Para el estudio de las respuestas de las células excitables in vitro, el protocolo describe el seguimiento óptico de los cambios en la generación de potencial de acción debidos a la electroporación en un modelo simple de célula excitable simple de células HEK con spiging tet-on modificadas genéticamente, así como los cambios en el voltaje transmembrana con extracción automatizada de parámetros relevantes.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Monitoreo de cambios inducidos por electroporación en la generación de potencial de acción en celdas HEK de Tet-On Spiking diseñadas genéticamente
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células excitables, como las neuronales y las musculares, pueden ser objetivos principales en los tratamientos basados en la electroporación que están surgiendo rápidamente. Sin embargo, pueden verse afectados por los pulsos eléctricos incluso en terapias en las que no son los objetivos principales, y esto puede causar efectos secundarios adversos. Por lo tanto, para optimizar los tratamientos basados en la electroporación de tejidos excitables y no excitables, es necesario estudiar los efectos de los impulsos eléctricos sobre las células excitables, sus canales iónicos y su excitabilidad in vitro. Para este propósito, se desarrolló un protocolo para el monitoreo óptico de los cambios en la generación de potencial de acción debido a la electroporación en un modelo de celda excitable simple de celdas HEK con spiga tet-on modificadas genéticamente. Con el uso de un colorante potenciométrico fluorescente, los cambios en el voltaje transmembrana se monitorizaron bajo un microscopio de fluorescencia, y los parámetros relevantes de las respuestas celulares se extrajeron automáticamente con una aplicación de MATLAB. De esta manera, se podrían evaluar de manera eficiente las respuestas de las células excitables a diferentes impulsos eléctricos y la interacción entre la excitación y la electroporación.
Introducción
En la electroporación, los pulsos eléctricos de alto voltaje causan un aumento en la permeabilidad de la membrana plasmática para moléculas que de otro modo serían mal permeadas1. Las técnicas basadas en la electroporación son hoy en día ampliamente utilizadas en aplicaciones en medicina2, biotecnología3 y tecnología de alimentos4.
Las células excitables, como las neuronales y las musculares, se encuentran entre los principales objetivos de los tratamientos basados en la electroporación que emergen rápidamente en el corazón, el cerebro ylos músculos esqueléticos. Además, pueden verse afectados por los impulsos eléctricos incluso en terapias en las que no son los objetivos principales, y esto puede causar efectos secundarios adversos como dolor, espasmos musculares y daño nervioso6. Es decir, los pulsos eléctricos pueden causar estimulación eléctrica de las células excitables: activan canales iónicos dependientes de voltaje y desencadenan potenciales de acción (AP). Sin embargo, en campos eléctricos más altos, la membrana plasmática de las células se vuelve permeabilizada y se produce corriente iónica adicional a través de poros/defectos7. Esta corriente iónica adicional afecta la excitabilidad de la célula en una compleja interacción entre excitación y electroporación. Por lo tanto, para optimizar los tratamientos basados en la electroporación de tejidos excitables y no excitables, es necesario estudiar los efectos de los impulsos eléctricos sobre las células excitables, sus canales iónicos y su excitabilidad in vitro.
En un estudio reciente8, exploramos células de riñón embrionario humano (HEK) genéticamente modificadas y desarrolladas por Cohen et al.9,10, como una herramienta valiosa para estudiar la electroporación en células excitables. En estas células, por lo demás no excitables, se expresa un complemento mínimo de canales de sodio y potasio (NaV1,5 y Kir2,1) necesario para la excitabilidad. La expresión de Kir2.1 en estas células está controlada por un sistema de tet-on inducido por doxiciclina que permite el establecimiento de dos variantes celulares: células S-HEK excitables con picos (que contienen NaV1.5 y Kir2.1) y células NS-HEK no excitables sin picos (que contienen solo canales de NaV1.5). Esto nos permite comparar los efectos de los impulsos eléctricos en variantes excitables y no excitables del mismo tipo de células. En comparación con las células excitables primarias aisladas, las células excitables diferenciadas de las células madre pluripotentes embrionarias o inducidas y las líneas celulares derivadas de tejidos excitables, las células S-HEK tienen varias ventajas: son fáciles de manejar, cultivar y propagar, tienen canales de sodio y potasio bien definidos y generan AP robustos8.
