Protocolo para cultivos de explantes de gliomas difusos de bajo grado con mutación en IDH1

Resumen

Los gliomas difusos de bajo grado con mutación IDH1 son tumores raros y difíciles de cultivar. Presentamos un método simple de explante no enzimático que preserva la expresión de la proteína mutante IDH1 y mantiene los cultivos durante meses. Es importante destacar que esta técnica funciona con tumores criopreservados, lo que ofrece un recurso valioso para la investigación del glioma.

Resumen

Los gliomas difusos, los tumores cerebrales primarios más prevalentes, se clasifican en grados bajos y altos en función de criterios histopatológicos y mutaciones genéticas. Los gliomas difusos de grado bajo constituyen un subgrupo, que afecta predominantemente a adultos jóvenes y predispone a gliomas de grado alto. Hay dos tipos principales de gliomas difusos de grado bajo: los astrocitomas y los oligodendrogliomas, cada uno definido por características genéticas e histológicas distintas. Estos tumores exhiben característicamente una variante mutada de la enzima metabólica IDH1, que interrumpe la diferenciación celular. Son heterogéneas y comprenden tanto células madre proliferativas como células gliales más diferenciadas y quiescentes.

Los modelos tumorales in vitro específicos del paciente tienen un potencial significativo para desentrañar los mecanismos oncogénicos y adaptar la selección de fármacos para una terapia personalizada. Sin embargo, la ausencia de modelos in vitro fiables específicos para los gliomas de bajo grado con mutación en IDH1 ha dificultado la investigación fundamental y traslacional. Aquí, presentamos un método simple para cultivar tumores con mutación IDH1 como explantes en medios definidos sin necesidad de disociación enzimática. Estos explantes pueden mantenerse durante períodos prolongados, manteniendo la expresión de la proteína mutante IDH1, así como marcadores para células progenitoras de oligodendrocitos como ASCL1 (MASH1), OLIG1 y OLIG2 y para astrocitos (GFAP, SOX9). También se pueden establecer a partir de tumores congelados en DMSO. Estos cultivos pueden servir como una plataforma valiosa para la detección de fármacos, la videomicroscopía y los estudios genéticos, lo que facilita los avances en la comprensión y el tratamiento de estos tumores difíciles. También ofrecen el potencial de derivar líneas celulares con mutaciones IDH1.

Introducción

Los gliomas difusos son los tumores cerebrales primarios más frecuentes. Estos tumores son actualmente incurables a pesar de un tratamiento muy intenso (cirugía, radio y quimioterapia)¹. Cada vez hay más pruebas que apoyan la hipótesis de que la gliomagénesis se origina a partir de células madre adultas o progenitoras gliales residentes en el cerebro². Aunque los glioblastomas representan el tipo más agresivo, los gliomas difusos de bajo grado (DLGG, tumores de grado 2) también son prevalentes (15% de los gliomas difusos)^1,3. Las DLGGs crecen lentamente y migran a lo largo de los tractos de sustancia blanca, un sello distintivo de esta neoplasia 'difusa'⁴. Estas DLGG muy a menudo se repiten a pesar del tratamiento, progresando finalmente a neoplasias malignas de alto grado (grados 3 y 4)⁵.

DLGG se caracterizan por una mutación de cambio de sentido en el gen de la isocitrato deshidrogenasa 1 o 2 (IDH1 o IDH2), lo que resulta en la producción aberrante del oncometabolito 2-hidroxiglutarato (2HG). Esto interrumpe la diferenciación celular a través de desregulaciones epigenéticas⁶. Los gliomas con mutaciones en IDH1 se clasifican a su vez en subtipos: los astrocitomas suelen tener mutaciones en ATRX y P53, mientras que los oligodendrogliomas se caracterizan por deleciones 1p19q⁷. Estos tumores exhiben una heterogeneidad de células tumorales. La secuenciación del ARN de una sola célula y la inmunocaracterización han revelado una población diversa de células tumorales, que muestran fenotipos similares a las células madre, a los astrocitos y a los oligodendrocitos dentro de estos tumores^8,9.

