Protocolo para cultivos de explantes de gliomas difusos de bajo grado con mutación en IDH1

Resumen

Los gliomas difusos de bajo grado con mutación IDH1 son tumores raros y difíciles de cultivar. Presentamos un método simple de explante no enzimático que preserva la expresión de la proteína mutante IDH1 y mantiene los cultivos durante meses. Es importante destacar que esta técnica funciona con tumores criopreservados, lo que ofrece un recurso valioso para la investigación del glioma.

Resumen

Los gliomas difusos, los tumores cerebrales primarios más prevalentes, se clasifican en grados bajos y altos en función de criterios histopatológicos y mutaciones genéticas. Los gliomas difusos de grado bajo constituyen un subgrupo, que afecta predominantemente a adultos jóvenes y predispone a gliomas de grado alto. Hay dos tipos principales de gliomas difusos de grado bajo: los astrocitomas y los oligodendrogliomas, cada uno definido por características genéticas e histológicas distintas. Estos tumores exhiben característicamente una variante mutada de la enzima metabólica IDH1, que interrumpe la diferenciación celular. Son heterogéneas y comprenden tanto células madre proliferativas como células gliales más diferenciadas y quiescentes.

Los modelos tumorales in vitro específicos del paciente tienen un potencial significativo para desentrañar los mecanismos oncogénicos y adaptar la selección de fármacos para una terapia personalizada. Sin embargo, la ausencia de modelos in vitro fiables específicos para los gliomas de bajo grado con mutación en IDH1 ha dificultado la investigación fundamental y traslacional. Aquí, presentamos un método simple para cultivar tumores con mutación IDH1 como explantes en medios definidos sin necesidad de disociación enzimática. Estos explantes pueden mantenerse durante períodos prolongados, manteniendo la expresión de la proteína mutante IDH1, así como marcadores para células progenitoras de oligodendrocitos como ASCL1 (MASH1), OLIG1 y OLIG2 y para astrocitos (GFAP, SOX9). También se pueden establecer a partir de tumores congelados en DMSO. Estos cultivos pueden servir como una plataforma valiosa para la detección de fármacos, la videomicroscopía y los estudios genéticos, lo que facilita los avances en la comprensión y el tratamiento de estos tumores difíciles. También ofrecen el potencial de derivar líneas celulares con mutaciones IDH1.

Introducción

Los gliomas difusos son los tumores cerebrales primarios más frecuentes. Estos tumores son actualmente incurables a pesar de un tratamiento muy intenso (cirugía, radio y quimioterapia)¹. Cada vez hay más pruebas que apoyan la hipótesis de que la gliomagénesis se origina a partir de células madre adultas o progenitoras gliales residentes en el cerebro². Aunque los glioblastomas representan el tipo más agresivo, los gliomas difusos de bajo grado (DLGG, tumores de grado 2) también son prevalentes (15% de los gliomas difusos)^1,3. Las DLGGs crecen lentamente y migran a lo largo de los tractos de sustancia blanca, un sello distintivo de esta neoplasia 'difusa'⁴. Estas DLGG muy a menudo se repiten a pesar del tratamiento, progresando finalmente a neoplasias malignas de alto grado (grados 3 y 4)⁵.

DLGG se caracterizan por una mutación de cambio de sentido en el gen de la isocitrato deshidrogenasa 1 o 2 (IDH1 o IDH2), lo que resulta en la producción aberrante del oncometabolito 2-hidroxiglutarato (2HG). Esto interrumpe la diferenciación celular a través de desregulaciones epigenéticas⁶. Los gliomas con mutaciones en IDH1 se clasifican a su vez en subtipos: los astrocitomas suelen tener mutaciones en ATRX y P53, mientras que los oligodendrogliomas se caracterizan por deleciones 1p19q⁷. Estos tumores exhiben una heterogeneidad de células tumorales. La secuenciación del ARN de una sola célula y la inmunocaracterización han revelado una población diversa de células tumorales, que muestran fenotipos similares a las células madre, a los astrocitos y a los oligodendrocitos dentro de estos tumores^8,9.