Diseñamos un protocolo para monitorear los cambios en el voltaje transmembrana (TMV) desencadenados por pulsos eléctricos de diferentes amplitudes con el uso de un colorante potenciométrico fluorescente. De esta manera, podemos estudiar cómo afecta la electroporación a la generación de AP en las células S-HEK y otros cambios en el TMV tanto en las células S-HEK como en las NS-HEK. En resumen, las células S-HEK o NS-HEK se exponen a un solo pulso eléctrico de 100 μs cada 2 minutos, y los cambios relativos en la fluorescencia se registran durante aproximadamente 3 s alrededor de cada aplicación de pulso. Los pulsos aplicados son de voltaje creciente, primero activando AP en las celdas y, a un campo eléctrico más alto, electroporación. El intervalo de 2 minutos entre la aplicación de pulsos se eligió para minimizar los posibles efectos acumulativos de pulsos consecutivos y mantener los experimentos lo suficientemente cortos como para no deteriorar las células. El procesamiento de imágenes se automatizó con una aplicación personalizada de MATLAB para extraer parámetros relevantes de las respuestas de fluorescencia del colorante potenciométrico, evaluando así los cambios en TMV (AP y despolarización sostenida debido a la electroporación) en celdas S-HEK y NS-HEK.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación de reactivos y cultivo celular
- Prepare el medio de cultivo celular complementando la glucosa media-alta de Eagle Modified de Dulbecco con suero fetal bovino al 10%, 2 mM de glutamina, penicilina-estreptomicina (penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 μg/mL), 2 μg/mL de puromicina, 5 μg/mL de blasticidina y 200 μg/mL de genética.
- Prepare una solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM deNa2HPO4 y 1,8 mM de KH2PO4, pH 7,4. Fíltralo a través de un filtro de membrana esterilizante con un tamaño de poro de 0,22 μm.
- Prepare la solución de Tyrode con 2 mM de KCl, 125 mM de NaCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 10 mM de HEPES, 30 mM de glucosa, pH 7,3. Prepare una solución Tyrode baja en potasio con 0,5 mM de KCl, 126,5 mM de NaCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 10 mM de HEPES, 30 mM de glucosa, pH 7,3. Filtre ambas soluciones a través de un filtro de membrana esterilizante con un tamaño de poro de 0,22 μm.
- Prepare 1 mg/mL de solución madre de poli-L-lisina añadiendo 5 mL de PBS en un vial que contenga 5 mg de poli-L-lisina.
- Prepare 2 mg/mL de solución madre de doxiciclina en agua destilada y fíltrela a través de un filtro de membrana esterilizante con un tamaño de poro de 0,22 μm.
- Prepare 4 mM de colorante potenciométrico ElectroFluor630 solución madre en etanol puro (agregue 25 μL de etanol puro al tubo que contiene 100 nM - 73 μg del colorante).
- Cultivo de células HEK modificadas genéticamente en un matraz T25 en 6 mL del medio de cultivo celular como se ha descritoanteriormente 8. Los ingredientes del medio de cultivo son sensibles a la luz; Por lo tanto, mantenga el medio protegido de la luz (envuelva el matraz mediano en papel de aluminio) y realice el paso en condiciones de poca luz.
- Pase las celdas cada 3-4 días sembrando 3 x 105 o 5 x 105 celdas a un matraz T25 fresco. Cuente las células con un hemocitómetro. Mantienen las células en un matraz maestro como células NS-HEK no excitables sin adición de doxiciclina porque no toleran la expresión sostenida de Kir2.1. Utilice celdas de pasajes inferiores a 14 en los experimentos.
2. Preparación de la muestra
- Recubrimiento de poli-L-lisina de portaobjetos de cámara de vidrio
- Pipetear 1 mL de PBS en un pocillo de los portaobjetos de la cámara de vidrio de cubierta de 2 pocillos, añadir 10 μL de solución estéril de poli-L-lisina de 1 mg/mL y mezclar bien con una pipeta.
