Dilucidación de alteraciones proteómicas específicas de tejidos y plasma en la salud y la enfermedad

Resumen

La proteómica es una evaluación de alto rendimiento de las interacciones, la función, la composición y las estructuras de las proteínas y sus actividades celulares. Aquí, presentamos un protocolo para evaluar los cambios proteómicos totales en varias muestras biológicas, incluido el plasma y los tejidos. La metodología que se informa en este documento es aplicable a todas las muestras biológicas que contienen proteínas.

Resumen

La proteómica es el estudio a gran escala de las proteínas expresadas, centrándose en su estructura, función, interacciones, abundancia y modificaciones postraduccionales dentro de un sistema biológico. Por ejemplo, la fosfoproteómica, un subconjunto vital de la proteómica total, es el estudio de los patrones de fosforilación y las alteraciones en las proteínas. La metodología descrita en este documento ilustra un enfoque de proteómica total para dilucidar alteraciones en los perfiles generales de expresión de proteínas, incluidos los patrones de fosforilación, en el plasma, el cerebro, los pulmones, el bazo y los tejidos hepáticos recolectados de modelos animales de investigación (es decir, hurones y ratones). Esta técnica es aplicable a otros tipos de tejidos, así como a casi cualquier biomuestra que contenga proteínas (por ejemplo, células cultivadas). Después de la disección, los tejidos de interés se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 °C. Luego, los tejidos se homogeneizaron usando un mortero con nitrógeno líquido para preservar la integridad de las proteínas y los cambios de fosforilación. La proteína total se extrajo de los homogeneizados tisulares utilizando un tampón de lisis con una nucleasa universal e inhibidores de proteasa/fosfatasa. Las proteínas extraídas del tejido y el plasma equivalente se convirtieron en péptidos totales mediante digestión controlada de proteasa utilizando un kit de preparación de muestras de espectrómetro de masas comercial. Los péptidos se analizaron directamente mediante cromatografía líquida de ultra alta resolución/espectrometría de masas en tándem Orbitrap-tribrid. Las identidades de las proteínas constituyentes se reconstruyeron a partir de los datos espectrales de masas de péptidos, utilizando software bioinformático de proteómica, emparejados con una biblioteca de secuencias de aminoácidos específica de la especie. Después de esto, el análisis debe incluir criterios de corte estrictos, especialmente utilizando solo identificaciones de proteínas de alta confianza. Se pueden determinar diferencias proteómicas estadísticamente significativas (cambio de >2 veces; p < 0,05) entre los grupos de control y experimentales.

Introducción

La proteómica, como combinación de experimentación con proteomas y análisis de datos, se centra en identificar y cuantificar proteínas, caracterizándolas en función de la composición, la interacción, las modificaciones pretraduccionales y postraduccionales (por ejemplo, fosforilación), la localización subcelular y la estructura en condiciones fisiológicas¹. La proteómica de expresión se ocupa de las comparaciones cuantitativas de proteínas que difieren en condiciones biológicas cambiantes². También tiene una gran importancia en la elaboración de perfiles de un mapa de las vías, redes y sistemas moleculares complejos e interconectados, que controlan directamente las principales funciones biológicas, como la proliferación celular, la diferenciación, la senescencia y los mecanismos de muerte celular. Con el avance sustancial de la tecnología experimental en los últimos años, los métodos de proteómica han evolucionado de enfoques convencionales, incluida la inmunohistoquímica y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, a técnicas de alto rendimiento como la cromatografía líquida ^3,4. Los enfoques basados en la proteómica están ganando impulso en la determinación de fenotipos y subtipos de enfermedades únicos, así como en la identificación de nuevas interacciones diana para fármacos terapéuticos (farmacoproteómica). Por ejemplo, la estratificación de pacientes se ha centrado principalmente en enfoques genómicos para definir grupos homogéneos y guiar regímenes de tratamiento. Sin embargo, el estado de transcripción por sí solo no predice el destino de las proteínas traducidas después (por ejemplo, estabilidad o modificación); y por lo tanto, los mecanismos no genómicos contribuyen más al desarrollo, la progresión, la gravedad y la resistencia a la terapéutica de la enfermedad ^5,6,7.

Una de esas áreas de investigación que se ha beneficiado enormemente de las comparaciones cuantitativas de la expresión y actividad de las proteínas es el descubrimiento de biomarcadores en el campo de las enfermedades neurodegenerativas y las lesiones cerebrales traumáticas (LCT). La base para el descubrimiento de biomarcadores es desarrollar técnicas de diagnóstico que faciliten la detección temprana y los posibles objetivos de intervención. La proteómica cuantitativa basada en LC/MS-MS, junto con la bioinformática, ha ayudado al descubrimiento de biomarcadores proteicos clave, incluida la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y la ubiquitina carboxilo-terminal hidrolasa isoenzima L1 (UCH-L1), con un impacto severo o un TCE penetrante ^8,9. Por ejemplo, el personal militar sufre con frecuencia incidentes de TBI durante sus misiones, debido a la exposición a explosiones de bombas (es decir, blast-TBI). Sin embargo, la patobiología subyacente de los déficits neurológicos causados por una lesión cerebral traumática leve inducida por una explosión sigue sin estar clara. Por lo tanto, comprender los mecanismos moleculares y ultraestructurales de la lesión cerebral inducida por explosiones requiere una mejor identificación de sustitutos de biomarcadores específicos. Con la observación de los cambios proteómicos, los estudios han demostrado que los posibles mecanismos de estrés oxidativo inducido por la explosión en el cerebro se asocian con la disfunción mitocondrial, incluida la alteración de la dinámica de fisión-fusión, la disminución de la fosforilación oxidativa y las actividades enzimáticas compensadas relevantes para la respiración¹⁰. Los conocimientos sobre la patogénesis temprana de la desregulación inducida por blastos de modificaciones postraduccionales como la acetilación, la nitrosilación, la desaminación y la fosforilación también pueden proporcionar una mayor caracterización de sus efectos sobre la función de la proteína implicada en el daño axonal, la inflamación y la alteración de la barrera hematoencefálica^11,12. Con el avance de los enfoques de biología de sistemas, el mapeo de la información total del proteoma del cerebro y los tejidos periféricos en diferentes especies animales, incluidos roedores y hurones, se ha convertido en un procedimiento clave en la investigación de lesiones por explosión.

En este artículo, nos centramos en el flujo de trabajo metodológico para evaluar aspectos cuantitativos de la proteómica de expresión y sus modificaciones postraduccionales a partir de tejido o plasma, que se ha utilizado ampliamente para monitorear tanto fenómenos fisiológicos como condiciones patológicas. El uso de la siguiente metodología permite la consistencia y confiabilidad en la preparación de muestras y la adquisición de datos. Al tener esta metodología estandarizada, se pueden hacer comparaciones para determinar patrones proteómicos preservados en todos los tipos de tejidos y patrones de fosforilación únicos para tejidos específicos. Junto con esto, se pueden realizar análisis en varios modelos animales preclínicos y muestras clínicas humanas para obtener patrones de fosforilación conservados que podrían servir como biomarcadores y adaptar los regímenes de tratamiento farmacológico.

Protocolo

La investigación se llevó a cabo bajo un protocolo de uso de animales aprobado por IACUC en una instalación acreditada por AAALAC International con una Garantía de Bienestar Animal de los Servicios de Salud Pública y en cumplimiento con la Ley de Bienestar Animal y otros estatutos y regulaciones federales relacionados con los animales de laboratorio. Todos los suministros necesarios para este procedimiento se enumeran en la Tabla de materiales. El procedimiento se subdivide en siete componentes.

CAUTELA. Asegúrese de que se sigan los protocolos de seguridad adecuados cuando se trabaja con nitrógeno líquido para homogeneizar el tejido. El personal del laboratorio usó guantes de congelador, un delantal de congelador, una mascarilla quirúrgica y un protector facial durante la homogeneización del tejido congelado. Esta técnica de homogeneización se puede utilizar para cualquier tipo de tejido, incluidas sustancias extremadamente duras como el hueso, simplemente ajustando el tamaño del mortero en consecuencia. Consulte la Figura 1A para ver la configuración inicial del banco de trabajo. Consulte la Tabla de materiales para conocer los tamaños utilizados al homogeneizar tejidos de ratones y hurones.

