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Artículo de método

Caracterización integral de la mineralización tisular en un modelo ex vivo

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DOI:

10.3791/67235

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27 de septiembre de 2024

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1Nantes Université, Univ Angers, Oniris, CHU Nantes, INSERM, Regenerative Medicine and Skeleton, RMeS, UMR 1229, 2CHU Angers, Departement pathologie cellulaire et tissulaire

En este artículo

Resumen

El protocolo propuesto implica un enfoque global para evaluar la formación ósea en el contexto de la regeneración ósea mediante análisis multimodales. Su objetivo es proporcionar información cualitativa y cuantitativa sobre la formación de hueso nuevo, mejorando el rigor y la validez de las investigaciones básicas y preclínicas.

Resumen

La caracterización extensiva de la mineralización tisular en el contexto de la regeneración ósea representa un desafío importante, dadas las numerosas modalidades que actualmente están disponibles para el análisis. Aquí, proponemos un flujo de trabajo para una evaluación integral de la formación de hueso nuevo utilizando un explante ex vivo óseo de animal grande relevante. Se crea un defecto óseo (diámetro = 3,75 mm; profundidad = 5,0 mm) en la cabeza femoral de una oveja explantada y se inyecta un sustituto óseo macroporoso cargado con un factor de crecimiento proosteogénico (proteína morfogenética ósea 2 - BMP2). Posteriormente, el explante se mantiene en cultivo durante un periodo de 28 días, permitiendo la colonización celular y la posterior formación de hueso. Para evaluar la calidad y estructura del tejido recién mineralizado, se establecen los siguientes métodos sucesivos: (i) Caracterización e imágenes 3D de alta resolución de todo el explante mediante micro-CT, seguidas de análisis de imágenes de aprendizaje profundo para mejorar la discriminación de los tejidos mineralizados; ii) Nanoindentación para determinar las propiedades mecánicas del tejido recién formado; (iii) Exámenes histológicos, como hematoxilina/eosina/azafrán (HES), tricrómico de Goldner y pentacromo de Movat para proporcionar una evaluación cualitativa del tejido mineralizado, particularmente con respecto a la visualización de la barrera osteoide y la presencia de células óseas; (iv) Mapeo de microscopía electrónica de barrido (SEM) de retrodispersión con referencia interna para cuantificar el grado de mineralización y proporcionar información detallada sobre la morfología de la superficie, la composición mineral y la interfaz hueso-biomaterial; (v) Espectroscopía Raman para caracterizar la composición molecular de la matriz mineralizada y proporcionar información sobre la persistencia de BMP2 dentro del cemento a través de la detección de enlaces peptídicos. Este análisis multimodal proporcionará una evaluación eficaz del hueso recién formado y una visión cualitativa y cuantitativa completa de los tejidos mineralizados. A través de la estandarización de estos protocolos, nuestro objetivo es facilitar las comparaciones entre estudios y mejorar la validez y confiabilidad de los hallazgos de la investigación.

Introducción

Los defectos óseos, ya sean causados por traumatismos, resección de tumores, anomalías congénitas o infecciones, representan un gran desafío para la medicina regenerativa. Estas alteraciones comprometen la integridad estructural del sistema esquelético, lo que provoca molestias, deterioro funcional y una reducción de la calidad de vida de los pacientes.

Para superar estos desafíos, han surgido estrategias innovadoras de reparación ósea, con un enfoque en mejorar la osteogénesis y la regeneración del tejido óseo. Estos enfoques incluyen el uso de sustitutos óseos implantables, inyectables o imprimibles en 3D, que pueden ser de origen natural (p. ej., macromoléculas de origen biológico, hidroxiapatita de origen animal) o sintéticos (p. ej., biovidrios, fosfatos de calcio)1. Para mejorar su baja capacidad inherente para guiar y estimular la regeneración ósea, los sustitutos óseos pueden cargarse con factores osteoinductores, como las proteínas morfogenéticas óseas (BMP), para promover la diferenciación osteogénica de las células progenitoras y mejorar la formación ósea2.

La formación ósea se basa en la formación inicial de una matriz de colágeno, que luego es mineralizada por cristales de hidroxiapatita, reforzando así la estructura ósea3. Este proceso confiere rigidez y resistencia específicas al hueso. La calidad del tejido mineralizado está estrechamente gobernada por sus atributos microestructurales y su grado de mineralización4. Esta cualidad desempeña un papel fundamental en la cicatrización ósea y en la funcionalidad del hueso regenerado5. Sin embargo, la caracterización de la mineralización ósea sigue siendo una tarea desafiante debido a la variabilidad inherente entre los estudios multivariados 6,7,8.

