Este protocolo proporciona una descripción detallada de la clasificación de las vesículas extracelulares (VE) liberadas por las células estromales mesenquimales. En particular, se centra en el ajuste del instrumento y la optimización de las condiciones de clasificación. El objetivo es clasificar las vesículas extracelulares preservando sus características.
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Artículo de método
Establecer una clasificación exitosa para el aislamiento de vesículas extracelulares
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Resumen
Resumen
Las vesículas extracelulares (VE) liberadas por las células estromales mesenquimales (MSC) contienen un conjunto de microARN con funciones regenerativas y antiinflamatorias. Por lo tanto, los MSC-EV purificados se conciben como una opción terapéutica de próxima generación para una amplia gama de enfermedades. En este protocolo, informamos sobre la estrategia para separar con éxito las VE del sobrenadante de las MSC derivadas del tejido adiposo (ASC), que se utilizan a menudo en aplicaciones de medicina regenerativa ortopédica.
En primer lugar, describimos la preparación de la muestra, centrándonos en los pasos de aislamiento y marcaje de EV con éster de carboxifluoresceína succinimidilo (CFSE) para la detección de fluorescencia; Posteriormente, detallamos el proceso de clasificación, que constituye la parte principal del protocolo.
Además de las reglas definidas por las directrices MISEV 2023 y MIFlowCyt EV, aplicamos condiciones experimentales específicas relativas al tamaño de la boquilla, la frecuencia y la presión de la vaina. Los parámetros morfológicos se establecen utilizando cordones de diámetros seleccionados para cubrir el rango teórico de tamaño EV. Después de la clasificación de los ASC-EVs, realizamos un control de pureza de la fracción clasificada volviéndola a analizar con el clasificador y verificando la distribución del tamaño del EV con la técnica de análisis de seguimiento de nanopartículas.
Debido a la creciente importancia de los vehículos eléctricos, tener una población pura para estudiar y caracterizar se está volviendo crucial. Aquí, demostramos una estrategia ganadora para configurar la clasificación para lograr este objetivo.
Introducción
Las vesículas extracelulares (VE) son un grupo heterogéneo de vesículas estructuradas en membrana liberadas por casi todas las células, delimitadas por una bicapa lipídica, incapaces de replicarse por sí mismas1. Se pueden encontrar en varios biofluidos como el plasma sanguíneo, el suero, la saliva, la leche materna, la orina, el líquido de lavado bronquial, el líquido amniótico, el líquido cefalorraquídeo y la ascitis maligna2. Una de las principales funciones de los VE es transportar varias moléculas, incluidos ácidos nucleicos, proteínas, lípidos y carbohidratos, entre una célula dona....
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Protocolo
El protocolo aquí consta de cuatro partes: (1) Preparación de la muestra, (2) Caracterización de ASC-EVs, (3) Clasificación de ASC-EVs y (4) Análisis posterior a la clasificación. En la figura 1 se muestra un esquema que representa el flujo de trabajo.
Figura 1: Diagrama de flujo del protocolo. El diagrama de flujo muestra los pasos involucrados en el protocolo. (1) preparación de la muestra, (2) caracte....
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Resultados
Las perlas de poliestireno FSC se han clasificado para validar la configuración del instrumento y las condiciones de clasificación. Las perlas de poliestireno FSC son una mezcla de perlas fluorescentes que van desde 100 nm, 300 nm, 500 nm y 900 nm y son visibles en el canal FITC. La Figura 7A muestra el diagrama de puntos de la escala logarítmica SSC frente a la escala logarítmica FITC con las cuatro poblaciones de cuentas antes de la clasificación. Las poblaciones fluorescentes de 100 nm, 3.......
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Discusión
El análisis y la clasificación de los vehículos eléctricos es un reto debido a su pequeño tamaño y al hecho de que están cerca del límite de detección de la mayoría de los citómetros de flujo. Nuestro objetivo fue desarrollar un protocolo para aislar vehículos eléctricos derivados de AMSC marcados con CFSE. Se seleccionó CFSE como método de tinción debido a su alta eficiencia de marcaje de EVs (≥90%), sin la formación de partículas no deseadas como agregados de proteínas dadas por los an.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Emanuele Canonico por su apoyo técnico. Parte de este trabajo se llevó a cabo en ALEMBIC, un laboratorio de microscopía avanzada establecido por IRCCS Ospedale San Raffaele y Università Vita-Salute San Raffaele. El trabajo de Enrico Ragni y Laura de Girolamo contó con el apoyo del Ministerio de Salud italiano, "Ricerca Corrente".
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 5(6)-Diacetato de carboxifluoresceína Éster de N-succinimidilo | Merck | 150347-59-4 | |
| Células del estroma mesenquimal adiposo | Wepredic, Parc d'affaires, 35760 Saint-Gré goire, Francia | Células utilizadas en este estudio | |
| Alexa 488 anti-Caveolin | R& D Systems | IC5736G | anticuerpo de citometría de flujo |
| APC anti-humano CD44 | BioLegend | 338805 | anticuerpo de citometría de flujo |
| APC anti-humano CD63 | BioLegend | 353007 | anticuerpo de citometría de flujo |
| APC anti-humano CD81 (TAPA-1) | BioLegend | 349509 | anticuerpo de citometría de flujo |
| APC anti-humano CD9 | BioLegend | 312107 | Citometría de flujo anticuerpo |
| BC CytoFLEX S | Beckman Coulter | BC CytoFLEX S equipado con 3 láseres, azul, rojo y violeta | |
| Flow-Check Pro Fluorosferas | Beckman Coulter | A63493 | Perlas de control fluorescentes para el software MoFLO Astrios EQ |
| FlowJo (versión 10.8.1) | BD | versión 10.8.1 | Software de análisis |
| Kit IntraSure BD | Biosciences | 641776 | Fijación y permeabilización para tinción intracelular |
| Megamix-Plus FSC | BioCytex | 7802 | FSC perlas de poliestireno |
| MoFLO Astrios EQ | Beckman Coulter | MoFLO Astrios EQ equipado con 4 láseres, Azul, Amarillo - Verde, Violeta y Rojo | |
| Anticuerpo anti-FLOT1 de ratón | BD Transduction Laboratories | 610820 | Anticuerpo Western Blot |
| NanoSight NS300 | Malvern | NS300 | |
| Anticuerpo anti-Calnexina de conejo | Origene | TA336279 | Western Blot |
| Anticuerpo anti-CD9 y CD81 de conejo (kit de anticuerpos ExoAb) | System Biosciences | Anticuerpos EXOAB-KIT-1 | Western Blot |
| Anticuerpo anti-TSG101 de conejo | Anticuerpo HPA006161 | Western Blot | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Ultra Rainbow Partículas Fluorescentes Spherotech | URFP-30-2 | ||
| Ultracel 100 kDa MWCO | Merck | UFC910024 | |
| VER01 - Exometry | Perlas de sílice orgánicas para la calibración de dispersión |
Referencias
- Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J.
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Reimpresiones y permisos