En contraste con el glioblastoma, que se beneficia de cultivos y líneas celulares fácilmente disponibles a largo plazo, existe una notable escasez de herramientas celulares diseñadas para investigar tumores con mutaciones en IDH1¹. Esto presenta un obstáculo importante para avanzar en el desarrollo terapéutico y profundizar nuestra comprensión de la gliomagénesis y la progresión de la enfermedad con mutación IDH1. Las líneas celulares tradicionales cultivadas en suero, aunque se utilizan durante mucho tiempo, replican inadecuadamente los tumores originales, mostrando perfiles transcripcionales alterados. Alternativamente, las condiciones de cultivo sin suero, ya sea en modelos tumoroides 2D o 3D, preservan de manera más efectiva los perfiles transcripcionales de las células tumorales y sus fenotipos in vivo, como la invasión en el tejido cerebral normal^10,11.

Además, los cultivos celulares a corto plazo derivados de la muestra quirúrgica de un paciente preservan el perfil molecular y la diversidad celular del tumor, representando así mejor los rasgos biológicos de los tumores en comparación con las líneas celulares¹². En este artículo, presentamos un método sencillo no enzimático para el cultivo de gliomas difusos de bajo grado con mutación IDH1 como explantes derivados de resecciones de pacientes frescas o congeladas, con el objetivo de abordar la necesidad de modelos in vitro mejorados para la investigación y el desarrollo terapéutico del glioma. También ofrecen el potencial de derivar líneas celulares con mutaciones IDH1.

Protocolo

Los fragmentos tumorales utilizados en este protocolo se obtuvieron de una colección bien caracterizada y éticamente aprobada, con el consentimiento del paciente. Esta investigación se llevó a cabo en el marco del proyecto Gliomacult: Caracterización y Cultivos Primarios de Gliomas de Bajo Grado (Proyecto No. RECH/P722/1-5) y fue aprobado por el consejo científico del biobanco de tumores el 28 de agosto de 2023.

1. Preparación de placas de cultivo

NOTA: Realice estos pasos bajo una campana de flujo laminar de cultivo de tejidos estéril.

1. Al menos 1 h antes del cultivo, prepare placas de 24 pocillos recubiertas de poli-D-lisina (PDL) y laminina.
   1. Diluir 10 mg de polvo de PDL en 100 mL de tampón borato (pH 8,4) hasta una concentración final de 100 μg/mL. Una vez disuelta, filtrar la solución (0,22 μm) para obtener esterilidad. PDL está listo para usar; preparar 3 mL de alícuotas y almacenarlas a -20 °C.
   2. Descongele el tubo de laminina de 1-2 mg/ml a 4 °C para evitar la formación de gel. Prepare 50 μL de alícuotas y guárdelas a -20 °C.
      NOTA: Se debe evitar la descongelación y congelación repetidas.
   3. Recubrimiento de placas
      1. Paso opcional: coloque cubreobjetos estériles de Ø, 13 mm, adecuados para placas de cultivo celular, en una placa de 24 pocillos, un cubreobjetos por pocillo.
         NOTA: Este paso es para una inmunotinción adicional de explantes de glioma.
      2. Para el recubrimiento de los pocillos, mezcle los 3 mL de la solución de PDL en 9 mL de 1x PBS y agregue 50 μL de laminina. Agregue 500 μL de esta solución a cada pocillo para obtener una concentración de recubrimiento de 1-2 μg/cm². Incubar las placas recubiertas a temperatura ambiente, preferiblemente con balanceo lento (15 RPM), durante al menos 1 h.
      3. Inmediatamente antes del cultivo, retire la solución de PDL-laminina y enjuague dos veces con 1x PBS.
         estéril NOTA: No deje que los pozos se sequen.

2. Medios

1. Cultivo de explantes con mutación IDH1 en un medio definido que comprende DMEM/F12 suplementado con L-glutamina, junto con una mezcla de reemplazo de suero que consiste en N2 y B27 sin vitamina A. Use antibióticos, incluidos ciprofloxacina, gentamicina y hongos, para prevenir la contaminación bacteriana y fúngica. Además, incorpore los factores de crecimiento heparina, EGF y FGF2 en el medio, fíltrelo (0,2 μm) y almacene hasta 2 semanas a 4 °C.
   NOTA: Para obtener detalles sobre los ingredientes y la preparación de los medios, consulte la Tabla 1 y la Tabla de Materiales.

