Artículo de método

Optimización de la preparación de antígenos para el ensayo de inhibición de la hemaglutinación de la serología del virus de la enfermedad de Newcastle

DOI:

10.3791/67256

⸱

24 de enero de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Science and Technology, Suzhou Chien-shiung Institute of Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Novel Tumor-targeting Drug Conjugates, 3Crown Bioscience Inc.

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo presenta un método simplificado para la preparación de 4 unidades de hemaglutinación de antígeno para las pruebas serológicas del virus de la enfermedad de Newcastle. Al determinar con precisión el título de hemaglutinación del antígeno, combinado con un método de valoración inversa más riguroso y un proceso de ajuste bien definido, mejora la eficiencia de la prueba, reduce los falsos positivos y mejora la vigilancia de la enfermedad en las aves de corral.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La evaluación precisa de los títulos de anticuerpos contra el virus de la enfermedad de Newcastle (VEN) es crucial para el control y la vigilancia eficaces de las enfermedades avícolas. Este artículo presenta un método optimizado para preparar una solución de antígeno de 4 unidades de hemaglutinación (4-HAU), un componente clave del ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI) utilizado en la detección serológica del VEN. A diferencia de los métodos convencionales, que implican pasos de ajuste y valoración indefinidos y que requieren mucho tiempo, este enfoque agiliza este proceso al medir con precisión el título de HA utilizando una serie inicial de diluciones (1:3, 1:5, 1:7 y 1:9). También proporcionamos un método específico para ajustar o reformular en función de los resultados de la valoración inversa, lo que reduce la necesidad de repetidas valoraciones inversas. Además, evaluamos el efecto de la precisión de la solución de antígeno 4-HAU en el título sérico de HI y encontramos que cuando el título del antígeno 4-HAU era inferior a 3, resultaba en la aparición de muestras de HI falsos positivos. Al proporcionar un método preciso y minimizar las tareas computacionales, este enfoque aumenta la eficiencia y la confiabilidad de las pruebas, lo que contribuye a mejorar la vigilancia y el control de enfermedades en las poblaciones de aves de corral.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La enfermedad de Newcastle (ND) es una afección avícola generalizada y grave reconocida a nivel mundial 1,2,3. Se manifiesta a través de diversos síntomas como fiebre alta, dificultad respiratoria, disentería, trastornos nerviosos y hemorragia mucosa4. El agente causal, el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), ha perdurado durante casi un siglo, afectando a más de 200 especies de aves, incluidos pollos, patos, gansos y palomas5. La transmisión se produce principalmente a través del contacto directo o indirecto con aves infectadas, y las aves de corral, las palomas y las aves criadas en libertad sirven como reservorios potenciales6. A pesar del serotipo único del VN, su diversidad genética plantea desafíos significativos para los esfuerzos de manejo y control de la enfermedad 3,7.

La vacunación sirve como estrategia principal para el control de la EN, complementada con estrictas medidas de bioseguridad 5,8. Varias vacunas comerciales están disponibles en todo el mundo para las aves de corral, lo que provoca fuertes respuestas de anticuerpos séricos después de la inmunización9. Estos anticuerpos desempeñan un papel fundamental en la mitigación de la gravedad de los síntomas tras la exposición a cepas virulentas y en la reducción de la transmisión entre rebaños10. Los protocolos estándar de revacunación, que generalmente involucran vacunas vivas atenuadas administradas cada 6 a 12 semanas, son una práctica estándar en las regiones endémicas de ND9. El monitoreo rutinario de los títulos de anticuerpos posvacunación en parvadas de aves comerciales es esencial para evaluar la efectividad de la vacuna 11,12,13. Los títulos bajos de anticuerpos después de la vacunación pueden indicar un fracaso de la vacuna, lo que provoca medidas correctivas oportunas, como la vacunación complementaria o la investigación de posibles factores inmunosupresores que afectan la respuesta inmunitaria14.

Se utilizan múltiples técnicas para la detección de anticuerpos séricos contra el VN, incluyendo el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas, la inhibición de la hemaglutinación (HI) y el ensayo de neutralización 9,13,15,16. Cada método presenta ventajas y limitaciones únicas en cuanto a sensibilidad, especificidad y rentabilidad.