- Incubar durante 1,5 h a temperatura ambiente en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. Retire el PBS con poli-L-lisina sin lavar más.
- Siembra de las células
- Prepare una dilución 1:10 de la solución madre de doxiciclina en un medio de cultivo en un tubo de 1,5 mL. Para cada pocillo se necesitan 30 μL de dilución de doxiciclina 1:10 (3 μL de solución madre de doxiciclina y 27 μL de medio de cultivo), preparar el volumen final en función del número total de pocillos experimentales.
- Retirar el medio de cultivo del matraz T25 e tripsinizar las células con 2,5 mL de solución de tripsina-EDTA en una incubadora de CO2 a 37 °C durante 2 min.
- Añadir 2,5 mL de medio de cultivo fresco y, mediante un pipeteo suave, separar las células de la superficie. Mezcle bien la suspensión de celdas.
- Cuente las células con un hemocitómetro y determine la densidad de células en suspensión.
- Calcular el volumen de suspensión celular tripsinizada necesario para establecer el cultivo. Para el cultivo de 2 días, siembre 2,5 x 105 celdas, y para el cultivo de 3 días, siembre 1 x 105 celdas por pocillo. Ajuste el número exacto de celdas si es necesario.
- Calcule el volumen del medio de cultivo restando el volumen de suspensión celular previamente calculado de 1470 μL. Los 30 μL restantes representan el volumen de dilución de doxiciclina 1:10. El volumen total de cada pocillo será de 1500 μL (células, doxiciclina y medio de cultivo).
- Para preparar muestras con células S-HEK excitables, pipetear el volumen calculado de medio de cultivo y suspensión celular tripsinizada en un pocillo y añadir 30 μL de dilución de doxiciclina 1:10. Utilice solo un pocillo de las cámaras de dos pocillos, ya que el experimento lleva mucho tiempo (alrededor de 40 minutos). Mezcle bien pipeteando suavemente justo antes de colocar las cámaras en la incubadora deCO2 .
- Para la preparación de muestras con células NS-HEK no excitables, pipetee el volumen calculado de medio de cultivo en un pocillo y añada el 90% del volumen calculado de suspensión celular para células S-HEK sin doxiciclina. Las células NS-HEK crecen ligeramente más rápido que las células S-HEK.
- Incubar las cámaras en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C durante 2-3 días antes del experimento. En el caso de las muestras con doxiciclina, este tiempo de incubación es suficiente para que las células sean excitables.
- Etiquetado de las celdas
- Antes del experimento, pipetear 3 μL de solución madre de colorante potenciométrico en un tubo de 1,5 mL y dejar el tubo abierto a temperatura ambiente en una campana de flujo laminar para permitir que el etanol se evapore y el colorante potenciométrico se seque (aproximadamente 15 min). Añadir 997 μL de medio de cultivo en frío (de un refrigerador a 4 °C) al tubo y disolver el colorante hasta una concentración final de 12 μM.
- Retire el medio de cultivo del pocillo y agregue 1 mL de solución de colorante potenciométrico a las células. Refrigerarlos a 4 °C e incubar durante 20 min.
- Retire la solución de colorante potenciométrico y guárdela en el tubo para su posterior reutilización (hasta seis experimentos secuenciales en 1 día).
- Lave suavemente las células 3 veces con la solución de Tyrode y, después del último lavado, pipetee 1 ml de solución de Tyrode con bajo contenido de potasio en el pocillo.
3. Electroestimulación y electroporación
- Configure la sincronización de la entrega de pulsos con la adquisición de imágenes mediante una señal TTL del sistema de microscopio que activa el generador de pulsos. Para la generación de pulsos de alto voltaje, utilice un generador de pulsos personalizado11 o cualquier generador de pulsos que se pueda activar externamente con una señal TTL.
