Method Article

Análisis de las interacciones teloméricas proteína-ADN utilizando pinzas magnéticas de una sola molécula

DOI:

10.3791/67251

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August 30th, 2024

 ,  , 
1State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Pharmacy, Nankai University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo demuestra el uso de pinzas magnéticas de una sola molécula para estudiar las interacciones entre las proteínas teloméricas de unión al ADN (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] y TRF2) y los telómeros largos extraídos de células humanas. Describe los pasos preparatorios para los telómeros y los factores de unión de repetición telomérica, la ejecución de experimentos de una sola molécula y los métodos de recopilación y análisis de datos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los telómeros, las estructuras protectoras en los extremos de los cromosomas, son cruciales para mantener la longevidad celular y la estabilidad del genoma. Su función adecuada depende de procesos estrictamente regulados de replicación, elongación y respuesta al daño. El complejo shelterina, especialmente el factor de unión repetida a los telómeros 1 (TRF1) y TRF2, desempeña un papel fundamental en la protección de los telómeros y se ha convertido en un objetivo potencial contra el cáncer para el descubrimiento de fármacos. Estas proteínas se unen al motivo repetitivo de ADN telomérico TTAGGG, facilitando la formación de estructuras protectoras y el reclutamiento de otras proteínas teloméricas. Los métodos estructurales y las técnicas de imagen avanzadas han proporcionado información sobre las interacciones teloméricas proteína-ADN, pero el sondeo de los procesos dinámicos requiere enfoques de una sola molécula. Se han empleado herramientas como pinzas magnéticas, pinzas ópticas y microscopía de fuerza atómica (AFM) para estudiar las interacciones teloméricas proteína-ADN, revelando detalles importantes como la distorsión del ADN dependiente de TRF2 y la catálisis de la telomerasa. Sin embargo, la preparación de construcciones de una sola molécula con motivos repetitivos teloméricos sigue siendo una tarea desafiante, lo que podría limitar la amplitud de los estudios que utilizan métodos mecánicos de una sola molécula. Para abordar esto, desarrollamos un método para estudiar las interacciones utilizando ADN telomérico humano de longitud completa con pinzas magnéticas. Este protocolo describe cómo expresar y purificar TRF2, preparar ADN telomérico, configurar ensayos mecánicos de una sola molécula y analizar datos. Esta guía detallada beneficiará a los investigadores en biología de telómeros y descubrimiento de fármacos dirigidos a telómeros.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los telómeros son estructuras protectoras en los extremos de los cromosomas 1,2,3. La erosión de los telómeros durante la división celular conduce a la senescencia celular y al envejecimiento, mientras que la elongación anormal de los telómeros contribuye al cáncer 4,5. Para que los telómeros funcionen correctamente, sus respuestas de replicación, elongación y daño deben estar altamente reguladas 6,7,8. La shelterina, compuesta por seis subunidades, desempeña un papel central en la protección de los telómeros 9,10,11. Una comprensión más profunda de los telómeros proporcionará información valiosa sobre la biología de los telómeros.

TRF1 y TRF2, subunidades centrales de la shelterina, son proteínas de unión telomérica 12,13. Tanto TRF1 como TRF2 se unen al motivo repetitivo de ADN TTAGGG en los telómeros a través de sus dominios Myb14. Forman dímeros a través de sus dominios TRFH compartidos, que les permiten rodear el ADN telomérico bicatenario y reclutar proteínas teloméricas 15,16,17,18,19. TRF2 es particularmente importante para la formación de bucles D y bucles T teloméricos20,21. Debido a su papel crucial en la protección de los telómeros, TRF1 y TRF2 han surgido como posibles dianas farmacológicas contra el cáncer 22,23,24,25.

Se han realizado esfuerzos significativos para investigar las interacciones proteína-ADN en los telómeros. Se han utilizado métodos bioquímicos como el Ensayo de Cambio de Movilidad Electroforética (EMSA) y la Resonancia de Plasmón de Superficie (SPR) para examinar las afinidades de unión20,26. Numerosas estructuras de proteínas de unión telomérica complejadas con ADN han sido dilucidadas mediante criomicroscopía electrónica (crio-EM), cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear (RMN)27,28,29. Las técnicas de imagen de superresolución, como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM), han revelado la formación de bucles T21 dependientes de TRF2. Recientemente, se ha desarrollado la secuenciación de nanoporos para perfilar secuencias teloméricas 4,30,31. Estos conocimientos estructurales han mejorado en gran medida nuestra comprensión de las interacciones teloméricas proteína-ADN. Para explorar más a fondo la dinámica de las interacciones teloméricas proteína-ADN, es esencial el desarrollo de nuevas tecnologías.

Las herramientas de una sola molécula son técnicas poderosas para explorar las interacciones proteína-ADN en los telómeros 32,33,34. Se han empleado métodos mecánicos de una sola molécula, como pinzas magnéticas, pinzas ópticas y AFM, para investigar la distorsión del ADN dependiente de TRF2, revelar el apilamiento columnar mediado por TRF2 de la cromatina telomérica humana y observar la catálisis procesiva de la telomerasa, entre otras aplicaciones 35,36,37,38,39,40. Estos métodos son particularmente útiles para sondear las conformaciones topológicas y la cinética de la asociación y disociación proteína-ADN.

Sin embargo, la preparación de construcciones de una sola molécula con motivos repetitivos teloméricos aún presenta desafíos, lo que limita los estudios que utilizan métodos mecánicos de una sola molécula. Para abordar esta limitación, hemos desarrollado un método mecánico de una sola molécula para estudiar las interacciones globales proteína-ADN en telómeros humanos de longitud completa41. Este método extrae directamente el ADN telomérico de las células humanas, evitando la laboriosa preparación del ADN telomérico artificial. Facilita la investigación de los procesos cinéticos en telómeros nativos largos que abarcan varias kilobases.