3. Preparación del explante

1. Antes del procesamiento de la muestra, prepare el espacio de trabajo y las herramientas estériles como se muestra en Figura 1A. Desinfecte una compresa fría rociándola con etanol al 70%. Esterilice las tijeras y pinzas sumergiéndolas en etanol al 70% y enjuagándolas con PBS.
2. Transfiera rápidamente la resección tumoral para cultivo en hielo, idealmente dentro de las 2 h posteriores a la extracción quirúrgica (Figura 1B).
   NOTA: La muestra tumoral debe tener un diámetro mínimo de 9-10 mm para garantizar mejores resultados. El tejido se transporta sin medio de cultivo, ya que este método es el preferido para fines histológicos. La ausencia de líquido evita la formación de cristales de hielo durante la congelación instantánea, preservando así la integridad del tejido para el examen histológico posterior si es necesario.
3. Coloque la placa de cultivo con el espécimen tumoral sobre la compresa fría y enjuáguela suavemente con 1X PBS para eliminar el exceso de sangre.
4. El tumor resecado a menudo exhibe un tamaño y heterogeneidad significativos, que comprenden masa tumoral, tejido infiltrado y componentes no tumorales (Figura 1C). Seleccione porciones que muestren un color gris con una textura suave o gelatinosa para el aislamiento de células tumorales, ya que tienden a contener más células tumorales. Por el contrario, evite las regiones duras y blancas, ya que pueden contener menos células tumorales adecuadas para el cultivo (Figura 1D), así como las áreas ennegrecidas, ya que probablemente sean el resultado de la electrocauterización y pueden no proporcionar resultados fiables para el análisis.
5. Transfiera las muestras seleccionadas a un microtubo de 1,5 mL o criovial para picarlas. Añadir 1 mL de medio estéril al microtubo de 1,5 mL o criovial y picar la muestra con las tijeras estériles hasta obtener trozos pequeños (1-2 mm³)
   NOTA: Se necesitan aproximadamente 1-2 minutos de picado para obtener fragmentos diminutos, generalmente de 1-2 mm³ de tamaño (Figura 1E).
6. Con unas tijeras estériles, recorte con cuidado el extremo de una punta de pipeta azul de 1.000 μL para crear una abertura amplia, de unos 3-4 mm de diámetro. Empleando esta punta modificada, pipetee 50-200 μL de los fragmentos de tejido picado y distribúyalos uniformemente por cada pocillo. Debido a que las piezas más pequeñas tienden a asentarse rápidamente, vuelva a homogeneizar suavemente la suspensión en cada pocillo para garantizar una distribución uniforme.
   NOTA: Evite el hacinamiento y mantenga un equilibrio al no introducir un número excesivo de fragmentos en cada pozo (Figura 1F).
7. Incubar los fragmentos tumorales a 37°C en una incubadora de CO2 al 5% con 100% de humedad. Cambie el medio todos los días si la actividad metabólica del tumor (indicada por el rápido amarillamiento del medio) y la cantidad de fragmentos en cada pocillo lo requieren. Durante los cambios de medio, tenga cuidado aspirando delicadamente el medio con una pipeta equipada con una punta de 200 μL, asegurándose de evitar alterar los fragmentos tumorales adheridos.