NOTA: En la configuración experimental presentada, se utiliza el software LAS X para la adquisición de imágenes, que se puede configurar para enviar una señal TTL en un momento preseleccionado durante una adquisición de lapso de tiempo. - Coloque dos electrodos de alambre Pt/Ir paralelos, con un diámetro de 0,8 mm y una distancia de 5 mm entre los bordes interiores, en la parte inferior de la cámara y fije la cámara bajo el microscopio.
- Conecte los electrodos al generador de impulsos. Conecte la salida del generador de pulsos a un osciloscopio utilizando una sonda de voltaje y corriente para permitir la verificación de que los pulsos se entregaron correctamente durante el experimento.
- Enfoca las celdas en campo claro. Imagine las celdas que se encuentran aproximadamente en el medio entre los electrodos.
- Inicie la primera adquisición de imágenes de fluorescencia en modo time-lapse con un objetivo de 40x, registrando la señal de fluorescencia en todo el campo de visión. La cámara debe ser lo suficientemente rápida como para adquirir un curso de tiempo claro de un potencial de acción (idealmente superior a 25 fotogramas/s).
- Adquiera 80 imágenes en un modo de lapso de tiempo, con al menos 25 fotogramas / s para resolver el curso en tiempo real del potencial de acción. La duración total de la adquisición de imágenes es de unos 3 s. Durante la adquisición de imágenes, ilumine las celdas con una longitud de onda de excitación de 635 nm, un tiempo de exposición de 10 ms y detecte la emisión a unos 700 nm. En esta primera adquisición, no aplique ningún pulso: esta adquisición se utilizará para corregir las adquisiciones posteriores para el fotoblanqueo de tinte. Después de esta adquisición, espere 2 min.
NOTA: Este experimento utiliza 27,8 fotogramas/s, es decir, un período de 36 ms, que es el tiempo desde el comienzo de la primera adquisición de imagen hasta el comienzo de la siguiente adquisición de imagen en la grabación de lapso de tiempo).
- Adquiera 80 imágenes en un modo de lapso de tiempo, con al menos 25 fotogramas / s para resolver el curso en tiempo real del potencial de acción. La duración total de la adquisición de imágenes es de unos 3 s. Durante la adquisición de imágenes, ilumine las celdas con una longitud de onda de excitación de 635 nm, un tiempo de exposición de 10 ms y detecte la emisión a unos 700 nm. En esta primera adquisición, no aplique ningún pulso: esta adquisición se utilizará para corregir las adquisiciones posteriores para el fotoblanqueo de tinte. Después de esta adquisición, espere 2 min.
- Cada 2 minutos, grabe un lapso de tiempo de la misma manera que en el paso 3.5. Para estas adquisiciones, aplique un solo pulso de 100 μs en el momento de la adquisición de la 10ª imagen (a 324 ms). Adquiera imágenes con los siguientes voltajes de pulso: 63 V, 75 V, 88 V, 100 V, 125 V, 150 V, 175 V y 200 V. Estime el campo eléctrico al que están expuestas las celdas como la relación voltaje-distancia del electrodo aplicada (E = 126, 150, 176, 200, 250, 300, 350 y 400 V/cm).
NOTA: A campos eléctricos más bajos, los pulsos activarán potenciales de acción; En campos eléctricos más altos, desencadenarán la electroporación, que se manifiesta como una despolarización prolongada. La duración del experimento en cada muestra de células es de aproximadamente 40 minutos (20 minutos para el etiquetado y 20 minutos para la microscopía).
4. Análisis de datos
- Exporte las grabaciones de lapso de tiempo a formato tiff.
- Coloque las grabaciones de lapso de tiempo de todos los voltajes aplicados durante un experimento individual (una muestra de celdas) en una sola carpeta. Cambie el nombre de las grabaciones de lapso de tiempo de tal forma que la aplicación de MATLAB pueda reconocer el campo eléctrico E: Vcm (por ejemplo, 126 Vcm para 126 V/cm). Las partes restantes del nombre pueden ser arbitrarias. Para la adquisición al principio del experimento en el que no se aplica ningún pulso, cambie el nombre utilizando la frase 000Vcm. Un ejemplo de los nombres de grabación de lapso de tiempo: 2022_1_20 1DOX 000Vcm, 2022_1_20 1DOX 126Vcm, 2022_1_20 1DOX 150Vcm, etc.