1. Molienda criogénica de tejidos con un mortero

1. Tome el peso de un tubo de recolección vacío y regístrelo. Mientras está en el tubo de recolección, pese el tejido con una balanza analítica y registre el peso en un cuaderno de laboratorio. Reste el peso de un tubo vacío del tejido más el peso del tubo para obtener los mg de tejido utilizados.
   NOTA: Los tejidos que se evaluaron para los estudios proteómicos incluyen cerebro, pulmón, hígado y bazo. Todo el tejido se molió criogénicamente en forma de polvo con un mortero.
2. Vierta nitrógeno líquido en el criópodo, pero asegúrese de que esté lleno a menos de la mitad.
3. Transfiera el tubo que contiene la muestra y los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml vacíos y previamente esterilizados en autoclave a la gradilla de tubos ubicada en el criópodo. Esto asegura que la muestra permanezca congelada mientras se enfría el mortero, evitando que la muestra se descongele al transferir el tejido homogeneizado a los tubos vacíos de microcentrífuga de 1,5 ml.
4. Vierta nitrógeno líquido en el mortero para enfriar estos instrumentos antes de usarlos. El mortero se encuentra fuera del criópodo (Figura 1A, B).
5. Transfiera el tejido al mortero enfriado que contiene nitrógeno líquido (Figura 1B).
6. Presione repetidamente el tejido congelado con el mortero y haga un movimiento giratorio y de molienda con el mortero contra el tejido hasta que el tejido se muela hasta convertirlo en un polvo fino (Figura 1C).
   1. Asegúrese de que no se aplique una fuerza excesiva, lo que corre el riesgo de que las muestras se derramen del mortero. Asegúrese de tener un control firme sobre el mortero.
   2. Agregue nitrógeno líquido adicional al mortero mientras homogeneiza los tejidos grandes para reducir la posibilidad de que la muestra se descongele durante la molienda.
   3. Mientras muele el pañuelo, verifique que no se esté descongelando. Si se está descongelando, coloque nitrógeno líquido adicional en el mortero.
7. Sumerja los extremos de las espátulas de metal en el nitrógeno líquido para enfriarlas. Esto ayuda a transferir fácilmente el tejido homogeneizado al tubo de 1,5 ml. Esto evita que el tejido se descongele y se pegue a la espátula durante la transferencia.
8. Una vez que el tejido esté homogeneizado en un polvo fino y las espátulas metálicas estén frías, transfiera con cuidado el polvo de tejido homogeneizado a los nuevos tubos de 1,5 ml.
   1. Divida la muestra en alícuotas según el número de ensayos a completar.
      NOTA: Por ejemplo, se debían completar cuatro ensayos para las muestras de este estudio, por lo que el tejido homogeneizado se alícuotas igualmente en cuatro tubos de 1,5 ml.
   2. Guarde cualquier tejido homogeneizado adicional en un tubo de recolección de 5 ml con tapa a presión esterilizado en autoclave.
9. Almacene los tejidos alícuotas en un congelador a -80 °C hasta futuros análisis, con un uso realista dentro de 1 año para minimizar la oxidación del aire y la ligera de las proteínas.
10. Pesar el tubo de recolección vacío.
11. Reste el peso del tubo de recolección vacío de la medición inicial (tubo de recolección más muestra) para obtener el peso de la muestra de tejido.

2. Lisis tisular para el aislamiento de proteínas

1. Coloque hielo seco en un recipiente con hielo.
2. Coloque una rejilla para tubos en el hielo seco y deje que se enfríe.
3. Retire las muestras de tejido homogeneizadas del congelador a -80 °C y colóquelas en la gradilla de tubos refrigerada. Esto evita que las muestras se descongelen, lo que podría provocar la degradación de las proteínas y/o cambios en la fosforilación durante el proceso de pesaje.
   1. Asegúrese de que los tubos de 1,5 ml que contienen la muestra permanezcan congelados en la gradilla de tubos en hielo seco.
4. Coloque un nuevo tubo canónico de 50 ml en el hielo seco.
5. Retire la tapa del tubo canónico de 50 ml y coloque espátulas de plástico desechables en el tubo canónico de 50 ml para mantenerlas frescas. Esto evita que la muestra se pegue a las espátulas durante su transferencia a los tubos de homogeneización.
6. Para la lisis tisular y el aislamiento de proteínas, use tubos de 2 ml que contengan cinco perlas de cerámica de 2,8 mm (denominadas tubos homogeneizadores en este protocolo).
7. Etiquete la tapa y el costado del tubo de homogeneización con la identificación de la muestra con un rotulador de tinta permanente.
8. Coloque los tubos homogeneizadores etiquetados en la gradilla de tubos ubicada en el hielo seco para mantener los tubos fríos y evitar que la muestra se descongele.
9. Coloque un tubo de homogeneización en una báscula analítica y tara la báscula.
10. Regrese el tubo homogeneizador a la rejilla para tubos sobre hielo seco.
11. Retire la tapa del tubo de homogeneización que contiene las perlas y, con una de las espátulas de plástico enfriadas, transfiera de 5 mg a 10 mg de muestra de tejido en polvo al tubo de homogeneización respectivo.
12. Vuelva a colocar la tapa en el tubo de homogeneización.
13. Pese el tubo de homogeneización en la balanza analítica y registre la cantidad de muestra en el tubo de homogeneización.
    1. Utilice este peso para determinar la cantidad de tampón de lisis necesaria para una extracción eficaz de proteínas totales.
14. Una vez registrado el peso, vuelva a colocar el tubo de homogeneización que contiene la muestra en la rejilla del tubo sobre hielo seco para mantenerlo frío.
15. Deseche la espátula de plástico usada.
16. Use una espátula de plástico nueva y limpia para cada muestra que se transfiera y se pese para evitar la contaminación cruzada. Repita los pasos 2.9 a 2.15 para todas las muestras.
17. Después de transferir todas las muestras a tubos de homogeneización individuales, calcule la cantidad de mezcla maestra de lisis de proteínas necesaria.
    1. Prepare el volumen requerido de la mezcla maestra de lisis de proteínas, que se calcula en función del número de muestras que deben procesarse y el peso de cada muestra en polvo. Agregue 100 μL de mezcla maestra de lisis de proteínas por cada 5 mg de tejido a cada tubo.
    2. Consulte las pautas de la empresa para conocer los volúmenes de reactivos para hacer la mezcla maestra de lisis de proteínas (consulte la tabla de materiales).
18. Coloque los tubos de homogeneización que contienen las muestras homogeneizadas en polvo en un bloque frío a 4 °C. Los tubos de homogeneización ya no pueden permanecer en hielo seco. La colocación de los tubos homogeneizadores en el bloque frío evita que la solución de lisis se congele.
19. Retire la tapa de los tubos de homogeneización y transfiera la cantidad calculada de mezcla maestra de lisis de proteínas necesaria al tubo de homogeneización respectivo utilizando la pipeta de capacidad adecuada.
    1. Vuelva a colocar la tapa en los tubos homogeneizadores y gírelas hasta que estén bien apretadas.
20. Coloque los tubos de muestra en el homogeneizador y colóquelo en un programa de tejidos blandos (velocidad 4500 RPM, 2 x 30 s por ciclo, pausa de 30 s) a 4 °C para homogeneización.
21. Una vez completado el ciclo de homogeneización, retire los tubos del instrumento y vuelva a colocarlos en el bloque frío a 4 °C.
    1. Inspeccione visualmente los tubos de muestra. Asegúrese de que no se vea ninguna muestra en polvo. Si la muestra aún se visualiza a lo largo de la mezcla maestra de lisis de proteínas, complete la lisis tisular nuevamente en el instrumento.
    2. Optimice la configuración para el tipo de tejido que se utiliza. Por ejemplo, el tejido en polvo derivado de órganos fibrosos (por ejemplo, el corazón) puede necesitar ciclos adicionales o RPM más altas.
22. Transfiera los tubos de homogeneización a una centrífuga. Introduzca los siguientes ajustes en la centrífuga: 16.000 g durante 10 min a 4 °C y pulse Inicio en la centrífuga.
23. Una vez completada la centrifugación, transfiera cuidadosamente los tubos de homogeneización al bloque frío a 4 °C.
24. Etiquete los nuevos tubos de 1,5 ml en la tapa y el costado con la identificación de la muestra y cualquier otra información pertinente. Una vez etiquetados, coloque estos tubos de 1,5 ml en un bloque frío a 4 °C.
    NOTA: Los tubos se etiquetaron con al menos lo siguiente: identificación del animal, punto de tiempo del estudio, tipo de animal y tipo de tejido.
25. Transfiera el lisado de proteínas correspondiente de los tubos homogeneizadores a los respectivos tubos marcados de 1,5 ml mantenidos en un bloque frío a 4 °C.
26. Almacene las muestras a -80 °C para su posterior análisis. Este es un punto de parada seguro.

