Control espacio-temporal de la actividad proteica a través de la regulación alostérica optogenética

Resumen

Este protocolo describe la aplicación de un dominio de interruptor alostérico activado por luz azul (LightR) para el control espacio-temporal reversible de la actividad de las proteínas. Utilizando la tirosina quinasa Src como modelo, este estudio ofrece un protocolo elaborado para desarrollar y caracterizar Src regulado por luz (LightR-Src). Demuestra la versatilidad de este enfoque en todas las clases de enzimas.

Resumen

La optogenética ofrece el potencial de imitar el control espacio-temporal complejo de la actividad enzimática hasta una resolución subcelular. Sin embargo, la mayoría de los enfoques optogenéticos a menudo enfrentan desafíos significativos para integrar múltiples capacidades en una sola herramienta aplicable a una amplia gama de proteínas objetivo. Lograr un control preciso sobre la cinética de encendido y apagado, garantizar una fuga mínima en la oscuridad y demostrar un rendimiento eficiente en células de mamíferos con precisión subcelular son algunos de los desafíos más comunes que se enfrentan en este campo. Una solución prometedora radica en la aplicación de dominios sensibles a la luz diseñados racionalmente para controlar alostéricamente la actividad de las proteínas. Con esa estrategia, generamos un método optogenético que combina todas las características deseadas. El enfoque implica la incorporación del módulo de interruptor alostérico regulado por luz (LightR) en la proteína objetivo para regular la actividad enzimática utilizando luz azul (465 nm). El dominio LightR se genera mediante la unión de dos dominios fotorreceptores Vivid (VVD), creando una abrazadera sensible a la luz que se puede incorporar en un pequeño bucle flexible dentro del dominio catalítico de una enzima. En su estado oscuro, la pinza LightR está abierta, distorsionando así el dominio catalítico de la enzima e inactivándola. Tras la exposición a la luz azul, el dominio LightR se cierra y restaura la estructura y la actividad enzimática del dominio catalítico. En este manuscrito, discutimos estrategias de diseño para generar una proteína quinasa regulada por luz y demostramos su control por luz azul, reversibilidad, cinética y regulación precisa a nivel subcelular, lo que permite una precisión espacio-temporal ajustada. Utilizando la tirosina quinasa Src como modelo, mostramos un protocolo para regular eficazmente la actividad de la quinasa LightR-Src. También demostramos la aplicabilidad de LightR en diferentes clases de enzimas, ampliando la utilidad del sistema de herramientas para abordar cuestiones mecanicistas de las vías de señalización en diferentes enfermedades.

Introducción

La capacidad de la célula para interpretar señales externas y convertirlas en respuestas específicas en contextos fisiológicos o patológicos está dirigida por grupos específicos de proteínas. La contribución de cualquier proteína a estas respuestas complejas a menudo se define por su ubicación subcelular, nivel de expresión y el momento de la activación transitoria, sostenida u oscilatoria. Diseccionar el papel de estos parámetros individuales en la regulación de la señalización exige métodos capaces de replicar el intrincado control espacio-temporal de la actividad de las proteínas a nivel subcelular. Las técnicas tradicionales, como la manipulación genética y los inhibidores de moléculas pequeñas, se quedan cortas en este sentido. Por el contrario, las técnicas optogenéticas prometen el potencial para la disección de procesos biológicos mediante la manipulación o imitación de procesos fisiológicos y patológicos. Sin embargo, las herramientas actuales a menudo carecen de una amplia aplicabilidad o control subcelular. Varias estrategias existentes logran una regulación estricta de la localización y las interacciones de las proteínas; pero carecen de control directo sobre la actividad enzimática 1,2,3,4. Otros permiten la regulación de la actividad enzimática, pero pueden carecer de control subcelular o tener una aplicabilidad limitada en diferentes clases de enzimas 5,6,7,8,9. En este documento de protocolo, describimos un nuevo método de ingeniería de proteínas que combina las ventajas de la optogenética en una sola herramienta: regulación temporal estricta, cinética sintonizable, control subcelular y amplia aplicabilidad enzimática¹⁰. Diseñamos un dominio regulado por luz (LightR) que funciona como un interruptor alostérico cuando se inserta en la proteína objetivo de interés. Esta estrategia permite un estricto control espacio-temporal de la activación y desactivación de una proteína de interés en las células vivas.