Figura 1: Procedimiento de cultivo de explantes tumorales. Se obtuvo una resección difusa de glioma de bajo grado de un paciente de 44 años diagnosticado de astrocitoma grado II según la clasificación de la OMS 2021. El tumor presentaba una mutación en IDH1 (Exón 4 c.395 G>A, p.Arg132His) y una mutación en TP53 (Exón 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis), junto con la ausencia de tinción ATRX. No se detectaron mutaciones en los sitios de unión Ets/TCF (C250T y C228T) del gen TERT. (A) La superficie de trabajo comprende un paquete de refrigeración, proporcionando un entorno que minimiza la degradación de la muestra y mantiene la viabilidad de los componentes biológicos. Estas precauciones son importantes para preservar la calidad e integridad del tejido. (B) El transporte de la muestra desde el hospital hasta el laboratorio debe realizarse en hielo. (C) Fragmento de resección tumoral. Las flechas muestran las partes más adecuadas para el cultivo. (D) Se realiza la disección del tumor para seleccionar la parte más relevante que se va a picar. En nuestra experiencia, la materia blanca es generalmente menos probable que genere explantes exitosos. (E) Fragmentos tumorales de aproximadamente 1-2 mm³ de diámetro en un tubo de 15 mL después de haber sido picados mecánicamente con tijeras. (F) El número de piezas tumorales necesarias para la siembra adecuada se muestra para los pocillos en una placa de 24 pocillos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Criopreservación y descongelación de tumores picados

NOTA: La criopreservación garantiza el respaldo en caso de contaminación y pérdida de cultivos de explantes o para procesar las muestras tumorales posteriormente.

1. Criopreservación: Prepare el medio de congelación (solución de DMSO al 20% v/v) añadiendo 2 mL de DMSO a 8 mL de medio de cultivo celular.
2. Combine 1 volumen de la suspensión tumoral picada con un volumen igual del medio de congelación de DMSO al 20 % para lograr una concentración final de DMSO al 10 %. Pipetee cuidadosamente la mezcla hacia arriba y hacia abajo para asegurar una mezcla completa, luego dispense aproximadamente 1 ml en crioviales.
3. Transfiera rápidamente los crioviales a un recipiente criogénico para una reducción gradual de la temperatura, seguido de una incubación nocturna a -80 °C antes del almacenamiento final en nitrógeno líquido.
   NOTA: Este paso debe realizarse inmediatamente después de que las células se coloquen en el medio de congelación, ya que ciertos crioprotectores, como el DMSO, pueden ser dañinos si las células se exponen a ellos a temperatura ambiente durante más tiempo del necesario.
4. Descongelación: Retire los crioviales del nitrógeno líquido y colóquelos inmediatamente en un baño de agua a 37 °C hasta que aproximadamente el 80% de las células se hayan descongelado.
5. Para eliminar el DMSO, pipetee rápidamente la suspensión en un tubo de centrífuga de 15 mL que contenga 5 mL de PBS 1x precalentado y centrifugue a 300 × g durante 5 min.
6. Retire el sobrenadante y repita el lavado con 1X PBS seguido de centrifugación (paso 4.5). Aspire el sobrenadante, teniendo cuidado de no alterar el pellet, y agregue la cantidad adecuada de medio para transferirlo a una placa de 24 pocillos PDL-Laminin prerrecubierta y colóquela en la incubadora.
7. Después de 24 h, verifique que las celdas se hayan unido. Después de unos días, elimine los fragmentos no adherentes reemplazando el medio de cultivo.

5. Paso de la cultura

NOTA: Una vez establecidos, los explantes se pueden utilizar para videomicroscopía o inmunotinción. Alternativamente, si las células tumorales han migrado fuera del explante y parecen sanas, el explante puede pasar a través de la disociación enzimática y volver a sembrarse en pozos para una mayor experimentación. Sin embargo, es importante tener en cuenta que este protocolo no está diseñado para pases repetidos. Por lo general, solo se puede intentar un solo paso antes de que las células tumorales se vuelvan senescentes o mueran. No todos los cultivos de explantes darán lugar a un paso exitoso.

1. Para el paso, retire los medios viejos, enjuague con 1X PBS y agregue (125 μL) tripsina-EDTA al 0,05% a los pocillos e incube durante 3-4 minutos a 37 °C, seguido de la adición de 6,5 μL de inhibidor de tripsina, 12 μL de 20 mM de CaCl₂ (dilución final a 2 mM) y 1 μL de ADNasa I.
   NOTA: El tiempo de incubación necesario para la disociación puede variar según el cultivo. Es importante comprobar si las células se desprenden después de al menos 3 minutos. Por lo general, es posible que el explante no esté completamente disociado en una suspensión de una sola célula, y a menudo se conservan pequeños grupos, lo que puede generar nuevos cultivos de explantes.
2. Con un p1000 ajustado a 500-600 μL, enjuague suavemente para desagregar los explantes. Evite la formación de burbujas.
3. Añadir 5 mL de 1x PBS y centrifugar durante 5 min a 300 × g. Aspire el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en un medio fresco precalentado y cuente para la siembra.
4. Identifique cultivos con el potencial de generar líneas celulares mediante la observación de células en división bajo un microscopio de contraste de fase. Estas células en división suelen tener una morfología redondeada y cromosomas visibles, como se muestra en Figura 2A.