3. Cuantificación de proteínas totales

1. Retire las muestras del congelador a -80 °C y descongele las muestras en hielo húmedo en un cubo de hielo.
2. Una vez descongelado, agite todas las muestras y estándares del kit de cuantificación de proteínas durante al menos 3 s.
3. Agregue 10 μL de cada réplica de estándar, muestras y blancos apropiados en una placa de microtitulación de 96 pocillos según el diseño esquemático (Figura 2A).
   NOTA: Para cada muestra de tejido, se utiliza una dilución 1:100 del lisado de proteínas en solución salina preferiblemente tamponada con fosfato en el análisis del ensayo de proteínas. El diseño esquemático se puede modificar según el número de muestras utilizadas en el ensayo de proteínas. Las muestras, los estándares y los espacios en blanco apropiados se cargan en una placa de microtitulación de 96 pocillos por triplicado para evaluar la precisión de la concentración de proteínas, pero si es necesario que quepan muchas muestras en una placa, se aceptan duplicados.
   1. Para las muestras con una cantidad baja de tejido inicial (es decir, menos de 5 mg), use solo una réplica o duplicados para el ensayo de proteínas para maximizar la cantidad de lisado de proteínas disponible para la digestión posterior de proteínas.
   2. Asegúrese de que se utilizan pipetas precisas y calibradas.
4. Invierta el frasco de reactivo de ensayo de proteínas varias veces para mezclar bien y luego viértalo en un depósito de reactivo de 10 ml.
5. Con una pipeta multicanal de capacidad máxima de 200 μl, agregue 150 μl del reactivo de ensayo de proteínas a la columna 1.
6. Pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar el reactivo de ensayo de proteínas con los 10 μL de contenido que ya están en el pocillo para ayudar a reducir el precipitado en los pocillos.
7. Deseche las puntas de pipeta y coloque nuevas puntas en la pipeta multicanal de capacidad máxima de 200 μl.
8. Repita los pasos 3.5-3.7 hasta que se agregue el reactivo de ensayo de proteínas a toda la placa de 96 pocillos.
   1. Utilice puntas de pipeta nuevas para cada columna de pocillos para evitar la contaminación cruzada.
   2. Asegúrese de que al menos un pocillo se deje vacío sin reactivos ni muestras agregadas para usar como valor de absorbancia en blanco para la cuantificación de proteínas.
9. Una vez que se haya agregado el reactivo de ensayo de proteínas a todos los pocillos necesarios, cubra la placa de 96 pocillos con un sello de placa de papel de aluminio.
10. Agite la placa de 96 pocillos en un instrumento de vórtice durante 1 minuto a velocidad media y luego incube a temperatura ambiente (RT) durante 5 minutos antes de leer la placa.
11. Inspeccione la placa de 96 pocillos y el sello de papel de aluminio. Si el reactivo permanece pegado al sello de papel de aluminio, colóquelo con una balanza adecuada dentro de una centrífuga.
    1. Mantenga presionado el centrifugado rápido hasta que alcance aproximadamente 200 g.
    2. Saque la placa de 96 pocillos e inspeccione visualmente el sello de papel de aluminio para asegurarse de que no quede líquido en el papel de aluminio.
12. Retire lentamente el sello de papel de aluminio y vuelva a colocar la tapa transparente en la placa de 96 pocillos (Figura 2B).
13. Lea la placa de 96 pocillos en un espectrofotómetro a 660 nm, después de permitir que se desarrolle la reacción colorimétrica durante 5 minutos.
    NOTA: Las lecturas de absorbancia con un espectrofotómetro UV/Visible se miden a temperatura ambiente. El ensayo de proteínas de 660 nm se basa en la unión de un complejo de colorante metálico patentado a la proteína en condiciones ácidas que provoca un cambio en el máximo de absorción del colorante, que se mide a 660 nm.
14. Utilice las lecturas de absorbancia de los patrones conocidos para crear la curva estándar utilizando un software de gráficos (Figura 2C-E), que se aplica además para calcular las concentraciones de proteínas para todas las muestras.

4. Digestión de proteínas

CAUTELA. Asegúrese de que se sigan los protocolos de seguridad adecuados cuando se trabaja con los productos químicos peligrosos utilizados en el protocolo a continuación. El personal del laboratorio usó equipo de protección personal (EPP) y completó estos pasos en una campana extractora de gases químicos. Revise todas las hojas de datos de seguridad antes de trabajar con estos productos químicos.

1. Etiquete un nuevo juego de tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con los ID de muestra en la tapa y el costado de los tubos con tinta permanente. Incluya cualquier otra información pertinente.
   1. Basándose en la ecuación de la curva estándar, las lecturas de absorbancia de la muestra y el factor de dilución, calcule la concentración de proteína de cada muestra en microgramos por microlitro (μg/μL). Utilice este valor para calcular el volumen requerido de lisado de muestra que contiene 100 μg de proteína (Figura 2C-E). Transfiera este volumen calculado de lisado de muestra a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Completar el volumen final a 100 μL con el tampón de lisis; Este es el volumen inicial necesario para el protocolo de digestión.
   NOTA: El volumen final de la muestra de proteína más el tampón de lisis debe ser igual a 100 μl.
3. Según la literatura publicada anteriormente, use 1,5 μL de plasma para la digestión, que es aproximadamente igual a 100 μg de proteína.
4. Agregue 50 μL de solución de reducción (10 mM de ditiothreitol) a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, cierre la parte superior y haga un vórtice brevemente durante 3 s. Luego agregue 50 μL de solución de alquilación (30 mM de yodoacetamida) a cada muestra, cierre la parte superior y forme un vórtice durante 3 s.
5. Incubar muestras a 95 °C utilizando un bloque de calor durante 11 min para reducir y alquilar, respectivamente, la muestra de proteína. Esto escinde todos los puentes disulfuro y los cubre con un grupo acetamida, evitando su reformación y, por lo tanto, desnaturaliza la proteína en un estado completamente desplegado y maximiza la exposición de los sitios de digestión de péptidos.
6. Después de la incubación, retire las muestras del bloque de calor y déjelas enfriar a temperatura ambiente.
7. Mientras espera a que las muestras se enfríen, reconstituya la mezcla liofilizada de tripsina/proteasa Lys-C (proporción 1:1, 50 μg cada una) con la solución de reconstitución enzimática añadiendo 515 μL del líquido a 1 vial del reactivo sólido, es decir, 0,1 μg/μL cada uno. Evite el contacto directo de la piel con la solución de proteasa y todos los pasos posteriores, ya que la tripsina puede ser un irritante y alérgeno grave.
8. Una vez que las muestras se enfrían a RT, agregue 50 μL de mezcla de tripsina/proteasa Lys-C reconstituida (2,5 μg cada una) a la solución de muestra de proteína reducida y alquilada y vórtice brevemente.
9. Incubar en un termomezclador a 37 °C y ajustar a 1000 rpm durante 3 h para digerir la muestra de proteína.
   NOTA: La proteasa Lys-C se incluye para ayudar a escindir cualquier sitio que sea resistente a la digestión por tripsina, debido al plegamiento o la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, enlaces Lys-Pro). Esto no solo reduce cada proteína en numerosos péptidos conocibles de un tamaño y carga total razonablemente pequeños, sino que también es altamente reproducible si se siguen de cerca las mismas condiciones de digestión. El tiempo de incubación de 3 h durante la digestión es el tiempo mínimo que recomendamos para asegurar la escisión completa de todas las proteínas.
10. Después de las 3 h de incubación, retirar del termomezclador con un par de pinzas para evitar quemaduras en los dedos.
11. Agregue 50 μL de solución de parada de digestión (ácido trifluoroacético al 6% o ácido fórmico en agua) a la muestra y haga un vórtice breve.
    NOTA: Esto inhibe la reacción, ya que las dos proteasas tienen actividades máximas a un pH neutro 7-8.
12. Almacene las muestras en un congelador a -80 °C, ya que esto también detiene cualquier actividad residual de proteasa. Este es un punto de parada seguro.