Además, las evaluaciones iniciales de la biocompatibilidad, la citocompatibilidad y el potencial de diferenciación de los sustitutos de injertos óseos suelen realizarse in vitro. Sin embargo, las disparidades metodológicas impiden la comparación fluida de los resultados. Además, estos estudios in vitro no capturan completamente las interacciones multicelulares y el diálogo complejo entre las poblaciones celulares, incluidas las células de la médula ósea, que son esenciales para regular el proceso de regeneración ósea9. Esta falta de representación precisa del microambiente óseo puede comprometer la precisión de los estudios preclínicos posteriores10.

Aunque las evaluaciones in vivo proporcionan una representación más precisa de los contextos fisiológicos, están limitadas por consideraciones éticas, logísticas y financieras. En consecuencia, las evaluaciones ex vivo juegan un papel fundamental como interfaz entre los estudios in vitro e in vivo, sirviendo como un paso intermedio necesario antes de pasar a los experimentos en sujetos vivos 11,12,13.

En este contexto, es necesaria la implementación de metodologías de caracterización integrales para evaluar la calidad del tejido óseo regenerado y garantizar la pertinencia de la estrategia antes de pasar a un modelo preclínico. En consecuencia, proponemos un protocolo basado en el análisis de un modelo de explante utilizando tejido articular de rodilla de oveja. Esta metodología innovadora consiste en implantar cemento cargado de BMP2 en los explantes y realizar un análisis detallado de la mineralización del tejido después de 28 días de cultivo.

Los enfoques técnicos empleados en este estudio son diversos y complementarios, proporcionando colectivamente un enfoque integral para evaluar la calidad del tejido óseo regenerado (Figura 1). Las imágenes de micro-TC de alta resolución permiten una visualización detallada en 3D de la estructura ósea, lo que proporciona información valiosa sobre la densidad mineral, la morfología y la integridad del tejido recién formado. Esta técnica es crucial para evaluar la eficacia de la regeneración ósea y monitorear la progresión de la mineralización a lo largo del tiempo. La nanoindentación es un enfoque preciso para determinar las propiedades mecánicas del tejido, como su dureza y resistencia. Al medir la respuesta del material a una fuerza aplicada a escala nanométrica, este método permite evaluar la robustez y la calidad del tejido mineralizado. Los exámenes histológicos que utilizan tinciones comunes como la hematoxilina/eosina/azafrán (HES), el tricrómico de Goldner y el pentacromo de Movat proporcionan información valiosa sobre la estructura y composición de los tejidos. Estas tinciones permiten la diferenciación de los distintos componentes del tejido, incluidas las células, la matriz extracelular y los depósitos minerales, lo que permite una evaluación cualitativa completa del proceso de regeneración ósea. El mapeo de microscopía electrónica de barrido (SEM) de retrodispersión ofrece una visualización de alta resolución de la superficie de las muestras, lo que permite un análisis detallado del grado de mineralización de la matriz ósea, así como de las interfaces entre el material implantado y el tejido huésped. Por último, la espectroscopia Raman proporciona información sobre la composición molecular del tejido, en particular mediante la identificación de componentes específicos como proteínas, lípidos y minerales. Este enfoque permite la caracterización de la matriz mineralizada y la detección de factores de crecimiento como BMP2, proporcionando así información crucial sobre la persistencia de estímulos pro-osteogénicos en el medio de regeneración.

Utilizando un enfoque multidisciplinar, integrando diversas técnicas analíticas, nuestro estudio tiene como objetivo proporcionar una evaluación exhaustiva y completa de la calidad del tejido óseo regenerado, proporcionando así una base sólida para la evaluación de los sustitutos de injertos óseos y su potencial aplicación clínica.

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Protocolo

Este estudio ha sido aprobado por un comité de ética y bienestar animal y por la Administración Nacional Veterinaria y Alimentaria francesa con el número G44171.