Resultados

Después de unos días, algunos fragmentos de tumor se adherirán a las superficies del pocillo, iniciando el crecimiento de las células de los explantes. El tiempo que transcurre entre la siembra inicial y la aparición de las células tumorales en crecimiento es diferente de una muestra a otra. Los cultivos iniciales a menudo contienen desechos celulares sustanciales, lo que dificulta la evaluación de la presencia de células viables. En consecuencia, el cultivo debe mantenerse durante un mínimo de 4 semanas. Una vez que las...

Discusión

El desarrollo de modelos in vitro y preclínicos para gliomas de bajo grado con mutación IDH1 es particularmente desafiante debido al lento crecimiento de estos tumores y la complejidad de replicar las extensas alteraciones genómicas y epigenómicas causadas por la mutación IDH. Además, estas células tumorales infiltrativas interactúan activamente con las células circundantes, incluidas las células inmunitarias, endoteliales, gliales y neuronales, y potencialmente dependen de ellas para sobrevivir. Esta compleja interacció...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anti-ASCL1	BD Pharmingen™	556604	Dilución 1:500
Anti-ATRX	Sigma-Aldrich		HPA001906 Dilución 1:100
Anti-CD68	Agilent	M081401-2	Dilución 1:500
Anti-GFAP	Aves Labs	AB_2313547	Dilución 1:500
Anti-IBA1	Anticuerpos Fujifilm Wako	019-19741	Dilituion 1:1000
Anticuerpo monoclonal anti-IDH1 (R132H) de ratón	Dianova	DIA-H09
Anti-KI67	BD Pharmingen™	556003	Dilituion 1:1000
Anti-OLIG1	R& D Sistemas®	AF2417	Dulituion 1:300
Anti-OLIG2	Sigma-Aldrich	MABN50	Dilución 1:250
Anti-SOX9	Abcam®	EPR14335-78	Dilución 1:100
B-27 Suplemento (50x), menos vitamina A	Thermo Fisher Scientific	12587010
Albúmina sérica bovina (BSA)	CiteAb	A-421-100
Ciprofloxacina HCl	Sigma-Aldrich	PHR1044-1G
CoolCell	Corning®	432000	Contenedor de congelación de células, para viales criogénicos de 12 x 1 mL o 2
mL Cubreobjetos Ø, 13 mm	Karl Hecht™ Asistencial&comercio;
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
DMEM/F-12, sin glutamina	Thermo Fisher Scientific	21331020
DNAse I	Sigma-Aldrich	10104159001
Dulbecco′ s Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x	Sigma-Aldrich	D8537
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning®
Falcon 24-well Clear Flat Bottom Corning	®	353047	Placa de cultivo celular multipocillo tratada con TC, con tapa, estéril
Hongo	InvivoGen	ant-fn-1
Gentamicina	Thermo Fisher Scientific	15750-037
Heparina	Sigma-Aldrich	H3149-100KU
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3375
EGF humano	PeproTech	AF-100-15-1MG
FGF humano-básico	PeproTech	100-18B-1MG
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
L-Glutamina	Thermo Fisher Scientific	25030-024
N-2 Suplemento (100x )	Thermo Fisher Scientific	17502-048
PDL	Sigma-Aldrich	P7886
Serum acrodisc 37 mm filtro de jeringa con GF/0.2 y micro; m Supor	PALL Corporation	4525
Inhibidor de tripsina	Thermo Fisher Scientific	17075-029
Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol	Thermo Fisher Scientific	25300054
Zeiss Z1 Apotome 3 Microscopio	Zeiss		de campo amplio recto