5. Limpieza, secado y resuspensión de péptidos

NOTA: Este procedimiento es principalmente para eliminar los reactivos de digestión, especialmente las sales no volátiles, que pueden dañar fácilmente el instrumento LC/MS-MS, así como ayudar a aislar y concentrar los péptidos producidos. La limpieza de péptidos se logra utilizando columnas de centrifugación de desalinización proporcionadas por el kit, que están preempaquetadas con una resina de exclusión de tamaño (filtración en gel) que inicialmente captura los péptidos y luego permite que se laven especialmente las sales. Transferencia completa de los reactivos del kit a las columnas de centrifugación en una campana de gases químicos, ya que contienen disolventes orgánicos tóxicos.

CAUTELA. Garantizar que se sigan los procedimientos de seguridad adecuados, incluido el uso de EPP y las normas de contención de residuos peligrosos, cuando se trabaje con los productos químicos peligrosos del protocolo a continuación. Complete estos pasos en una campana extractora de productos químicos y revise todas las hojas de datos de seguridad antes de trabajar con estos productos químicos.

1. Retire las muestras del congelador a -80 °C y deje que las muestras lleguen a RT.
2. Retire la tapa blanca en la parte inferior de la columna de limpieza de péptidos, afloje la tapa superior verde y colóquela en un tubo de recolección de 2 ml.
3. Colóquelos en la centrífuga, cierre la tapa, presione el botón de inicio y centrifugue a 3000 g durante 2 minutos para eliminar todo el líquido acondicionador previo al envío.
4. Deseche el flujo en un contenedor de desechos peligrosos y coloque la columna de limpieza de péptidos en un nuevo tubo de recolección de 2 ml.
5. Etiquete las tapas verdes de la columna de limpieza de péptidos con los ID de muestra, utilizando un rotulador de marcado de tinta permanente.
6. Transfiera suavemente la preparación de digestión de proteínas, que tiene un volumen de aproximadamente 300 μl, a la columna de limpieza de péptidos secos, utilizando una pipeta de 200 μl (por ejemplo, 150 μl dos veces).
   1. Asegúrese de que no se observen burbujas en la parte superior de la resina de la columna de centrifugado. Si se observan burbujas, elimínelas golpeando suavemente la columna o utilizando una punta de pipeta limpia de 10 μl para dispersar la(s) burbuja(s).
      NOTA: Las burbujas de aire atrapadas pueden impedir la transición suave de la muestra a la resina y, por lo tanto, afectar negativamente la eficiencia de la limpieza y el rendimiento del péptido.
7. Colóquelos en la centrífuga, cierre la tapa, presione Inicio y centrifugue a 1.500 g durante 2 min.
8. Deseche el flujo en un contenedor de desechos peligrosos y coloque la columna de limpieza de péptidos en un nuevo tubo de recolección de 2 ml.
9. Agregue 300 μL de la solución de lavado A (agua, ácido trifluoroacético al 0,1% / TFA) sobre la resina de la columna, nuevamente usando una pipeta de 200 μL.
   1. Asegúrese de que no se observen burbujas en la parte superior de la resina de la columna de centrifugado. Si se observan burbujas, elimínelas golpeando suavemente la columna o use una punta de pipeta limpia de 10 μL para dispersar las burbujas.
10. Colóquelos en la centrífuga, cierre la tapa, presione Inicio y centrifugue a 1.500 g durante 2 min.
11. Deseche el flujo en un contenedor de desechos peligrosos y coloque la columna de limpieza de péptidos en un nuevo tubo de recolección de 2 ml.
12. Agregue 300 μL de solución de lavado B (metanol al 5 %, TFA al 0,1 %) sobre la resina de la columna, nuevamente con una pipeta de 200 μl.
    1. Asegúrese de que no se observen burbujas en la parte superior de la resina de la columna de centrifugado. Si se observan burbujas, elimínelas golpeando suavemente la columna o use una punta de pipeta limpia de 10 μl para dispersar las burbujas.
13. Colóquelos en la centrífuga, cierre la tapa, presione Inicio y centrifugue a 1.500 g durante 2 min.
14. Deseche el flujo en un contenedor de desechos peligrosos y coloque la columna de limpieza de péptidos en un nuevo tubo de recolección de 2 ml.
15. Repita los pasos 5.12-5.14 una vez más para que la columna se lave dos veces con la solución de lavado B.
16. Transfiera la columna de limpieza de péptidos a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 ml.
    1. Asegúrese de que los tubos de microcentrífuga de 2 ml utilizados en este paso sean los tubos de recolección de baja unión a proteínas proporcionados por el kit.
    2. Para conservar la cantidad disponible de tubos de recolección de baja unión a proteínas, use tubos de laboratorio estándar para los pasos de lavado anteriores.
17. Agregue 300 μL de solución de elución (50% acetonitrilo, 0,1% TFA) sobre la resina de la columna, nuevamente usando una pipeta de 200 μL.
    1. Asegúrese de que no se observen burbujas en la parte superior de la resina de la columna de centrifugado. Si se observan burbujas, elimínelas golpeando suavemente la columna o use una punta de pipeta limpia de 10 μL para dispersar las burbujas.
18. Colóquelos en la centrífuga, cierre la tapa, presione Inicio y centrifugue a 1.500 g durante 3 minutos para recolectar la muestra de péptido limpio en el nuevo tubo de recolección de 2 ml de baja unión a proteínas.
    1. Si lo desea, transfiera 125 μl (aproximadamente la mitad) de la solución peptídica limpia eluida a un vial de vidrio de 1 ml, utilizando una pipeta de 200 μl, y guárdela a -80 °C.
       NOTA: Esta alícuota se puede utilizar más adelante para análisis adicionales, como el etiquetado de etiquetas de masa en tándem (TMT) de los péptidos, como se hace con un kit disponible en el mercado, para una cuantificación más precisa en todas las muestras, especialmente en conjuntos preparados de forma independiente.
19. Almacene la muestra restante, aproximadamente 175 μL, a -30 °C en los tubos de 2 ml de baja unión a proteínas hasta que esté lista para proceder al secado y la reconstitución. Este es un punto de parada seguro.
20. Para secar la muestra, descongele la muestra de péptido de -30 °C a RT. Si continúa con el secado y la reconstitución justo después de la limpieza del péptido, ignore este paso.
21. Abra los tubos de microcentrífuga de 2 ml y colóquelos en un concentrador de centrífuga al vacío.
    1. Asegúrese de equilibrar el concentrador de centrífuga de vacío si se está procesando un número impar de muestras al mismo tiempo.
    2. Cierre la tapa del concentrador de centrífuga de vacío y presione Inicio.
    3. Deje que las muestras corran en el concentrador centrífugo de vacío durante 3 h, sin aplicar calentamiento.
    4. Inspeccione los tubos periódicamente para asegurarse de que no quede líquido en el interior, ya que esto puede interferir con la unión de los péptidos a la columna de separación del instrumento LC/MS-MS.
    5. Si aún se observa líquido, continúe girando las muestras durante más tiempo.
    6. Verifique entre 30 min y 1 h para ver si queda líquido en el tubo.
       NOTA: Los péptidos son altamente estables durante este proceso, ya que están en condiciones de vacío y no se deteriorarán por un corto período de sequedad o calor moderado generado por el funcionamiento del concentrador de centrífuga de vacío por sí solo.
22. Una vez seca, vuelva a suspender inmediatamente la muestra en 50 μl de ácido fórmico al 0,1 % en agua de grado MS (por ejemplo, 5 μl de ácido fórmico al 100 % en 5 ml de agua).
    1. Agregue 50 μl de ácido fórmico al 0,1 % al fondo del tubo de baja unión a proteínas de 2 ml que contiene la muestra de péptido seco, utilizando una pipeta de 200 μl.
23. Cierre las tapas, luego haga un vórtice durante 15 s.
24. Transfiera las muestras reconstituidas a los respectivos viales de vidrio de 1 ml, utilizando una pipeta de 200 μl.
25. Almacene los viales de vidrio que contienen las muestras reconstituidas a -30 °C y analícelos mediante un enfoque basado en LC-MS/MS lo antes posible.
    NOTA: Las muestras de péptidos congelados son estables a -30 °C para almacenamiento a corto plazo y -80 °C para almacenamiento más prolongado.

