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Modelado del glicocálix endotelial después de la neumonectomía en un chip fluídico 3D: un enfoque para fabricar un sistema de órgano en chip basado en el sistema vascular

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DOI:

10.3791/67246

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16 de septiembre de 2025

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1Biomedical Engineering Department, Worcester Polytechnic Institute

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para construir un sistema de órgano en chip (OOC) diseñado para imitar la neumonectomía. Este sistema investiga la posible correlación entre el deterioro del glicocáliz y las complicaciones después de la neumonectomía.

Resumen

El glicocáliz endotelial (GCX), una capa rica en carbohidratos que recubre la superficie luminal de las células endoteliales, desempeña un papel fundamental en la regulación de las respuestas celulares a los estímulos. Está compuesto por proteínas transmembrana que sirven como mecanotransductores para las respuestas celulares. Si bien mantiene naturalmente su estructura y estabilidad en condiciones homeostáticas, la exposición a un alto esfuerzo cortante puede inducir daños con numerosas consecuencias. Se han explorado los efectos generales del esfuerzo cortante en las células endoteliales, pero no se ha estudiado bien el alcance y el impacto del estrés cortante en los sistemas vasculares, específicamente después de la neumonectomía. Para investigar esto, se llevó a cabo un enfoque integral, que incluyó la creación de un modelo CAD de vasculatura pulmonar antes y después de la neumonectomía. Utilizando la simulación computacional de fluidos, se identificaron y replicaron regiones clave de esfuerzo y presión de cizallamiento elevadas en un sistema de órgano en chip (OOC). Las células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HLMVEC) se sembraron en un molde con la forma de las secciones seleccionadas para caracterizar los efectos del esfuerzo cortante elevado in vitro. Después de la experimentación, los HLMVEC se inmunotiñeron para evaluar cualitativamente la salud de GCX bajo tensiones normales y aumentadas inducidas por la neumonectomía. La integración del modelado computacional y el análisis experimental mejora nuestra comprensión de cómo los cambios en el esfuerzo cortante afectan a GCX, aclarando sus efectos sobre la función vascular y las complicaciones posquirúrgicas.

Introducción

Una neumonectomía es una intervención quirúrgica invasiva y de alto riesgo que se realiza para extraer el pulmón derecho o izquierdo1. Este procedimiento se utiliza típicamente como una opción de tratamiento para diversas dolencias graves, como cáncer de pulmón, tuberculosis pulmonary lesiones pulmonares traumáticas. Si bien el procedimiento es prometedor, presenta riesgos significativos, resaltados por el aumento de las tasas de complicaciones postoperatorias que van desde arritmias hasta edemas pulmonares1.

Las neumonectomías tienen un profundo impacto en la dinámica cardiovascular al dirigir todo el gasto cardíaco del corazón hacia el pulmón restante3. Se sabe que esta redirección del flujo sanguíneo aumenta la presión y las tensiones de cizallamiento dentro de la vasculatura pulmonar restante4. Con estas grandes alteraciones en los patrones de flujo sanguíneo, el glicocálix endotelial (GCX) juega un papel fundamental en la detección de estos cambios en los patrones de flujo sanguíneo5.

El GCX es una capa similar a un gel que regula las actividades bioquímicas en respuesta a los cambios en su entorno 6,7. Se ha demostrado que su expresión aumenta con la exposición prolongada al flujo uniforme y disminuye con la exposición al flujo perturbado en comparación con el cultivo estático 8,9. El GCX exhibe un espesor variable que varía de 0,1 a 1 μm en toda la vasculatura y funciona como una capa de mecanotransducción esencial que recubre las células endoteliales de los vasos sanguíneos10. La red está compuesta por una densa capa de azúcares, lípidos y proteínas, como se muestra en la Figura 1. Estos azúcares se unen para formar glicanos, que pueden existir libremente en el torrente sanguíneo o unidos a proteínas o lípidos, lo que da como resultado la formación de proteoglicanos, glicoproteínas o glicolípidos 7,11. Los proteoglicanos están compuestos por cadenas de glicosaminoglicanos (GAG), que se unen a la membrana celular a través de proteínas o receptores plasmáticos. Estos GAG incluyen sulfato de heparán (HS), ácido hialurónico (HA), sulfato de condroitina (CS), sulfato de dermatán y sulfato de queratán12. El sulfato de heparán es el GAG predominante, que representa más del 50% del total de GAG que se encuentran en el GCX. Estas cadenas laterales pueden unirse a proteínas centrales incrustadas, que incluyen glipicanos (anclados por glicosilfosfatidilinositol) y sindecanos (con un dominio que abarca la membrana), junto con CD44 (un receptor de adhesión superficial). Los complejos descritos anteriormente juegan un papel crucial en la regulación de los factores de crecimiento, las reacciones antiinflamatorias, la facilitación de la dilatación de los vasos y el control de la permeabilidad vascular13.

