Caracterización integral de la mineralización tisular en un modelo ex vivo

Resumen

El protocolo propuesto implica un enfoque global para evaluar la formación ósea en el contexto de la regeneración ósea mediante análisis multimodales. Su objetivo es proporcionar información cualitativa y cuantitativa sobre la formación de hueso nuevo, mejorando el rigor y la validez de las investigaciones básicas y preclínicas.

Resumen

La caracterización extensiva de la mineralización tisular en el contexto de la regeneración ósea representa un desafío importante, dadas las numerosas modalidades que actualmente están disponibles para el análisis. Aquí, proponemos un flujo de trabajo para una evaluación integral de la formación de hueso nuevo utilizando un explante ex vivo óseo de animal grande relevante. Se crea un defecto óseo (diámetro = 3,75 mm; profundidad = 5,0 mm) en la cabeza femoral de una oveja explantada y se inyecta un sustituto óseo macroporoso cargado con un factor de crecimiento proosteogénico (proteína morfogenética ósea 2 - BMP2). Posteriormente, el explante se mantiene en cultivo durante un periodo de 28 días, permitiendo la colonización celular y la posterior formación de hueso. Para evaluar la calidad y estructura del tejido recién mineralizado, se establecen los siguientes métodos sucesivos: (i) Caracterización e imágenes 3D de alta resolución de todo el explante mediante micro-CT, seguidas de análisis de imágenes de aprendizaje profundo para mejorar la discriminación de los tejidos mineralizados; ii) Nanoindentación para determinar las propiedades mecánicas del tejido recién formado; (iii) Exámenes histológicos, como hematoxilina/eosina/azafrán (HES), tricrómico de Goldner y pentacromo de Movat para proporcionar una evaluación cualitativa del tejido mineralizado, particularmente con respecto a la visualización de la barrera osteoide y la presencia de células óseas; (iv) Mapeo de microscopía electrónica de barrido (SEM) de retrodispersión con referencia interna para cuantificar el grado de mineralización y proporcionar información detallada sobre la morfología de la superficie, la composición mineral y la interfaz hueso-biomaterial; (v) Espectroscopía Raman para caracterizar la composición molecular de la matriz mineralizada y proporcionar información sobre la persistencia de BMP2 dentro del cemento a través de la detección de enlaces peptídicos. Este análisis multimodal proporcionará una evaluación eficaz del hueso recién formado y una visión cualitativa y cuantitativa completa de los tejidos mineralizados. A través de la estandarización de estos protocolos, nuestro objetivo es facilitar las comparaciones entre estudios y mejorar la validez y confiabilidad de los hallazgos de la investigación.

Introducción

Los defectos óseos, ya sean causados por traumatismos, resección de tumores, anomalías congénitas o infecciones, representan un gran desafío para la medicina regenerativa. Estas alteraciones comprometen la integridad estructural del sistema esquelético, lo que provoca molestias, deterioro funcional y una reducción de la calidad de vida de los pacientes.

Para superar estos desafíos, han surgido estrategias innovadoras de reparación ósea, con un enfoque en mejorar la osteogénesis y la regeneración del tejido óseo. Estos enfoques incluyen el uso de sustitutos óseos implantables, inyectables o imprimibles en 3D, que pueden ser de origen natural (p. ej., macromoléculas de origen biológico, hidroxiapatita de origen animal) o sintéticos (p. ej., biovidrios, fosfatos de calcio)¹. Para mejorar su baja capacidad inherente para guiar y estimular la regeneración ósea, los sustitutos óseos pueden cargarse con factores osteoinductores, como las proteínas morfogenéticas óseas (BMP), para promover la diferenciación osteogénica de las células progenitoras y mejorar la formación ósea².

La formación ósea se basa en la formación inicial de una matriz de colágeno, que luego es mineralizada por cristales de hidroxiapatita, reforzando así la estructura ósea³. Este proceso confiere rigidez y resistencia específicas al hueso. La calidad del tejido mineralizado está estrechamente gobernada por sus atributos microestructurales y su grado de mineralización⁴. Esta cualidad desempeña un papel fundamental en la cicatrización ósea y en la funcionalidad del hueso regenerado⁵. Sin embargo, la caracterización de la mineralización ósea sigue siendo una tarea desafiante debido a la variabilidad inherente entre los estudios multivariados ^6,7,8.

Además, las evaluaciones iniciales de la biocompatibilidad, la citocompatibilidad y el potencial de diferenciación de los sustitutos de injertos óseos suelen realizarse in vitro. Sin embargo, las disparidades metodológicas impiden la comparación fluida de los resultados. Además, estos estudios in vitro no capturan completamente las interacciones multicelulares y el diálogo complejo entre las poblaciones celulares, incluidas las células de la médula ósea, que son esenciales para regular el proceso de regeneración ósea⁹. Esta falta de representación precisa del microambiente óseo puede comprometer la precisión de los estudios preclínicos posteriores¹⁰.

Aunque las evaluaciones in vivo proporcionan una representación más precisa de los contextos fisiológicos, están limitadas por consideraciones éticas, logísticas y financieras. En consecuencia, las evaluaciones ex vivo juegan un papel fundamental como interfaz entre los estudios in vitro e in vivo, sirviendo como un paso intermedio necesario antes de pasar a los experimentos en sujetos vivos 11,12,13.

En este contexto, es necesaria la implementación de metodologías de caracterización integrales para evaluar la calidad del tejido óseo regenerado y garantizar la pertinencia de la estrategia antes de pasar a un modelo preclínico. En consecuencia, proponemos un protocolo basado en el análisis de un modelo de explante utilizando tejido articular de rodilla de oveja. Esta metodología innovadora consiste en implantar cemento cargado de BMP2 en los explantes y realizar un análisis detallado de la mineralización del tejido después de 28 días de cultivo.