6. Adquisición de datos de muestras de péptidos en un instrumento UHPLC/MS-MS

CAUTELA. Asegúrese de que se sigan los protocolos de seguridad adecuados cuando se trabaja con un sistema de espectrómetro de masas en tándem de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento/Orbitrap. El personal del laboratorio usó EPP y recibió capacitación formal y práctica sobre instrumentos proporcionada por el fabricante de UHPLC / MS-MS. Las principales precauciones son el manejo adecuado de las fases móviles de disolventes ácidos y orgánicos para el UHPLC y la fuente de ionización de alto voltaje para el MS.

1. Realice separaciones de péptidos utilizando un sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UHPLC). La columna LC es un diseño de separación rápida de fase inversa C18 con capacidad de electropulverización, de dimensiones de 2 μm, 100 Å, 50 μm x 15 cm, tal como se coloca en línea después de una precolumna de protección del mismo material.
2. Utilice las siguientes fases móviles UHPLC: ácido fórmico al 0,1 % en agua (disolvente A), ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo (disolvente B) y ácido fórmico al 0,1 % en agua al 90 % y metanol al 10 % (disolvente C).
   NOTA: Todos los disolventes, así como el ácido fórmico, utilizados para preparar las fases móviles están certificados como de grado LC/MS y se fabrican solo según sea necesario. El UHPLC tiene una unidad de filtración y desgasificación antes de las bombas, por lo que las fases móviles no se filtran ni purgan manualmente de aire.
3. Establezca inyecciones programadas de los péptidos totales preparados para las muestras de plasma y tejido a 3 μL para empezar, lo que equivale a ~ 3 μg de material peptídico según lo determinado por la cantidad inicial de proteína utilizada.
   NOTA: Esto debería producir una intensidad de señal MS ideal para la máxima identificación de proteínas. El volumen de inyección se puede aumentar hasta 15 μL para aumentar aún más la salida de la señal o disminuir hasta 1 μL si la sobrecarga es evidente.
4. Mantenga la columna y el muestreador automático a 40 °C y 10 °C, respectivamente.
5. Ajuste el caudal de disolvente para la adquisición proteómica a una constante de 0,3 μl/min, utilizando las nanobombas UHPLC, con un gradiente de separación lineal de las fases móviles de agua (A) a acetonitrilo (B).
6. Realice lavados de la jeringa de inyección y el circuito de muestra (capacidad de 20 μL) utilizando la fase móvil de agua y metanol (C), con la bomba de carga UHPLC ajustada inicialmente a 5 μL/min.
7. Durante la separación de muestras durante 80 min en total, establezca el gradiente de LC (curvas lineales) de la siguiente manera: Inicial - 5% B; 0-60 min - 32% B; 60-61 min - 95% B; 61-65 min - 95% B; 65-66 min - 2% B; y 66-80 min - 2% B. Del mismo modo, haga funcionar la bomba de carga a un 100% constante de A, pero ajuste el caudal linealmente de la siguiente manera: Inicial - 5 μL / min; 0-5 min - 1 μL/min; 5-61 min - 5 μL/min; y 61-80 min - 5 μL/min (Figura 3A).
8. Inyecte muestras de péptidos desconocidos como ejecuciones duplicadas secuenciales.
9. Para evitar el arrastre, realice al menos dos inyecciones secuenciales en blanco de ácido fórmico al 0,1% en agua entre muestras utilizando un gradiente LC truncado (curvas lineales) durante 35 min en total de la siguiente manera: Inicial - 5% B; 0-23 min - 32% B; 23-24 min - 95% B; 24-30 min - 95% B; 30-31 min - 2% B; y 31-35 min - 2% B (Figura 3B).
   1. Asegúrese de que los ajustes de la pendiente LC de la bomba de carga permanezcan sin cambios.
   2. Para muestras de péptidos que tienen altos niveles de contaminantes endógenos, como el hígado (p. ej., ácidos biliares), incluya un tercer espacio en blanco cada 3 a 5 muestras y al final de la ejecución para ayudar a limpiar la columna de LC. Consiste en inyectar de 1 a 2 μL de solución que contiene un 25% de acetonitrilo, isopropanol, metanol y agua.
   3. Alternativamente, o en combinación con el paso anterior, realice un gradiente de LC mejorado con cambio porcentual (es decir, balancín) durante un total de 35 minutos como lavado del sistema de la siguiente manera: Inicial - 2% B; 0-3 min - 2% B; 3-4 min - 95% B; 4-10 min - 95% B; 10-11 min - 2% B; y 11-15 min - 2% B; 15-16 min - 95% B; 16-20 min - 95% B; 20-21 min - 2% B; 21-25 min - 2% B; 25-26 min - 95% B; 26-30 min - 95% B; 30-31 min - 2% B; y 31-35 min - 2% B (Figura 3C).
10. Llevar a cabo la detección de los péptidos, es decir, las masas moleculares correspondientes, a medida que se separan y eluyen de la columna LC, utilizando un sistema Orbitrap y un sistema de espectrómetro de masas cuadrupolo en tándem (MS-MS) combinado con trampa de iones.
    1. Antes de realizar las ejecuciones de muestra, conecte la columna LC directamente a la cara de la fuente de ionización por nanopulverización (NSI) intercambiable del instrumento MS, que se encuentra en la esquina frontal superior izquierda del dispositivo.
       NOTA: Esto expone la aguja de electropulverización incorporada de la columna LC que entrega los péptidos, suspendidos dentro de microgotas cargadas de solvente de fase móvil LC, en la entrada del tubo de transferencia de iones del detector.
    2. Además, para mejorar la eficiencia de volatilización del electrospray, encienda la unidad de calentamiento incorporada de la fuente NSI y configúrela a 40 °C.
11. Además, antes de la ejecución de la muestra, verifique que haya una entrada externa satisfactoria de nitrógeno comprimido y gas helio en el instrumento MS. Logre esto utilizando tanques de cilindros de acero de tamaño 300 de grado de pureza ultra alta de cada gas, que tienen los manómetros reguladores configurados a presiones de flujo estáticas de 60 y 40 psi, respectivamente.
12. Si el instrumento MS emite advertencias sobre la inestabilidad de la entrada de gas nitrógeno, aumente la presión hasta un máximo de 100 psi. Asegúrese de que los tanques estén al menos llenos al 10-20%, que es una lectura del manómetro de la válvula superior de ~ 250-500 psi; y si no, cámbielos por otros nuevos. Caer por debajo del 10% de la capacidad total tiene el riesgo de atraer contaminantes al instrumento MS, que puede depositarse en el fondo de los tanques de gas.