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Figura 1: Diagrama de componentes de GCX. Esquema que representa los componentes del glicocálix endotelial. Este esquema muestra el glicocáliz apical, que se encuentra en la luz del vaso, mostrando sus proteoglicanos y glicoproteínas unidos a la membrana. Creado con BioRender.com Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aunque la conexión precisa entre las neumonectomías y el daño de GCX no está bien estudiada, existe una correlación plausible entre los patrones de flujo sanguíneo alterados inducidos por las neumonectomías y la integridad del GCX. Se sabe que la alteración del flujo sanguíneo en la vasculatura inflige daño al GCX6. Planteamos la hipótesis de que el aumento del flujo alterado y los cambios en el esfuerzo cortante en la vasculatura restante después de una neumonectomía pueden infligir daño al GCX con el tiempo. Este deterioro acelerado puede catalizar complicaciones y morbilidades postoperatorias, aumentando así los riesgos inherentes para la salud general del paciente13.

Este protocolo tuvo como objetivo modelar la vasculatura pulmonar después de la neumonectomía, siguiendo el procedimiento general descrito en la Figura 2. Las simulaciones de fluidos se realizaron en un modelo de diseño asistido por computadora que replicaba la vasculatura pulmonar humana con y sin neumonectomía. Los modelos de neumonectomía se crearon mediante el diseño de vasculatura pulmonar 3D en software de modelado 3D, basado en dimensiones derivadas de tomografías computarizadas y datos de literatura, y luego simplificándolos aún más para simulaciones de flujo en software de dinámica de fluidos computacional (CFD). Las simulaciones identificaron áreas específicas de interés, elegidas por áreas donde el esfuerzo cortante aumentó en los modelos de neumonectomía en comparación con el control. Estas áreas de interés fueron elegidas para replicar para construir un modelo in vitro . El modelo in vitro utilizó un diseño de cámara fluídica para simular múltiples secciones de vasculatura con geometría normal y geometría de neumonectomía para simular la diferencia en las condiciones de flujo.

Las células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HLMVEC) se cultivaron en sustratos de polidimetilsiloxano (PDMS) recubiertos de fibronectina, con forma de imitar una región de bifurcación seleccionada. Los medios de cultivo de células endoteliales microvasculares se perfundieron a través del sistema utilizando una bomba peristáltica. Finalmente, las células y GCX se fijaron, se inmunotiñeron con un anticuerpo de tinción GCX y se visualizaron con un microscopio fluorescente para evaluar su estado después de la exposición al flujo de fluido. En la Tabla 1 se puede encontrar una línea de tiempo general del protocolo.

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Figura 2: Secuencia de desarrollo de OOC. Secuencia de desarrollo de un nuevo sistema OOC para estudiar los efectos de la neumonectomía pulmonar (1) tomografía computarizada generada de la vasculatura pulmonar humana. (2) Geometría de tomografía computarizada utilizada para identificar regiones de interés para el modelo CAD 3D. (3) Simulaciones de flujo de fluidos para determinar geometrías de interés para el modelo in vitro . (4) Molde PDMS modelado que contiene áreas de interés de los resultados de la simulación (5) Molde insertado en una caja acrílica para fijar el molde para la perfusión (6) Configuración completa de la cámara de flujo (7) Configuración completa de la cámara de flujo transferida a la incubadora (8) Imágenes fluorescentes y de campo claro tomadas después de la exposición a la tensión de corte. Creado con BioRender.com Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Cronograma general del protocolo. General Secuencia de realización de pasos dentro del protocolo con duración media (h) de cada paso. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Protocolo

Este estudio utilizó datos de imágenes de tomografía computarizada (TC) de la literatura previa14 que se recopilaron de acuerdo con las normas éticas institucionales y federales. Todos los datos de imágenes a los que se hizo referencia contaron con el consentimiento informado de los participantes, luego de la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB) para garantizar la protección de los derechos y la privacidad de los participantes.