Los enfoques técnicos empleados en este estudio son diversos y complementarios, proporcionando colectivamente un enfoque integral para evaluar la calidad del tejido óseo regenerado (Figura 1). Las imágenes de micro-TC de alta resolución permiten una visualización detallada en 3D de la estructura ósea, lo que proporciona información valiosa sobre la densidad mineral, la morfología y la integridad del tejido recién formado. Esta técnica es crucial para evaluar la eficacia de la regeneración ósea y monitorear la progresión de la mineralización a lo largo del tiempo. La nanoindentación es un enfoque preciso para determinar las propiedades mecánicas del tejido, como su dureza y resistencia. Al medir la respuesta del material a una fuerza aplicada a escala nanométrica, este método permite evaluar la robustez y la calidad del tejido mineralizado. Los exámenes histológicos que utilizan tinciones comunes como la hematoxilina/eosina/azafrán (HES), el tricrómico de Goldner y el pentacromo de Movat proporcionan información valiosa sobre la estructura y composición de los tejidos. Estas tinciones permiten la diferenciación de los distintos componentes del tejido, incluidas las células, la matriz extracelular y los depósitos minerales, lo que permite una evaluación cualitativa completa del proceso de regeneración ósea. El mapeo de microscopía electrónica de barrido (SEM) de retrodispersión ofrece una visualización de alta resolución de la superficie de las muestras, lo que permite un análisis detallado del grado de mineralización de la matriz ósea, así como de las interfaces entre el material implantado y el tejido huésped. Por último, la espectroscopia Raman proporciona información sobre la composición molecular del tejido, en particular mediante la identificación de componentes específicos como proteínas, lípidos y minerales. Este enfoque permite la caracterización de la matriz mineralizada y la detección de factores de crecimiento como BMP2, proporcionando así información crucial sobre la persistencia de estímulos pro-osteogénicos en el medio de regeneración.

Utilizando un enfoque multidisciplinar, integrando diversas técnicas analíticas, nuestro estudio tiene como objetivo proporcionar una evaluación exhaustiva y completa de la calidad del tejido óseo regenerado, proporcionando así una base sólida para la evaluación de los sustitutos de injertos óseos y su potencial aplicación clínica.

Protocolo

Este estudio ha sido aprobado por un comité de ética y bienestar animal y por la Administración Nacional Veterinaria y Alimentaria francesa con el número G44171.

1. Preparación y cultivo de explantes osteocondrales

1. Coseche especímenes de articulaciones de ovejas de animales recién sacrificados en un entorno aséptico. Coloque la oveja en posición supina y afeite la extremidad trasera izquierda. Prepárese desinfectando con alcohol alrededor de la articulación de la rodilla. Utilice la artrotomía parapatelar lateral para exponer los ligamentos cruzados anterior y posterior, seguida de la luxación rotuliana para revelar la tróclea femoral.
   1. Después de la recolección de tejido, cree un defecto de 4,75 mm de diámetro en el cóndilo lateral utilizando un sistema de transferencia de autoinjerto osteocondral.
2. Con un martillo ortopédico, cree un defecto de 10 mm de profundidad y extraiga el explante del cóndilo. Posteriormente, se realizó un segundo defecto de 8 mm de diámetro, centrado alrededor del primero, utilizando un sistema de transferencia de autoinjerto osteocondral. Esto produce explantes osteocondrales de 8 mm x 10 mm, que contienen un defecto central de 4,75 mm x 10,0 mm.
3. Si es necesario por razones logísticas, transporte los explantes en la solución salina equilibrada de Hank (hBSS) suplementada con penicilina-estreptomicina al 1% y almacene a 4 °C.
4. Enjuague los explantes 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), luego inyecte el defecto de 4,75 mm x 10,0 mm con un cemento de fosfato de calcio suplementado con 40 μg/mL de BMP2. Prepare el cemento como se describe a continuación.
   1. Producir fosfato α-tricálcico (α-TCP) mediante tratamiento térmico de varillas de fosfato tricálcico apatítico (prensa isostática a 120 MPa) a 1364 °C durante un mínimo de 12 h, seguido de enfriamiento por aire¹⁴.
   2. Muela las varillas de α-TCP en etanol absoluto con una bola de molino planetario 2x durante 5 min a 500 rpm para producir un polvo fino de 13,1 ± 1,7 μm (medido mediante difracción láser, como se describió anteriormente¹⁴).
   3. Esterilizar el polvo de α-TCP calentándolo en seco a 180 °C durante 45 min. Prepare el cemento de fosfato de calcio mezclando polvo α-TCP con una solución filtrada de Na₂HPO₄ al 2,5% (p/v) de 0,22 μm (proporción líquido/polvo de 0,35) durante 1 min.
   4. Cargue la pasta de cemento en una jeringa de 3 ml antes de la inyección con una aguja de 18 G.
5. Después de 10 min a temperatura ambiente (RT), transfiera los explantes a un matraz de 25 cm² y agregue suavemente 10 mL de medio de cultivo completo que consista en Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con alto contenido de glucosa con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina-estreptomicina.
6. Mantener los explantes hasta 28 días en una incubadora a 37 °C con 5% de CO₂ y cambiar el medio de cultivo completo cada 2 días bajo una campana de flujo laminar.
7. Enjuague los explantes 3 veces con PBS. Transfiéralos a tubos de 50 mL, agregue 20 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% y manténgalos a 4 °C durante 3 días. Luego, enjuague los explantes con PBS y guárdelos en etanol al 70% antes de los análisis posteriores.

2. Análisis de micro-TC

1. Realizar análisis de microtomografía utilizando una micro-tomografía computarizada. Adquiera proyecciones de rayos X a una resolución de 10,7 μm, con un tiempo de exposición de 1200 ms y un filtro de aluminio de 1 mm (80 kV y 125 μA). Realice un promedio de tres imágenes por cada incremento de rotación de 0,45° para mejorar la relación señal-ruido.
2. Reconstruya imágenes tridimensionales (3D) utilizando el software de reconstrucción del fabricante después de una alineación X/Y con un escaneo de referencia, con los siguientes parámetros: Suavizado: 0, Artefacto de anillo: 3, Endurecimiento del haz: 35%. Limpie las pilas de imágenes con software de procesamiento de imágenes y observe con herramientas de visualización bidimensional (2D) y 3D.