En este artículo se describe un protocolo paso a paso basado en el protocolo de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) para la realización de IH con el fin de cuantificar los títulos de anticuerpos específicos en suero frente al VEN11. La hemaglutinación (HA), un fenómeno inducido por ciertos virus con envoltura como el NDV, implica la aglomeración de glóbulos rojos (RBC)9. La proteína hemaglutinina-neuraminidasa (HN) en la superficie del NDV interactúa con los glóbulos rojos, lo que resulta en la aglomeración de células y la formación de redes2. Se prefiere el ensayo HI como método serológico debido a su capacidad para evaluar la especificidad de los anticuerpos séricos frente a la proteína HN del NDV 8,9. Además, su rentabilidad e independencia de la instrumentación especializada lo hacen accesible y práctico para el uso rutinario.

Para mejorar la eficiencia de los ensayos, refinamos el flujo de trabajo del protocolo11 de la OIE, centrándonos en lograr títulos de antígeno HA más precisos y ofrecer ajustes detallados para la solución de antígeno de 4 unidades de hemaglutinación (4-HAU). Además, a través de un análisis comparativo, evaluamos el impacto de la precisión de 4-HAU en los resultados de HI, proporcionando información valiosa para los profesionales de campo. Este enfoque no se limita a las pruebas de anticuerpos contra el VEN, sino que se extiende a la detección de subtipos virales y otros virus hemaglutinantes, como el sarampión, el poliomavirus, las paperas y la rubéola.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La aprobación del protocolo fue otorgada por el comité institucional local de cuidado y uso de animales. Todos los procedimientos con antígenos de virus vivos y muestras de suero clínico se realizaron en un laboratorio de Bioseguridad Nivel 2, de acuerdo con los protocolos de seguridad establecidos.

1. Preparación de suspensión de glóbulos rojos de pollo al 1%

  1. Añada 3 mL de solución de Alserver (anticoagulante) en un tubo de centrífuga cónico estéril de 15 mL.
  2. Recoja 1 mL de sangre de la vena del ala de cada uno de los tres pollos no inmunes (sin anticuerpos contra el VEN). Transfiera inmediatamente la sangre al tubo que contiene el anticoagulante y mezcle suavemente.
  3. Llene el tubo con solución salina estéril tamponada con fosfato 1x (PBS, pH 7,2-7,4) hasta un volumen total de 12 ml y mezcle suavemente. Centrifugar a 500 × g durante 10 min utilizando un rotor horizontal.
  4. Retire con cuidado el sobrenadante y la capa de glóbulos blancos. Repita los pasos 1.3 y 1.4 2x para obtener el pellet RBC.
  5. Pipetear 1 mL del pellet de RBC en 99 mL de PBS estéril, para preparar una suspensión de RBC al 1%.
    NOTA: El volumen requerido de la suspensión de glóbulos rojos de pollo al 1% se estima en 3 mL/placa (25 μL/pocillo x 96 pocillos x 1,25 = 3,0 mL; donde 1,25 representa el desperdicio de pipeteo para garantizar un volumen suficiente).

2. Reconstitución del antígeno liofilizado o suero

  1. Añadir 2 mL de PBS estéril a la ampolla que contiene el antígeno liofilizado o suero. Agite suavemente la ampolla y déjela reposar durante 2-3 minutos para minimizar las burbujas y asegurar la disolución completa.
    NOTA: Siga las instrucciones específicas del fabricante, ya que en este estudio no se compararon diferentes tipos de materiales liofilizados.
  2. Alicuente la solución reconstituida en tubos de centrífuga de 1,5 mL y congele a -20 °C hasta su uso.
    NOTA: Vuelva a determinar el título de HA cada vez que se descongele y use el antígeno, o cuando se prepare una nueva suspensión de glóbulos rojos.