1. Preparación y cultivo de explantes osteocondrales

  1. Coseche especímenes de articulaciones de ovejas de animales recién sacrificados en un entorno aséptico. Coloque la oveja en posición supina y afeite la extremidad trasera izquierda. Prepárese desinfectando con alcohol alrededor de la articulación de la rodilla. Utilice la artrotomía parapatelar lateral para exponer los ligamentos cruzados anterior y posterior, seguida de la luxación rotuliana para revelar la tróclea femoral.
    1. Después de la recolección de tejido, cree un defecto de 4,75 mm de diámetro en el cóndilo lateral utilizando un sistema de transferencia de autoinjerto osteocondral.
  2. Con un martillo ortopédico, cree un defecto de 10 mm de profundidad y extraiga el explante del cóndilo. Posteriormente, se realizó un segundo defecto de 8 mm de diámetro, centrado alrededor del primero, utilizando un sistema de transferencia de autoinjerto osteocondral. Esto produce explantes osteocondrales de 8 mm x 10 mm, que contienen un defecto central de 4,75 mm x 10,0 mm.
  3. Si es necesario por razones logísticas, transporte los explantes en la solución salina equilibrada de Hank (hBSS) suplementada con penicilina-estreptomicina al 1% y almacene a 4 °C.
  4. Enjuague los explantes 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), luego inyecte el defecto de 4,75 mm x 10,0 mm con un cemento de fosfato de calcio suplementado con 40 μg/mL de BMP2. Prepare el cemento como se describe a continuación.
    1. Producir fosfato α-tricálcico (α-TCP) mediante tratamiento térmico de varillas de fosfato tricálcico apatítico (prensa isostática a 120 MPa) a 1364 °C durante un mínimo de 12 h, seguido de enfriamiento por aire14.
    2. Muela las varillas de α-TCP en etanol absoluto con una bola de molino planetario 2x durante 5 min a 500 rpm para producir un polvo fino de 13,1 ± 1,7 μm (medido mediante difracción láser, como se describió anteriormente14).
    3. Esterilizar el polvo de α-TCP calentándolo en seco a 180 °C durante 45 min. Prepare el cemento de fosfato de calcio mezclando polvo α-TCP con una solución filtrada de Na2HPO4 al 2,5% (p/v) de 0,22 μm (proporción líquido/polvo de 0,35) durante 1 min.
    4. Cargue la pasta de cemento en una jeringa de 3 ml antes de la inyección con una aguja de 18 G.
  5. Después de 10 min a temperatura ambiente (RT), transfiera los explantes a un matraz de 25 cm² y agregue suavemente 10 mL de medio de cultivo completo que consista en Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con alto contenido de glucosa con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina-estreptomicina.
  6. Mantener los explantes hasta 28 días en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 y cambiar el medio de cultivo completo cada 2 días bajo una campana de flujo laminar.
  7. Enjuague los explantes 3 veces con PBS. Transfiéralos a tubos de 50 mL, agregue 20 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% y manténgalos a 4 °C durante 3 días. Luego, enjuague los explantes con PBS y guárdelos en etanol al 70% antes de los análisis posteriores.

2. Análisis de micro-TC

  1. Realizar análisis de microtomografía utilizando una micro-tomografía computarizada. Adquiera proyecciones de rayos X a una resolución de 10,7 μm, con un tiempo de exposición de 1200 ms y un filtro de aluminio de 1 mm (80 kV y 125 μA). Realice un promedio de tres imágenes por cada incremento de rotación de 0,45° para mejorar la relación señal-ruido.
  2. Reconstruya imágenes tridimensionales (3D) utilizando el software de reconstrucción del fabricante después de una alineación X/Y con un escaneo de referencia, con los siguientes parámetros: Suavizado: 0, Artefacto de anillo: 3, Endurecimiento del haz: 35%. Limpie las pilas de imágenes con software de procesamiento de imágenes y observe con herramientas de visualización bidimensional (2D) y 3D.

3. Análisis de imágenes de aprendizaje profundo

  1. Realice la segmentación de imágenes utilizando software especializado dedicado. Utilice el Asistente de segmentación integrado para entrenar un modelo de aprendizaje profundo para la discriminación de hueso y cemento.
  2. Seleccione una zona representativa (es decir, marco) que contenga hueso, cemento y fondo de las imágenes de micro-TC reconstruidas. Segmente este primer fotograma manualmente utilizando herramientas simples (por ejemplo, umbral) o potentes (por ejemplo, propagación) proporcionadas por el software.
  3. Genere un modelo de aprendizaje profundo en la pestaña Modelo y seleccione Rutina 3D-Unet en el menú desplegable. Definir sus parámetros experimentales en adecuación con las imágenes a analizar haciendo clic derecho sobre el modelo generado; aquí: profundidad de 5, tamaño de parche 32 x 32, algoritmo Adadetla, relación de zancada de 0,25, aumento de datos x10.
  4. Utilice el fotograma segmentado para entrenar la rutina de aprendizaje profundo (haga clic en el botón Entrenar), que se reconoce como relevante por sus capacidades de segmentación de imágenes rápidas y precisas 3,15. Una vez finalizado el entrenamiento, defina una segunda zona de trabajo (marco) y segmente automáticamente utilizando la función de predicción.
    1. Aplique la corrección manual si es necesario para generar datos de entrenamiento más precisos. Rutina de entrenamiento una vez más. Repita el proceso hasta obtener un resultado satisfactorio; El número de aumentos de datos disminuye progresivamente a medida que aumenta el número de fotogramas de entrenamiento.
      NOTA: El índice DICE proporcionado durante el entrenamiento del modelo da una indicación de la precisión del modelo (en comparación con la información de entrada), pero no es suficiente. La confirmación de la relevancia del modelo debe llevarse a cabo mediante la validación de los datos segmentados automáticamente por 3 investigadores independientes experimentados.
  5. Publique el modelo haciendo clic en el botón Exportar y aplíquelo a todo el conjunto de datos micro -CT haciendo clic en Segmento > modelo exportado > Conjunto de datos completo de segmento.