En contraste con el glioblastoma, que se beneficia de cultivos y líneas celulares fácilmente disponibles a largo plazo, existe una notable escasez de herramientas celulares diseñadas para investigar tumores con mutaciones en IDH1¹. Esto presenta un obstáculo importante para avanzar en el desarrollo terapéutico y profundizar nuestra comprensión de la gliomagénesis y la progresión de la enfermedad con mutación IDH1. Las líneas celulares tradicionales cultivadas en suero, aunque se utilizan durante mucho tiempo, replican inadecuadamente los tumores originales, mostrando perfiles transcripcionales alterados. Alternativamente, las condiciones de cultivo sin suero, ya sea en modelos tumoroides 2D o 3D, preservan de manera más efectiva los perfiles transcripcionales de las células tumorales y sus fenotipos in vivo, como la invasión en el tejido cerebral normal^10,11.

Además, los cultivos celulares a corto plazo derivados de la muestra quirúrgica de un paciente preservan el perfil molecular y la diversidad celular del tumor, representando así mejor los rasgos biológicos de los tumores en comparación con las líneas celulares¹². En este artículo, presentamos un método sencillo no enzimático para el cultivo de gliomas difusos de bajo grado con mutación IDH1 como explantes derivados de resecciones de pacientes frescas o congeladas, con el objetivo de abordar la necesidad de modelos in vitro mejorados para la investigación y el desarrollo terapéutico del glioma. También ofrecen el potencial de derivar líneas celulares con mutaciones IDH1.

Protocolo

Los fragmentos tumorales utilizados en este protocolo se obtuvieron de una colección bien caracterizada y aprobada éticamente, con el consentimiento del paciente. Esta investigación se realizó bajo el proyecto titulado Gliomacult: Caracterización y Cultivos Primarios de Gliomas de Bajo Grado (Número de Proyecto RECH/P722/1-5) y fue aprobada por el consejo científico del biobanco de tumores el 28 de agosto de 2023.

1. Preparación de placas de cultivo

NOTA: Realice estos pasos bajo una campana de flujo laminar de cultivo celular estéril.

1. Al menos 1 h antes del cultivo, prepare placas de 24 pocillos recubiertas con poli-D-lisina (PDL) y laminina.
   1. Diluya 10 mg de polvo de PDL en 100 mL de tampón de borato (pH 8,4) para obtener una concentración final de 100 µg/mL. Una vez disuelto, filtre la solución (0,22 µm) para esterilizarla. El PDL ya está listo para usar; prepare alícuotas de 3 mL y almacénelas a -20 °C.
   2. Descongele el tubo de laminina de 1-2 mg/mL a 4 °C para evitar la formación de gel. Prepare alícuotas de 50 µL y almacénelas a -20 °C.
      NOTA: Se debe evitar repetir los ciclos de descongelación y congelación.
   3. Recubrimiento de placas
      1. Paso opcional: coloque cubreobjetos estériles de Ø 13 mm, adecuados para placas de cultivo celular, en una placa de 24 pocillos, un cubreobjetos por pocillo.
         NOTA: Este paso es para realizar inmunotinciones adicionales de los explantes de glioma.
      2. Para el recubrimiento de los pocillos, mezcle 3 mL de la solución de PDL en 9 mL de PBS 1x y añada 50 µL de laminina. Añada 500 µL de esta solución a cada pocillo para obtener una concentración de recubrimiento de 1-2 µg/cm². Incube las placas recubiertas a temperatura ambiente, preferiblemente con agitación lenta (15 RPM), durante al menos 1 h.
      3. Inmediatamente antes del cultivo, retire la solución de PDL-laminina y lave dos veces con PBS 1x estéril.
         NOTA: No permita que los pocillos se sequen.

2. Medios

1. Cultive explantes con mutación IDH1 en un medio definido que consiste en DMEM/F12 suplementado con L-glutamina, junto con una mezcla de reemplazo del suero que incluye N2 y B27 sin vitamina A. Utilice antibióticos, como ciprofloxacino, gentamicina y fungina, para prevenir la contaminación bacteriana y fúngica. Además, incorpore factores de crecimiento como heparina, EGF y FGF2 al medio, filtre el medio (0,2 µm) y almacénelo hasta por 2 semanas a 4 °C.
   NOTA: Para obtener más detalles sobre los componentes del medio y su preparación, consulte Tabla 1 y la Tabla de Materiales.