En este protocolo, proporcionamos una descripción detallada de los pasos para sondear las interacciones teloméricas proteína-ADN utilizando pinzas magnéticas, una popular herramienta mecánica de una sola molécula 42,43,44. Demostramos cómo expresar y purificar proteínas teloméricas, utilizando TRF2 como ejemplo, y cómo preparar ADN telomérico a partir de células humanas. Además, mostramos cómo configurar un ensayo de una sola molécula en pinzas magnéticas para estudiar las interacciones teloméricas proteína-ADN, y cubrimos el análisis de datos posterior de experimentos de una sola molécula. Este protocolo beneficiará a los investigadores en el campo de la biología de los telómeros y el descubrimiento de fármacos dirigidos a los telómeros.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Materiales y métodos generales

  1. Consulte el archivo de la Tabla de materiales para conocer las sales, productos químicos, antibióticos, enzimas, anticuerpos y materiales de resina utilizados en este protocolo.
  2. Prepare el medio líquido Luria-Bertani (LB), placas de agar LB, tampón HEPES, electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE), solución salina tamponada con fosfato (PBS), tampón Tris-EDTA (TE) de acuerdo con las recetas de los protocolos de puerto de primavera fría 45,46,47,48,49,50,51,52,53.
  3. Adquirir el vector pET28a (Addgene), líneas celulares procariotas y eucariotas (ATCC) a través de fuentes comerciales. Luego, cultivarlos y pasarlos continuamente al laboratorio.
  4. Para grandes volúmenes de líquido, autoclave a 120 °C durante 20 min. Para volúmenes pequeños, utilice un filtro estéril con un tamaño de poro de 0,22 μm.
  5. Ajuste el pH de las soluciones al nivel deseado utilizando HCl o NaOH antes de llevarlas a sus volúmenes finales.
    NOTA: Las pinzas magnéticas se construyen a medida y se ejecutan en un entorno de LabVIEW 2017, mientras que el análisis de datos de una sola molécula se realiza en MATLAB 2017 2,54,55.
  6. Por razones de seguridad, use batas de laboratorio de manga larga, guantes de nitrilo (o guantes hechos de un material que sea impermeable y resistente a la sustancia), anteojos o gafas de seguridad y zapatos cerrados.

2. Expresión proteica y purificación de proteínas teloméricas de unión al ADN

  1. Realizar cultivos celulares e inducir la expresión de proteínas.
    1. Inserte la secuencia codificante para las proteínas teloméricas de unión al ADN (Figura 1A), TRF2 como ejemplo en este caso, en el vector pET28a mediante digestión y ligadura de enzimas, con SUMO empleado como etiqueta de fusión. Inserte entre los sitios de restricción de BamHI y HindIII, produciendo el plásmido de pET28a-SUMO-TRF2 (Figura 1B).
    2. Transforme las células BL21(DE3) con el plásmido pET28a-SUMO-TRF2.
      1. Descongele una alícuota de 50 μL de células BL21(DE3) competentes en hielo.
      2. Añadir 1 μL de ADN del plásmido pET28a-SUMO-TRF2 (que contiene 50 ng de ADN) a las células competentes. Gire suavemente para mezclar sin pipetear hacia arriba y hacia abajo.
        NOTA: No haga vórtice.
      3. Incuba la mezcla en hielo durante 30 min.
      4. Para el choque térmico, caliente la mezcla de celdas a 42 °C durante exactamente 45 s en un baño de agua. Vuelva a congelar inmediatamente las células durante 2 minutos para estabilizar las células transformadas.
      5. Agregue 950 μL de medio LB a temperatura ambiente (RT) a las células para facilitar la recuperación.
      6. Incubar las células transformadas a 37 °C durante 1 h agitando a 220 rpm.
      7. Extienda 100 μL de la mezcla de transformación en una placa de agar LB que contenga 50 μg/mL de kanamicina (85,8 μM).
      8. Incubar las células plateadas durante la noche a 37 °C. Después de la incubación, seleccione colonias distintas para su uso en la inoculación de cultivos iniciadores.
        NOTA: Las colonias en placas se pueden almacenar a 4 °C hasta por 2 semanas.
    3. Recoger una colonia de células BL21(DE3) transformadas y cultivarla en 5 mL de medio LB suplementado con 50 μg/mL de kanamicina (85,8 μM). Incubar durante 18 h a 37 °C con agitación a 220 rpm.
    4. Para aumentar, transfiera 2 mL del cultivo durante la noche a 200 mL de medio LB que contenga 50 μg/mL de kanamicina (85,8 μM). Continúe incubando a 37 °C con agitación a 220 rpm hasta que la densidad óptica a 600 nm (OD 600) alcance 0,6-0,8.
    5. Tome 1 mL del cultivo como muestra de control no inducida.
    6. Inducir el cultivo restante con isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) hasta una concentración final de 1 mM e incubar a 20 °C durante 17 h para promover la expresión de proteínas.
    7. Realice SDS-PAGE utilizando un gel de apilamiento al 5% y un gel de separación al 10%. Cargue muestras con el búfer de carga SDS-PAGE y ejecute SDS-PAGE inicialmente a 100 V durante 30 minutos, seguido de 120 V durante 50 minutos en un tampón de tris-glicina. Teñir con azul de Coomassie para visualizar la expresión de la proteína (ver recetas en la Tabla Suplementaria 1) (Figura 1C).
      NOTA: Consulte Discusión para solucionar problemas si no se observa la expresión.
  2. Purifica la proteína.
    1. Cosechar las células por centrifugación a 4 °C, 8500 x g durante 10 min. Deseche el sobrenadante y lave el pellet en 200 mL de PBS. Centrifugar de nuevo, desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet de la célula en 25 mL de tampón de lisis (20 mM de HEPES, 300 mM de NaCl, 20 mM de imidazol, 10% de glicerol, 0,5 mM de DTT, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo [PMSF]).
      PRECAUCIÓN: El PMSF es corrosivo y tóxico y causa quemaduras. Use ropa protectora adecuada, guantes y protección para los ojos y la cara.
      NOTA: Congele a -80 °C si no se procede inmediatamente.
    2. Agregue 5 μL de 100 mg/mL de lisozima, 5 μL de 1 U/μL de DNasa I y 5 μL de 10 mg/mL de ARNasa A a las células resuspendidas.
    3. Realiza la sonicación en hielo, con ráfagas de 1 s a 250 W seguidas de una pausa de 2 s, durante un total de 30 min.
    4. Centrifugar a 38.000 x g, 4 °C durante 40 min (30-60 min es aceptable) y filtrar el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm.
    5. Prepare 500 mL de tampón de unión a la columna de Ni disolviendo 8,76 g de NaCl (concentración final 300 mM) y 0,68 g de imidazol (concentración final 20 mM) en 20 mM HEPES (pH 8,0). Filtre la solución a través de un filtro de 0,22 μm.
      PRECAUCIÓN: El imidazol es peligroso y puede causar irritación de la piel y los ojos. También puede dañar al feto. Evite el contacto con los ojos, la piel y la ropa. No ingerir ni inhalar. Use equipo de protección personal, incluida la protección facial.
    6. Prepare tampones de elución en columna de Ni (20 mM HEPES (pH 8.0), 300 mM NaCl) con concentraciones crecientes de imidazol (100 mM, 200 mM, 300 mM y 500 mM) para la elución escalonada, asegurando que todos los tampones se filtren adecuadamente.
    7. Cargue el sobrenadante filtrado en la columna de Ni preequilibrada en tampón de unión (20 mM HEPES (pH 8.0),300 mM de NaCl, 20 mM de imidazol). Lavar con tampón de unión y eluir la proteína con el gradiente de imidazol preparado, recogiendo 12 fracciones, cada una con 1 mL (Figura 1C). Combine fracciones con >95% de pureza.
    8. Mida la concentración de la proteína de fusión 6xHis-sumo-TRF2 eluida por A280 en un espectrofotómetro.
    9. Para la proteína utilizada en los ensayos de molécula única, agregue sumo proteasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (normalmente 0,125 U de proteasa por 2 μg de proteína de fusión) y permita la digestión durante la noche a 4 °C.
    10. Después del tratamiento con proteasa de sumo, cargue la mezcla de nuevo en una columna de Ni para unirse a cualquier proteína de fusión no digerida y al sumo marcado con His, permitiendo que la proteína TRF2 sin etiquetas fluya a través de ella. Recoja el flujo continuo.
  3. Determine la concentración de proteínas y almacene la proteína.
    1. Concentre la proteína TRF2 purificada utilizando una unidad de filtro centrífugo de corte de 30 kDa e intercambie en un tampón de almacenamiento que contenga 20 mM de HEPES (pH 8,0), 150 mM de NaCl, 0,5 mM de DTT, para reducir la concentración de imidazol por debajo de 150 mM.
    2. Repita el proceso de concentración hasta que el volumen se reduzca a menos de 1 mL.
    3. Analice las muestras de cada paso de purificación con SDS-PAGE para evaluar la pureza e integridad de la proteína (Figura 1C).
      NOTA: La cromatografía de afinidad se utiliza para purificar proteínas, recolectar y lavar muestras eluidas y realizar SDS-PAGE para evaluar la integridad de las proteínas y garantizar el control de calidad. Cuando la cromatografía de afinidad por sí sola no cumple con los requisitos de pureza, se emplea la cromatografía de exclusión por tamaño para mejorar aún más la pureza de las proteínas. Las curvas de absorbancia UV ayudan a evaluar las fracciones de elución, y SDS-PAGE verifica la integridad de la proteína, lo que garantiza un estricto control de calidad durante todo el proceso.
    4. Agregue glicerol hasta una concentración final del 50% a la proteína concentrada e intercambiada por tampón para su almacenamiento.
    5. Almacene la proteína a -80 °C.