13. Realice el método del espectrómetro de masas de antemano utilizando una plantilla proporcionada por un software de control que está diseñada para la detección óptima de péptidos y sus modificaciones postraduccionales (Figura 3D-H), e ingrese las siguientes condiciones estándar:
    1. Establezca el período total de detección en 80 min.
    2. Establezca el modo de detección general en péptidos.
    3. Establezca la fuente NSI en el modo positivo (es decir, carga de los iones peptídicos).
    4. Ajuste el voltaje de la aguja de nanopulverización a 2000 V y manténgalo estático.
    5. Establezca la entrada de gas nitrógeno en el NSI y configure los detectores en estáticos.
    6. Ajuste la temperatura del tubo de transferencia de iones a 275 °C.
    7. Detectar las masas de los péptidos completos (es decir, iones padres; MS1) ajustando el rango de escaneo a 350-2000 m/z, la lente de RF al 30%, el tiempo máximo de inyección a Automático y el analizador de masas orbitrap a una resolución de 120.000.
       NOTA: La capacidad alternativa de trampa de iones del instrumento no se utiliza aquí para detectar las masas peptídicas, ya que es menos sensible para monitorear este tipo de molécula en comparación con el orbitrap.
    8. Configure los filtros de iones para discriminar entre aquellos péptidos que tienen múltiples estados de carga en un rango de 2 a 7. Esto permite que el instrumento, mientras registra los datos, convierta automáticamente las relaciones de masa sobre carga detectadas inherentemente (m / z) de las moléculas en sus masas exactas. Del mismo modo, un péptido con un solo estado de carga (m / z = 1) no requiere ningún factor de conversión para obtener su masa exacta.
    9. Establezca las puertas de exclusión dinámica para los iones en 1 paso a 60 s de duración, ±10 ppm de tolerancia de masa y para eliminar cualquier molécula con átomos isotópicos naturales presentes (por ejemplo, ¹⁴C).
    10. Detectar las masas de fragmentos de confirmación de identidad generados para los péptidos (es decir, iones hijos; MS2) configurando el instrumento en la adquisición dependiente de datos (modo DDA).
    11. Capture los péptidos completos (es decir, iones padres) mediante aislamiento de cuadrupolos, utilizando una configuración para la ventana de tolerancia de variabilidad de masa de m / z = 1.6.
    12. Realice la fragmentación de los péptidos capturados configurando el modo de impacto de electrones en HCD (es decir, disociación de colisión de mayor energía utilizando nitrógeno y helio como agente de transferencia de electrones), energía de colisión al 30%, rango de escaneo a Auto, tiempo máximo de inyección a Auto y el analizador de masas Orbitrap a una resolución de 30,000.
    13. Adquiera los datos finales (iones MS1 y MS2) estableciendo la forma del pico de la señal en un formato centroide.
14. Mantenga determinaciones de masa precisas para los péptidos detectados calibrando rutinariamente el instrumento, generalmente antes de cada lote de muestra, como se describe a continuación.
    1. Coloque el instrumento MS en un estado de apagado de la fuente de iones, utilizando el software de control, y cambie la fuente NSI a la fuente alternativa de ionización por electropulverización calentada internamente (HESI) del dispositivo. Esta es la fuente utilizada para aplicaciones que pueden requerir volúmenes de inyección de muestras muy grandes y un alto caudal correspondiente (1-2500 μL/min) para la bomba LC, por ejemplo, experimentos de metabolómica y farmacocinética de fármacos.
    2. Seleccione la opción de verificación de calibración completa en el software de control.
    3. Llene una jeringa de vidrio de 500 μL con un émbolo recubierto de teflón y una aguja roma de acero inoxidable con una solución estándar MS disponible en el mercado y, a continuación, conecte la línea del tubo capilar de PTFE a la fuente HSEI (mientras está apagada).
       NOTA: El estándar utilizado aquí contiene una mezcla de moléculas naturales y sintéticas (16 en total, por ejemplo, cafeína) que abarcan un rango de masa de m / z = 50-2800 y cubren una amplia gama de posibles tipos de enlaces químicos, especialmente aquellos que están asociados con péptidos (por ejemplo, grupos amida).
    4. Inicie una infusión constante del estándar MS en la fuente HSEI (mientras está encendido), utilizando una velocidad de 3-5 μL / min como se hace con una bomba de jeringa. Una vez que se observe un patrón estable de picos estándar en la ventana de visualización en vivo del software de control, active la verificación de calibración automática.
       NOTA: Si no se encuentran problemas con la sensibilidad y precisión de las determinaciones de masa para el estándar, una calibración completa exitosa generalmente toma < 40 minutos. Del mismo modo, solo si el instrumento pasa todos los parámetros de hardware de MS que se verifican se considera confiable para ejecutar muestras.
    5. Confirme el éxito de la calibración reiniciando la fuente NSI y la columna LC, y luego ejecutando una solución estándar de [Glu 1]-fibrinopéptido B humano (Glu-Fib) en cantidades totales inyectadas que cubren 1-10 ng (por ejemplo, 1, 2, 6 y 10 ng). Utilice los mismos métodos de separación de LC y detección de MS que los descritos anteriormente para las muestras desconocidas.
    6. Verifique el estándar Glu-Fib para conocer el tiempo de retención de LC apropiado (~ 20 min), la presencia de iones MS1 y MS2 (m / z = 1285.54, 813.39, 785.84, 445.12, 333.19 y 175.12) y la linealidad de las áreas de pico crecientes con la cantidad inyectada.
    7. A continuación, genere tablas de secuencia, utilizando el software de control y captura de datos, para ejecutar el péptido desconocido y las muestras en blanco que contienen columnas para introducir el tipo de muestra, el nombre del archivo, el ID de la muestra, la ruta de datos, el método del instrumento LC/MS, la posición del vial y el volumen de inyección (Figura 3D-E).
    8. Guarde los archivos de datos MS resultantes (extensión: RAW; 500 - 800 GB cada uno) en la carpeta de ruta designada en el disco duro de la computadora del instrumento. Luego, transfiera estos archivos a una computadora de estación de trabajo que sea lo suficientemente potente como para impulsar el software bioinformático, como se describe más adelante, que convierte los datos espectrales de masas de péptidos extremadamente extensos y complejos (es decir, señales MS1 y MS2) en los perfiles de composición total de proteínas correspondientes.