3. Preparación de los explantes

1. Antes del procesamiento de la muestra, prepare el área de trabajo y las herramientas estériles como se muestra en Figura 1A. Sanitice una bolsa de enfriamiento rociándola con etanol al 70%. Esterilice las tijeras y pinzas sumergiéndolas en etanol al 70% y enjuagándolas con PBS.
2. Transfiera inmediatamente la resección tumoral para su cultivo sobre hielo, idealmente dentro de las 2 h posteriores a la extracción quirúrgica (Figura 1B).
   NOTA: La muestra tumoral debe tener un diámetro mínimo de 9-10 mm para garantizar mejores resultados. El tejido se transporta sin medio de cultivo, ya que este método es preferido para fines histológicos. La ausencia de líquido evita la formación de cristales de hielo durante la congelación rápida, preservando así la integridad del tejido para un examen histológico posterior si fuera necesario.
3. Coloque el cultivo con la muestra tumoral sobre la bolsa de enfriamiento y enjuáguelo suavemente con PBS 1X para eliminar el exceso de sangre.
4. El tumor resecado suele presentar un tamaño considerable y heterogeneidad, compuesto por masa tumoral, tejido infiltrado y componentes no tumorales (Figura 1C). Seleccione porciones con color grisáceo y textura blanda o similar a gelatina para el aislamiento de células tumorales, ya que tienden a contener mayor cantidad de células tumorales. Por el contrario, evite las regiones duras y blancas, ya que pueden contener menos células tumorales adecuadas para el cultivo (Figura 1D), así como las áreas ennegrecidas, que probablemente sean resultado de electrocoagulación y podrían no proporcionar resultados confiables para el análisis.
5. Transfiera las muestras seleccionadas a un microtubo de 1,5 mL o un criovial para su picado. Añada 1 mL de medio estéril al microtubo de 1,5 mL o al criovial y corte la muestra con las tijeras estériles hasta obtener fragmentos pequeños (1-2 mm³).
   NOTA: Se necesitan aproximadamente 1-2 min de picado para obtener fragmentos diminutos, generalmente de tamaño 1-2 mm³ (Figura 1E).
6. Con tijeras estériles, corte cuidadosamente el extremo de una punta azul de pipeta de 1.000 µL para crear una abertura ancha, de aproximadamente 3-4 mm de diámetro. Utilizando esta punta modificada, aspire 50-200 µL de los fragmentos de tejido picado y distribúyalos uniformemente en cada pocillo. Dado que los fragmentos más pequeños tienden a sedimentar rápidamente, rehomogenice suavemente la suspensión en cada pocillo para asegurar una distribución uniforme.
   ​NOTA: Evite la sobrecarga y mantenga un equilibrio, sin introducir un número excesivo de fragmentos en cada pocillo (Figura 1F).
7. Incube los fragmentos tumorales a 37°C en una incubadora con 5% de CO2 y humedad al 100%. Cambie el medio cada día si la actividad metabólica del tumor (indicada por el enrojecimiento rápido del medio) y la cantidad de fragmentos en cada pocillo lo requieren. Durante los cambios de medio, tenga cuidado al aspirar delicadamente el medio usando una pipeta equipada con una punta de 200 µL, asegurándose de no perturbar los fragmentos tumorales adheridos.