3. Análisis de imágenes de aprendizaje profundo

1. Realice la segmentación de imágenes utilizando software especializado dedicado. Utilice el Asistente de segmentación integrado para entrenar un modelo de aprendizaje profundo para la discriminación de hueso y cemento.
2. Seleccione una zona representativa (es decir, marco) que contenga hueso, cemento y fondo de las imágenes de micro-TC reconstruidas. Segmente este primer fotograma manualmente utilizando herramientas simples (por ejemplo, umbral) o potentes (por ejemplo, propagación) proporcionadas por el software.
3. Genere un modelo de aprendizaje profundo en la pestaña Modelo y seleccione Rutina 3D-Unet en el menú desplegable. Definir sus parámetros experimentales en adecuación con las imágenes a analizar haciendo clic derecho sobre el modelo generado; aquí: profundidad de 5, tamaño de parche 32 x 32, algoritmo Adadetla, relación de zancada de 0,25, aumento de datos x10.
4. Utilice el fotograma segmentado para entrenar la rutina de aprendizaje profundo (haga clic en el botón Entrenar), que se reconoce como relevante por sus capacidades de segmentación de imágenes rápidas y precisas ^3,15. Una vez finalizado el entrenamiento, defina una segunda zona de trabajo (marco) y segmente automáticamente utilizando la función de predicción.
   1. Aplique la corrección manual si es necesario para generar datos de entrenamiento más precisos. Rutina de entrenamiento una vez más. Repita el proceso hasta obtener un resultado satisfactorio; El número de aumentos de datos disminuye progresivamente a medida que aumenta el número de fotogramas de entrenamiento.
      NOTA: El índice DICE proporcionado durante el entrenamiento del modelo da una indicación de la precisión del modelo (en comparación con la información de entrada), pero no es suficiente. La confirmación de la relevancia del modelo debe llevarse a cabo mediante la validación de los datos segmentados automáticamente por 3 investigadores independientes experimentados.
5. Publique el modelo haciendo clic en el botón Exportar y aplíquelo a todo el conjunto de datos micro -CT haciendo clic en Segmento > modelo exportado > Conjunto de datos completo de segmento.

4. Incrustación

1. Deshidratar los explantes óseos colocándolos en un vial de vidrio de 40 mL que contenga 25 mL de solución deshidratante compuesta por un 70% de acetona y un 30% de xileno. Coloque el vial de vidrio en una rueda giratoria durante 1 h en RT. Repita este paso 3 veces.
2. Sustituya la solución de deshidratación por 25 ml de xileno y coloque el vial de vidrio en la rueda giratoria durante 1 h en RT.
3. Reemplace la solución de xileno con 25 mL de metilmetacrilato enriquecido (MMA) con peróxido de benzoilo (BPO) al 10% y ftalato de dibutilo al 10% (DBP). Colóquelo en la rueda giratoria durante 1 h en RT. Repita este paso 2 veces.
4. Reemplace la solución de MMA con 25 mL de MMA enriquecido con 10% de BPO, 10% de DBP y 450 μL de N, N dimetilanilina diluida 1:20 en propan-2-ol. Coloque el vial de vidrio a -20 °C durante la noche. La solución se vuelve amarillenta.
5. Coloque el explante en un molde de inclusión de tamaño mediano y vierta la anilina MMA-BPO-DBP-N, N en el molde. Coloque el molde en una caja de plástico y ventile con flujo de nitrógeno durante 5 minutos. Cierre herméticamente la caja y colóquela a 4 °C durante 48 h para la polimerización y endurecimiento de MMA.
6. Retire la resina que contiene el explante del molde y manténgala a 4 °C hasta su procesamiento para su posterior análisis.