3. Preparación de fragmentos de restricción telomérica humana

  1. Extraer ADN genómico.
    1. Siguiendo el diagrama de flujo (Figura 2A), centrifugar 1 x 107 celdas a 1000 x g durante 3 min y desechar el sobrenadante. Para el lavado, vuelva a suspender las células en 200 μL de PBS, centrifugue nuevamente a 1000 x g durante 3 min y deseche el sobrenadante.
    2. Agregue 760 μL de tampón que contenga 50 mM de Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM de NaCl, 100 mM de EDTA y 1% de SDS al tubo que contiene 1 x 107 celdas y vuelva a suspender suavemente mediante pipeteo para evitar burbujas de aire.
      NOTA: No haga vórtice.
    3. Para la digestión de las proteínas y la eliminación de DNasas y RNasas en la muestra, añadir proteinasa K hasta una concentración final de 0,5 mg/mL, correspondiente a 40 μL de una solución madre de 10 mg/mL. Golpee la parte inferior del tubo para mezclar (no haga vórtice).
    4. Incubar durante la noche a 37 °C.
    5. Añadir 265 μL de NaCl 5,4 M. Mezcle durante 5 minutos invirtiendo el tubo cinco veces por minuto, luego colóquelo en hielo durante 20 minutos.
    6. Centrifugar a velocidad máxima (por ejemplo, 16.900 x g) durante 10 min a RT.
    7. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga y agregue un volumen igual de isopropanol (aproximadamente 750 μL), evitando lípidos flotantes o sedimentos. El ADN está en el sobrenadante.
    8. Invierta el tubo cinco veces para mezclar. Confirmar visualmente la presencia de una bolita de ADN precipitando en el tubo de centrífuga.
    9. Centrífuga a RT a velocidad máxima durante 10 min.
    10. Deseche el sobrenadante. Lave el pellet de ADN con 500 μL de etanol al 70% invirtiendo el tubo de centrífuga cinco veces.
      NOTA: La bolita es ADN.
    11. Centrifugar a RT a velocidad máxima (por ejemplo, 16.900 x g) durante 10 min.
    12. Retire con cuidado todo el sobrenadante, dejando la bolita de ADN. Deje que el pellet se seque al aire en RT durante 5 min.
      NOTA: Evite el secado excesivo, ya que el ADN genómico puede resultar difícil de disolver.
    13. Vuelva a suspender el gránulo de ADN en 475 μL de tampón TE (10 mM de Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM de EDTA). Mezcle suavemente golpeando la parte inferior del tubo. Para la digestión del ARN durante la preparación del ADN, agregue 25 μL de 10 mg/mL de ARNasa A (concentración final de 0,5 mg/mL) y mezcle golpeando suavemente hasta que la pastilla de ADN se haya disuelto por completo.
      NOTA: Evite el vórtice para evitar el cizallamiento del ADN.
    14. Incubar la muestra de ADN a 4 °C durante la noche.
    15. Realice una extracción de fenol trissaturado de igual volumen: agregue 500 μL de fenol al tubo de centrífuga, mezcle suavemente con una pipeta y centrifuga a velocidad máxima durante 10 min a 4 °C.
      PRECAUCIÓN: La exposición al fenol puede causar irritación en la piel, los ojos, la nariz, la garganta y el sistema nervioso. Evite el contacto con los ojos, la piel y la ropa. No ingerir ni inhalar. Use equipo de protección personal, incluida la protección facial.
      NOTA: El ADN está en la fase acuosa superior, las proteínas están en la interfase y la fase orgánica está en la parte inferior.
    16. Repite tres veces. Tome el sobrenadante de ADN (aproximadamente 280 μL).
    17. De acuerdo con el volumen de la muestra de ADN, agregue 1/10 de volumen (28 μL) de acetato de sodio 3 M (concentración final 0,3 M, pH 5,2) y 2 volúmenes (616 μL) de etanol 100% frío. Coloque el tubo de centrífuga a -80 °C durante 2-3 h.
    18. Centrifugar a velocidad máxima (por ejemplo, 16.900 x g) durante 10 min a 4 °C. Descongele la solución en hielo si está congelada antes de la centrifugación.
    19. Deseche el sobrenadante y lave 3-4 veces con etanol al 70% invirtiendo el tubo de centrífuga. Centrifugar a velocidad máxima durante 5 min a 4 °C.
    20. Retire el etanol y deje que el pellet se seque al aire a RT durante 5 min.
    21. Añadir 100 μL de tampón TE, golpear el tubo para mezclar y dejar reposar a 4 °C durante 2 h para que se disuelva por completo.
      NOTA: Examine la integridad del ADN genómico en un gel de agarosa al 1% (Figura 2B).
    22. Almacene el ADN a -20 °C en el congelador. Se mantendrá estable durante al menos 1 año.
  2. Realizar la digestión y modificación del ADN genómico.
    1. Tome 4 μg de ADN genómico y combínelo con 1 μL de CviAII (10 U), 2 μL de tampón de digestión 10x (consulte la Tabla complementaria 1 para recetas) y agregue agua para alcanzar un volumen total de 20 μL. Incubar la mezcla a 25 °C durante 12 h.
      NOTA: FatI puede reemplazar a CviAII, que ahora está descontinuado por NEB.
    2. Agregue 1 μL de NdeI (20 U), 1 μL de MseI (10 U) y 1 μL de BfaI (10 U) al mismo tubo que contiene la mezcla anterior (20 μL). Además, agregue 2 μL de tampón de digestión 10x y 15 μL de agua para lograr un volumen total de 40 μL. Incubar a 37 °C durante 12 h, luego inactivar por calor todas las enzimas a 80 °C durante 20 min.
      NOTA: La digestión del ADN genómico se puede examinar utilizando el método de fragmento de restricción terminal (TRF) (Figura 2C). La combinación de las cuatro enzimas de restricción (CviAII, NdeI, MseI y BfaI) digiere el ADN genómico en fragmentos de aproximadamente 800 pb y produce los TRF con una contaminación mínima del ADN subtelomérico.
    3. Para la modificación de la digoxigenina, tome 40 μL del ADN genómico digerido y agregue 4 μL de 1 mM de dATP (concentración final de 0,08 mM), 4 μL de 1 mM de digoxigenina-11-dUTP (concentración final de 0,08 mM), 1 μL de fragmento de Klenow (5 U), 0,5 μL de DTT de 100 mM (concentración final de 1 mM) y 1 μL de tampón de digestión 10x. Incubar a 37 °C durante 12 h, seguido de calentar a 75 °C durante 20 min para inactivar el fragmento de Klenow.
    4. Para el marcaje de biotina, tome 12,5 μL del ADN genómico modificado con digoxigenina (1 μg) y agregue 1 μL de sonda telomérica biotinilada de 1 μM (es decir, 1 pmol) que sean complementarias al saliente telomérico monocatenario. Agregue 611,5 μL de tampón TE Li (10 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 50 mM LiCl) para diluir los iones K de 50 mM a 1 mM, haciendo un volumen total de 625 μL, que se puede dividir en 16 tubos de 39 μL cada uno.
    5. Calentar a 75 °C durante 3 min en un termociclador, luego disminuir la temperatura en 0,1 °C cada 30 s hasta alcanzar los 25 °C.
    6. Almacene las muestras de ADN a -20 °C durante al menos un año.