Aquí, se discute el diseño y la estrategia de aplicación de la herramienta optogenética LightR en varias clases de enzimas. Este estudio ofrece un protocolo paso a paso para el desarrollo, caracterización y aplicación de la tirosina quinasa Src regulada por luz (LightR-Src). El estudio demuestra aún más la capacidad de ajuste de la cinética de inactivación del interruptor LightR. El interruptor LightR de inactivación lenta puede mantener la actividad enzimática con una frecuencia de iluminación reducida, mientras que la versión de ciclo rápido, FastLightR, requiere una iluminación más frecuente para la activación, pero muestra una inactivación rápida cuando la iluminación está apagada. La activación/inactivación de FastLightR-Src en células vivas induce ciclos de propagación y retracción celular. La diseminación celular inducida por FastLightR-Src coincide con el papel fisiológico de la quinasa Src^11,12. Debido a la cinética de inactivación rápida, FastLightR-Src también se puede regular a nivel subcelular, lo que resulta en la estimulación de las protuberancias locales y la polarización celular. Para demostrar la aplicabilidad de la herramienta LightR a otros tipos de enzimas, guiamos brevemente a los lectores a través de un éxito similar con la quinasa bRaf regulada por luz diseñada (LightR-bRaf, FastLightR-bRaf) y una recombinasa de ADN Cre de sitio específico (LightR-Cre). En general, este enfoque tiene el potencial de avanzar en nuestra comprensión de las complejas vías de señalización que dan forma a la fisiopatología de diversas enfermedades.