1. Modelado de la vasculatura pulmonar en software CAD

  1. Investigar las geometrías fisiológicas de los vasos primarios a modelar.
  2. Utilice imágenes de TC del paciente de los vasos que se van a modelar para elegir geometrías específicas para replicar, como se muestra en la Figura 2.
    NOTA: Para este protocolo, se utilizaron tomografías computarizadas de pulmón de condición clínica de la literatura previa14. Este protocolo también permite el uso de cualquier dato de tomografía computarizada para generar modelos in vitro .
    1. Abra un visor DICOM e importe las imágenes CT. Navegue por los cortes para identificar los recipientes de interés. Guarde las imágenes relevantes para su posterior análisis.
      NOTA: El vaso replicado para este protocolo fue la vasculatura pulmonar, ya que la aplicación de este protocolo es modelar el glicocálix endotelial en condiciones sanas y posteriores a la neumonectomía. Se pueden utilizar otras ubicaciones para diferentes aplicaciones.
  3. Con ImageJ FIJI v1.54f15, mida los diámetros de los vasos a partir de imágenes de TC o valores de la literatura.
    1. Abrir ImageJ FIJI e Importar las imágenes CT guardadas: seleccione Archivo > Abrir.
    2. Seleccione la herramienta Línea de la barra de herramientas para dibujar una línea que abarque la longitud de la barra de escala en la imagen CT.
    3. A continuación, seleccione Analizar > Establecer escala. Introduzca la distancia conocida (por ejemplo, si la barra de escala de la imagen es de 10 mm, introduzca 10 como distancia conocida). Ingrese la unidad de longitud (por ejemplo, mm). Haga clic en Aceptar.
  4. Utilice la herramienta de línea para medir diámetros. Para hacerlo, seleccione la herramienta Línea de la barra de herramientas y dibuje una línea que abarque el diámetro del recipiente. A continuación, seleccione Analizar > medir para obtener el valor del diámetro.
  5. Repita los pasos 1.3 y 1.4 para todos los recipientes de interés y registre las mediciones.
  6. Compile las mediciones de los recipientes en tipos de segmentos para facilitar el modelado.
    1. Cree una hoja de cálculo para categorizar las medidas de los vasos y etiquete cada fila con el nombre del vaso, la medida y el tipo de segmento (por ejemplo, arteria, vena).
  7. Cree una tabla de referencia para las longitudes y diámetros de los segmentos vasculares según la literatura y las mediciones de radiografía.
  8. Genere un modelo 3D utilizando software de modelado 3D para replicar la geometría y las dimensiones de las imágenes de TC.
    1. Abra el software y cree un nuevo archivo de pieza: seleccione Archivo > Nueva pieza > y seleccione Boceto > Crear boceto y dibuje el perfil utilizando las cotas de ImageJ.
    2. Utilice barridos de superficie y solevación para geometría 3D: para barridos, seleccione Entidades > Saliente/Base de barrido. Para recubrimientos, seleccione Operaciones > Saliente/Base solevado.
    3. Refine el modelo para que coincida con las medidas exactas.
  9. Identificar las variaciones del modelo que se desarrollarán, como un modelo de control y un modelo de neumonectomía.
    1. Describa las diferentes afecciones (p. ej., neumonectomía normal vs. neumonectomía) y enumere los cambios estructurales necesarios para cada variación.
  10. Duplique el modelo original para modificarlo y crear los modelos experimentales de acuerdo con sus parámetros (es decir, neumonectomía derecha e izquierda).
    1. Guarde el modelo original y, a continuación, seleccione Archivo > Guardar como copia para crear copias para cada condición experimental.
    2. Modifique cada copia de acuerdo con los parámetros definidos (por ejemplo, neumonectomía derecha e izquierda).
  11. Convierta el modelo de un archivo de pieza a un archivo Parasolid para simulaciones de dinámica de fluidos computacional (CFD).
    1. Seleccione Archivo > Guardar como. Elija Parasolid (*.x_t) en el menú desplegable de tipo de archivo y, a continuación, guarde el archivo en el directorio deseado.

2. Simulación de flujo de fluidos

NOTA: Este paso es útil para localizar regiones de esfuerzo cortante modificado después de la neumonectomía para seleccionar la geometría vascular que se replicará para el sistema in vitro . Además, la licencia de software debe ser compatible con el módulo de importación.

