Dilucidación de alteraciones proteómicas específicas de tejidos y plasma en la salud y la enfermedad

Lily S. Neff; James C. DeMar; Nicholas C. Gary; Mital Y. Patel; Burook Misganaw; Aarti Gautam; Rasha Hammamieh

doi:10.3791/67240

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Artículo de método

Dilucidación de alteraciones proteómicas específicas de tejidos y plasma en la salud y la enfermedad

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DOI:

10.3791/67240

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23 de septiembre de 2025

Lily S. Neff^*¹^,² , James C. DeMar^*²^,³ , Nicholas C. Gary²^,⁴ , Mital Y. Patel²^,⁵ , Burook Misganaw²^,⁶ , Aarti Gautam² , Rasha Hammamieh²

¹NRC Fellow, ²Medical Readiness Systems Biology, Walter Reed Army Institute of Research, ³ORISE Fellow, ⁴The Geneva Foundation, ⁵AEOP Fellow, ⁶Culmen International, LLC

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

La proteómica es una evaluación de alto rendimiento de las interacciones, la función, la composición y las estructuras de las proteínas y sus actividades celulares. Aquí, presentamos un protocolo para evaluar los cambios proteómicos totales en varias muestras biológicas, incluido el plasma y los tejidos. La metodología que se informa en este documento es aplicable a todas las muestras biológicas que contienen proteínas.

Resumen

La proteómica es el estudio a gran escala de las proteínas expresadas, centrándose en su estructura, función, interacciones, abundancia y modificaciones postraduccionales dentro de un sistema biológico. Por ejemplo, la fosfoproteómica, un subconjunto vital de la proteómica total, es el estudio de los patrones de fosforilación y las alteraciones en las proteínas. La metodología descrita en este documento ilustra un enfoque de proteómica total para dilucidar alteraciones en los perfiles generales de expresión de proteínas, incluidos los patrones de fosforilación, en el plasma, el cerebro, los pulmones, el bazo y los tejidos hepáticos recolectados de modelos animales de investigación (es decir, hurones y ratones). Esta técnica es aplicable a otros tipos de tejidos, así como a casi cualquier biomuestra que contenga proteínas (por ejemplo, células cultivadas). Después de la disección, los tejidos de interés se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 °C. Luego, los tejidos se homogeneizaron usando un mortero con nitrógeno líquido para preservar la integridad de las proteínas y los cambios de fosforilación. La proteína total se extrajo de los homogeneizados tisulares utilizando un tampón de lisis con una nucleasa universal e inhibidores de proteasa/fosfatasa. Las proteínas extraídas del tejido y el plasma equivalente se convirtieron en péptidos totales mediante digestión controlada de proteasa utilizando un kit de preparación de muestras de espectrómetro de masas comercial. Los péptidos se analizaron directamente mediante cromatografía líquida de ultra alta resolución/espectrometría de masas en tándem Orbitrap-tribrid. Las identidades de las proteínas constituyentes se reconstruyeron a partir de los datos espectrales de masas de péptidos, utilizando software bioinformático de proteómica, emparejados con una biblioteca de secuencias de aminoácidos específica de la especie. Después de esto, el análisis debe incluir criterios de corte estrictos, especialmente utilizando solo identificaciones de proteínas de alta confianza. Se pueden determinar diferencias proteómicas estadísticamente significativas (cambio de >2 veces; p < 0,05) entre los grupos de control y experimentales.

Introducción

La proteómica, como combinación de experimentación con proteomas y análisis de datos, se centra en identificar y cuantificar proteínas, caracterizándolas en función de la composición, la interacción, las modificaciones pretraduccionales y postraduccionales (por ejemplo, fosforilación), la localización subcelular y la estructura en condiciones fisiológicas¹. La proteómica de expresión se ocupa de las comparaciones cuantitativas de proteínas que difieren en condiciones biológicas cambiantes². También tiene una gran importancia en la elaboración de perfiles de un mapa de las vías, redes y s....