentro de la repetición (Figura 5B), probablemente debido a la formación de tríplex. Esto se acompaña de intermedios más pesados y ramificados (II y III) por encima del sitio del establo. Hemos descrito la naturaleza de estos intermediarios con más profundidad en Rastokina et al. 2023²⁴. En resumen, es probable que representen una combinación de horquillas que se invierten en respuesta a la pérdida (II), además del advenimiento de la horquilla convergente (Figura 5B) (III).

Una observación que se puede hacer después de la visualización es un arco amplio menos que ideal. En el peor de los casos, esto puede presentarse como una duplicación completa del arco. Típicamente, esto representa una mala separación de intermedios en la primera dimensión. Esto puede atribuirse a varios factores, el más probable de los cuales es la contaminación por sal o proteínas en la muestra intermedia de replicación. Una purificación de fenol:cloroformo después de digerir los productos intermedios, seguida de un lavado extenso con etanol al 70%, puede minimizar este riesgo. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la exposición adicional al fenol puede aumentar la posibilidad de desnaturalizar los intermedios, que pueden presentarse como una intensidad oscurecida del ADN lineal bajo el arco, lo que representa intermedios de replicación colapsados (Figura 5C).

En el peor de los casos, la visualización puede resultar en una ausencia total de intermediarios de replicación, evidenciada por la falta de arco (Figura 5D). Es poco probable que la ausencia de un arco se atribuya a intermediarios de replicación desnaturalizados, ya que no hay una mancha oscurecida debajo del área esperada del arco. Dada la presencia de una mancha 1n (IV) particularmente pequeña, la cantidad total de ADN presente en este ejemplo representado es mínima y, por lo tanto, este problema puede ser causado por una replicación insuficiente del plásmido o una mala transfección o aislamiento general de ADN.

Figura 5: Resultados potenciales del análisis 2DGE. (A) Análisis exitoso de 2DGE de replicación a través de la repetición de formación de estructuras (GAA)₁₀₀ en HEK293T células. (I) se refiere a las bifurcaciones que se detienen en la repetición, mientras que (II) y (III) se refieren a intermedios más estructurados que surgen en respuesta a la pérdida. Arriba se muestra una ilustración del fragmento de 2,7 kb. (B) Intermedios representativos que surgen durante la replicación de la repetición (GAA)₁₀₀ . Mediante el uso de reversiones y reinicios de la horquilla de replicación de los siRNA, se establecieron controles genéticos para identificar la naturaleza de estos intermediarios. (C) Representación de intermediarios de replicación no resueltos que pueden aparecer si las bifurcaciones se desnaturalizan durante el aislamiento. (D) Un experimento 2DGE fallido, como lo demuestra la ausencia total de intermedios de replicación. IV representa fragmentos lineales no replicados del plásmido digerido. Abreviatura: 2DGE = Electroforesis bidimensional en gel neutro/neutro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

2DGE proporciona una imagen semicuantitativa y completa de las poblaciones relativas de intermedios que surgen durante la replicación de una secuencia particular. Dado que las frágiles estructuras moleculares de las horquillas de replicación deben mantenerse durante todo este procedimiento, se debe tener mucho cuidado para evitar el cizallamiento físico y la desnaturalización química. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente evitar cualquier tratamiento alcalino durante el aislamiento de plásmidos. Para evitar esto, nosotros y otros hemos implementado una forma modificada del aislamiento de ADN de Hirt, establecido por Hirt en 1967³³. Aquí, el ADN se separa de las proteínas, el ARN y otros desechos celulares mediante el tratamiento del lisado celular con 1 M de NaCl a 4 °C durante la noche. Si bien este método ha demostrado ser excepcional para preservar la calidad de los intermediarios de replicación, no parece separar completamente el ADN plasmídico del ADN genómico. Esto debe tenerse en cuenta al diseñar la secuencia para el sondeo radiomarcado, ya que la sonda diseñada no debe tener una gran similitud de secuencia con ningún ADN genómico para evitar mejor la unión fuera del objetivo. Además, la integridad de los intermedios de replicación puede aumentar en gran medida a través de la reticulación UV-psoraleno. Aquí, las células pueden incubarse con psoraleno durante varios minutos en la oscuridad antes de ser irradiadas con rayos UV a 366 nm³⁴, creando así enlaces covalentes entre las moléculas de ADN. Además de reforzar la cohesión de las estructuras intermedias, esto también puede aliviar cualquier preocupación de que las estructuras se formen durante el aislamiento en lugar de in vivo.

Un aspecto que debe tenerse en cuenta a la hora de diseñar este experimento es la colocación repetida en el arco final resuelto. La primera mitad del arco que se extiende desde el punto 1n se denota como el brazo ascendente, mientras que la segunda mitad se conoce como el brazo descendente (Figura 1B). Para observar el estancamiento de la horquilla de replicación, debería ser suficiente repetir la colocación en cualquiera de los brazos del arco. Sin embargo, para observar intermedios más estructurados que surgen en secuencias repetidas, como uniones postreplicativas, recomendamos colocar la secuencia repetida en el brazo descendente. Esto se debe en gran medida a la movilidad electroforética más lenta de estos intermedios en ambas dimensiones, lo que puede resultar en una comigración con estructuras Ys simples más avanzadas en su progresión si la secuencia que contiene repeticiones se coloca en el brazo ascendente, lo que dificulta cualquier análisis detallado. Para obtener la mejor resolución, se recomienda colocar la secuencia de repetición en algún lugar entre el 60% y el 90% dentro del fragmento de interés en relación con el origen de la replicación.