5. Microscopía electrónica de barrido (SEM): imágenes cuantitativas de electrones retrodispersados (qBEI)

1. Corte el bloque de pMMA que contiene el explante con una sierra de diamante a lo largo de su eje largo. Guarde la primera mitad del bloque para el análisis histológico. Corta la otra mitad más para generar una sección de 1,5 mm de grosor. Realice el corte a 3000 rpm con una velocidad de 3 mm/min.
2. Muela la sección con papel de carburo de silicona con números ascendentes correspondientes al tamaño de grano inferior: SiC 320 durante 10 s, SiC 1000 durante 15 s, SiC 2000 durante 30 s y SiC 4000 durante 30 s.
3. Pule la sección con pasta de diamante y ropa específica: paño de pulido con solución de diamante Mol B3 de 3 μm durante 1 min y paño de vellón con solución de diamante Nap B1 de 1 μm durante 1 min.
4. Enjuague la sección con agua destilada doble y limpie las partículas de diamante con un bastoncillo de algodón. Seque la sección bajo gas nitrógeno.
5. Recubrimiento de carbono de la sección gruesa (espesor de película de carbono de 10 nm) y móntelo en un trozo de aluminio con pintura plateada. Haga un puente de pintura plateada entre la parte superior de la sección y el muñón para permitir la evacuación de la carga de electrones al suelo.
6. Coloque el código auxiliar en la etapa SEM. Junto a la muestra, inserte un talón de control compuesto por una copa de Faraday con estándares de carbono, aluminio y silicio en la cámara SEM. Esto se utilizará para calibrar el haz de electrones y convertir los niveles de gris en porcentajes de Ca. Cierre la cámara SEM y aspire.
7. Encienda el haz de electrones y ajuste los parámetros SEM para que se ejecute en el modo de electrones retrodispersados. En las imágenes retrodispersadas, el nivel de gris del estándar de carbono es 25, el estándar de aluminio es 225 y el estándar de silicio es 253. A título indicativo, en el sistema utilizado, los parámetros SEM son la tensión de aceleración de 20 keV, la corriente de la sonda medida con la copa de Faraday: 250 pA, la distancia de trabajo: 15 mm, la apertura: 30 μm, la resolución de la imagen: 1024 x 768 píxeles, el vacío: < ^4,10-4 Pa, el tiempo de permanencia de 100 μs/píxel, el brillo ~38 y el contraste ~72.
8. Cuando el SEM está calibrado con los estándares, adquiera imágenes de la muestra en modo de electrones retrodispersados.
9. Utilice la imagen de electrones retrodispersados del espécimen para convertir los niveles de gris en contenido de calcio, como se describe en Roschger et ^al.16. Realice esto utilizando cualquier software de análisis de imágenes.
10. Trazar la distribución del contenido de calcio. La distribución del contenido de calcio muestra una distribución gaussiana. Se calculan tres parámetros principales de interés: la_media de Ca, como el contenido medio de calcio en la imagen, el_pico de Ca como la concentración de calcio más frecuente que se encuentra en la imagen y la anchura de Ca como la_anchura total a la mitad del máximo de la distribución del contenido de calcio.
    NOTA: La reproducibilidad de qBEi se ha investigado mediante la obtención de imágenes de la misma región de interés durante 5 días consecutivos (una adquisición por día). Esto significa que el haz de electrones se encendió y apagó entre sesiones. El porcentaje de error en la_media de Ca, el_pico de Ca y el Cawidth se estimó en 0,5%, 0,7% y 1,2%, respectivamente. El contenido de calcio también se investigó mediante análisis de rayos X de dispersión de energía (EDS). Se estableció una muy buena relación lineal entre la_media de Ca y el contenido de calcio estimado por EDS con un valor de R² de 0,99, similar a los datos obtenidos por Roschger et al. anteriormente¹⁷.

6. Histología

1. Para cada muestra, corte secciones de 7 μm con un micrótomo de tejido duro con una hoja de tungsteno ^18,19. Tiñe secciones con tinción tricrómica de Goldner, HES y MOVAT mediante un sistema de tinción automático.
2. Para la deplastificación, remoje las muestras sucesivamente en acetona durante 5 minutos y repita 2 veces. Enjuague las muestras en agua destilada durante 5 minutos y repita 2 veces.
3. Realice la coloración del tricrómico dorado como se describe a continuación.
   1. Coloque las muestras en hematoxilina férrica Weigert durante 20 min. Lavar con agua del grifo. Sumerja las muestras en alcohol ácido al 0,5% durante 30 s-1 min. Lavar con agua del grifo durante 20 min.
   2. Coloque las muestras en una solución de Ponceau/ácido fucsino/azofloxina durante 5 min. Sumergir en ácido acético al 1% durante 1 min.
   3. Teñir con una solución de ácido fosfomolíbdico/naranja G durante 20 min. Sumergir en ácido acético al 1% durante 1 min.
   4. Teñir con solución verde rápida durante 15 min a temperatura ambiente u 8 min a 60 °C. Enjuague bien con agua del grifo; Repita 3 veces.
4. Realice la coloración Pentachrome de Movat como se describe a continuación.
   1. Tinción con azul alcián: sumergir las muestras en una solución de azul alcián durante 30 min. Enjuague las muestras en agua del grifo durante 5 min. Coloque las muestras en etanol alcalino durante 60 min. Enjuague las muestras con agua del grifo durante 10 min. Realizar un enjuague final con agua destilada.
   2. Tinción de hematoxilina de Weigert: colocar muestras en hematoxilina férrica de Weigert durante 20-30 min. Enjuague las muestras con agua del grifo durante 15 min. Enjuague nuevamente con agua destilada.
   3. Tinción con Crocein Brilliant/ácido fucsino: sumergir las muestras en una solución de Crocein Brilliant/Acid Fuchsin durante 10 min. Enjuagar con ácido acético al 0,5%. Sumerja las muestras en una solución de ácido fosfotúngstico al 5% durante 20 minutos. Enjuagar con ácido acético al 0,5% durante 2 min. Realizar tres enjuagues sucesivos con etanol al 100%, de 5 min cada uno.
   4. Tinción con Safran du Gatinais: colocar muestras en Safran du Gatinais durante 15 min. Realizar un enjuague final con agua del grifo.
5. Realice la coloración HES como se describe a continuación.
   1. Tinción con hematoxilina de Weigert: sumergir las muestras en hematoxilina de Weigert durante 30 min. Enjuague con agua del grifo durante 2 min.
   2. Decoloración: sumergir las muestras en alcohol de ácido clorhídrico durante 10 s. Enjuague con agua del grifo durante 2 min.
   3. Neutralización: sumergir las muestras en una solución de carbonato de litio durante 1 min. Enjuague con agua del grifo durante 2 min. Realizar un enjuague final con agua destilada durante 1 min.
   4. Tinción con Eosina-Eritrosina: colocar las muestras en una solución de Eosina-Eritrosina durante 3 min. Enjuague con agua del grifo durante 10 s.
   5. Deshidratación: Sumergir las muestras en alcohol al 95% durante 15 s. Transfiera a 100% de alcohol durante 15 s. Repetir la inmersión en alcohol al 100% durante 30 s.
   6. Tinción final con safranina alcohólica: sumergir las muestras en safranina alcohólica durante 10 min. Realizar un enjuague final con agua del grifo.
6. Realice el montaje de la corredera como se describe a continuación.
   1. Enjuague las muestras con etanol al 95%, luego con etanol al 100%, luego con metilciclohexano y repita esto 3 veces en cada paso.
   2. Monte las muestras con un kit de montaje y agregue un cubreobjetos. Escanee las imágenes con un escáner digital de diapositivas.