  1. Establezca un nuevo estudio de flujo laminar en estado estacionario.
    1. Seleccione Asistente para modelos > 3D (dimensión espacial) > flujo de fluido > flujo monofásico > flujo laminar (spf) > seleccione Agregar para agregar la interfaz de física de flujo laminar > seleccione Estudiar > elija Estacionario en Estudio general > seleccione Listo.
  2. Agregue geometría desde el modelo CAD.
    1. Importar archivo Parasolid. Seleccione Caras de tapa y, en la ventana gráfica, seleccione la circunferencia de la pared interior del recipiente en cada entrada y salida abiertas. Estos serán los bordes delimitadores de las caras de la tapa. Seleccione Formar unión y Compilar todo.
    2. Seleccione Quitar detalles y asegúrese de que todas las opciones estén seleccionadas en Detalles para quitar y, a continuación, seleccione Compilar todo para eliminar la geometría innecesaria.
  3. Creación de la malla 1 (pared del vaso mallado + dominio de fluido mallado).
    1. Establezca el tamaño en predefinido: extra fino, calibre para dinámica de fluidos.
    2. Establezca el Tamaño 1 en predefinido: extrafino, calibrar para dinámica de fluidos, para Selección de entidad geométrica, especifique Límite y Manual. En la ventana Gráficos, seleccione todas las caras exteriores visibles del dominio de la pared del recipiente, incluida la cara en forma de anillo alrededor de la cara del capuchón. No seleccione las caras de la tapa en la entrada y las salidas.
      NOTA: Seleccione la cara de la tapa al final de la sección extirpada a la derecha e izquierda de los modelos de neumonectomía, ya que se consideran límites geométricos después de una neumonectomía.
    3. En Refinamiento de esquinas, seleccione Dominio y manual. En la ventana gráfica, seleccione [Dominio] 1 (pared del recipiente) y [Dominio] 2 (fluido).
    4. En Selección de contornos, asegúrese de que los contornos sean los mismos que se especifican en la "Selección de entidades geométricas" de "Tamaño 1".
    5. En Tetraédrico libre 1, seleccione Restante para el nivel de entidad geométrica en Selección de dominio.
    6. En Capas de contorno 1 y Selección de entidad geométrica, especifique Dominio y seleccione Manual en la ventana gráfica [Dominio] 1 y [Dominio] 2. Las propiedades de la capa de contorno serán la misma selección especificada en Tamaño 1.
    7. Construya la malla seleccionando Construir todo en Malla 1.
  4. Creación de la malla 2 (solo dominio fluido en malla).
    1. Haga clic con el botón derecho en Malla 1, seleccione Importar para crear "Malla 2" y elimine Importar 2.
    2. En Importar 1, seleccione Secuencia de mallado para seleccionar automáticamente Malla 1. Asegúrese de que Compilar malla de origen automáticamente, Importar elementos de dominio e Importar dominios sin malla estén activados y, a continuación, seleccione Importar. Todos los ajustes definidos en la malla 1 se transferirán a la malla 2.
    3. Haga clic con el botón derecho en Malla 2 y seleccione Eliminar entidades. Para Eliminar entidades 1, en Selección de entidad geométrica , seleccione Dominio, seleccione Manual, en la ventana Gráficos, seleccione [Dominio] 1 (pared del recipiente) y, a continuación, seleccione Construir todo para dejar solo la geometría del fluido, ya que la superficie de la malla del dominio del fluido estará en la interfaz entre el flujo de fluido y la pared interior de los recipientes.
  5. Agregar material de flujo: Cree un nuevo material utilizando las propiedades de la sangre de la literatura. Haga clic con el botón derecho en Materiales y seleccione Material en blanco. Seleccione Dominio en la selección de nivel de entidad geométrica, seleccione Todos los dominios. Seleccione No sólido Para Tipo de material, agregue las propiedades del material de la sangre, incluida la viscosidad y la densidad.
  6. Configure las condiciones y parámetros de contorno del estudio de flujo laminar.
    1. Seleccione Flujo laminar (spf), en Selección de dominio, seleccione Todos los dominios. Solo se mostrará [Dominio] 1. El dominio 1 en este caso es la geometría del fluido, no la pared del vaso. Propiedades del fluido 1 se llena automáticamente a partir del material definido en el paso 5.
    2. Establezca los valores iniciales 1 presión a presión arterial fisiológica. Establezca la condición de contorno para Muro 1 en antideslizante.
    3. Seleccione el sumidero 1 en la ventana gráfica y establezca la condición de contorno en Flujo completamente desarrollado. Asegúrese de que la opción Aplicar condición en cada selección inconexa por separado esté marcada.
    4. En Flujo completamente desarrollado, seleccione Caudal e introduzca la velocidad.
    5. Para la salida 1, seleccione todas las salidas en la ventana gráfica y asegúrese de que la condición de contorno esté establecida en Presión.
    6. En Condiciones de presión, seleccione Total e introduzca la presión. Seleccione Promedio y Suprimir reflujo.
  7. Configure y ejecute el estudio.
    1. Para Paso 1: Estacionario en estudio, asegúrese de que la sección Física y variables coincida con el estudio previsto y que el componente 1 de Selección de malla esté configurado como Malla 2. Seleccione Proceso.
  8. Analice los resultados del esfuerzo cortante.
    1. Haga clic con el botón derecho en Presión (spf) y seleccione Duplicar. Cambiar el nombre a Esfuerzo cortante.
    2. En Esfuerzo cortante, seleccione Superficie y cambie el conjunto de datos a Estudio 1/Solución 1 (sol1).
    3. En Expresión, escriba spf.sr*spf.mu establezca unidades en Pa.
      NOTA: Esto significa "velocidad de cizallamiento de flujo monofásico * viscosidad de flujo monofásico".
    4. A continuación, seleccione Trazar y haga clic derecho en Transparencia 1 y seleccione Desactivar.
    5. Haga clic derecho en Esfuerzo cortante y seleccione Volumen para cambiar el conjunto de datos a Estudio 1 / Solución 1 (sol1).
    6. En Expresión, escriba spf.sr*spf.mu y establezca las unidades en Pa.
    7. Seleccione Trazar, haga clic con el botón derecho en Superficie y seleccione Deshabilitar para analizar visualmente el "Volumen 1" para determinar las áreas de interés de los vasos para estudiar en el modelo OOC

3. Preparación de moldes PDMS

  1. Utilizando los resultados de la simulación de fluidos, elija geometrías para el control y la neumonectomía seleccionando áreas que exhiban diferencias significativas en el esfuerzo cortante entre los modelos de control y neumonectomía y repliquételas como moldes negativos en CAD. Las dimensiones de los modelos CAD de vasculatura de control y neumonectomía se muestran en las Figuras 3 y 4.
  2. Además, diseñe tapones para la entrada y salida del molde para evitar fugas durante la siembra celular.
  3. Con una impresora 3D, imprima los moldes y los tapones con filamento PLA.
  4. Obtener los moldes de ácido poliláctico (PLA) que se imprimieron en 3D (control + neumonectomía) (Figura 5A).
  5. Pese 10 partes de base de elastómero de silicona y 1 parte de agente de curado de elastómero de silicona para hacer un total de 30 ml de mezcla (relación masa/masa 10:1) para llenar los moldes hasta un espesor de 3 mm (Figura 5B).
    NOTA: No mezcle soluciones madre durante el proceso de pesaje. Utilice materiales de pesaje separados para cada reactivo.
  6. Vierta la base de elastómero y el agente de curado juntos y mezcle bien
    NOTA: Esto se puede hacer en un bote de pesaje.
  7. Vierta la solución bien mezclada en los moldes (aproximadamente 15 ml para la mitad del molde) (Figura 5C).
  8. Desgasifique el PDMS colocándolo en una cámara de vacío durante 30 a 60 minutos o hasta que no queden burbujas (Figura 5D).
  9. Retire el PDMS de la cámara de vacío y cure a temperatura ambiente durante 48 h.
    NOTA: No se utilizó un horno para el curado debido a la capacidad térmica de los moldes de PLA.
  10. Extraiga el PDMS del molde de PLA.
  11. Enjuague el molde de PLA generosamente con agua desionizada para asegurarse de que no queden impurezas en su superficie para que pueda usarse nuevamente.