4. Incrustación

  1. Deshidratar los explantes óseos colocándolos en un vial de vidrio de 40 mL que contenga 25 mL de solución deshidratante compuesta por un 70% de acetona y un 30% de xileno. Coloque el vial de vidrio en una rueda giratoria durante 1 h en RT. Repita este paso 3 veces.
  2. Sustituya la solución de deshidratación por 25 ml de xileno y coloque el vial de vidrio en la rueda giratoria durante 1 h en RT.
  3. Reemplace la solución de xileno con 25 mL de metilmetacrilato enriquecido (MMA) con peróxido de benzoilo (BPO) al 10% y ftalato de dibutilo al 10% (DBP). Colóquelo en la rueda giratoria durante 1 h en RT. Repita este paso 2 veces.
  4. Reemplace la solución de MMA con 25 mL de MMA enriquecido con 10% de BPO, 10% de DBP y 450 μL de N, N dimetilanilina diluida 1:20 en propan-2-ol. Coloque el vial de vidrio a -20 °C durante la noche. La solución se vuelve amarillenta.
  5. Coloque el explante en un molde de inclusión de tamaño mediano y vierta la anilina MMA-BPO-DBP-N, N en el molde. Coloque el molde en una caja de plástico y ventile con flujo de nitrógeno durante 5 minutos. Cierre herméticamente la caja y colóquela a 4 °C durante 48 h para la polimerización y endurecimiento de MMA.
  6. Retire la resina que contiene el explante del molde y manténgala a 4 °C hasta su procesamiento para su posterior análisis.

5. Microscopía electrónica de barrido (SEM): imágenes cuantitativas de electrones retrodispersados (qBEI)

  1. Corte el bloque de pMMA que contiene el explante con una sierra de diamante a lo largo de su eje largo. Guarde la primera mitad del bloque para el análisis histológico. Corta la otra mitad más para generar una sección de 1,5 mm de grosor. Realice el corte a 3000 rpm con una velocidad de 3 mm/min.
  2. Muela la sección con papel de carburo de silicona con números ascendentes correspondientes al tamaño de grano inferior: SiC 320 durante 10 s, SiC 1000 durante 15 s, SiC 2000 durante 30 s y SiC 4000 durante 30 s.
  3. Pule la sección con pasta de diamante y ropa específica: paño de pulido con solución de diamante Mol B3 de 3 μm durante 1 min y paño de vellón con solución de diamante Nap B1 de 1 μm durante 1 min.
  4. Enjuague la sección con agua destilada doble y limpie las partículas de diamante con un bastoncillo de algodón. Seque la sección bajo gas nitrógeno.
  5. Recubrimiento de carbono de la sección gruesa (espesor de película de carbono de 10 nm) y móntelo en un trozo de aluminio con pintura plateada. Haga un puente de pintura plateada entre la parte superior de la sección y el muñón para permitir la evacuación de la carga de electrones al suelo.
  6. Coloque el código auxiliar en la etapa SEM. Junto a la muestra, inserte un talón de control compuesto por una copa de Faraday con estándares de carbono, aluminio y silicio en la cámara SEM. Esto se utilizará para calibrar el haz de electrones y convertir los niveles de gris en porcentajes de Ca. Cierre la cámara SEM y aspire.
  7. Encienda el haz de electrones y ajuste los parámetros SEM para que se ejecute en el modo de electrones retrodispersados. En las imágenes retrodispersadas, el nivel de gris del estándar de carbono es 25, el estándar de aluminio es 225 y el estándar de silicio es 253. A título indicativo, en el sistema utilizado, los parámetros SEM son la tensión de aceleración de 20 keV, la corriente de la sonda medida con la copa de Faraday: 250 pA, la distancia de trabajo: 15 mm, la apertura: 30 μm, la resolución de la imagen: 1024 x 768 píxeles, el vacío: < 4,10-4 Pa, el tiempo de permanencia de 100 μs/píxel, el brillo ~38 y el contraste ~72.
  8. Cuando el SEM está calibrado con los estándares, adquiera imágenes de la muestra en modo de electrones retrodispersados.
  9. Utilice la imagen de electrones retrodispersados del espécimen para convertir los niveles de gris en contenido de calcio, como se describe en Roschger et al.16. Realice esto utilizando cualquier software de análisis de imágenes.
  10. Trazar la distribución del contenido de calcio. La distribución del contenido de calcio muestra una distribución gaussiana. Se calculan tres parámetros principales de interés: lamedia de Ca, como el contenido medio de calcio en la imagen, elpico de Ca como la concentración de calcio más frecuente que se encuentra en la imagen y la anchura de Ca como laanchura total a la mitad del máximo de la distribución del contenido de calcio.
    NOTA: La reproducibilidad de qBEi se ha investigado mediante la obtención de imágenes de la misma región de interés durante 5 días consecutivos (una adquisición por día). Esto significa que el haz de electrones se encendió y apagó entre sesiones. El porcentaje de error en lamedia de Ca, elpico de Ca y el Cawidth se estimó en 0,5%, 0,7% y 1,2%, respectivamente. El contenido de calcio también se investigó mediante análisis de rayos X de dispersión de energía (EDS). Se estableció una muy buena relación lineal entre lamedia de Ca y el contenido de calcio estimado por EDS con un valor de R² de 0,99, similar a los datos obtenidos por Roschger et al. anteriormente17.