7. Conversión de datos brutos de EM en resultados representativos del proteoma total

NOTA: Los datos brutos de MS capturados para las muestras de péptidos se procesan en perfiles de composición de proteínas totales (proteoma), utilizando software bioinformático. En resumen, el software bioinformático reconstruye las proteínas originales en la muestra haciendo coincidir los datos de MS sin procesar con sus espectros de péptidos conocidos MS1 y MS2 que se encuentran en una biblioteca de referencia de proteomas específica de la especie basada en la web, a través de una cobertura extensa y única de la secuencia de aminoácidos de la proteína. Las abundancias relativas de cada proteína identificada son determinadas por el programa utilizando las intensidades de señal MS1 de sus péptidos únicos coincidentes. Las abundancias determinadas se pueden comparar de manera confiable entre muestras, pero solo si se ejecutan dentro del mismo lote de preparación y utilizando configuraciones idénticas de LC y MS. De lo contrario, se deberán emplear técnicas cuantitativas absolutas mencionadas anteriormente basadas en recuperaciones internas de iones estándar/reporteros, como el etiquetado selectivo de TMT de los péptidos dentro de cada muestra.

1. Descargue en el disco duro de la computadora de la estación de trabajo el archivo de referencia del proteoma de la biblioteca basada en la web.
   1. Encuentre esto utilizando la base de datos ubicada en el sitio web de Uniprot para las especies de muestra de interés (por ejemplo, hurones / Mustela furo). Esto se llama archivo FASTA. Utilice la herramienta de búsqueda de proteomas y la vista de tabla para localizar y luego descargar el archivo de referencia del proteoma.
   2. Para maximizar el número posible de identificaciones de proteínas generadas, seleccione las entradas revisadas por pares (Swiss-Prot) y no revisadas (TrEMBL) del comité en la base de datos de Uniprot al crear el archivo FASTA. Del mismo modo, elija la opción de incluir todas las isoformas revisadas para las proteínas.
2. Abra el software bioinformático, es decir, Proteome Discoverer, en la pestaña Página de inicio y, a continuación, seleccione la pestaña Administración .
3. Vaya a la subpestaña Mantener archivos FASTA y luego descargue en el programa el archivo FASTA específico de la especie anterior generado para sus experimentos.
4. Regrese a la pestaña Página de inicio y haga clic en Nuevo estudio/análisis, y en el cuadro de diálogo, escriba un nombre de estudio en el campo Nombre del estudio y seleccione una carpeta de archivos para guardar el estudio en el campo Directorio raíz del estudio .
5. Deje los campos Flujo de trabajo de procesamiento y Flujo de trabajo de consenso en blanco por ahora, ya que se seleccionarán para más adelante.
6. Haga clic en Aceptar para guardar y salir del cuadro de diálogo, que luego abrirá la página Definición del estudio .
7. Vaya a la pestaña Definición del estudio y escriba los detalles del proyecto en el cuadro Descripción del estudio ubicado en el lado central izquierdo.
8. Vaya a la pestaña Archivos de entrada y haga clic en Agregar archivos.
   1. Esto abrirá un cuadro de diálogo en el que los archivos de datos sin procesar necesarios para ser procesados en resultados del perfil de composición total de proteínas (proteoma) se pueden seleccionar y descargar desde el disco duro de la computadora.
9. Haga clic en los archivos de datos de MS sin procesar que ahora se enumeran en la pestaña Archivos de entrada , que se pueden seleccionar y resaltar individualmente o todos a la vez.
10. Arrástralos y suéltalos en la sección Archivos para análisis del cuadro Análisis ubicado en el lado central derecho como parte del subcuadro Paso de procesamiento .
11. Vaya a la pestaña Flujos de trabajo y haga clic en Editar, que se encuentra junto al encabezado Paso de procesamiento del cuadro Análisis ubicado en el lado central derecho.
12. Haga clic en Abrir común y, en la carpeta ProcessingWF_Tribrid , seleccione el archivo de flujo de trabajo de procesamiento designado específicamente para las subidentificaciones de fosfoproteínas, tal como se obtiene en la detección de MS basada en la fragmentación de HCD (Figura 4A).
    NOTA: Aparecerá un diagrama de pasos de procesamiento que contiene nodos editables en el cuadro Árbol de flujo de trabajo . Habrá dos nodos, como se describe a continuación, que están marcados con signos de exclamación que indican que hay una entrada obligatoria de información específica del experimento por parte del usuario.
13. En el diagrama de árbol del flujo de trabajo de procesamiento, haga clic y abra el nodo RC de Spectrum Files .
    1. En la categoría Parámetros de los archivos de espectro RC , busque y seleccione bajo el parámetro Base de datos de proteínas el archivo FASTA, que se generó previamente utilizando el sitio web de Uniprot, para la biblioteca de referencia específica de especies de espectros de MS peptídicos que se buscará para identificar las proteínas de interés experimental.
14. Haga clic y abra el nodo Sequest HT y realice los siguientes tres cambios:
    1. En el parámetro Base de datos de proteínas , seleccione el mismo archivo FASTA, como se ha descrito anteriormente.
    2. En el parámetro Nombre de la enzima , seleccione Tripsina (completa) o, alternativamente, Lys-C, que son las proteasas principales y de respaldo utilizadas para preparar la digestión peptídica original.
    3. En el parámetro Modificaciones dinámicas, asegúrese de que se haya seleccionado al menos Fosfo / +79,966 Da (S, T, Y).
       1. Utilice esta última configuración para revelar péptidos asociados con proteínas que se modifican postraduccionalmente por fosforilación, mediante la búsqueda de pérdidas de espectros MS correspondientes de un grupo fosfato (m / z = 79.97).
       2. Encuentre los sitios de aminoácidos ocupados por fosfato (es decir, serina, treonina o tirosina) por las alteraciones esperadas en sus patrones de fragmentación de MS2.
       3. Agregue otras modificaciones postraduccionales de proteínas de interés rutinario de la misma manera al nodo HT de Sequest en este punto, por ejemplo, metilación, acetilación, miristilación, si se conoce la pérdida de masa exacta de los grupos relacionados. Del mismo modo, amplíe la búsqueda de los sitios de fosforilación a otros aminoácidos reportados con menos frecuencia, por ejemplo, histidina.
          NOTA: Los nodos Spectrum Files RC y Sequest HT del árbol de flujo de trabajo para el paso de procesamiento son los únicos dos que requieren que se ajusten los parámetros.
    4. Deje el resto como su configuración predeterminada, ya que el fabricante ya ha optimizado para producir la mayor cantidad de identificaciones de proteínas designadas de interés. Del mismo modo, esto se aplica a todos los demás nodos del árbol de flujo de trabajo.
    5. Asegúrese de que los nodos Percolator e IMP-ptmRS estén incluidos al final del árbol de flujo de trabajo.
       NOTA: Percolator utiliza un ajuste reiterativo para refinar en gran medida los resultados finales. IMP-ptmRS es esencial para informar la identificación adecuada y la localización del sitio de todas las modificaciones postraduccionales de las proteínas, incluida la fosforilación.
15. Vuelve a la pestaña Flujos de trabajo y haz clic en Editar que se encuentra junto al encabezado Paso de consenso del cuadro Análisis ubicado en la parte superior derecha. Esto mostrará el diagrama de árbol del flujo de trabajo para el paso de consenso.
16. Haga clic en Abrir común y en la carpeta ConsensusWF seleccione el archivo de flujo de trabajo de consenso que producirá el formato de salida deseado para los resultados del perfil de composición de proteínas (proteoma) (Figura 4B).
    NOTA: Se abrirá un diagrama de pasos de consenso que contiene nodos editables en el cuadro Árbol de flujo de trabajo . El diagrama utilizado para procesar los datos se genera mediante la modificación del flujo de trabajo de consenso básico, donde se agregaron nodos en línea Feature Mapper y Precursor Ions Quantifier como una rama del nodo inicial de archivos MSF , para facilitar la cuantificación de las abundancias relativas de proteínas. Si bien todos los nodos del flujo de trabajo ya contienen parámetros optimizados establecidos por el fabricante, hay algunos que contienen entradas muy importantes para verificar la selección adecuada de las que se describen a continuación.
17. En el diagrama de árbol de flujo de trabajo, haga clic en y abra el nodo Cuantificador de iones precursores . Este es el nodo que es esencial para cuantificar las abundancias relativas de cada proteína identificada.
    1. En la categoría Configuración de cuantificación general , busque y seleccione en el parámetro Péptidos para usar la opción Único + Maquinilla de afeitar .
       NOTA: Los péptidos únicos son aquellos que contienen secuencias de aminoácidos que son exclusivas de una sola proteína; y, por lo tanto, se utilizan para determinar específicamente su cantidad en función de las intensidades de la señal de MS. Los péptidos de navaja son aquellos compartidos entre grupos de proteínas; y por lo tanto, se utilizan para poner de acuerdo las abundancias relativas calculadas.
    2. En la categoría Normalización y escalado , cambie los parámetros Modo de normalización y Modo de escalado a la opción Ninguno , ya que este tipo de ajuste está demasiado restringido para una aplicación confiable en todo el proteoma.
       NOTA: Estos ajustes solo se activan cuando se desea normalizar las abundancias relativas calculadas de proteínas seleccionadas de interés contra aquellas que son intrínsecas estables a la célula, por ejemplo, genes de mantenimiento, y luego expresar los valores resultantes como una proporción escalada.
    3. A continuación, haga clic y abra el nodo Filtro de péptidos y proteínas y, en la categoría Filtros de péptidos , cambie los parámetros PSM Confianza de péptidos al menos y Mantener una confianza más baja a las opciones Alto y Falso , respectivamente. Esto establece las coincidencias de péptidos utilizadas para realizar las identificaciones de proteínas en el mayor nivel de importancia de ajuste (es decir, ≥ 95%).
       NOTA: Alternativamente, el primer parámetro se puede establecer en Medio para relajar la rigurosidad de las coincidencias peptídicas y, por lo tanto, aumentar en gran medida la producción de aciertos de proteínas; Pero esto, por el contrario, conduce a un riesgo muy alto de generar muchas identificaciones falsas. Del mismo modo, nunca debería darse el caso de que se utilice un valor "Bajo" como una opción aceptable para ambos parámetros.
    4. Estos son los únicos nodos del paso de consenso que necesitan ajustar los parámetros, deje el resto como si usara su configuración predeterminada.
       NOTA: En general, el flujo de trabajo del paso de consenso maneja todo el análisis post-hoc, es decir, la determinación de las abundancias relativas de proteínas, las confidencias de identificación (es decir, las tasas de descubrimiento falso y las puntuaciones de coincidencia espectral de péptidos) y la cobertura de péptidos mapeados. Las estadísticas de resultados y las distribuciones de datos también se proporcionan como tablas finales.
18. Una vez que los flujos de trabajo de los pasos de procesamiento y consenso anteriores estén en su lugar, guarde todo el estudio y luego haga clic en el icono Ejecutar (engranajes) ubicado en la parte superior del cuadro Análisis . Si se procesan varios archivos de datos MS sin procesar a la vez, antes de iniciar la ejecución del procesamiento, haga clic y marque el icono Por archivo cercano (cuadrado).
    NOTA: El procesamiento de un archivo de datos sin procesar de MS en un archivo de resultados de proteoma total generalmente toma de 20 a 40 minutos, pero puede producir una lista actualizada de muchos miles de identificaciones de proteínas que van desde coincidencias de confianza baja, media a alta (es decir, con una ponderación hacia aciertos altos), junto con las modificaciones de fosfato que están presentes dentro de cada entidad (Figura 4C). Los principales parámetros de salida de resultados para las proteínas identificadas son FDR (confianza), Maestro (si se revisó la entrada del archivo / biblioteca FASTA), # de acceso, Descripción, % de cobertura, Cobertura de secuencia, Coincidencias espectrales de péptidos (p. ej., número de péptidos únicos), Características físicas (p. ej., MW en kDa), Abundancias relativas y Modificaciones (es decir, grupos de fosforilación).
    1. Ordene en columna los resultados del proteoma total en orden ascendente o descendente o completamente filtrados, utilizando el icono de embudo en la barra de herramientas (Figura 4C), de acuerdo con los intereses de investigación, por ejemplo, muestre solo aquellos con una identificación de alta confianza (proteína FDR) o un alto grado de coincidencia de péptidos (por ejemplo, por % de cobertura y / o número de únicos encontrados).
    2. Si se desea específicamente información de modificación postraduccional, filtre las proteínas identificadas que tienen fosforilación para su posterior análisis.
    3. Guarde los resultados filtrados, sin un cambio de nombre de archivo, ya que se pueden restaurar a la salida original simplemente eliminando los filtros aplicados y actualizando la ventana.