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Figura 3: Dibujo CAD 3D de la vasculatura de control. Dimensiones, en mm, del modelo de vasculatura de control en una vista superior y lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Dibujo CAD 3D de la vasculatura de neumonectomía. Dimensiones, en mm, del modelo de vasculatura de neumonectomía en vista superior y lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Creación de moldes PDMS. Creación de moldes PDMS. (A) Moldes de PLA impresos en 3D para experimentos de control (naranja) y neumonectomía (verde). (B) Balanza con materiales de fabricación PDMS. (C) Verter la mezcla de PDMS (base 10:1 + agente de curado) en los moldes impresos en 3D. (D) Desgasificación de PDMS en una cámara de vacío. Creado con BioRender.com Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Cultivo celular y siembra

  1. Utilice la técnica aséptica adecuada de acuerdo con los protocolos de laboratorio locales.
  2. Rocíe con etanol al 70% y lleve todos los materiales y componentes necesarios al gabinete de bioseguridad (BSC) (Figura 6A), incluidas las piezas de PDMS y cuatro piezas de cinta adhesiva de doble cara.
  3. Coloque dos piezas de cinta adhesiva de doble cara en cada placa de cultivo celular (Figura 6B).
  4. Coloque cada mitad de la vasculatura de PDMS en su propia placa de cultivo celular encima de la cinta de doble cara (Figura 6C).
  5. Esterilice aún más todos los componentes mediante la exposición a la luz ultravioleta durante 20 minutos en el BSC.
  6. Descongele la tripsina, los medios de cultivo HLMVEC y 20 μg/ml de fibronectina a 37 °C si es necesario.
  7. Coloque varias gotas de 30 μL de fibronectina de 20 μg/mL a lo largo de la vasculatura del PDMS utilizando una micropipeta. Inclinando el PDMS si es necesario, use una punta de pipeta para cubrir uniformemente el PDMS (Figura 7A).
  8. Incube las piezas de PDMS durante 30 minutos mientras está en el BSC.
  9. Después de la incubación, aspire la solución de fibronectina y deje que las piezas de PDMS se sequen en el BSC (Figura 7B).
  10. Lleve un matraz confluente de células HLMVEC de la incubadora (37 °C, 5% de CO2) al BSC.
  11. Aspirar los medios de cultivo HLMVEC del matraz de cultivo. Enjuague brevemente con tripsina o PBS estéril.
  12. Aspirar el lavado y añadir 3 ml de tripsina al matraz. Incubar a 37 °C, 5% CO2 durante 5 min. Observe las células con un microscopio para confirmar que todas las células se desprenden del matraz.
  13. Agregue 9 ml de medio de cultivo completo HLMVEC para detener la acción de la tripsina.
  14. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 50 ml, luego enjuague el matraz con 10 ml de medio de cultivo HLMVEC para recolectar las células restantes.
  15. Transfiera al tubo de 50 ml. Centrifugar celdas a 220 x g durante 5 min.
  16. Cuando haya terminado, confirme visualmente el gránulo celular en la parte inferior del tubo. Rocíe el tubo con etanol al 70% y llévelo al gabinete de bioseguridad. Aspira el sobrenadante, dejando el gránulo.
  17. Vuelva a suspender suavemente las células en 1 ml de medio de cultivo HLMVEC fresco y cuente las células con un hemocitómetro. Calcule el número total de células usando las ecuaciones a continuación, donde A-H es el número de células contadas por cuadrado del hemocitómetro. Mantenga las células en hielo.
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  18. Lleve la concentración de células a 2 x 106 células/ml con medio de cultivo HLMVEC.
  19. Coloque los tapones impresos en 3D en los extremos de cada mitad de vasculatura para eliminar la fuga de suspensión celular del molde PDMS, como se muestra en la Figura 5 (4 tapones en total, 2 por pieza PDMS) (Figura 7C).
  20. Siembre 300 μL de suspensión celular HLMVEC (600 k células) usando una micropipeta en cada pieza de PDMS (Figura 7D).
  21. Transfiera suavemente las piezas de PDMS que contienen células HLMVEC a la incubadora (37 °C, 5% CO2) durante 1-2 h para que se conecten (Figura 7E).
  22. Inspeccione con un microscopio para confirmar visualmente la conexión exitosa de HLMVEC a los sustratos PDMS.
  23. Devuelva las mitades de la vasculatura del PDMS al BSC.
  24. Retire los cuatro tapones, agregue suficiente medio de cultivo HLMVEC para sumergir las mitades de la vasculatura de PDMS y devuelva las placas de cultivo que contienen las vasculaturas de PDMS a la incubadora (Figura 7F).
  25. 6-10 h después de la siembra, pipetee manualmente los medios de cultivo HLMVEC que rodean el PDMS a la vasculatura para refrescar los medios más cercanos a las células.