6. Histología

  1. Para cada muestra, corte secciones de 7 μm con un micrótomo de tejido duro con una hoja de tungsteno 18,19. Tiñe secciones con tinción tricrómica de Goldner, HES y MOVAT mediante un sistema de tinción automático.
  2. Para la deplastificación, remoje las muestras sucesivamente en acetona durante 5 minutos y repita 2 veces. Enjuague las muestras en agua destilada durante 5 minutos y repita 2 veces.
  3. Realice la coloración del tricrómico dorado como se describe a continuación.
    1. Coloque las muestras en hematoxilina férrica Weigert durante 20 min. Lavar con agua del grifo. Sumerja las muestras en alcohol ácido al 0,5% durante 30 s-1 min. Lavar con agua del grifo durante 20 min.
    2. Coloque las muestras en una solución de Ponceau/ácido fucsino/azofloxina durante 5 min. Sumergir en ácido acético al 1% durante 1 min.
    3. Teñir con una solución de ácido fosfomolíbdico/naranja G durante 20 min. Sumergir en ácido acético al 1% durante 1 min.
    4. Teñir con solución verde rápida durante 15 min a temperatura ambiente u 8 min a 60 °C. Enjuague bien con agua del grifo; Repita 3 veces.
  4. Realice la coloración Pentachrome de Movat como se describe a continuación.
    1. Tinción con azul alcián: sumergir las muestras en una solución de azul alcián durante 30 min. Enjuague las muestras en agua del grifo durante 5 min. Coloque las muestras en etanol alcalino durante 60 min. Enjuague las muestras con agua del grifo durante 10 min. Realizar un enjuague final con agua destilada.
    2. Tinción de hematoxilina de Weigert: colocar muestras en hematoxilina férrica de Weigert durante 20-30 min. Enjuague las muestras con agua del grifo durante 15 min. Enjuague nuevamente con agua destilada.
    3. Tinción con Crocein Brilliant/ácido fucsino: sumergir las muestras en una solución de Crocein Brilliant/Acid Fuchsin durante 10 min. Enjuagar con ácido acético al 0,5%. Sumerja las muestras en una solución de ácido fosfotúngstico al 5% durante 20 minutos. Enjuagar con ácido acético al 0,5% durante 2 min. Realizar tres enjuagues sucesivos con etanol al 100%, de 5 min cada uno.
    4. Tinción con Safran du Gatinais: colocar muestras en Safran du Gatinais durante 15 min. Realizar un enjuague final con agua del grifo.
  5. Realice la coloración HES como se describe a continuación.
    1. Tinción con hematoxilina de Weigert: sumergir las muestras en hematoxilina de Weigert durante 30 min. Enjuague con agua del grifo durante 2 min.
    2. Decoloración: sumergir las muestras en alcohol de ácido clorhídrico durante 10 s. Enjuague con agua del grifo durante 2 min.
    3. Neutralización: sumergir las muestras en una solución de carbonato de litio durante 1 min. Enjuague con agua del grifo durante 2 min. Realizar un enjuague final con agua destilada durante 1 min.
    4. Tinción con Eosina-Eritrosina: colocar las muestras en una solución de Eosina-Eritrosina durante 3 min. Enjuague con agua del grifo durante 10 s.
    5. Deshidratación: Sumergir las muestras en alcohol al 95% durante 15 s. Transfiera a 100% de alcohol durante 15 s. Repetir la inmersión en alcohol al 100% durante 30 s.
    6. Tinción final con safranina alcohólica: sumergir las muestras en safranina alcohólica durante 10 min. Realizar un enjuague final con agua del grifo.
  6. Realice el montaje de la corredera como se describe a continuación.
    1. Enjuague las muestras con etanol al 95%, luego con etanol al 100%, luego con metilciclohexano y repita esto 3 veces en cada paso.
    2. Monte las muestras con un kit de montaje y agregue un cubreobjetos. Escanee las imágenes con un escáner digital de diapositivas.