Se debe prestar atención a los detalles durante el paso de transferencia de ADN y el tratamiento posterior de la membrana. Es extremadamente importante que la transferencia de Southern se ensamble de una manera que facilite una transferencia uniforme y ajustada del ADN a la membrana. Esto significa que todos los componentes de la transferencia están libres de burbujas de aire y que el aparato es uniforme en toda su superficie. Para ayudar en esto, es estándar voltear el gel de segunda dimensión antes de agregarlo a la mancha de Southern. Se supone que la parte inferior del gel es más plana que la parte superior; por lo tanto, dar la vuelta al gel asegura la transferencia más suave posible de ADN a la membrana.

Si hay un fondo fuerte en la resolución final de la mancha, esto puede ser indicativo de la unión no específica de la sonda radiomarcada. Esto se puede aliviar de varias maneras. En primer lugar, se debe comprobar que la sonda no contiene una alta similitud de secuencia con ningún ADN genómico. Esto se puede verificar fácilmente utilizando la Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica de Nucleótidos (BLAST), que está disponible a través del sitio web de los NIH³⁵. De lo contrario, las sondas no unidas específicamente se pueden eliminar mediante lavados estrictos adicionales. Recomendamos comenzar con dos lavados adicionales del tampón 1 (0,1x SSC, 0,1% SDS) a 42 °C en intervalos de 15 minutos cada uno; sin embargo, es posible que se necesiten más lavados. Por último, la temperatura a la que se produce la hibridación también puede verse alterada. Para la mayoría de las sondas que contienen un contenido de G/C del 40-60%, 65 °C tiende a ser suficiente, aunque este no es un valor estático. La unión eficiente de la sonda depende de su temperatura de fusión y, por lo tanto, puede requerir alteraciones en la temperatura de hibridación.

Dado que 2DGE proporciona una visión general de las poblaciones relativas de intermedios de replicación en un momento dado, uno de sus mayores inconvenientes es que no proporciona una medida sólida del tiempo de progresión de la replicación. Para ello, recomendamos utilizar el análisis de una sola molécula como el peinado de ADN. Además, si bien la 2DGE permite el análisis de los intermediarios de replicación que surgen en respuesta al estancamiento, se deben establecer controles genéticos para descubrir su identidad exacta, lo que puede ser oportuno. Aunque costosa, la microscopía electrónica sigue siendo superior en la identificación de la estructura exacta de las moléculas de ADN.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Tampón TBE	Bio Rad	1610733
20x Tampón SSC	Fisher Scientific	BP1325-1
293T celdas	ATCC	CRL-3216
a-32P dATP, 3000 Ci/mmol	Revvity	BLU512H250UC
Agarosa	Fisher Scientific	BP160-500
Amersham Hybond-N+	Fisher Scientific	RPN303B
Cribas de fósforo BAS	Fisher Scientific	28956482
Church y el tampón de hibridación de Gibert	Fisher Scientific	50-103-5408
Marcaje de ADN DecaLabel kit	ThermoFisher Scientific	K0622
DMEM, alto contenido de glucosa, Suplemento GltaMAX, piruvato	ThermoFisher Scientific	10569010
DpnI	New England Biolabs	R0176S	También será necesario comprar enzimas de restricción adicionales
EDTA 0,5 M, pH 8	Fisher Scientific	BP2482500
etanol, 70%	Fisher Scientific
Suero Fetal Bovino	VWR	97068-085
Solución de ácido clorhídrico, 12 M	Millipore Sigma	13-1683
Isopropanol	Fisher Scientific	BP26184
reactivo de transfección de ADN y siRNA jetPRIME con tampón	VWR	101000027
MycoZap Plus-CL	VWR	75870-448
NaCl	Millipore Sigma	746398-500G
Tubos de centrífuga de alta velocidad Oak Ridge	Nalgene ThermoFisher Scientific	3139-0050
Tampón de fosfato solución salina, pH 7,4	ThermoFisher Scientific	10010023
Tampón de fosfato solución salina, pH 7,5	ThermoFisher Scientific	10010024
Proteinasa K	ThermoFisher Scientific	EO0491
Proteinasa K	ThermoFisher Scientific	EO0492
Papel de cromatografía de celulosa pura	Fisher Scientific	05-714-4
Papel de cromatografía de celulosa pura	Fisher Scientific	05-714-5
Regla	Fisher Scientific	09-016
Bisturí	Fisher Scientific	12-460-451
Dodecil sulfato	de sodioMillipore Sigma	436143-25G
Hidróxido de sodio	Fisher Scientific	S25548
Sorval LYNX 4000 Superspeed ThermoFisher	Scientific	75006580
Sistema de electroforesis horizontal de subcelda	Bio Rad	1704401
TH13-6 x 50 Rotor de cubeta oscilante	ThermoFisher Scientific	75003010
Tris-HCl 1 M, pH 7,5	Fisher Scientific	BP1757-500
Tripsina-EDTA (0,25%), rojo fenol	ThermoFisher Scientific	25200056