3. Valoración de antígenos de HA

  1. Dispensar 40, 80, 120 y 160 μL de PBS, respectivamente, en cuatro pocillos adyacentes de una placa de microtitulación desechable de 96 pocillos con fondo en V, luego agregar 20 μL de antígeno a cada pocillo y mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces para lograr diluciones de 1:3, 1:5, 1:7 y 1:9, respectivamente. En la Figura 1 se muestra un diagrama esquemático de la operación de dilución.

figure-protocol-1
Figura 1: Diagrama esquemático que ilustra el procedimiento para diluir la solución de antígeno en el ensayo de hemaglutinación. La solución de antígeno se diluye en PBS en proporciones de 1:3, 1:5, 1:7 y 1:9, respectivamente. El PBS en pocillos o tubos de centrífuga se representa en azul, mientras que los antígenos se muestran en verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Etiquete una nueva placa de microtitulación. Agregue 25 μL de PBS a cada pocillo en las filas 1-5.
  2. Coloque 25 μL de las soluciones de antígeno diluido en los primeros pocillos de las filas 1-5 con una pipeta multicanal y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 5 veces.
  3. Transfiera 25 μL del primer pocillo de cada fila al segundo pocillo, mezclando bien. Continúe transfiriendo de un pozo al siguiente, hasta la 11ª columna, para crear diluciones en serie dobles (1:2 a 1:2048). Deseche 25 μL después de la 11ª columna.
  4. Agregue 25 μL de PBS a cada pocillo, comenzando con los pocillos que contienen la concentración de antígeno más baja.
  5. Agregue 25 μL de suspensión de glóbulos rojos de pollo al 1% a cada pocillo, nuevamente comenzando con los pocillos que contienen la concentración de antígeno más baja.
  6. Agite la placa en un agitador de microplacas durante ~ 20 s para mezclar bien.
  7. Déjelo reposar en la mesa de trabajo a temperatura ambiente (20-25 °C) durante ~30 min hasta que el RBC de la 12ª columna se asiente por completo. Para conocer el diseño de la placa, consulte la Figura 2.

figure-protocol-2
Figura 2: Disposición esquemática de una microplaca utilizada en el ensayo de hemaglutinación. La primera columna de las filas 1 a 5 contiene diluciones iniciales sin diluir y varias diluciones de la solución de antígeno, seguidas de una dilución en serie doble de izquierda a derecha hasta la columna 11. El control PBS se coloca en la última columna. El gradiente de oscuro a claro indica una disminución de la concentración de antígenos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Lea y registre los resultados. La HA se determina inclinando la placa 90° durante ~25 s y observando la presencia o ausencia de flujo en forma de lágrima de los glóbulos rojos. La dilución más alta, que muestra hemaglutinación completa (sin flujo al agua), representa 1 unidad de AH. Los pozos de la 12ª columna sirven como controles RBC (negativos).
  2. Calcule el título de HA de cada fila utilizando la Tabla 1, cuyo máximo se utiliza para la preparación de la solución de antígeno 4-HAU. Por ejemplo, si a, b, c, d y e son iguales a 9, 8, 7, 6, 6, respectivamente, entonces 3 x 28 = 768 es el valor máximo y es el título de HA del stock de antígenos.
AntígenosColumna de dilución más alta de HA completoTítulo de HA de material sin diluir
Existencias sin diluirun2A
Dilución 3 vecesb3 x 2b
Dilución de 5 vecesc5 x 2c
Dilución de 7 vecesd7 x 2d
Dilución de 9 vecese9 x 2e

Tabla 1: Resultados del ensayo de HA y cálculo del título de HA de la solución madre.

4. Preparación de la solución de antígeno 4-HAU

  1. Calcular el factor de dilución para la preparación de la solución de antígeno 4-HAU: figure-protocol-3. Determine el volumen total de 4-HAU necesario: V = 3 ml x número de microplacas. A continuación, calcule los volúmenes necesarios de solución madre de antígeno: figure-protocol-4, y PBS: Vp = V - Va.
    NOTA: Los volúmenes se miden en mililitros. Calcule 3 mL por placa de microtitulación del 4-HAU (25 μL/pocillo x 96 pocillos x 1,25 = 3 mL).
  2. Pipetear el volumen calculado de PBS en un recipiente, luego agregar el volumen correspondiente de solución madre de antígeno y mezclar bien para obtener la solución de antígeno 4-HAU.
    NOTA: La solución de antígeno 4-HAU debe usarse lo antes posible.