7. Microespectroscopía Raman

  1. Utilice la misma sección que se utiliza para el análisis Raman que el SEM. Muela y pula brevemente la sección como se describe en los pasos 5.2 - 5.3 para eliminar la fina capa de carbono añadida para el SEM que perjudica la disipación de calor de la muestra.
  2. Coloque la sección en la platina del microespectrómetro Raman. Calibre el número de onda para garantizar la precisión y alinee el láser antes de la medición. Dado que estos procedimientos son específicos de cada instrumento, no se describirán en este artículo.
  3. Localice las regiones de interés en el tejido que necesitan ser analizadas. Coloque la zona a analizar en el centro de la herramienta de video y recoja espectros Raman con los siguientes parámetros: láser de 785 nm utilizado a 30 mW, tiempo de integración: 20 s repetido 3 veces, rango espectral: 350-1800 cm-1, rejilla 1200 líneas/mm.
  4. Recoge 10 espectros de la resina de incrustación con la misma configuración Raman y promedial. Utilízalo para restar la contribución de resina en el paso 7.6.
  5. Preprocese los espectros de la siguiente manera para eliminar la contribución de fluorescencia, ruido y resina: corrección de la línea de base con un ajuste polinómico de cinco órdenes, filtro Savitzky-Golay con un grado de 4 y un tamaño de ventana comprendido entre 17 y 21, sustracción digital de resina utilizando el pico de ~812 cm-1 de la resina. Dicho preprocesamiento se puede realizar con diferentes softwares diseñados para el análisis y la visualización de datos.
  6. Analice más a fondo los espectros preprocesados para extraer parámetros valiosos racionando la intensidad máxima de la vibración de interés con la intensidad máxima de la vibración de referencia. Para el análisis óseo, por ejemplo, utilice los siguientes parámetros para calcularlo.
    1. Proporciones mineral-matriz: divida la intensidad máxima de las vibraciones v1PO4 a ~960 cm-1 por la intensidad máxima de los modos vibracionales Amida I (~1668 cm-1), amida III (~1250 cm-1), CH2-wag (~1450 cm-1) o la suma de los modos vibracionales prolina (~854 cm-1) e hidroxiprolina (Hyp, ~872 cm-1). El v2PO4, ubicado a ~430 cm-1, o el v4PO4, ubicado a ~600 cm-1, también se pueden usar y relacionar con la vibración Amide III20. Estos parámetros representan el grado de mineralización de la fase orgánica de la matriz ósea.
    2. Carbonato/Fosfato: divida la intensidad máxima del v1CO3, ubicada en ~1070 cm-1, por el v1PO4. Esto representa la cantidad de sustitución de carbonato tipo B en la red de apatita. Hyp/Pro, representa el contenido de hidroxiprolina, ~1375 cm-1/Amida III, representa el contenido de proteoglicanos, ~1150 cm-1/CH2-wag y ~1495 cm-1/CH2-wag, representa la cantidad de los productos finales de glicación avanzada carboximetilisina y pentosidina, 1670 cm-1/1690 cm-1 y 1670 cm-1/1640 cm-1 representan la estructura secundaria desordenada del colágeno, también conocida como madurez del colágeno, y las estructuras ordenadas en forma de α-hélice en el colágeno tipo I, respectivamente.
  7. Evalúe la reproducibilidad de las mediciones Raman examinando la misma región de interés en 5 adquisiciones consecutivas (una adquisición al día). Para cada parámetro analizado, la varianza estuvo por debajo del 0,2% del valor del parámetro, lo que respalda una buena reproducibilidad. La especificidad de cada pico investigado ha sido ampliamente discutida en el campo, y se presenta una visión general en la reciente revisión de Unal21.