7. Microespectroscopía Raman

1. Utilice la misma sección que se utiliza para el análisis Raman que el SEM. Muela y pula brevemente la sección como se describe en los pasos 5.2 - 5.3 para eliminar la fina capa de carbono añadida para el SEM que perjudica la disipación de calor de la muestra.
2. Coloque la sección en la platina del microespectrómetro Raman. Calibre el número de onda para garantizar la precisión y alinee el láser antes de la medición. Dado que estos procedimientos son específicos de cada instrumento, no se describirán en este artículo.
3. Localice las regiones de interés en el tejido que necesitan ser analizadas. Coloque la zona a analizar en el centro de la herramienta de video y recoja espectros Raman con los siguientes parámetros: láser de 785 nm utilizado a 30 mW, tiempo de integración: 20 s repetido 3 veces, rango espectral: 350-1800 ^cm-1, rejilla 1200 líneas/mm.
4. Recoge 10 espectros de la resina de incrustación con la misma configuración Raman y promedial. Utilízalo para restar la contribución de resina en el paso 7.6.
5. Preprocese los espectros de la siguiente manera para eliminar la contribución de fluorescencia, ruido y resina: corrección de la línea de base con un ajuste polinómico de cinco órdenes, filtro Savitzky-Golay con un grado de 4 y un tamaño de ventana comprendido entre 17 y 21, sustracción digital de resina utilizando el pico de ~812 ^cm-1 de la resina. Dicho preprocesamiento se puede realizar con diferentes softwares diseñados para el análisis y la visualización de datos.
6. Analice más a fondo los espectros preprocesados para extraer parámetros valiosos racionando la intensidad máxima de la vibración de interés con la intensidad máxima de la vibración de referencia. Para el análisis óseo, por ejemplo, utilice los siguientes parámetros para calcularlo.
   1. Proporciones mineral-matriz: divida la intensidad máxima de las vibraciones v1PO4 a ~960 ^cm-1 por la intensidad máxima de los modos vibracionales Amida I (~1668 ^cm-1), amida III (~1250 ^cm-1), CH2-wag (~1450 ^cm-1) o la suma de los modos vibracionales prolina (~854 ^cm-1) e hidroxiprolina (Hyp, ~872 ^cm-1). El v2PO4, ubicado a ~430 ^cm-1, o el v4PO4, ubicado a ~600 ^cm-1, también se pueden usar y relacionar con la vibración Amide III²⁰. Estos parámetros representan el grado de mineralización de la fase orgánica de la matriz ósea.
   2. Carbonato/Fosfato: divida la intensidad máxima del v1CO₃, ubicada en ~1070 ^cm-1, por el v1PO4. Esto representa la cantidad de sustitución de carbonato tipo B en la red de apatita. Hyp/Pro, representa el contenido de hidroxiprolina, ~1375 ^cm-1/Amida III, representa el contenido de proteoglicanos, ~1150 ^cm-1/CH2-wag y ~1495 ^cm-1/CH2-wag, representa la cantidad de los productos finales de glicación avanzada carboximetilisina y pentosidina, 1670 ^cm-1/1690 ^cm-1 y 1670 ^cm-1/1640 ^cm-1 representan la estructura secundaria desordenada del colágeno, también conocida como madurez del colágeno, y las estructuras ordenadas en forma de α-hélice en el colágeno tipo I, respectivamente.
7. Evalúe la reproducibilidad de las mediciones Raman examinando la misma región de interés en 5 adquisiciones consecutivas (una adquisición al día). Para cada parámetro analizado, la varianza estuvo por debajo del 0,2% del valor del parámetro, lo que respalda una buena reproducibilidad. La especificidad de cada pico investigado ha sido ampliamente discutida en el campo, y se presenta una visión general en la reciente revisión de Unal²¹.

8. Nanoindentación

NOTA: Debido a la naturaleza destructiva de la nanoindentación, generalmente se realiza al final de la rutina de análisis de muestras. El sistema de nanoindentación que poseemos está equipado con un indentador de diamante Berkovitch piramidal. Sin embargo, existen varias formas de indentadores, y no se ha determinado un consenso en la literatura para especímenes óseos o biomateriales.

1. Hidratar la muestra ósea incrustada en solución salina durante 16 h en RT antes de la prueba de nanoindentación.
2. Calibrar el sistema de nanoindentación utilizando sílice fundida y registrar el módulo de indentación resultante. Para la sílice fundida, el módulo de indentación es de aproximadamente 72 GPa utilizando un coeficiente de Poisson de 0,17.
3. Una vez calibrado el sistema de nanoindentación, coloque la muestra utilizada para los análisis Raman en el sistema óptico del dispositivo de nanoindentación para señalar las ubicaciones donde se realizará la nanoindentación.
   NOTA: Esta modalidad varía de un equipo a otro; No detallamos cómo funciona el sistema de nanoindentación y el software, pero damos consejos generales sobre los diferentes pasos que se deben realizar.
4. Una vez elegida la ubicación de la nanoindentación, mueva la muestra debajo del dispositivo de indentación y realice la indentación. Realiza la nanoindentación a una profundidad constante de 900 nm, con una velocidad de carga/descarga de 40 mm/min y una pausa de 15 s entre carga y descarga. Establezca el coeficiente de Poisson para el tejido óseo en 0,3.
5. Recupere los diferentes parámetros de las curvas de nanoindentación y computúrelos de acuerdo con la teoría de Oliver y Pharr²².
   1. El módulo de indentación (E_IT) se deriva de las propiedades conocidas de la punta de indentación y el módulo reducido y combina el módulo elástico local de la muestra. Calcule la sangría como:
      
      Con v_s, v_i, E_i y E_r representando el coeficiente de Poisson de la muestra, suponiendo que es 0,3 para el hueso, el coeficiente de Poisson del indentador de diamante, que se supone que es 0,07, el módulo elástico del indentador de diamante, fijado en 1140 GPa y el módulo reducido, calculado como:
      
      Siendo S la pendiente del segmento de descarga y Ap el área proyectada y calculada como:
      