Resultados

Visualización de los resultados del proteoma total mediante el procesamiento opcional en gráficos volcánicos
Los resultados totales del proteoma para cada muestra se pueden buscar fácilmente por accesión # o descripción de proteínas específicas de interés para la investigación y las abundancias relativas asociadas se promedian y luego se comparan entre los grupos de tratamiento para detectar diferencias significativas (por ejemplo, como por valores p derivados de la prueba t). Alternativamente, puede ...

Discusión

El método anterior utilizó tejidos que se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido para detener inmediatamente toda actividad biológica antes de transferirlos a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo. Una vez que se recolectaron todas las muestras, se produjo la homogeneización del tejido. Durante la homogeneización, es fundamental mantener fríos todos los tejidos y herramientas para evitar la reactivación o degradación de las proteínas. Además, durante la extracción inicial de p...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de ensayo de proteínas de 660 nm	Pierce / Thermo Scientific	22662	Para que el BCA determine las concentraciones de proteínas de las muestras, contiene el reactivo de ensayo de proteínas Pierce de 660 nm y los estándares de ensayo de proteínas prediluidas
Acetonitrilo, grado Optima LC/MS	Thermo Fisher Scientific	Modelo 047138.K2	Acetonitrilo ultrapuro utilizado para cromatografía líquida/espectrometría de masas
Sello de placa de papel de aluminio	Beckman Coulter	538619	Sello utilizado durante el desarrollo de la placa de ensayo de proteínas
BioTek Synergy Neo2 Lector multimodo / Espectrómetro UV-Vis	Agilent	https://www.agilent.com/en/product/microplate-instrumentation/microplate-readers/multimode-microplate-readers/biotek-synergy-neo2-hybrid-multimode-reader-1623195	Instrumento de lector de placas de ensayo / espectrofotómetro utilizado para completar lecturas de absorbancia de 660 nm para determinar las concentraciones de proteínas
Solución de lavado de instrumentos ChromaCare LC-MS	Thermo Fisher Scientific	T111101000	Solución que contiene 25% de acetonitrilo, isopropranol, metanol y uso de agua para ayudar a limpiar el sistema de LC después de analizar las muestras
CK28 Tubo Precellys	Bertin Corp / Tecnologías	P000911LYSK0A.0	Los tejidos homogeneizados se colocan en estos tubos para la lisis tisular y el aislamiento de proteínas utilizando el instrumento Precellyis. Estos son los tubos utilizados por nuestro laboratorio denominados en el protocolo como "tubos homogeneizadores".
Criopodo	Brooks / Azenta Ciencias de la Vida	https://www.azenta.com/products/cryopod-carrier	Recipiente utilizado para contener nitrógeno líquido para enfriar el mortero durante la homogeneización tisuse
Kit de preparación de muestras EasyPep Mini MS	Thermo Fisher Scientific	A40006	Un kit puede procesar 20 muestras, el contenido incluye la solución de lisis para la extracción de proteínas, la nucleasa universal suplementada en la solución de extracción y los refrigerantes necesarios para los pasos 1.4 y 1.5
Columna EASY-Spray C18 LC (15 cm L, 50 µ m Dia, y 2 µ m tamaño de partícula)	Thermo Fisher Scientific	ES901	Columna LC de electrospray utilizada para la separación de péptidos antes de la detección de MS
Solución de calibración FlexMix	Pierce / Thermo Scientific	Referencia A39239	Mezcla de 16 moléculas estándar utilizadas para calibrar la precisión y sensibilidad del detector del instrumento MS antes de las muestras
Ácido fórmico, grado LC/MS	Thermo Fisher Scientific	85178	Ácido fórmico ultrapuro utilizado para satisfacer todas las soluciones y muestras de LC a una concentración final del 0,1% (v/v)
Detener la proteasa y Cóctel inhibidor de fosfotasa de un solo uso (100x)	Thermo Fisher Scientific	78442	Suplementado en el tampón de extracción para evitar la degradación de proteínas y fosfoproteínas en la muestra
Metanol, grado Optima LC/MS	Thermo Fisher Scientific	047192.K2	Metanol ultrapuro utilizado para cromatografía líquida/espectrometría de masas
Mortero de porcelana, 150 mL	Thermo Fisher Scientific	FB961C	Capacidad de 150 ml, utilizada para homogeneizar tejidos de hurones más pequeños (es decir, cerebro)
Mortero de porcelana, 275 mL	Thermo Fisher Scientific	FB961D	Capacidad de 275 ml, utilizada para homogeneizar tejidos de hurones grandes (es decir, hígado)
Mortero de porcelana, 50 mL	Thermo Fisher Scientific	FB961A	Capacidad de 50 ml, utilizada para homogeneizar tejidos de ratón
Mortero de porcelana, 50 mL	Thermo Fisher Scientific	FB961K	Para usar con mortero de 50 ml
Majas de porcelana, 150 mL	Thermo Fisher Scientific	FB961M	Para usar con mortero de 150 ml
Morteros de porcelana, 275 mL	Thermo Fisher Scientific	FB961N	Para usar con mortero de 275 ml
Precellys	Bertin Corp / Tecnologías	https://www.bertin-technologies.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys-evolution-homogenizer/	Instrumento utilizado para homogeneizar muestras de tejido. Se utilizaron los siguientes ajustes: 4500 RPM, 2 x 30 s por ciclo, 30 s de pausa.
Reactivo de ensayo de proteínas	Pierce / Thermo Scientific	22662	Reactivo de ensayo de proteínas utilizado en los pasos 3.4 y ndash; 3.8
Descubridor de proteomas	Thermo Fisher Scientific	CSW0064764	Software bioinformático para el análisis de datos proteómicos/fosfoproteómicos
SureSTART MSCERT tapón de rosca LC viales de inyección (0.02– Capacidad de 1,5 ml)	Thermo Fisher Scientific	6PMCK39TR	Viales de vidrio con tapón de rosca (PTFE, septos precortados) certificados para aplicaciones de alto rendimiento utilizados para contener muestras para inyección en el instrumento LC/MS
Sistema Ultimate 3000 UHPLC / Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS (LC/MS)	Thermo Fisher Scientific	LC: con descuento / MS: FETD2-10002, por pedido especial	Instrumento de cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS) de ultra alto rendimiento utilizado para separar y luego detectar por peso molecular los péptidos en las muestras
Nucleasa universal para lisis celular, 100kU, 400 µ L	Pierce / Thermo Scientific	88702	Se compró nucleasa universal adicional
Vacufuge Plus	Eppendorf	https://www.eppendorf.com/us-en/Products/Centrifugation/Concentrator/Vacufuge-plus-p-PF-25748	Vacufuge utilizado para secar muestras de péptidos antes de la reconstitución.
Agua, grado Optima LC/MS	Thermo Fisher Scientific	047146.K2	Agua ultrapura utilizada para cromatografía líquida/espectrometría de masas