4. Configuración de una celda de flujo para muestras de ADN telomérico en pinzas magnéticas

  1. Cree una celda de flujo para ensayos de una sola molécula.
    1. Utilice una amoladora eléctrica para perforar agujeros como la entrada y la salida en los cubreobjetos superiores (# 2 cubreobjetos con un grosor de 0,2 mm).
    2. Limpie los cubreobjetos con detergente por sonicación durante 30 min.
    3. Lave los cubreobjetos con agua ultrapura 3 veces.
    4. Limpie los cubreobjetos en isopropanol por sonicación durante 30 min.
    5. Lave los cubreobjetos con agua ultrapura 3 veces.
    6. Limpie los cubreobjetos en ultrapura por sonicación durante 15-30 min.
    7. Seque los cubreobjetos con nitrógeno.
      NOTA: El protocolo se puede detener aquí y los cubreobjetos limpios se pueden almacenar para su uso posterior.
    8. Recubrir los cubreobjetos inferiores (sin agujeros) con 20 μL de nitrocelulosa al 0,1% y añadir perlas de referencia (dilución 20x, 3 μm de diámetro). Hornea a 100 °C durante 4 min.
    9. Utilice un bisturí para cortar espaciadores de parafilm de doble capa de acuerdo con un molde de metal. El molde es una pieza rectangular de aleación de aluminio con las mismas dimensiones que el cubreobjetos, con un centro ahuecado para facilitar el corte del canal.
    10. Ensamble el sándwich de celda de flujo (Figura 3A). Calentar a 85 °C y masajear con dos bastoncillos hasta que el parafilm selle el canal.
    11. Cubra la celda de flujo con un anticuerpo. Inyecte 70 μL de anticuerpo anti-digoxigenina (0,1 mg/mL) directamente en la celda de flujo. Dejar en RT durante 1 h.
    12. Pasivar la celda de flujo. Inyectar 70 μL de BSA de 10 mg/mL para desplazar el anticuerpo anti-digoxigenina. Dejar en RT durante 12 h. Los anticuerpos anti-digoxigenina no unidos se eliminarán en los siguientes pasos con un lavado riguroso.
      NOTA: Almacene la celda de flujo a 4 °C durante 1-2 semanas.
    13. Pruebe la unión inespecífica enjuagando 5 μL de MyOne lavado (10 mg/mL) (o 5 μL de perlas M270 (10 mg/mL) lavadas) sin ADN en la celda de flujo. Dejar actuar durante 10 min, luego enjuagar las perlas con un tampón de trabajo (20 mM HEPES (pH 7,5), 100 mM de NaCl, 1 mM de EDTA). Cuente el número de cuentas pegadas a la superficie en un campo de visión. Una superficie bien tratada debe mostrar cero o solo unas pocas cuentas.
  2. Aísle e inmovilice las ataduras de ADN telomérico en una celda de flujo.
    1. Tome 10 μL de perlas M270 (10 mg/mL) o 5 μL de MyOne de 10 mg/mL y lávelas cinco veces con 50 μL de tampón de trabajo (20 mM HEPES [pH 7,5], 100 mM de NaCl, 1 mM de EDTA) utilizando un imán.
    2. Tome 500 ng de ADN genómico digerido y colóquelo en un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Agregue todas las perlas (50 μL) encima de la muestra de ADN.
    3. Sin pipetar, agite suavemente el tubo de centrífuga unas cuantas veces para mezclar las perlas y la muestra de ADN. Deja la mezcla en hielo durante 1 h. Lavar con 500 μL de tampón de trabajo tres veces usando un imán para tirar de las perlas hacia abajo, con intervalos de 10 minutos entre lavados.
    4. Vuelva a suspender la muestra con 30 μL de tampón de trabajo y cargue la mezcla en la celda de flujo. Dejar actuar durante 30 min. Cuentas magnéticas sin atajar al ras.
      NOTA: El ADN telomérico está unido entre el cubreobjetos inferior y el cordón magnético a través de interacciones de afinidad mediadas por digoxigenina-anticuerpo y biotina-estreptavidina (Figura 3B).
  3. Configurar una celda de flujo en pinzas magnéticas
    1. Limpie la celda de flujo con etanol al 70% y seque la superficie con papel de lente. Coloque la celda de flujo limpia en el portamuestras inferior y ensamble suavemente el estante de muestras superior con un destornillador.
    2. Aplique una gota de aceite para lentes en la superficie inferior de la celda de flujo, donde se alinea con la lente del objetivo. A continuación, coloque el portamuestras encima de la lente del objetivo y asegúrelo con un destornillador.
    3. Seleccione un par de imanes cúbicos de 5 mm dispuestos en configuración vertical. Alinee el soporte del imán con el eje X de la trayectoria de la luz de las pinzas magnéticas para obtener imágenes.
      NOTA: Este es un paso crítico. La dirección del campo magnético está alineada y, por lo tanto, determinada por la orientación del soporte del imán.
    4. Inicie el software de programación gráfica y conecte los controladores para las pinzas magnéticas. Ajuste el campo de visión para ubicar un cordón de referencia en la parte inferior de la celda de flujo y ajuste ligeramente la lente del objetivo para que el cordón de referencia muestre anillos de difracción claros.
    5. Mueva los imanes hacia abajo hasta la parte superior de la celda de flujo.
      NOTA: Este es un paso crítico. Los cambios repentinos en el patrón de difracción del cordón indican que los imanes acaban de tocar la superficie de la celda de flujo. Esta posición se considera el desplazamiento para el punto cero de medición.
      NOTA: Baje los imanes con cuidado, comenzando con pasos más grandes y cambiando gradualmente a pasos más pequeños. Muévase en incrementos de 0,1 mm para evitar dañar la celda de flujo al acercarse a la celda de flujo.
    6. Levante los imanes a su posición más alta y retire el soporte del imán.
    7. Encienda la bomba peristáltica conectada a la botella de residuos y deseche el líquido. Agregue 100 μL de tampón de trabajo a la entrada y ajuste el caudal de la bomba peristáltica a 100 μL/min para llenar la celda de flujo con tampón.