   2. Dureza (H_IT): corresponde a la resistencia del hueso a la iniciación y propagación de grietas. En otras palabras, es un indicador de la dureza de los huesos. Calcule_{H IT} como:
      
   3. Tasa de fluencia de la indentación (C_IT): Refleja la deformación ósea a lo largo del tiempo a carga constante, indicativa de las propiedades viscoelásticas de la muestra, calculada como:
      
   4. Carga máxima (L_m): Corresponde a la carga opuesta necesaria para penetrar la profundidad indicada en la matriz ósea mineralizada.
   5. Obra de indentación (_plasto W): Corresponde al área bajo la curva de deformación de carga/descarga. Es un reflejo directo de la energía disipada para inducir la deformación plástica.
      NOTA: La reproducibilidad de la nanoindentación es más difícil de evaluar en muestras óseas debido a la naturaleza destructiva de esta metodología. Sin embargo, estimamos la reproducibilidad de la muestra de sílice fundida estándar y uniforme. Para todos los parámetros anteriores, la varianza se estimó por debajo del 0,26% (5 medidas consecutivas en 5 días separados), lo que respalda una muy buena reproducibilidad. Por otro lado, debido a la naturaleza anisotrópica de las muestras óseas, es más difícil apreciar su reproducibilidad.

Resultados

En la Figura 2 se muestra una imagen de micro-TC del explante. El uso de la segmentación manual no puede separar de manera óptima el hueso del cemento, presente en el canal central, utilizando el umbral global. Para mejorar el reconocimiento del hueso trabecular y el cemento, proponemos utilizar el aprendizaje profundo. El aprendizaje profundo es poderoso para reconocer las características de los biomateriales y ayuda a mejorar la separación entre el hueso y el cemento, lo que permite una mejor evaluación de las interacciones entre el cemento y el hueso. Esto es de suma importancia para cuantificar con precisión la cantidad de hueso formado en la interfaz con el cemento y no incorporar píxeles falsos en este cálculo.

Sin embargo, la simple cuantificación del hueso en la interfase no es suficiente para caracterizar el hueso recién formado. Se requiere un estudio más profundo de la calidad de la matriz ósea y la composición celular para comprender mejor la fuerza del nuevo hueso y los mecanismos celulares que llevaron a la formación de esta nueva matriz. La matriz ósea se puede caracterizar utilizando dos enfoques complementarios: qBEI y microespectroscopía Raman. En la Figura 3 se presenta un ejemplo de una imagen qBEI. Con qBEI, cada píxel codificado en escala de grises se transforma en una concentración de calcio. Este es un requisito previo para evaluar la distribución del contenido de calcio en el hueso trabecular y para comprender (i) el grado de mineralización del hueso recién formado en la interfaz con el cemento y (ii) si la presencia de cemento interrumpe la mineralización del hueso trabecular. La ventaja de qBEI es su capacidad para adquirir una imagen de alta resolución en muy poco tiempo, a diferencia de la microespectroscopia Raman que requiere un tiempo de adquisición más largo. Los parámetros de qBEI, como la_media de Ca, el_pico de Ca y la_anchura de Ca, pueden derivarse de la distribución de calcio y utilizarse para comparar la respuesta entre dos cementos o biomateriales.

Por otro lado, qBEI no proporciona ninguna información sobre la calidad de la fase orgánica de la matriz ósea en la interfaz con el biomaterial. La información adicional sobre las propiedades del material de la fase orgánica se deriva de la microespectroscopía Raman. La microespectroscopia Raman se realiza en la misma muestra que se utiliza para qBEI después de un rápido esmerilado y pulido de la superficie para eliminar la capa de carbono conductor. En la microespectroscopia Raman, los espectros se adquieren en cada ubicación de píxel. En la Figura 4 se proporcionan ejemplos de espectros Raman sin procesar, sin procesar y sin procesar. Cada espectro contiene información sobre la composición del píxel analizado e incluye picos relacionados con la resina de incrustación, en este caso, pMMA, la fase mineral, picos v1PO4 y v1CO3, y la fase orgánica, picos Pro, Hyp, CML, Amide III, PG, CH2, Pen. y Amida I. En el ejemplo de la Figura 4, el espectro sin tratar muestra la contribución de la resina de recubrimiento a ~812 ^cm-1 y una línea de base curva distinta de cero debido a la fluorescencia, aunque se utiliza un láser rojo de infrarrojo cercano. El procesamiento del espectro es un requisito previo para garantizar un cálculo preciso de los diversos parámetros Raman, en particular la eliminación de la fluorescencia de fondo. Al adquirir datos, el usuario debe asegurarse de un posicionamiento preciso y evitar la saturación del detector para confirmar la presencia del pico v1PO4 ubicado a ~960 ^cm-1. Después del posprocesamiento, las relaciones de intensidad máxima se calculan de acuerdo con la ubicación del modo vibratorio característico.

Sin embargo, es cuestionable si los cambios en la composición del material condujeron a cambios en la respuesta biomecánica. Para recopilar información sobre la biomecánica del hueso recién formado, llevamos a cabo sistemáticamente investigaciones de nanoindentación en la misma muestra utilizada para la microespectroscopia Raman. La información mecánica de los tejidos se obtiene a partir de curvas de nanoindentación representadas por curvas de carga frente a profundidad (Figura 5). Vale la pena señalar que la profundidad no vuelve a cero al final de la prueba, lo que representa la deformación plástica y el daño permanente creado en el material. La tasa de fluencia de la indentación se deriva de la curva de profundidad frente al tiempo.

Por último, la tinción histológica se utiliza para evaluar la respuesta del tejido al biomaterial a nivel celular (Figura 6). Las tinciones histológicas propuestas permiten determinar la presencia de tejido osteoide, pero también la identificación de células (macrófagos, células gigantes multinucleadas, osteoclastos, osteoblastos) y la posible presencia de una cápsula fibrosa en la interfaz con el biomaterial. Esto es muy importante para comprender la biocompatibilidad de un biomaterial, pero también la persistencia de hueso nuevo cuando el biomaterial se degrada.