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Figura 6: Fijación de moldes PDMS a placas. Pasos básicos para unir la vasculatura de PDMS a placas de cultivo celular. (A) Materiales necesarios para colocar las mitades de vasculatura de PDMS en placas de cultivo. (B) Se colocan dos piezas de cinta adhesiva de doble cara en diagonal en cada placa de cultivo estéril. (C) Mitades de vasculatura de PDMS montadas sobre el adhesivo de doble cara. Creado con BioRender.com Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Siembra de HLMVEC en moldes PDMS. Pasos para la siembra de HLMVEC en la vasculatura del PDMS. (A) Llene la vasculatura 150-300 μL con 20 μg/mL de fibronectina. (B) Aspire el exceso de fibronectina utilizando la técnica de golpeteo basculante. (C) Tape los extremos de la mitad de la vasculatura del PDMS con tapones impresos en 3D. (D) Siembre 500-600K células en medios de 300 μL en cada mitad de vasculatura. (E) Coloque las mitades de PDMS en la incubadora durante 1-2 h para facilitar la unión celular. (F) Cubra las mitades del PDMS con medios y retire los tapones. Creado con BioRender.com Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Montaje y funcionamiento del sistema de flujo

  1. Realice el procedimiento de flujo una vez que las células en las mitades de vasculatura de PDMS sean completamente confluentes, según lo determinado por inspección visual bajo un microscopio.
  2. Calibrar la bomba peristáltica de acuerdo con el protocolo del fabricante antes de realizar un experimento.
  3. Esterilizar en autoclave todos los componentes esterilizables en autoclave, incluidos el tubo de flujo, los conectores del tubo, el depósito de jeringa y el tapón de goma.
  4. Sumerja los bloques acrílicos, los tornillos, los tapones, las piezas de tubería Masterflex L/S 16 de 1 pulgada de largo y la tapa de la placa de Petri de 15 mm en etanol al 70% durante 15 min y el tratamiento UV durante 20 min en un BSC, volteando a la mitad.
  5. Una vez que todos los demás equipos y materiales estén esterilizados, lleve las mitades de la vasculatura del PDMS al BSC.
  6. Aspire el medio HLMVEC de la placa de Petri que contiene las mitades de la vasculatura (Figura 8A, B).
  7. Coloque las mitades de PDMS en los dos bloques de policarbonato, asegurándose de que estén alineadas (Figura 8C).
  8. Aplique sellador de silicona en los extremos de la vasculatura, donde el tubo se unirá a las mitades del PDMS, y coloque el tubo de una pulgada de largo en los dos extremos de la vasculatura inferior (Figura 8D).
  9. Voltee el bloque acrílico superior (que contiene la mitad superior de la vasculatura PDMS) sobre el bloque acrílico inferior (que contiene la mitad inferior de la vasculatura PDMS) (Figura 8E).
  10. Atornille los bloques acrílicos junto con el bloque roscado en la parte inferior y tape los extremos libres de los tubos de una pulgada de largo con los tapones impresos en 3D (Figura 8F).
  11. Retire un tapón e inyecte suavemente 500 μL de medio de cultivo HLMVEC en la vasculatura, inclinándolo para evitar burbujas de aire, luego vuelva a colocar el tapón.
  12. Coloque todo el chip ensamblado en la incubadora para permitir que la silicona se cure durante 1-2 h.
  13. Lleve el chip ensamblado y todos los demás materiales estériles al BSC y conecte todo para configurar el sistema de flujo de acuerdo con la Figura 9. Asegúrese de que el tubo que pasa a través de la bomba peristáltica hasta la entrada de la vasculatura esté conectado al fondo del depósito de la jeringa. Esto permitirá que la gravedad alimente el tubo y reduzca las burbujas de aire en el sistema.
  14. Prepare suavemente el sistema de flujo con medios HLMVEC. Con una pipeta serológica de 50 ml, inyecte 30 ml de medio en la parte superior del depósito de la jeringa (Figura 10B). Haga funcionar la bomba peristáltica a un caudal bajo para llenar la tubería. Continúe agregando medios al depósito hasta que el sistema esté completamente cebado y se eliminen todas las burbujas.
    NOTA: Las burbujas de aire pueden cortar las celdas durante el experimento de flujo.
  15. Conecte el tubo a la entrada del depósito (desde la salida del molde vascular) usando un accesorio conectado a un tapón de goma colocado en la parte superior del depósito (Figura 10C).
  16. Separe el sistema de flujo de la bomba peristáltica y colóquelo en la bandeja de metal. Transportar suavemente toda la configuración desde el BSC hasta la incubadora (37 °C, 5% CO2). Alimente el tubo a la bomba peristáltica a través de la parte posterior de la incubadora.
  17. Vuelva a conectar la bomba peristáltica y ajústela al caudal deseado para emular el caudal sanguíneo a través del modelo vascular.
  18. Encienda la bomba y asegúrese de que no haya fugas. Deje que el sistema funcione durante 24 h o la duración deseada. Verifique si hay fugas periódicamente.