Figura 1: Procedimiento de cultivo de explantes tumorales. Se obtuvo una resección de glioma difuso de bajo grado de un paciente de 44 años diagnosticado con astrocitoma grado II según la clasificación de la OMS 2021. El tumor presentaba una mutación en IDH1 (exón 4 c.395 G>A, p.Arg132His) y una mutación en TP53 (exón 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis), junto con la ausencia de tinción de ATRX. No se detectaron mutaciones en los sitios de unión Ets/TCF (C250T y C228T) del gen TERT. (A) La superficie de trabajo comprende una bolsa fría, que proporciona un entorno que minimiza la degradación de la muestra y mantiene la viabilidad de los componentes biológicos. Estas precauciones son importantes para preservar la calidad e integridad del tejido. (B) El transporte de la muestra desde el hospital hasta el laboratorio debe realizarse sobre hielo. (C) Fragmento de resección tumoral. Las flechas indican las partes más adecuadas para el cultivo. (D) Se realiza la disección del tumor para seleccionar la parte más relevante que será picada. Según nuestra experiencia, la sustancia blanca generalmente tiene menos probabilidades de generar explantes exitosos. (E) Fragmentos tumorales de aproximadamente 1-2 mm³ de diámetro en un tubo de 15 mL tras ser picados mecánicamente con tijeras. (F) Se muestra la cantidad de fragmentos tumorales necesarios para la siembra adecuada en pozos de una placa de 24 pozos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Criopreservación y descongelación del tejido tumoral picado

NOTA: La criopreservación garantiza una copia de seguridad en caso de contaminación y pérdida de cultivos de explantes o para procesar las muestras tumorales en un momento posterior.

1. Criopreservación: Prepare el medio de congelación (solución al 20% v/v de DMSO) añadiendo 2 mL de DMSO a 8 mL de medio de cultivo celular.
2. Combine un volumen de la suspensión de tumor triturado con un volumen igual del medio de congelación al 20% de DMSO para obtener una concentración final del 10% de DMSO. Pipetee cuidadosamente la mezcla hacia arriba y hacia abajo para asegurar una mezcla completa, luego distribuya aproximadamente 1 mL en viales criogénicos.
3. Transfiera rápidamente los viales criogénicos a un recipiente criogénico para reducir gradualmente la temperatura, seguido de una incubación nocturna a -80 °C antes del almacenamiento final en nitrógeno líquido.
   NOTA: Este paso debe realizarse inmediatamente después de colocar las células en el medio de congelación, ya que ciertos crioprotectores, como el DMSO, pueden ser dañinos si las células están expuestas a ellos a temperatura ambiente durante más tiempo del necesario.
4. Descongelación: Saque los viales criogénicos del nitrógeno líquido y colóquelos inmediatamente en un baño de agua a 37 °C hasta que alrededor del 80% de las células se hayan descongelado.
5. Para eliminar el DMSO, pipetee rápidamente la suspensión en un tubo cónico de 15 mL que contenga 5 mL de PBS 1x precalentado y centrifugue a 300 × g durante 5 min.
6. Retire el sobrenadante y repita el lavado con PBS 1X seguido de centrifugación (paso 4.5). Aspire el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el botón celular, y añada la cantidad adecuada de medio para transferir a una placa de 24 pocillos recubierta con PDL-Laminina y coloque en el incubador.
7. Después de 24 h, verifique que las células se hayan adherido. Después de unos días, elimine los fragmentos no adherentes reemplazando el medio de cultivo.

5. Pase de la cultura

NOTA: Una vez establecidos, los explantes pueden utilizarse para videomicroscopía o inmunotinción. Alternativamente, si las células tumorales han migrado fuera del explante y presentan un aspecto saludable, el explante puede ser pasado mediante disociación enzimática y resembrado en pocillos para experimentos posteriores. Sin embargo, es importante tener en cuenta que este protocolo no está diseñado para pasajes repetidos. Por lo general, solo se puede realizar un único pasaje antes de que las células tumorales entren en senescencia o mueran. No todos los cultivos de explantes darán lugar a un pasaje exitoso.

1. Para el pase, retire el medio antiguo, lave con PBS 1X y agregue (125 µL) de tripsina-EDTA al 0,05 % a los pocillos e incube durante 3-4 min a 37 °C, seguido por la adición de 6,5 µL de inhibidor de tripsina, 12 µL de CaCl₂ 20 mM (dilución final a 2 mM) y 1 µL de DNasa I.
   NOTA: El tiempo de incubación necesario para la disociación puede variar según el cultivo. Es importante verificar si las células se han desprendido después de al menos 3 min. Por lo general, el explante puede no disociarse completamente en una suspensión de células individuales, y a menudo se conservan pequeños cúmulos, que pueden generar nuevos cultivos de explantes.
2. Con una pipeta p1000 ajustada a 500-600 µL, realice un lavado suave para desagregar los explantes. Evite la formación de burbujas.
3. Agregue 5 mL de PBS 1X y centrifugue durante 5 min a 300 × g. Aspire el sobrenadante, resuspenda el sedimento en medio fresco precalentado y cuente para siembra.
4. Identifique los cultivos con potencial para generar líneas celulares observando las células en división bajo un microscopio de contraste de fases. Estas células en división suelen tener una morfología redondeada y cromosomas visibles, como se muestra en Figura 2A.