Protocolo

1. Diseño y desarrollo de LightR (Figura 1)

1. Planificación estratégica
   NOTA: El dominio LightR se compone de dos dominios fotorreceptores Vivid (VVD) conectados en tándem de Neurospora crassa^13,14,15,16. Los VVD se homodimerizan en presencia de luz, y dicha dimerización implica un cambio conformacional que hace que el extremo N-terminal de un monómero VVD coincida con el extremo C de otro monómero VVD (Figura 1A). La conexión de dos dominios VVD con un enlazador flexible crea un dominio en forma de abrazadera que se abrirá en la oscuridad y se cerrará al iluminarse con luz azul. La integración de esta pinza en el dominio catalítico de una enzima permite la regulación de la actividad mediada por la luz. En la oscuridad, la pinza abierta distorsiona el dominio, desactivando la enzima; La iluminación con la luz azul hace que la pinza se cierre, restaurando la actividad de la enzima (Figura 1B). Este concepto se puede aplicar a enzimas de varias familias, incluidas las proteínas quinasas y las recombinasas de ADN¹⁰ (Figura 1C).
   1. Diseño de LightR
      1. Para conectar dos moléculas de VVD, utilice un enlazador flexible de 22 aminoácidos (GGS)4G(GGS)3 entre cada monómero.
         NOTA: El enlazador proporciona suficiente flexibilidad y longitud para acomodar la asociación y disociación de monómeros VVD.
      2. Agregue enlazadores GPGGSGG y GSGGPG a los terminales N y C del dominio LightR, respectivamente.
         NOTA: Es posible que sea necesario ajustar la longitud y la composición de los enlazadores para una proteína específica. Los enlazadores GSG más cortos y de un solo Gly se utilizan de forma rutinaria cuando se necesita una regulación más estricta. El tamaño del bucle de inserción y su proximidad a los residuos catalíticos también influirán en el rango dinámico de la regulación. Es más probable que los bucles más cortos proporcionen una regulación más estricta de la actividad catalítica, pero pueden resultar en una menor actividad después de la iluminación. La secuencia del dominio LightR se proporciona en la Tabla complementaria 1.
   2. Inserción de LightR
      NOTA: Un sitio de inserción de LightR adecuado permitirá una regulación estricta de la función del dominio objetivo sin bloquear estéricamente sus interacciones ni causar cambios estructurales irreversibles que afecten su papel biológico. Una estructura cristalina de la proteína objetivo es una guía ideal en la identificación de tales regiones de bucle flexibles para la inserción de LightR. Si es necesario, la estructura cristalina de un homólogo cercano puede ser suficiente. A continuación se proporcionan algunos criterios generales a tener en cuenta.
      1. Asegúrese de que el bucle de inserción esté acoplado estructuralmente a los elementos catalíticos críticos de la enzima. Asegúrese de que el bucle de inserción seleccionado no sea un sitio de unión existente para la proteína y que la inserción de LightR no interrumpa potencialmente ninguna interacción funcional debido a efectos estéricos.
      2. Como estrategia inicial, reemplace un aminoácido en el bucle de inserción al insertar LightR. Diríjase al centro del bucle de inserción que contenga un aminoácido polar o pequeño (por ejemplo, Glu, Arg, Lys, Gly) expuesto al disolvente y que no participe en interacciones intramoleculares.
         NOTA: Cuando el reemplazo de un aminoácido no da como resultado una proteína funcional, la optimización de la construcción LightR requerirá el reemplazo de múltiples aminoácidos o todo el ciclo de inserción. Evalúe la funcionalidad de varios sitios de inserción para LightR dentro del bucle definido.
      3. Asegurar que la enzima diana funcione independientemente de la regulación endógena. Para ello, utilice una versión mutante constitutivamente activa de la enzima para la plantilla de inserción.
         NOTA: Las enzimas de tipo salvaje también se pueden usar para generar construcciones LightR, pero esto puede resultar en un sistema AND cerrado que estará regulado por mecanismos endógenos y luz.
      4. Los controles positivos y negativos son vitales para el análisis de la actividad de la enzima LightR. Utilice mutantes constitutivamente activos de proteínas endógenas como controles positivos y versiones mutantes catalíticamente inactivas de la enzima LightR objetivo como controles negativos.
         NOTA: Al seleccionar mutaciones inactivadoras, es crucial asegurarse de que la mutación esté lo suficientemente espaciada desde el sitio de inserción de LightR para evitar interrumpir la irreversibilidad del plegamiento de la enzima LightR. Sobre la base de los criterios anteriores, el sitio de inserción de LightR en la quinasa Src se selecciona en una región de bucle flexible que está estructuralmente acoplada al motivo GXGXXG altamente conservado en la región de bucle G/bucle rico en glicina de unión a ATP a través de una hebra beta. Es importante destacar que se coloca lejos del bolsillo de unión de ATP y de la región de unión del sustrato^10,17 (Figura 1C (i)).
         NOTA: Debido a la homología estructural entre quinasas, el sitio de inserción de LightR en bRaf se selecciona en el mismo bucle estructural que el sitio de inserción en Src (Figura 1C (ii)).
         NOTA: Sobre la base de los principios establecidos en la Sección 1.1.2., el sitio de inserción de LightR en Cre recombinasa, una no quinasa, se elige en uno de los bucles flexibles distantes del núcleo catalítico, es decir, el sitio de unión al ADN. Sin embargo, el bucle de inserción todavía está estructuralmente acoplado a los residuos catalíticos críticos dentro del dominio de unión al ADN a través de una α-hélice para garantizar el éxito de la funcionalidad de LightR-Cre (Figura 1C (iii)). Todos los sitios de inserción con controles positivos y negativos para las diferentes enzimas descritas en el protocolo actual se detallan en la Tabla Suplementaria 2.
   3. Desarrollo de FastLightR.
      NOTA: La introducción de la mutación I85V en ambos VVDs en LightR permite una dinámica de activación-inactivación más rápida, atribuida a la rápida conversión del mutante al estado oscuro^18,19. La generación de FastLightR-Src y FastLightR-bRaf con cinética de inactivación rápida permite un control temporal estricto de la activación y la inactivación. Permite lograr la regulación subcelular de LightR-Src en células vivas.