5. Mediciones de un telómero mediante pinzas magnéticas de una sola molécula

  1. Configura la cámara.
    1. Establezca la escala de grises de la cámara complementaria de semiconductor de óxido metálico (CMOS) con un ajuste de brillo en 150 niveles.
    2. Defina el tamaño de la región de interés (ROI).
    3. Ajusta la velocidad de fotogramas a 200 Hz con un tiempo de exposición de 5000 μs.
      NOTA: Este es un paso crítico. Asegúrese de que el tiempo muerto del obturador esté establecido en cero.
    4. Mueva la posición del imán a 3 cm (aproximadamente 8 pN) y ajuste el enfoque del objetivo en las cuentas.
  2. Establecer la tabla de búsqueda (LUT).
    1. Mueva los imanes a una posición correspondiente a 8 pN para estirar firmemente la cuenta magnética atada al ADN.
    2. Establece la LUT en 200 pasos con un tamaño de paso de 0,05 μm.
    3. Utilice una cámara CMOS para capturar los perfiles de las cuentas magnéticas en diferentes posiciones para establecer la LUT.
      NOTA: Este es un paso crítico. Las perlas de poliestireno fijadas en la celda de flujo sirven como perlas de referencia para eliminar la deriva de las perlas de interés.
  3. Diseñar un experimento mecánico de una sola molécula.
    1. Escriba un script en MATLAB para controlar los movimientos del motor para ensayos de rampa de fuerza o salto de fuerza.
      NOTA: Este es un paso crítico. Este script codifica los comandos para los movimientos del imán. La tasa de carga de fuerza se establece en este paso para un ensayo de rampa de fuerza. Aquí también se determinan los niveles y duraciones de los ensayos de salto de fuerza (Figura 4, Archivo Suplementario 1, Archivo Suplementario 2 y Archivo Suplementario 3).
    2. Importe el script en un software de programación gráfica para probar los experimentos de una sola molécula.
    3. Compruebe el total de fotogramas necesarios para ejecutar el experimento de una sola molécula y asegúrese de que la memoria disponible supera este requisito.
      NOTA: Los datos se perderán si la memoria asignada es menor que la necesaria, ya que el almacenamiento de datos lleva tiempo.
    4. Verifique la velocidad máxima de generación de imágenes para determinar el número máximo de cuentas que se pueden monitorear simultáneamente.
      NOTA: El experimento finalizará si se excede el límite de velocidad de obtención de imágenes.
    5. Usando un ensayo de salto de fuerza como ejemplo, ejecute el experimento mecánico de una sola molécula. Las fuerzas se aplican bruscamente a la perla magnética, que transmite estas fuerzas a la molécula de ADN, estirándola inmediatamente hacia arriba.