Resultados

Después de unos días, algunos fragmentos tumorales se adherirán a las superficies de las pocilas, iniciando la migración celular a partir de los explantes. El tiempo entre el cultivo inicial y la aparición de células tumorales en crecimiento varía según la muestra. Los cultivos iniciales suelen contener una cantidad considerable de restos celulares, lo que dificulta evaluar la presencia de células viables. Por consiguiente, el cultivo debe mantenerse durante un mínimo de 4 semanas. Una vez que las células comienzan a cre...

Discusión

El desarrollo de modelos in vitro y preclínicos para gliomas de bajo grado con mutación en IDH1 es particularmente difícil debido al crecimiento lento de estos tumores y a la complejidad de replicar las extensas alteraciones genómicas y epigenómicas causadas por la mutación en IDH. Además, estas células tumorales infiltrativas interactúan activamente con células circundantes, incluyendo células inmunitarias, endoteliales, gliales y neuronales, posiblemente dependiendo de ellas para su supervivencia. Esta compleja interac...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anti-ASCL1	BD Pharmingen™	556604	Dilución 1:500
Anti-ATRX	Sigma-Aldrich		HPA001906 Dilución 1:100
Anti-CD68	Agilent	M081401-2	Dilución 1:500
Anti-GFAP	Aves Labs	AB_2313547	Dilución 1:500
Anti-IBA1	Anticuerpos Fujifilm Wako	019-19741	Dilituion 1:1000
Anticuerpo monoclonal anti-IDH1 (R132H) de ratón	Dianova	DIA-H09
Anti-KI67	BD Pharmingen™	556003	Dilituion 1:1000
Anti-OLIG1	R& D Sistemas®	AF2417	Dulituion 1:300
Anti-OLIG2	Sigma-Aldrich	MABN50	Dilución 1:250
Anti-SOX9	Abcam®	EPR14335-78	Dilución 1:100
B-27 Suplemento (50x), menos vitamina A	Thermo Fisher Scientific	12587010
Albúmina sérica bovina (BSA)	CiteAb	A-421-100
Ciprofloxacina HCl	Sigma-Aldrich	PHR1044-1G
CoolCell	Corning®	432000	Contenedor de congelación de células, para viales criogénicos de 12 x 1 mL o 2
mL Cubreobjetos Ø, 13 mm	Karl Hecht™ Asistencial&comercio;
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
DMEM/F-12, sin glutamina	Thermo Fisher Scientific	21331020
DNAse I	Sigma-Aldrich	10104159001
Dulbecco′ s Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x	Sigma-Aldrich	D8537
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning®
Falcon 24-well Clear Flat Bottom Corning	®	353047	Placa de cultivo celular multipocillo tratada con TC, con tapa, estéril
Hongo	InvivoGen	ant-fn-1
Gentamicina	Thermo Fisher Scientific	15750-037
Heparina	Sigma-Aldrich	H3149-100KU
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3375
EGF humano	PeproTech	AF-100-15-1MG
FGF humano-básico	PeproTech	100-18B-1MG
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
L-Glutamina	Thermo Fisher Scientific	25030-024
N-2 Suplemento (100x )	Thermo Fisher Scientific	17502-048
PDL	Sigma-Aldrich	P7886
Serum acrodisc 37 mm filtro de jeringa con GF/0.2 y micro; m Supor	PALL Corporation	4525
Inhibidor de tripsina	Thermo Fisher Scientific	17075-029
Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol	Thermo Fisher Scientific	25300054
Zeiss Z1 Apotome 3 Microscopio	Zeiss		de campo amplio recto

328017353003 de epifluorescencia