En general, el enfoque multimétodo permite un estudio en profundidad de la formación ósea, la calidad del hueso recién formado y la composición celular. Cuando se lleva a cabo en el orden secuencial propuesto, todas las investigaciones se pueden realizar en la misma muestra, lo que reduce el costo y el tiempo de procesamiento.

Figura 1: Resumen gráfico. Aquí se proporciona un resumen de los pasos del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Análisis de micro-CT y aprendizaje profundo. (A) Reconstrucción 3D de imágenes de micro-CT. (B) Segmentación ósea y cementosa: comparación entre la segmentación manual y el aprendizaje profundo. Barra de escala = 5 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes cuantitativas de electrones retrodispersados para determinar el contenido de calcio. (A) La imagen retrodispersada compuesta por los niveles de gris obtenidos en la microscopía electrónica de barrido (SEM) es convertida por el software de análisis de imágenes en (B) un mapa de calcio que muestra los puntos calientes de la muestra ósea. (C) Se traza la distribución del contenido de calcio en función del área ósea y se calculan los tres parámetros principales de qBEI, Camean, Capeak y_ancho de Ca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Ejemplo de espectros Raman. (A) Espectro Raman crudo sin procesar obtenido en el rango espectral de 800 a 1800 ^cm-1. El fondo de fluorescencia es claramente visible ya que los espectros no parten de 0. La contribución de resina (pMMA) es claramente visible a ~812 ^cm-1. (B) Espectro procesado. La posición de los diferentes modos vibratorios de interés se indica en el espectro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Investigación de las propiedades mecánicas de los tejidos mediante nanoindentación. (A) El dispositivo de nanoindentación se compone de una parte óptica que se utiliza para definir la ubicación de la región de interés en la superficie del bloque de muestra, y luego el bloque se traduce debajo de la parte de indentación. (B) La carga frente al tiempo y la profundidad frente al tiempo se trazan durante la prueba de indentación y se utilizan para generar el (C) Curva de carga en función de la profundidad. En este ejemplo, la profundidad elegida se fijó en 400 nm. La carga máxima (L_m), la profundidad al final de la carga (h_l), la profundidad después del período de pausa (h_m), la pendiente del segmento de descarga (S) y el área bajo la fase de carga-descarga del ensayo (_{W plast}) se derivan de la curva de carga versus profundidad y se utilizan para calcular los diferentes parámetros de nanoindentación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Análisis histológico de explantes osteocondrales tratados con cemento después de 28 días de cultivo. (A) La tinción con Movat demuestra la estructura del tejido, incluyendo el hueso y el cemento que rellena el defecto. (B) La tinción HES ilustra la integración del tejido y la respuesta celular alrededor del cemento. Barra de escala: 2,5 mm. (C) Aumento del área resaltada en (B), que detalla la interfaz entre el cemento y el tejido circundante, donde se pueden observar las células invadiendo el cemento. Barra de escala: 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La reparación de los defectos óseos es un desafío importante en la medicina regenerativa para restaurar la movilidad, reducir el dolor y mejorar la calidad de vida de las personas afectadas. El uso de modelos de explantes ofrece una serie de ventajas en comparación con los estudios in vivo para la investigación de la reparación de defectos óseos. Además de las consideraciones éticas, este modelo permite el control riguroso de las condiciones experimentales y la reducción de la variabilidad biológica, facilitando así la generación de resultados más precisos y reproducibles. Además, las propiedades mecánicas y biológicas del hueso de oveja están estrechamente alineadas con las del hueso humano en comparación con otros animales^23,24. Esto hace que el modelo de explante de oveja sea una opción particularmente relevante para estudios preclínicos y un modelo representativo de las condiciones clínicas humanas.

Junto con el desarrollo de la metodología de imágenes y ciencias de los materiales, el modelo de explante descrito aquí representa un buen modelo para investigar los efectos de la medicina regenerativa en los tejidos esqueléticos en un entorno controlado reduciendo el sesgo experimental. Las dimensiones y morfología del explante son óptimas para un análisis detallado de la neoosteogénesis y las propiedades del material, lo que permite una evaluación y caracterización exhaustivas²⁵. Estos hallazgos enfatizan el potencial del modelo para la traslación clínica, ofreciendo un marco sólido para evaluar los sustitutos de injertos óseos y mejorar la probabilidad de resultados clínicos exitosos en las terapias de regeneración ósea. Además, el modelo facilita la evaluación precisa de la osteointegración y el rendimiento del biomaterial, que son factores críticos en el desarrollo de estrategias efectivas de reparación ósea.

Para garantizar el éxito del estudio, es fundamental seguir meticulosamente los pasos clave del protocolo. Uno de los aspectos más importantes es asegurarse de que la muestra esté completamente deshidratada durante el proceso de inclusión. Cualquier humedad restante puede dificultar la incrustación adecuada de la resina, lo que da lugar a una resina borrosa y no transparente, lo que podría comprometer la claridad y la precisión de los resultados y también podría dar lugar a agujeros durante el corte histológico. Esta cuidadosa atención a los detalles es esencial para producir resultados fiables y reproducibles. Con el fin de garantizar una conversión precisa de los niveles de gris en un mapa de contenido de calcio, es esencial emplear la calibración utilizando una copa de Faraday y estándares de C, Al y Si para el análisis SEM. Es crucial garantizar la coherencia en el uso del mismo SEM para todas las muestras, ya que las diferencias en los detectores de electrones retrodispersados pueden dar lugar a variabilidad en los resultados. En la espectroscopia Raman, la calibración del número de onda y la corrección exhaustiva de la línea de base son esenciales para excluir el fondo de fluorescencia y diferenciar entre los picos de la resina de inclusión y la muestra. Para la nanoindentación, lograr una superficie perfectamente lisa es fundamental, dados los límites de desplazamiento de los indentadores, y es necesaria la calibración con un estándar conocido, como la sílice fundida, para garantizar mediciones confiables.