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Figura 8: Construcción del chip de flujo. Construyendo el chip de flujo. (A) Aspire el medio de la placa de cultivo celular. (B) PDMS se reduce a la mitad después de que se ha aspirado el medio. (C) Retire las mitades de PDMS de la placa con otros materiales necesarios para construir el chip (tapón, filtro de jeringa, piezas de tubo de 1/2 ", sellador de silicona, tornillos 10x y bloques acrílicos). (D) Coloque las mitades de PDMS en los bloques acrílicos y aplique sellador de silicona en las ubicaciones marcadas en rojo. (E) Coloque el tubo en los recortes respectivos. (F) Conecte las mitades de la cámara de flujo y conecte el tapón y el filtro de jeringa. Creado con BioRender.com Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-protocol-8
Figura 9: Configuración del sistema de flujo. Configuración del sistema de flujo. El sistema de flujo completo se construye utilizando tuberías, conectores de tuberías, una bomba peristáltica, un depósito de jeringa, un soporte y el chip de flujo. Creado con BioRender.com Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-protocol-9
Figura 10: Cebado del sistema de flujo. Cebado del sistema de flujo con medios. (A) Configuración simple del sistema de flujo sin medios. (B) El tapón de goma retirado del depósito de la jeringa y el medio se agrega continuamente hasta que se llena el tubo y hay 20-30 ml de exceso de medio en el depósito. (C) Sistema de flujo cebado con medios HLMVEC. Creado con BioRender.com Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Fijación y tinción

  1. Lave cada mitad de la vasculatura de PDMS en PBS durante 5 minutos. Agregue lo suficiente para sumergir toda la sección vascular.
  2. Aspire el PBS de la vasculatura inclinando la placa y permitiendo que el PBS se escurra, luego aspire al vacío la escorrentía.
  3. Agregue 600 μL de paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS a cada mitad vascular e incube a temperatura ambiente (RT) durante 20 minutos.
  4. Aspire la solución de PFA en un contenedor de residuos adecuado utilizando el método del paso 2.
  5. Lave las células fijas 3 veces en PBS durante 5 minutos cada una utilizando el procedimiento del paso 2.
    NOTA: Deseche cada uno de estos lavados en un contenedor de desechos adecuado para formaldehído.
  6. Tape los extremos de las mitades de vasculatura PDMS con los tapones limpios impresos en 3D.
  7. Prepare albúmina sérica bovina (BSA) al 3% en PBS para bloquear.
  8. Llene las mitades vasculares con 600 μL de solución bloqueante e incube durante 30 min a temperatura ambiente.
  9. Retire los tapones y aspire la solución de bloqueo.
  10. Prepare una dilución 1:200 de lectina aglutinina de germen de trigo (WGA) con una biotina conjugada (anticuerpo primario) en una solución de BSA al 3% para teñir GCX9.
  11. Tapones de retorno para taponar los extremos de la vasculatura y agregar 500 μL de solución de anticuerpos primarios a cada mitad vascular.
  12. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 1 h.
  13. Aspire el anticuerpo primario suavemente siguiendo la técnica utilizada anteriormente.
  14. Lavar 3 veces con PBS durante 5 min cada una.
  15. Preparar una dilución 1:500 del conjugado de estreptavidina WGA (anticuerpo secundario) en una solución de BSA al 3%.
  16. Tapones de retorno para taponar los extremos de la vasculatura y agregar 500 μL de solución de anticuerpos secundarios a cada mitad vascular.
  17. Repita los pasos 6.12-6.14.
  18. Agregue medio de montaje DAPI a la superficie vascular dispensando gotas de 30 μL a intervalos para llenar completamente la vasculatura.
  19. Coloque cubreobjetos de vidrio en el PDMS para cubrir los canales vasculares.
  20. Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.
  21. Cubra las placas con papel de aluminio y guárdelas a 4 °C hasta obtener imágenes.

7. Imágenes

  1. Encienda el microscopio y abra la aplicación de visualización en la computadora conectada.
  2. Abra el microscopio y levante la luz. Coloque la plataforma adecuada para que quepan las muestras (soporte versátil para placas de Petri).
  3. Coloque una muestra en el soporte del plato dentro del microscopio con el área de interés centrada sobre el objetivo.
  4. Baje la luz y cierre la tapa del microscopio.
  5. En el software del microscopio, seleccione la opción Capturar imagen fija .
  6. Elija el tipo de muestra, use versátil.
  7. Seleccione el objetivo apropiado en la sección de lentes para una mejor visualización.
  8. En el software del microscopio, ajuste la posición del objetivo para alinearla con una región de interés (ROI).
  9. Seleccione el enfoque automático y las celdas deberían enfocarse aproximadamente.
  10. Ajuste manualmente el enfoque para aclarar completamente la imagen.
  11. Ajuste el brillo y la exposición para visualizar las celdas con mayor claridad.
  12. Active el multicolor y el color en el software.
  13. En la configuración de CH , active CH1 Floor DAPI y CH2 Floor GFP.
  14. Ajuste el brillo de cada canal por separado para visualizar claramente las imágenes.
  15. Seleccione Z-Stack en el software del microscopio.
  16. Ajuste el enfoque al plano más alto de la imagen y seleccione establecer para establecer el límite superior
  17. Ajuste el enfoque al plano más bajo de la imagen y seleccione establecer para establecer el límite inferior
  18. Seleccione un grosor de corte como desee y presione Iniciar captura para tomar la imagen.
    NOTA: Estas imágenes también se enviarán al software de análisis de microscopio para su posterior modificación.

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Resultados

Los resultados del estudio de estado estacionario de flujo laminar de simulación de fluidos mostraron un aumento en el esfuerzo cortante en ciertas bifurcaciones en los modelos de neumonectomía en comparación con el modelo de control, que se muestra en la Figura 11. Visualizadas en el paso 2.8 del protocolo, las áreas rojas denotan áreas de alto esfuerzo cortante, mientras que las áreas azules muestran áreas de bajo esfuerzo cortante.