8. Nanoindentación

NOTA: Debido a la naturaleza destructiva de la nanoindentación, generalmente se realiza al final de la rutina de análisis de muestras. El sistema de nanoindentación que poseemos está equipado con un indentador de diamante Berkovitch piramidal. Sin embargo, existen varias formas de indentadores, y no se ha determinado un consenso en la literatura para especímenes óseos o biomateriales.

  1. Hidratar la muestra ósea incrustada en solución salina durante 16 h en RT antes de la prueba de nanoindentación.
  2. Calibrar el sistema de nanoindentación utilizando sílice fundida y registrar el módulo de indentación resultante. Para la sílice fundida, el módulo de indentación es de aproximadamente 72 GPa utilizando un coeficiente de Poisson de 0,17.
  3. Una vez calibrado el sistema de nanoindentación, coloque la muestra utilizada para los análisis Raman en el sistema óptico del dispositivo de nanoindentación para señalar las ubicaciones donde se realizará la nanoindentación.
    NOTA: Esta modalidad varía de un equipo a otro; No detallamos cómo funciona el sistema de nanoindentación y el software, pero damos consejos generales sobre los diferentes pasos que se deben realizar.
  4. Una vez elegida la ubicación de la nanoindentación, mueva la muestra debajo del dispositivo de indentación y realice la indentación. Realiza la nanoindentación a una profundidad constante de 900 nm, con una velocidad de carga/descarga de 40 mm/min y una pausa de 15 s entre carga y descarga. Establezca el coeficiente de Poisson para el tejido óseo en 0,3.
  5. Recupere los diferentes parámetros de las curvas de nanoindentación y computúrelos de acuerdo con la teoría de Oliver y Pharr22.
    1. El módulo de indentación (EIT) se deriva de las propiedades conocidas de la punta de indentación y el módulo reducido y combina el módulo elástico local de la muestra. Calcule la sangría como:
      figure-protocol-1
      Con vs, vi, Ei y Er representando el coeficiente de Poisson de la muestra, suponiendo que es 0,3 para el hueso, el coeficiente de Poisson del indentador de diamante, que se supone que es 0,07, el módulo elástico del indentador de diamante, fijado en 1140 GPa y el módulo reducido, calculado como:
      figure-protocol-2
      Siendo S la pendiente del segmento de descarga y Ap el área proyectada y calculada como:
      figure-protocol-3
    2. Dureza (HIT): corresponde a la resistencia del hueso a la iniciación y propagación de grietas. En otras palabras, es un indicador de la dureza de los huesos. CalculeH IT como:
      figure-protocol-4
    3. Tasa de fluencia de la indentación (CIT): Refleja la deformación ósea a lo largo del tiempo a carga constante, indicativa de las propiedades viscoelásticas de la muestra, calculada como:
      figure-protocol-5
    4. Carga máxima (Lm): Corresponde a la carga opuesta necesaria para penetrar la profundidad indicada en la matriz ósea mineralizada.
    5. Obra de indentación (plasto W): Corresponde al área bajo la curva de deformación de carga/descarga. Es un reflejo directo de la energía disipada para inducir la deformación plástica.
      NOTA: La reproducibilidad de la nanoindentación es más difícil de evaluar en muestras óseas debido a la naturaleza destructiva de esta metodología. Sin embargo, estimamos la reproducibilidad de la muestra de sílice fundida estándar y uniforme. Para todos los parámetros anteriores, la varianza se estimó por debajo del 0,26% (5 medidas consecutivas en 5 días separados), lo que respalda una muy buena reproducibilidad. Por otro lado, debido a la naturaleza anisotrópica de las muestras óseas, es más difícil apreciar su reproducibilidad.

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Resultados

En la Figura 2 se muestra una imagen de micro-TC del explante. El uso de la segmentación manual no puede separar de manera óptima el hueso del cemento, presente en el canal central, utilizando el umbral global. Para mejorar el reconocimiento del hueso trabecular y el cemento, proponemos utilizar el aprendizaje profundo. El aprendizaje profundo es poderoso para reconocer las características de los biomateriales y ayuda a mejorar la separación entre el hueso y el cemento, lo que permite una me...