- Abra la aplicación, que se puede descargar desde
https://github.com/bor-kos/fluorescenceActionPotential. Haga clic en Seleccionar carpeta de datos para elegir la carpeta que contiene las grabaciones de lapso de tiempo de un experimento. - Seleccione los píxeles que se utilizarán para el análisis posterior de los datos. Para ello, utilice dos controles deslizantes para determinar el umbral bajo para obtener una imagen clara de las membranas (en morado) y el umbral alto para eliminar residuos (puntos grandes con alta fluorescencia) del análisis (en verde).
- Seleccione Analizar datos. En la pestaña Análisis, aparece una tabla con los parámetros extraídos. En el lado derecho de la tabla, aparecen gráficos de fluorescencia relativa en el tiempo para cada E utilizado. Seleccione gráficos para una E determinada en el menú desplegable en el lado izquierdo sobre la tabla.
- Examine todos los gráficos y realice la corrección manual en caso de detección de picos falsos. Seleccione Borrar picos automáticos en la parte inferior de la pestaña Análisis y los picos que se detectaron se borrarán automáticamente. Haga clic en el gráfico para determinar manualmente un nuevo punto de hora punta.
- Seleccione Volver a ejecutar la detección automática de picos en la parte inferior de la pestaña Análisis para volver a realizar la detección automática de picos. Los parámetros extraídos ahora se ajustarán al nuevo pico.
- Seleccione Exportar datos en la parte inferior derecha de la pestaña Análisis para exportar datos a la misma carpeta en forma de archivo .mat, archivo de hoja de cálculo e imágenes PNG para cada E utilizado.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Los cambios en el TMV en células excitables in vitro desencadenados por pulsos eléctricos se pueden monitorear ópticamente con este protocolo, y las señales de fluorescencia se pueden analizar para extraer sus parámetros relevantes.
La configuración experimental se muestra en la Figura 1A. En la Figura 1B se muestra una señal típica de pulso eléctrico de 100 μs utilizada en los experimentos. Las células de las cámaras que se ...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Las células S-HEK son un modelo celular excitable simple con canales de sodio y potasio bien definidos, NaV1.5 y Kir2.19. Esto nos permite realizar estudios en profundidad de cómo responden las células excitables a los pulsos eléctricos aplicados y vincular los datos experimentales con modelos matemáticos basados en las características teóricas conocidas de los canales expresados en las células S-HEK. En nuestro estudio previo
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Agencia Eslovena de Investigación e Innovación (ARIS) dentro del programa de investigación P2-0249, el programa de infraestructura I0-0022 y el proyecto de investigación J2-2503. El trabajo fue apoyado en parte por ARIS y la Universidad de Liubliana a través de la financiación de programas de investigación de start-ups. El trabajo fue apoyado en parte por la Unión Europea y ARIS a través de la financiación de NextGenerationEU y NOO dentro del proyecto MN-0023. El trabajo fue apoyado en parte por la Unión Europea a través de la ERC Starting Grant (Nº 101115323 - REENCARNACIÓN) y la beca Marie Skłodowska-Curie (Nº 893077 - EPmIC). Sin embargo, los puntos de vista y opiniones expresados son únicamente los del autor o autores y no reflejan necesariamente los de la Unión Europea o del Consejo Europeo de Investigación. Ni la Unión Europea ni la autoridad que concede la ayuda pueden ser consideradas responsables de ellos. Los autores agradecen al grupo de Adam E. Cohen de la Universidad de Harvard por proporcionar amablemente las células HEK de pico tet-on y a Duša Hodžić por su ayuda en el laboratorio de cultivo celular.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo de 1,5 mL | Ratiolab | 5615000 | |