6. Mediciones de TRF1/2 en un telómero utilizando pinzas magnéticas

  1. Ensayo de rampa de fuerza
    1. Usando TRF1 como ejemplo, cargue 200 μL de TRF1 de 10 nM en la celda de flujo a un caudal lento (por ejemplo, 30 μL/min). Espere 30 minutos para que TRF1 se una al ADN telomérico.
    2. Elija un script para un experimento de rampa de fuerza con una tasa de carga de fuerza de ±1 pN/s.
    3. Asigne un nombre adecuado a los archivos de datos y ejecute el experimento. Los datos se guardarán en el destino especificado para su análisis (Figura 5).
      NOTA: Durante este experimento, la fuerza aumenta y disminuye linealmente entre 0 pN y 17 pN, lo que estira y relaja el ADN telomérico y rompe los bucles de ADN mediados por TRF1/2.
  2. Ensayo de salto de fuerza
    1. Seleccione un script para ejecutar un ensayo de salto forzado.
      NOTA: Se aplican varias fuerzas para estirar el ADN telomérico, por ejemplo, "Fuerza de reposo" (Frest) a 0 pN durante 40 s, "Fuerza de prueba" (Ftest) que oscila entre 2 y 8 pN durante 60 s, "Fuerza alta" (Fhigh) a 10 pN durante 30 s y "Fuerza máxima" (Fmax) a 20 pN durante 30 s.
    2. Asigne un nombre adecuado a los archivos de datos y ejecute el experimento. Los datos se guardarán en el destino especificado para su análisis (Figura 5).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La figura 1A ilustra los dominios esquemáticos y las estructuras de TRF1 y TRF2, que constan de 439 y 542 aminoácidos, respectivamente, que pueden expresarse en células procariotas. La preparación de TRF1 ha sido descrita previamente en la literatura41. Aquí, proporcionamos una descripción completa y resultados representativos de la preparación de TRF2. La Figura 1B muestra el mapa de plásmidos utilizado para expresar TRF2 en E. coli. Evaluamos la expresión de TRF2 antes y después de la inducción en E. coli, como se muestra en la Figura 1B. Los procesos de purificación y escisión de etiquetas también se analizaron utilizando SDS-PAGE (Figura 1C). Siguiendo este protocolo, ambas proteínas de unión telomérica, TRF1 y TRF2, se expresaron con éxito en E. coli.

El ADN telomérico, en forma de fragmentos de restricción terminal (TRF), se genera a partir de genomas humanos utilizando una combinación de cuatro enzimas de restricción. Siguiendo el diagrama de flujo que se muestra en la Figura 2A, extrajimos genomas de células humanas. Las enzimas digieren selectivamente el ADN genómico mientras dejan intacto el ADN telomérico de longitud completa, proporcionando así material para ensayos de una sola molécula. Hemos probado exhaustivamente la preparación de ADN TRF utilizando varias líneas celulares humanas. La integridad del ADN genómico se examinó mediante electroforesis en gel de agarosa, como se muestra en la Figura 2B. Posteriormente, los TRFs se analizaron mediante Southern blot, empleando oligonucleótidos marcados con fluorescencia complementarios a la secuencia de repetición telomérica TTAGGG (Figura 2C), siguiendo un método descrito en otro lugar41,56. En promedio, la longitud de los TRF humanos es de alrededor de unas pocas kilobases.

Los ensayos de una sola molécula se llevan a cabo en una celda de flujo ensamblada como se describe en la Figura 3A. Un recubrimiento de nitrocelulosa cubre la superficie del vidrio cargada negativamente, proporcionando una matriz hidrofílica para la adsorción de anticuerpos. La pasivación de BSA bloquea áreas de la matriz de nitrocelulosa que no están unidas por anticuerpos anti-digoxigenina. Las perlas de poliestireno, que no contienen nanopartículas de hierro, sirven como perlas de referencia. Las ataduras TRF se forman a través de interacciones de afinidad entre el anticuerpo digoxigenina en la matriz de nitrocelulosa y la biotina-estreptavidina en la superficie del cordón magnético (Figura 3B). TRF1 o TRF2 se introducen en la celda de flujo, uniéndose a las ataduras de ADN TRF a través de difusión libre. Las pinzas magnéticas se utilizan para modular el campo magnético, generando fuerzas sobre las perlas magnéticas para estirar y relajar las correas TRF, lo que permite el sondeo de las interacciones proteína-ADN.

Se diseña un ensayo mecánico de una sola molécula mediante el desarrollo de un script para controlar los movimientos de los motores de las pinzas magnéticas. Un diagrama de flujo proporciona un enfoque estructurado para crear este script en MatLab para un ensayo de una sola molécula utilizando pinzas magnéticas (Figura 4A). Los imanes se mueven a lo largo del eje z dentro de un rango de 0-25 mm. Las fuerzas se calculan en función de las posiciones de los imanes, de acuerdo con la configuración del imán, utilizando las ecuaciones descritas en la literatura54. Para una tasa de carga de fuerza específica, las posiciones de los imanes y las velocidades de movimiento se diseñan y programan en MatLab para lograr el perfil de manipulación de fuerza deseado, como se demuestra en el ejemplo del ensayo de rampa de fuerza (Figura 4B-D).

Usando TRF1 como ejemplo, probamos las interacciones teloméricas ADN-proteína con pinzas magnéticas de una sola molécula. La configuración experimental se puede configurar como un ensayo de fuerza-rampa, como se muestra en la Figura 5A, donde las curvas de fuerza-extensión exhiben características en zigzag durante el estiramiento debido a la ruptura de las interacciones proteína-ADN y trazas suaves durante la relajación, reflejando la fibra de ADN sin bucles mediados por proteínas. La configuración también se puede configurar como un ensayo de salto de fuerza, como se muestra en la Figura 5B, C, lo que nos permite medir los cambios en la extensión y las duraciones de las interacciones proteína-ADN bajo fuerzas específicas. La cinética de disociación de los complejos teloméricos ADN-proteína se puede derivar de estas mediciones (Figura 5D). Además, la formación de bucles en los complejos ADN-proteína puede revelarse mediante cambios en la extensión (Figura 5E). Además, la concentración de proteínas se puede valorar dentro de esta configuración experimental de ADN telomérico. Además, la heterogeneidad de la longitud del ADN telomérico de las células humanas nos permite investigar el mecanismo de formación de bucles en telómeros de varias longitudes (Figura 6).