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Discusión

La reparación de los defectos óseos es un desafío importante en la medicina regenerativa para restaurar la movilidad, reducir el dolor y mejorar la calidad de vida de las personas afectadas. El uso de modelos de explantes ofrece una serie de ventajas en comparación con los estudios in vivo para la investigación de la reparación de defectos óseos. Además de las consideraciones éticas, este modelo permite el control riguroso de las condiciones experimentales y la reducción de la v...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Queremos agradecer a las instalaciones técnicas involucradas en la recolección y procesamiento de especímenes, incluyendo SC3M (SFR Francois Bonamy (UMS 016), Universidad de Nantes), SFR ICAT (Universidad de Angers), BIO3, HiMolA y SC4BIO. El Inserm UMR_S 1229 RMeS cuenta con el apoyo de subvenciones del Gobierno francés a través de las instituciones Inserm, Nantes Université, Univ Angers y Oniris VetAgroBio. CL también agradece a HTL Biotechnology.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,20 filtrosVWR 28145-501
Aguja de 18 G (1,2x40 mm)Jeringa Sterican4665120
3 mLHENKE-JECT8300005762
ácido clorhídrico al 37% VWR 1.00317.1000 
Ácido acético (glacial) Sigma A6283 
Acetona  VWR 20063-365 
Azul Alcián 8GXVWR 
Hidróxido de amonioVWR 
Fosfato tricálcico apatítico Centro de Ingeniería Biomédica y Sanitaria (Mines Saint Etienne, Francia)TV26U 
AzophloxineSigma 
Peróxido de benzoiloSigma 8.01641.0250
BMP2Medtronic InductOs 1,5 mg/mL
Croceína Brillante Aldrich 
CTVox Bruker-DataViewer
 Skyscan-Disco
de diamanteStruersMOD13
Sierra de diamanteStruersAccutom-50
DiaPro Mol B3 solución de diamanteStruers40600379
DiaPro Nap B1 solución de diamanteStruers40600373
Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)Sigma 
ftalato de dibutiloChimie-Plus Laboratoires28656
DragonFly software ORS2022.1.0.1231. 
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) alta glucosa, GlutaMAX(TM), piruvatoThermoFisher Scientific31966-021
Eosine Y- Surgipath Sigma 
Eritrosina BSigma 
Etanol absolutoVWR 
Eukitt Dutscher6.00.01.0003.06.01.01
Falcon 50 mLSarstedt62.547.254
Cloruro férrico hexahidratado (FeCl3, 6H2O) Merck 1.03943.0250
Suero fetal bovino (FBS) EurobioCVFSVF00
Ácido fucsinaMerck 1.05231.0025 
Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)BioseraMS01NG100J
hematoxilinaSigma 86.118.9 
Prensa isostáticaNova SuissePmax 1500 bares
Granulometría de difracción láser  MalvernMastersizer 3000
verde claro 
Carbonato de litioSigma A13149 
Paño de pulido MD-MolStruers 40500077
MetilciclohexanoVWR 8.06147.1000 
Metilciclohexano VWR 8.06147.1000 
Metilciclohexano VWR 8.06147.1000 
MetilmetacrilatoSigma 8.00590.2500
Micro-CT, micro-escáner BrukerSkyscan 1272
Fosfato de sodio monobásico (NAH2PO4)Sigma 71496
MorteroFritsch Pulverisette 6
N,N, DimethylanilinSigma 803060
Estación de nanoindentaciónAnton PaarNHT2
ND-Nap paño de pulidoStruers40500080
OATS Juego de Sistema de Transferencia de Autoinjerto Osteocondral, 4,75 mmArthrexAR-1981-04S
OATS Juego de Sistema de Transferencia de Autoinjerto Osteocondral OATS, 8 mmArthrexAR-1981-08S
Naranja GRalM15
Paraformaldehído (PFA)Sigma P6148
Moldes de inclusión desechables Peel-a-wayPolysciences, Inc18646C-1
Penicilina/estreptomicina (P/S)ThermoFisher Scientific15140122
solución salina tamponada con fosfato (PBS)ThermoFisher Scientific10010023
Ácido fosfomolíbdico Sigma 221856-100 g
Ácido fosfotúngsticoAldrich 12863-5 
PulidoraSturersDap V
PoupinelMEMMERTTV26U 
Microespectrómetro RamanRenishawInVia Qontor
Safran du Gâ tinais Labonord 
Microscopio electrónico de barridoCarl ZeissEvo LS 10
SEMZeissCarl Zeiss Evo LS10
SiC Láminas/Papeles de esmeriladoStruers40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)
Pintura de plataCiencias de la microscopía electrónica12686-15
Talón estándar con patrones de copa de Faraday, carbono, aluminio y siliconaMicro-Analysis Consultants Ltd8602
T25 MatrazCorning430639
XilenoVWR 28975.325
Xilidina PonceauAldrich 19.976-1 
3611863186122106332107507102404598100283010510214105720820362Prolabo2894713511507737

Referencias

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