Las modificaciones y la resolución de problemas de estas técnicas abordan con frecuencia la naturaleza anisotrópica del material óseo, que tiene el potencial de influir en la consistencia de la medición. A modo de ejemplo, en la espectroscopia Raman, la polarización del láser incidente puede tener un impacto considerable en la intensidad registrada. El uso de un objetivo de 20x con una apertura numérica baja puede ayudar a mitigar este problema. También es de suma importancia garantizar condiciones de calibración y medición consistentes en todas las muestras para mantener la integridad de los datos. La anisotropía inherente al hueso representa una limitación de estas metodologías, ya que puede afectar a la uniformidad de las mediciones, especialmente en técnicas como la espectroscopia Raman. Además, la necesidad de una calibración precisa y un control ambiental puede limitar la aplicabilidad general si estos aspectos no se gestionan meticulosamente.

La aplicabilidad potencial de estos enfoques se extiende significativamente a la evaluación de nuevos biomateriales y estrategias terapéuticas para la reparación ósea. La capacidad del modelo para imitar de cerca la fisiología ósea humana proporciona una plataforma sólida para las pruebas preclínicas, lo que permite una evaluación exhaustiva de la seguridad y la eficacia de los nuevos tratamientos en un entorno controlado. La utilidad de este modelo es particularmente relevante para acelerar la vía traslacional desde la investigación de laboratorio hasta la práctica clínica, facilitando la identificación temprana de candidatos prometedores para terapias de regeneración ósea. Al proporcionar un método fiable y reproducible para evaluar los materiales de reparación ósea, esta técnica apoya el avance de la medicina regenerativa y el desarrollo de soluciones clínicamente viables.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,20 filtros	VWR	28145-501
Aguja de 18 G (1,2x40 mm)	Jeringa Sterican	4665120
3 mL	HENKE-JECT	8300005762
ácido clorhídrico al 37%	VWR	1.00317.1000
Ácido acético (glacial)	Sigma	A6283
Acetona	VWR	20063-365
Azul Alcián 8GX	VWR
Hidróxido de amonio	VWR
Fosfato tricálcico apatítico	Centro de Ingeniería Biomédica y Sanitaria (Mines Saint Etienne, Francia)	TV26U
Azophloxine	Sigma
Peróxido de benzoilo	Sigma	8.01641.0250
BMP2	Medtronic	InductOs 1,5 mg/mL
Croceína Brillante	Aldrich
CTVox	Bruker-DataViewer
	Skyscan-Disco
de diamante	Struers	MOD13
Sierra de diamante	Struers	Accutom-50
DiaPro Mol B3 solución de diamante	Struers	40600379
DiaPro Nap B1 solución de diamante	Struers	40600373
Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)	Sigma
ftalato de dibutilo	Chimie-Plus Laboratoires	28656
DragonFly software	ORS	2022.1.0.1231.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) alta glucosa, GlutaMAX(TM), piruvato	ThermoFisher Scientific	31966-021
Eosine Y- Surgipath	Sigma
Eritrosina B	Sigma
Etanol absoluto	VWR
Eukitt	Dutscher	6.00.01.0003.06.01.01
Falcon 50 mL	Sarstedt	62.547.254
Cloruro férrico hexahidratado (FeCl3, 6H2O)	Merck	1.03943.0250
Suero fetal bovino (FBS)	Eurobio	CVFSVF00
Ácido fucsina	Merck	1.05231.0025
Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)	Biosera	MS01NG100J
hematoxilina	Sigma	86.118.9
Prensa isostática	Nova Suisse	Pmax 1500 bares
Granulometría de difracción láser	Malvern	Mastersizer 3000
verde claro
Carbonato de litio	Sigma	A13149
Paño de pulido MD-Mol	Struers 40500077
Metilciclohexano	VWR	8.06147.1000
Metilciclohexano	VWR	8.06147.1000
Metilciclohexano	VWR	8.06147.1000
Metilmetacrilato	Sigma	8.00590.2500
Micro-CT, micro-escáner	Bruker	Skyscan 1272
Fosfato de sodio monobásico (NAH2PO4)	Sigma	71496
Mortero	Fritsch	Pulverisette 6
N,N, Dimethylanilin	Sigma	803060
Estación de nanoindentación	Anton Paar	NHT2
ND-Nap paño de pulido	Struers	40500080
OATS Juego de Sistema de Transferencia de Autoinjerto Osteocondral, 4,75 mm	Arthrex	AR-1981-04S
OATS Juego de Sistema de Transferencia de Autoinjerto Osteocondral OATS, 8 mm	Arthrex	AR-1981-08S
Naranja G	Ral	M15
Paraformaldehído (PFA)	Sigma	P6148
Moldes de inclusión desechables Peel-a-way	Polysciences, Inc	18646C-1
Penicilina/estreptomicina (P/S)	ThermoFisher Scientific	15140122
solución salina tamponada con fosfato (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023
Ácido fosfomolíbdico	Sigma	221856-100 g
Ácido fosfotúngstico	Aldrich	12863-5
Pulidora	Sturers	Dap V
Poupinel	MEMMERT	TV26U
Microespectrómetro Raman	Renishaw	InVia Qontor
Safran du Gâ tinais	Labonord
Microscopio electrónico de barrido	Carl Zeiss	Evo LS 10
SEM	Zeiss	Carl Zeiss Evo LS10
SiC Láminas/Papeles de esmerilado	Struers	40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)
Pintura de plata	Ciencias de la microscopía electrónica	12686-15
Talón estándar con patrones de copa de Faraday, carbono, aluminio y silicona	Micro-Analysis Consultants Ltd	8602
T25 Matraz	Corning	430639
Xileno	VWR	28975.325
Xilidina Ponceau	Aldrich	19.976-1