| 2 pocillos Nunc Lab-Tek II Chambered #1.5 Sistema de cubreobjetos alemán | Thermo Fisher Scientific | ||
| ADP305 Sonda de tensión diferencial | Teledyne LeCroy | ||
| AP015 Sonda de corriente | Teledyne LeCroy | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | ||
| incubadora de CO2 | PHCbi | MCO -230AICUV | |
| Doxiciclina | Sigma-Aldrich/Merck | D9891 | |
| Dulbecco' s Águila Modifada' s Medio de crecimiento de glucosa medio | alto Sigma-Aldrich/Merck | D5671 | |
| ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA) | sondas potenciométricas | 31795 | |
| Suero fetal bovino | Sigma-Aldrich/Merck | F2442 | |
| Geneticin | Thermo Fisher Scientific | ||
| Glutamina | Sigma-Aldrich/Merck | G7513 | |
| Campana de flujo laminar | Iskra Pio | MC 15-2 | |
| MATLAB | Mathworks | ||
| Penicilina– estreptomicina | Sigma-Aldrich/Merck | P07681 | |
| Hidrobromuro de poli-L-lisina | Sigma-Aldrich/Merck | P9155-5MG | |
| Generador de pulsos | Hecho a | ver referencia11 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | ||
| T25 25cm² Matraz para cultivo de tejidos | TPP | 90026 | |
| Tet-on spiking HEK | cells American Type Culture Collection ATCC | CRL-3479 | |
| Thunder Imager Live Cell system para microscopía de fluorescencia | Leica Microsystems | ||
| Solución de tripsina-EDTA | Sigma-Aldrich/Merck | T3924 | |
| WavePro 7300A Osciloscopio | Teledyne LeCroy |
Referencias
- Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavčič, D. Membrane electroporation and electropermeabilization: Mechanisms and models. Ann Rev Biophys. 48 (1), 63-91 (2019).
- Yarmush, M. L., Golberg, A., Serša, G., Kotnik, T., Miklavčič, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Ann Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
- Kotnik, T., et al. Electroporation-based applications in biotechnology. Trend Biotechnol. 33 (8), 480-488 (2015).
- Mahnič-Kalamiza, S., Vorobiev, E., Miklavčič, D. Electroporation in food processing and biorefinery. J Memb Biol. 247 (12), 1279-1304 (2014).
- Reddy, V. Y., et al. Pulsed field or conventional thermal ablation for paroxysmal atrial fibrillation. New Engl J Med. 389 (18), 1660-1671 (2023).
- Cvetkoska, A., Maček-Lebar, A., Trdina, P., Miklavčič, D., Reberšek, M. Muscle contractions and pain sensation accompanying high-frequency electroporation pulses. Sci Rep. 12 (1), 8019(2022).
- Tung, L., Tovar, O., Neunlist, M., Jain, S. K., O'neill, R. J. Effects of strong electrical shock on cardiac muscle tissue. Ann New York Acad Sci. 720 (1), 160-175 (1994).
- Batista Napotnik, T., et al. Genetically engineered HEK cells as a valuable tool for studying electroporation in excitable cells. Sci Rep. 14 (1), 720(2024).
- McNamara, H. M., Zhang, H., Werley, C. A., Cohen, A. E. Optically controlled oscillators in an engineered bioelectric tissue. Phys Rev X. 6 (3), 031001(2016).
- Tian, H., et al. Video-based pooled screening yields improved far-red genetically encoded voltage indicators. Nat Methods. 20 (7), 1082-1094 (2023).
- Sweeney, D. C., et al. Quantification of cell membrane permeability induced by monopolar and high-frequency bipolar bursts of electrical pulses. Biochim Biophys Acta Biomembranes. 1858 (11), 2689-2698 (2016).
- Pakhomov, A. G., et al. Long-lasting plasma membrane permeabilization in mammalian cells by nanosecond pulsed electric field (nsPEF). Bioelectromagnetics. 28 (8), 655-663 (2007).
- Lee, P., et al. In vivo ratiometric optical mapping enables high-resolution cardiac electrophysiology in pig models. Cardiovasc Res. 115 (11), 1659-1671 (2019).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