5. Valoración inversa de la solución de antígeno 4-HAU

  1. Dispensar 25, 50, 75, 100, 125 y 150 μL de PBS en seis pocillos adyacentes de una placa de microtitulación, luego agregue 25 μL de la solución de antígeno 4-HAU a cada pocillo y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces.
    NOTA: Diluya la solución de antígeno 4-HAU con PBS en diluciones de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 y 1:7. En la Figura 3 se muestra un diagrama esquemático de la operación de dilución.

figure-protocol-5
Figura 3: Diagrama esquemático del procedimiento de dilución de la solución de 4 unidades de hemaglutinación en retrotitulación. La solución de trabajo 4-HAU se diluye con PBS en proporciones de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 y 1:7. El PBS se representa en azul y los antígenos en verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Transfiera 25 μL de cada solución de antígeno diluida a los pocillos de otra fila utilizando una pipeta multicanal. Añadir 25 μL de PBS a un pozo extra como un control negativo.
  2. Agregue 25 μL de PBS a cada pocillo, luego agregue 25 μL de glóbulos rojos de pollo al 1% a cada pocillo.
  3. Agite la placa en un agitador de microplacas durante ~ 20 s para mezclar.
  4. Déjelo reposar en la mesa de trabajo a temperatura ambiente (20-25 °C) durante ~30 minutos hasta que los glóbulos rojos del control negativo se hayan asentado por completo.
  5. Lea y registre los resultados.
    NOTA: El pocillo de control negativo no debe mostrar HA. Idealmente, la dilución 1:4 es exactamente la dilución más alta con HA completo. Si el título de la solución de 4-HAU es superior a 4, la dilución más alta puede ser 1:5, 1:6 o 1:7; si es menor, puede ser 1:2 o 1:3. En la Figura 4 se muestra un diseño esquemático de la valoración inversa y los resultados representativos.

figure-protocol-6
Figura 4: Disposición esquemática de los pozos para la retrovaloración y resultado representativo. La solución de trabajo diluida de 4-HAU se transfiere a una nueva fila, con un control PBS adicional agregado. El gradiente de verde oscuro a verde claro indica la concentración de antígeno de mayor a menor. Los resultados representativos demuestran que la dilución 1:4 es la dilución más alta, mostrando una hemaglutinación completa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Ajuste o reformule la solución de antígeno 4-HAU si es necesario.
    NOTA: Si el volumen de la solución de antígeno 4-HAU utilizada en la retrovaloración es del ≤1% del volumen total (el volumen de la solución de antígeno 4-HAU ≥ 15 mL), consulte la Tabla 2 para obtener ajustes específicos. Por ejemplo, si la dilución más alta con HA completo es 1:2, el título de la solución de antígeno 4-HAU es ahora 2, y se debe agregar un volumen igual de antígeno que en la preparación anterior de la solución de antígeno 4-UA. Por el contrario, si la dilución más alta de AH completo es 1:6, el título es ahora 6 y se debe reponer la mitad del volumen de PBS.
    Si el volumen utilizado en la retrovaloración supera el 1% del total (el volumen de la solución de antígeno 4-HAU < 15 ml), reformule la solución de antígeno 4-HAU utilizando el factor de dilución corregido. Consulte la Tabla 3 para ver las correcciones específicas. Por ejemplo, si la dilución más alta de HA completo es 1:2, el título de la solución de antígeno 4-HAU es ahora 2 y el factor de dilución debe ajustarse a 1/2 del original. Por el contrario, si la dilución más alta de HA completo es 1:6, el título de la solución de antígeno 4-HAU es ahora 6 y el factor de dilución se ajusta a 3/2 del original.
Título de HA de la valoración inversaReposición de antígeno o PBS
1:2VA
1:3VA/3
1:5Vp/4
1:6Vp/2
1:73Vp/4

Tabla 2: Tabla de referencia para ajustar la concentración de 4-HAU en función de los resultados de la retrovaloración. Va y Vp representan los volúmenes de antígeno y PBS utilizados en la formulación de la solución de antígeno 4-HAU, respectivamente.

Título de HA de la valoración inversaCorrección del factor de dilución
1:2D/2
1:33D/4
1:55D/4
1:63D/2
1:77D/4

Tabla 3: Tabla de referencia de la corrección del factor de dilución para la repreparación del antígeno 4-HAU. D representa el factor de dilución utilizado previamente en la preparación del antígeno 4-HAU.