figure-results-1
Figura 1: La expresión y purificación de TRF1/2. (A) La arquitectura de dominio de TRF1 y TRF2. (B) El mapa plásmido de pET28a-SUMO-TRF2 para expresar TRF2 en E. coli. (C) Análisis SDS-PAGE de las muestras obtenidas en diversas etapas de expresión y purificación. Carril 1: No inducido por IPTG. Carril 2: Precipitado inducido por IPTG obtenido por lisis celular. Carril 3: sobrenadante inducido por IPTG obtenido después de la lisis celular. Carril 4: Flujo a través de la columna Ni. Carril 5: Lavar con tampón de imidazol bajo para eliminar las proteínas de impurezas. Carril 6: Elución de 6xHis-SUMO-TRF2 con tampón que contiene 300 mM de imidazol. Carril 7: Digestión de las etiquetas SUMO por la enzima proteasa SUMO. Carril 8: Repurificación con columna de Ni y elución de TRF2 (se eliminaron las etiquetas 6xHis y SUMO) con tampón que contiene 20 mM de imidazol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Preparación de fragmentos de restricción terminal (TRF). (A) Diagrama de flujo para la preparación de TRFs a partir de células humanas. (B) Examen de la integridad del ADN genómico utilizando un gel de agarosa al 1% para 5 líneas celulares humanas. (C) Análisis TRF realizado por Southern blot para 5 líneas celulares humanas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Preparación de ensayos mecánicos de molécula única. (A) Diagrama de flujo que representa la preparación de una celda de flujo para ensayos mecánicos de molécula única. (B) Representación esquemática de ensayos mecánicos de una sola molécula utilizando pinzas magnéticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-4
Figura 4: Diseño de un ensayo mecánico de una sola molécula. (A) Diagrama de flujo para generar un script para ejecutar un ensayo de rampa de fuerza. (B) El perfil de movimiento de los imanes a lo largo del eje z. (C) El perfil de fuerza correspondiente al movimiento del imán. (D) La correlación entre las posiciones de los imanes y las fuerzas resultantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-5
Figura 5: Interacciones teloméricas ADN-proteína sondeadas por pinzas magnéticas de una sola molécula. (A) Las interacciones TRF1-telómeros se probaron en ensayos de rampa de fuerza (N = 10) en un tampón que contenía 20 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM EDTA y 100 mM NaCl a 23 °C. La concentración de TRF1 fue de 10 nM, con una tasa de carga de fuerza de ±1 pN/s. (B) La correa TRF se estiró y relajó en ensayos de salto de fuerza. El protocolo de fuerza aplicada fue Frest = 0 pN, Ftest = 2 pN - 8 pN, Fhigh = 10 pN y Fmax = 20 pN. Las condiciones de amortiguación y temperatura fueron las mismas que en (A). Velocidad de fotogramas = 200 Hz. (C) Las interacciones TRF1-telómeros se probaron en ensayos de salto de fuerza con una concentración de TRF1 de 10 nM. (D) Cinética de disociación de los complejos TRF1-telómeros. El logaritmo de la tasa de disociación a las fuerzas probadas (media ± SD, n = 206) sigue el modelo de Kramer-Bell-Evans (curva roja y ecuación de leyenda). El recuadro muestra el tiempo medio de disociación (<τ>) en Ftest. (E) Distribución de los cambios en la extensión (ΔL) tras eventos de ruptura de los complejos TRF1-telómeros. Las curvas negras y rojas representan accesorios gaussianos. Esta figura ha sido modificada con permiso de Li et al.41. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-6
Figura 6: El número y el tamaño de los bucles de ADN formados por TRF1 en un telómero. (A) Dependencia de la longitud de los telómeros de los tamaños de los bucles de ADN (ΔL) a [TRF1] = 20 nM. Las curvas representan accesorios gaussianos. (B) Dependencia de la longitud de los telómeros de ΔL en [TRF1] = 40 nM. (C) Correlación entre ΔL y el número de eventos de ruptura por telómero, N. La correlación de orden cero es r = -0,20, con p < 0,001 (tamaño de la muestra = 1496). (D) Una caricatura que ilustra un posible mecanismo que explica la correlación negativa entre ΔL y N, sugiriendo que TRF1 puede compactar un solo telómero con dominios de bucle primarios en una topología de orden superior. Esta figura ha sido modificada con permiso de Li et al.41. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Código MatLab para generar scripts.m Haga clic aquí para descargar este archivo.

Legajo complementario 2: Script para assay.txt de fuerza constante. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Legajo complementario 3: Guión para assay.txt de rampa de fuerza. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 1: Recetas Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo emplea pinzas magnéticas para la manipulación de TRFs a nivel de una sola molécula 57,58,59. Utilizamos perlas magnéticas para separar los TRF de los fragmentos de ADN genómico. Después de la digestión de restricción, los TRF se unen a las perlas magnéticas, lo que permite su fácil separación de los fragmentos de ADN genómico. Este enfoque permite la manipulación mediante pinzas magnéticas, que pueden atrapar eficazmente las perlas magnéticas, a diferencia de las pinzas ópticas que están limitadas por problemas de transparencia. Además, si bien el AFM se puede utilizar para la manipulación de una sola molécula, se requieren pasos adicionales para disociar los TRF de las perlas magnéticas e inmovilizarlos entre una superficie de mica y una punta en voladizo. Por el contrario, las pinzas magnéticas ofrecen un método más sencillo y eficiente para la manipulación de TRF de una sola molécula, eliminando la necesidad de estos pasos adicionales41.

Mantener la integridad del ADN genómico y los TRF es crucial, ya que la manipulación de una sola molécula depende de los TRF intactos. Usando pinzas magnéticas, estiramos y relajamos los TRF sosteniendo sus dos extremos para sondear las interacciones proteína-ADN. La medición precisa de la fuerza en perlas magnéticas es fundamental para los ensayos mecánicos de una sola molécula54. Por lo tanto, los imanes de forma cúbica deben alinearse paralela u ortogonal a la trayectoria de la luz de la cámara en pinzas magnéticas (NOTA a continuación del paso 4.3.3), asegurando un registro preciso de la posición tridimensional de la cuenta según las ecuaciones54,60 establecidas. El desplazamiento del imán es crucial para determinar sus posiciones y las fuerzas resultantes en las perlas magnéticas. Utilizamos el cubreobjetos #2 con un grosor aproximado de 0,2 mm para mantener la consistencia o ajustamos el desplazamiento en la ecuación para diferentes cubreobjetos54. La velocidad de fotogramas es vital para capturar la dinámica de las interacciones proteína-ADN, lo que requiere un tiempo muerto del obturador de cero para obtener datos completos de movimiento de cuentas. Los movimientos motores, codificados por una escritura, son fundamentales para el diseño de ensayos mecánicos de una sola molécula. Los parámetros críticos, como la tasa de carga de fuerza, las fuerzas y las duraciones, deben establecerse y optimizarse de forma iterativa. Las concentraciones de proteínas utilizadas en ensayos de moléculas individuales requieren una valoración exhaustiva para determinar el nivel óptimo para estudiar las interacciones proteína-ADN. Las pruebas de fuerza iniciales se pueden realizar utilizando ensayos de fuerza y rampa con espectroscopia de fuerza, mientras que los ensayos de salto de fuerza evalúan las fuerzas de interés a un nivel constante.