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Discusión

El modelado vascular es un nuevo campo importante para la exploración. La creación exitosa de un modelo vascular preciso es muy prometedora para avanzar en el campo de la ingeniería de tejidos y el desarrollo de fármacos. Este artículo describe un método novedoso para generar un sistema vascular OOC que se puede utilizar para emular una neumonectomía o cualquier otro sistema vascular o geometría para estudiar un vínculo potencial entre el deterioro de GCX y las complicaciones posteriores...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Los autores desean expresar nuestra más profunda gratitud al Departamento de Ingeniería Biomédica del Instituto Politécnico de Worcester por su apoyo y orientación. Nos gustaría agradecer especialmente a Megan Ouellette, John Martel y Sudish Vengat por sus esfuerzos de colaboración e ideas innovadoras que mejoraron enormemente la calidad y viabilidad de esta investigación. Además, nos gustaría agradecer a Samantha Cocchiaro y Udaya Rattan por sus contribuciones en el laboratorio y su apoyo y asistencia esenciales.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
#8-32 x 3/4 pulg. Tornillo de máquina de cabeza redonda Combo Zincado (paquete de 8)Everbilt204274613-
0,25% EDTA-tripsinaThermoFisher Scientific25200056 -
Tubos de centrífuga cónicos estériles de polipropileno de 15 mlThermo Scientific12-565-269-
Plato de 35x10mm, Nunclon DeltaThermo Scientific153066-
Tubos de centrífuga de polipropileno estériles cónicos de 50 mlThermo Scientific12-565-271-
Tapones de goma surtidosMarca de pescador14-132
Matraces tratados con cultivo celular BioLite (25 cm ^ 2)Thermo Scientific12-556-009-
Matraces tratados con cultivo celular BioLite (75 cm ^ 2)Thermo Scientific12-556-010-
COMSOL MultifísicaCOMSOLN/A-
Adhesivo de doble cara 3M16758005-
Cubierta de vidrio científica Epredia Richard-Allan Thermo Scientific22-050-218-
Suero fetal bovinoThermoFisher Scientific A5256701 -
FibronectinaThermoFisher Scientific 33016015 20 μ g/ml de dilución
Baños de agua de control digital Fisherbrand Isotemp: Modelo 210Marca de pescador15-462-10Q-
Jeringa estéril Fisherbrand (60 ml)Marca de pescador14-955-461-
Células endoteliales microvasculares pulmonares humanasSigma Aldrich540-05A -
Microscopio fluorescente Keyence BZX810ClaveN/A-
Kit de elastómetro de silicona Krayden Dow Sylgard 184. Transparente, (1.1LB)Dow4019862-
Lámina de acrílico fundido Marga Cipta de 1/2' de espesor, 48x96'Marga CiptaN/A-
Cabezal de bomba Masterflex L/S Easy-Load IIMasterFlex77200-50
Tubo de bomba de precisión Masterflex L/S, silicona curada con platino, L/S 16; 25 piesMasterFlex96410-16-
Bomba peristáltica estándar Masterflex L/SMasterflex07522-20
Micropipeta 0,2 a 2 μ LMarca de pescadorFBE00002-
Micropipeta de 10 a 100 μ LMarca de pescadorFBE00100-
Micropipeta 100 a 1000 μ LMarca de pescadorFBE01000-
Micropipeta de 5 a 50 μ LMarca de pescadorFBE00050-
Medio de crecimiento de células endoteliales microvasculares (500 ml)Sigma - Aldrich111-500-
Filtros de jeringa estériles NalgeneThermo Scientific725-2520-
Microscopio fluorescente Nikon Eclipse TS-100NikonNI-TS100
Solución salina tamponada con fosfato (DPBS, 10X), fórmula de DulbeccoThermo ScientificJ61917. K3-
Prusament PLA Prusa Galaxy Negro 1kgPrusaPRM-PLA-GLX-1000-
Microscopio híbrido Rebel, vertical e invertido, Discover EchoECO76376-746-
Sellador de siliconaLoctite908570-
SolidWorksDassault SystèmesN/A
Pipetas serológicas desechables de poliestireno estéril con franja de lupa (10 ml)Marca de pescador13-678-11E-
Pipetas serológicas desechables de poliestireno estéril con franja de lupa (25 ml)Marca de pescador13-678-11-
Pipetas serológicas desechables de poliestireno estéril con franja de lupa (50 ml)Marca de pescador13-678-11F-
Pipetas serológicas desechables de poliestireno estéril con franja de lupa (5 ml)Marca de pescador13-678-11D-
Estreptavidina, Alexa Fluor 488 ConjugadoInvitrogenS32354
Estreptavidina, Alexa Fluor 488 ConjugadoInvitrogenS32354-
Depósito de jeringasBD300865
Thermo Scientific Alfa Aesar 1LT Albúmina, bovino, fracción V, 35 % de sol, grado reactivo, libre de ácidos grasos, con azida como conservanteThermo ScientificN12H004-
Conectores de tuberíaMarca de pescador01-000-161-
VECTASHIELD Medio de montaje antidecoloración con DAPIVectashieldH-1200-10-
Incubadora VWR con camisa de agua CO2Avantar 10810-744 -
Anticuerpo biotinilado WGAVectorB-1025-

Referencias

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