6. Preparación del suero

  1. Recoja ~ 1 ml de sangre de las alitas de pollo sin usar un anticoagulante.
  2. Transfiera la sangre a un tubo de centrífuga de 1,5 mL e incube a 37 °C durante ~2 h. Centrifugar a 3.000 x g durante 10 minutos y aspirar cuidadosamente el sobrenadante en un tubo nuevo.

7. Ensayo HI

  1. Etiquete las placas de microtitulación de acuerdo con el diseño del ensayo. Añada 25 μL de PBS a cada pocillo de las columnas 1 a 11, y 50 μL a los pocillos de la columna 12, utilizando una pipeta multicanal.
  2. Agregue 25 μL de suero al primer pocillo de cada fila, incluidas las filas de control de suero positivas y negativas. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 5 veces.
  3. Transfiera 25 μL del primer pocillo de cada fila al segundo pocillo y mezcle bien. Continúe transfiriendo y mezclando del segundo pocillo al tercero, y así sucesivamente, hasta la 10ª columna. Deseche 25 μL de líquido del pocillo en la 10ª columna después de mezclar.
  4. Agregue 25 μL de antígeno 4-HAU a cada pocillo en las columnas 1-11 en la dirección de la concentración sérica baja a alta.
  5. Agite la placa en un agitador de microplacas durante ~20 s. Déjelo reposar en la mesa de trabajo durante ~30 min.
  6. Agregue 25 μL de glóbulos rojos de pollo al 1% a cada pocillo en la dirección de la concentración sérica baja a alta.
  7. Agite la placa en un agitador de microplacas durante ~ 20 s para mezclar bien. Déjelo reposar en la mesa de trabajo durante ~30 minutos hasta que los glóbulos rojos de los pozos de control PBS estén completamente asentados.
  8. Lea y registre los resultados.
    NOTA: El título de HI es la dilución sérica más alta que inhibe completamente la hemaglutinación del antígeno 4-HAU. En la última columna de cada fila se puede observar un flujo de glóbulos rojos en forma de lágrima, inclinando la placa 90° durante 25 s. La HA completa (sin transmisión) se puede observar en el penúltimo pozo desde el final de cada fila. Los resultados válidos de las pruebas exigen que el título de IH del control sérico positivo esté dentro de una dilución del título de IH conocido; el título de IH del control sérico negativo será de ≤ 2 log2; y la ausencia de auto-HA del control de RBC. Para obtener un diagrama esquemático del flujo de trabajo del ensayo de alta disponibilidad, consulte la figura 5.

figure-protocol-7
Figura 5: Diagrama esquemático del flujo de trabajo del ensayo de hemaglutinación. El PBS está representado en azul, el suero en amarillo, la solución de antígeno 4-HAU en verde y la suspensión de glóbulos rojos de pollo al 1% en rojo. Las flechas indican el orden de dispensación de líquidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Validación del título de la solución de antígeno 4-HAU formulada mediante el método optimizado
El estudio empleó varias diluciones de la solución madre de antígeno para determinar con precisión el título de HA, lo que facilitó el cálculo del factor de dilución para la preparación de la solución de antígeno 4-HAU. Los resultados revelan que el método optimizado es eficiente y preciso, lo que reduce el número de procedimientos repetitivos de valoración y ajuste. En el primer escenario, un título inicial...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El método optimizado propuesto en este artículo presenta un enfoque para preparar con precisión la solución de antígeno 4-HAU. A pesar de que las directrices de la OIE y de la UE sugieren diluciones iniciales para la valoración del AH, no proporcionan detalles precisos sobre las proporciones de dilución a utilizar ni ofrecen metodologías específicas11,12. Además, a pesar de que la FAO y la OIE recomiendan la retrotitulación como medio para mejorar la precisión del 4-HAU, carecen de u...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.C. contó con el apoyo del programa de Tecnología de Taicang (TC2021JC16) y los Fondos del Equipo de Innovación del Instituto de Tecnología de Suzhou Chien-shiung (2023JXKYTD01). H.Y. contó con el apoyo del programa Taicang Technology (TC2021JC11). Ambos contaron con el apoyo del Fondo de Puesta en Marcha para Nuevos Investigadores Ph.D. del Instituto de Tecnología de Suzhou Chien-Shiung.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
  Tubo de centrífuga estéril (15 mL)  Centrífuga de
TitanLDC-5
Solución de AlserveSangon Biotech
DLAB9032002121
Pipeta Pasteur DesechableTitanSWXG-004
Jeringa estéril desechable (1 mL)BeyotimeFS801-30PCS Placa de
microtitulación desechable de fondo en V (96 pocillos)Labshark
Agitador de microplacasJiangsu Xinkang Medical Equipment Co., LtdXK96-3
NDV HI Negativo SeraQingdao Regen Diagnostics Center
NDV HI Positivo SeraQingdao Regen Diagnostics Center
NDV HI Test Antigen AntigenQingdao Qingdao Regen Diagnostics Center
PBS Solución (1x) Adamas LifeC8020
(1,5 ml)Labshark130201012
mesa de baja velocidad refrigerada por aire Labshark 130201030 Centrífuga E607058 130207001de DesarrolloTubo de centrífuga estéril