Es posible que se encuentren algunos desafíos al adaptar este protocolo. Si TRF1 o TRF2 no se expresa en E. coli, comience con un ensayo a pequeña escala, lise las células y analice las proteínas a través de SDS-PAGE y tinción, confirmando con Western Blot utilizando anticuerpos específicos de etiqueta. Se debe verificar la construcción y el plásmido para asegurar una clonación correcta sin mutaciones, cambios de marco o codones de parada prematuros, y verificar la idoneidad del promotor para E. coli. La expresión debe optimizarse mediante el análisis de diferentes cepas de E. coli (por ejemplo, BL21(DE3), Rosetta), ajustando la temperatura de crecimiento (15-25 °C), el tiempo de inducción (2-16 h) y la concentración de IPTG (0,1-1 mM). Los cuerpos de inclusión deben abordarse analizando los gránulos celulares antes y después de la sonicación. Se debe abordar el sesgo de codones con cepas que proporcionan ARNt raros o la optimización de codones. Pruebe diferentes medios de crecimiento (LB, TB, autoinducción) y mejore la aireación ajustando la velocidad de agitación y el volumen de cultivo. Para problemas de toxicidad, use promotores estrictamente regulados o vectores de menor número de copias y agregue glucosa (0.2%) para reprimir la expresión permeable del promotor de lac. Mantener la integridad del plásmido con una selección adecuada de antibióticos y asegurar la liberación completa de proteínas mediante la optimización del método de lisis celular61,62.

Si no se encuentran ataduras TRF en ensayos de una sola molécula, una posibilidad es que no se haya utilizado suficiente ADN genómico inicial. Intente usar 500 ng de ADN genómico equivalente de TRF para configurar un ensayo mecánico de una sola molécula. Los problemas persistentes para encontrar correas TRF en pinzas magnéticas podrían deberse a tiempos de digestión excesivamente largos del ADN genómico. Mantenga el procedimiento de digestión por debajo de las 12 h para evitar la actividad de las estrellas. Además, la formación de G-cuádruples en el saliente monocatenario del ADN telomérico podría inhibir el recocido de oligonucleótidos marcados con biotina para unirse a perlas magnéticas. Para evitar esto, mantenga las concentraciones de iones de potasio o sodio por debajo de 1 mM para evitar la formación de G-cuádruples y aumentar la probabilidad de formar ataduras TRF en la configuración de una sola molécula. Además, el aumento de la temperatura de calentamiento durante la etapa de recocido (paso 3.2.5) ayuda a desestabilizar los G-cuádruples y facilita la unión de los oligonucleótidos marcados con biotina a los TRF.

En presencia de proteínas TRF1 o TRF2, las ataduras de ADN TRF podrían compactarse fuertemente y ser demasiado difíciles de estirar en pinzas magnéticas debido a la abundancia de sitios de unión en el telómero para estas proteínas. La valoración de las concentraciones de proteínas puede ayudar a identificar los niveles óptimos para los ensayos mecánicos de una sola molécula. La afinidad de unión proteína-ADN se puede evaluar mediante ensayos EMSA o SPR para determinar la constante de disociación (Kd), que luego puede informar concentraciones adecuadas para ensayos de una sola molécula.

La cantidad limitada de TRFs generados a partir del ADN genómico podría frenar la eficiencia de los ensayos de una sola molécula. En consecuencia, la recopilación de datos de una sola molécula puede llevar más tiempo en comparación con el uso de construcciones de ADN telomérico sintetizadas artificialmente. Sin embargo, el uso de telómeros obtenidos directamente del genoma humano proporciona varias ventajas que el ADN telomérico artificial, comúnmente preparado por plásmido en bacterias o métodos de PCR, no puede ofrecer. Una ventaja es que los TRF humanos son heterogéneos en longitud, lo que permite examinar la dependencia de la longitud de los telómeros en las interacciones proteína-ADN. Por el contrario, el ADN telomérico artificial suele tener una longitud uniforme, y la generación de ADN telomérico artificial de varias longitudes llevaría mucho tiempo y mano de obra. Además, los TRF humanos contienen secuencias originales de las células, incluidos marcadores naturales como modificaciones, mutaciones y daños. Esto permite la investigación de las interacciones proteína-ADN en condiciones fisiológicas o patológicas, lo que no es posible con el ADN telomérico artificial.

Este protocolo es esencial para los estudios en el campo de la biología de los telómeros a nivel de una sola molécula y puede beneficiar potencialmente el descubrimiento de fármacos dirigidos a los telómeros.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos ni otros conflictos de intereses.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [Subvención 32071227 a Z.Y.], la Fundación Municipal de Ciencias Naturales de Tianjin de China (22JCYBJC01070 a Z.Y.) y el Laboratorio Estatal Clave de Tecnología e Instrumentos de Medición de Precisión (Universidad de Tianjin) [Subvención pilab2210 a Z.Y.].

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-DigoxigeninaRoche11214667001
BfaINew England Biolab (NEB)R0568S
BSASigma-AldrichV900933
cámara CMOS MikrotronMC1362
CviAIINew England Biolab (NEB)R0640S
DIG-11-dUTPJena BioscienceNU-803-DIGXL
solución de extracción de ADNG-CLONEEX0108
Dnase I, sin RNASA, Hc EaThermo Fisher ScientificEN0523
dNTP mezclaNanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)P032-02
TDTSolarbioD1070
Dynabeads M-270  perlasThermo Fisher Scientific65305Perlas de estreptavidina
Dynabeads MyOne perlasThermo Fisher Scientific65001Perlas de estreptavidina
EtanolTianjin No.6 Fábrica de reactivos químicos1083
GlicerolBeijing Hwrkchemical Co. LtdSMG66258-1
ImidazolSolarbioII0070
IPTGSolarbioI8070
IsopropanolTianjin No.6 Fábrica de reactivos químicosA1079
KanamicinaThermo Fisher ScientificEN0523
Fragmento de Klenow (3′-5′ exo-)New England Biolab (NEB)M0212S
LabViewNational Instrumentshttps://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.htmlSoftware de programación gráfica 
LiClBide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)BD136449
LysozymeSolarbioL8120-5
MseINew England Biolab (NEB)R0525S
NaClShanghai AladdinC111533
NanoDropThermo FisherEspectrofotómetro
NdeINew England Biolab (NEB)R0111S
Ni NTA Beads 6FFChangzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,LtdSA005025
Membrana de nitrocelulosaABclonalRM02801
PMSFSolarbioP8340
Proteinasa KBeyotime Biotech Inc (beyotime)ST535-500mg
tampón rCutSmart NewEngland Biolab (NEB)B6004S
Rnasa ASigma-AldrichR4875
Acetato de sodioSERVA Electroforesis GmbH2124902
Sumo proteasaBeyotime Biotech Inc (beyotime)P2312M
científico

References

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