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA. J Vis Exp. (80), e50830(2013).
  2. Chen, Y., et al. The HN protein of Newcastle disease virus induces cell apoptosis through the induction of lysosomal membrane permeabilization. PLoS Pathog. 20 (2), e1011981(2024).
  3. Miller, P. J., Decanini, E. L., Afonso, C. L. Newcastle disease: evolution of genotypes and the related diagnostic challenges. Infect Genet Evol. 10 (1), 26-35 (2010).
  4. Terregino, C., Capua, I. Clinical traits and pathology of Newcastle disease infection and guidelines for farm visit and differential diagnosis. Avian Influenza and Newcastle Disease: A Field and Laboratory. , 113-122 (2009).
  5. Dimitrov, K. M., Afonso, C. L., Yu, Q., Miller, P. J. Newcastle disease vaccines—A solved problem or a continuous challenge. Vet Microbiol. 206, 126-136 (2017).
  6. Sheng, W., et al. Molecular characteristics and phylogenetic analysis of pigeon paramyxovirus type 1 isolates from pigeon meat farms in Shanghai (2009-2012). Sci Rep. 14 (1), 10741(2024).
  7. Yates, J. G. E., et al. Production of high-titer recombinant Newcastle disease virus from allantoic fluid. J of Vis Exp. (183), e63817(2022).
  8. van Boven, M., et al. Herd immunity to Newcastle disease virus in poultry by vaccination. Avian Pathol. 37 (1), 1-5 (2008).
  9. Oberländer, B., et al. Evaluation of Newcastle disease antibody titers in backyard poultry in Germany with a vaccination interval of twelve weeks. PloS One. 15 (8), e0238068(2020).
  10. Bhattacharya, S., et al. Spillover of Newcastle disease virus to Himalayan Griffon vulture: a possible food-based transmission. Virus Genes. 60 (4), 385-392 (2024).
  11. World Organisation for Animal Health (OIE). Newcastle disease (Infection with Newcastle disease virus). Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. , (2024).
  12. Council of European Union. Council Directive 92/66/EEC of 14 July 1992 Introducing Community measures for the control of Newcastle disease. Document 31992L0066. L260, 1-20 (1992).
  13. Grimes, S. E. A basic laboratory manual for the small-scale production and testing of I-2 Newcastle disease vaccine. 2002/22, RAP Publication. 1-129 (2002).
  14. Dortmans, J. C. F. M., Peeters, B. P. H., Koch, G. Newcastle disease virus outbreaks: Vaccine mismatch or inadequate application. Vet Microbiol. 160 (1-2), 17-22 (2012).
  15. De Sousa, R. L. M., Montassier, H. J., Pinto, A. A. Detection and quantification of antibodies to Newcastle disease virus in ostrich and Rhea sera using a liquid phase blocking enzyme-linked immunosorbent assay. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (6), 940-944 (2000).
  16. Chumbe, A., Izquierdo-Lara, R., Calderón, K., Fernández-Díaz, M., Vakharia, V. N. Development of a novel Newcastle disease virus (NDV) neutralization test based on recombinant NDV expressing enhanced green fluorescent protein. Virol J. 14 (1), 232(2017).
  17. Webster, R., Cox, N., Stöhr, K. WHO animal influenza manual. WHO/CDS/CSR/NCS. 2002.5, 1-99 (2002).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Ensayo HIant geno 4 HAUdetecci n de anticuerposm todo de titulaci n inversaeritrocitos de polloplaca de microtitulaci ndetecci n serol gica

Artículos relacionados