      NOTA: La actividad recombinasa de Cre da lugar a una recombinación irreversible del ADN; por lo tanto, las propiedades de reversibilidad de LightR no son aplicables.
      NOTA: Para simplificar la detección de la construcción LightR, se puede adjuntar una proteína fluorescente o cualquier otra etiqueta adecuada al extremo N o C de la proteína objetivo. En este estudio se utilizó mCherry-myc para LightR-Src, Venus para LightR-bRaf y miRFP670 para LightR-Cre recombinasa.
2. Estrategia de clonación
   NOTA: El enfoque de clonación, a diferencia de los enfoques tradicionales, se basa en la mutagénesis dirigida al sitio que no se basa en sitios de restricción específicos^10,20.
   1. Generación de un "Megaprimer"
      1. Codón - Optimice los genes LightR para garantizar la expresión estable de las dos secuencias de ADN VVD en tándem de origen fúngico en células de mamíferos y para hacer que las secuencias sean lo más diferentes posible para una clonación sin errores mediante PCR. Para realizar la optimización de codones, siga los pasos 1.2.1.2-1.2.1.3.
      2. Alinee la secuencia de aminoácidos de los VVD y los enlazadores seleccionados uno al lado del otro para crear el mapa de secuencia teórico de LightR.
      3. Pegue la secuencia en cualquier plataforma de optimización de codones en línea que utilice un algoritmo avanzado para la optimización de codones para determinar la mejor opción de secuencia con una complejidad mínima. Asegúrese de seleccionar el organismo objetivo, mantener el marco de lectura y seleccionar las secuencias VVD para la optimización.
      4. Obtenga el ADN de LightR como un fragmento sintetizado personalizado (consulte la Tabla complementaria 1) o de una construcción de LightR¹⁰ publicada anteriormente.
      5. Amplifique el gen LightR para generar "Megaprimer" utilizando la estrategia²⁰ descrita anteriormente en la Figura 1D. Sintetice el LightR "Megaprimer" mediante PCR siguiendo las recomendaciones del fabricante para la ADN polimerasa específica y utilizando la siguiente mezcla de reacción de PCR:
         5x tampón compatible con ADN polimerasa: 10 μL
         100 μM Megaprimer delantero: 0,5 μL
         100 μM Megaprimer inverso: 0,5 μL
         Mezcla dNTP de 10 nM: 2 μL
         ADN polimerasa (2000 unidades/mL): 1 μl (0,02 U/μL)
         50 ng ADN plantilla: 1 μL
         Agua de grado PCR: 35 μL
         NOTA: Aquí se utiliza la ADN polimerasa de arranque en caliente de alta fidelidad con temperaturas de recocido de cebador universales.
      6. Separar la megaimprimación resultante mediante electroforesis en gel de agarosa. El producto tendrá una longitud aproximada de 1000 nucleótidos. Extraer la megaimprimación del gel de agarosa y purificar utilizando un kit de extracción en gel, siguiendo las recomendaciones del fabricante o utilizando una técnica análoga.
   2. Inserción del gen LightR mediante mutagénesis dirigida al sitio: Inserte el LightR, reemplazando un aminoácido deseado o una longitud de aminoácidos. El plásmido de plantilla será aquel en el que se inserte el dominio LightR. Realice la reacción de PCR como se describió anteriormente²⁰ utilizando la siguiente mezcla.
      5x Tampón compatible con ADN polimerasa: 5 μL
      Mezcla dNTP de 10 nM: 1 μL
      ADN polimerasa (2000 unidades/mL): 1 μL (0,02 U/μL)
      50 ng ADN de la plantilla objetivo: 1 μL
      Megaprimer extraído (masa calculada): 10 μL
      DMSO: 2,5 μL
      Agua de grado PCR: 2,5 μL
      NOTA: Masa del megubador (ng) = relación molar deseada entre la plaquita y el vector x la masa del vector x la relación entre las longitudes del inserto y del vector. La relación molar de inserción/vector deseada utilizada es de 3/1.
   3. Una vez finalizada la reacción de PCR, añadir 1 μL de enzima DpnI (2000 unidades/mL) para digerir selectivamente sólo el exceso de ADN metilado e incubar la mezcla a 37 °C durante 1-1,5 h. Esto aumentará significativamente el rendimiento de la construcción modificada.
   4. Transformar 1-2 μL de la reacción de PCR en células competentes para DH5α siguiendo los protocolos del fabricante.
   5. Placa de bacterias transformadas en placa de caldo Luria (LB)-agar con el antibiótico adecuado para la selección. Incubar la placa a 37 °C durante la noche o a temperatura ambiente (RT; 25-30 °C) durante 72 h.
      NOTA: Las placas LB con colonias cultivadas en ellas se pueden almacenar a 4 °C hasta por 1 mes, y el protocolo se puede pausar.
   6. PCR de cribado de colonias
      1. Para el cribado de colonias basado en PCR, diseñe cebadores que se recocen en el inserto LightR y se dirijan al ADN para generar fragmentos de aproximadamente 400-700 pb.
      2. Agregue una pequeña cantidad de una colonia de la placa LB a la mezcla de PCR que se proporciona a continuación y proceda al termociclado siguiendo las recomendaciones del fabricante para la ADN polimerasa específica.
         2x Mezcla Maestra Taq RED: 5 μL
         Agua de grado PCR: 5 μL
         100 μM Imprimación directa : 0,5 μL
         100 μM Imprimación inversa: 0,5 μL
      3. Comprobación de colonias positivas mediante electroforesis en gel de agarosa.
      4. Elija las colonias que generaron el tamaño de producto de PCR deseado e inocule individualmente en 3 mL de caldo LB con el antibiótico, coincidiendo con la resistencia al antibiótico en la columna vertebral del plásmido. A continuación, incubar y agitar a 37 °C durante la noche.
      5. Extraiga el ADN plasmídico del cultivo líquido siguiendo las instrucciones del fabricante del kit de purificación de plásmidos para la extracción de ADN plasmídico y verifique la presencia del inserto mediante secuenciación.
         NOTA: Los cebadores de clonación se resumen en la Tabla Suplementaria 3.

2. Recubrimiento celular y análisis bioquímico de la actividad de la enzima LightR (Figura 2A)

1. Para el análisis bioquímico de las LightR-quinasas (LightR Src, FastLightR Src, LightR bRaf), coloque 1 x 10⁶ células LinXE por placa de cultivo celular de 3,5 cm para cada grupo experimental. Véase el cuadro complementario 4.
2. Incubar las células a 37 °C y 5 % de CO₂ durante 16-18 h.
3. Al día siguiente, transfectar las células con la construcción de ADN seleccionada, utilizando un reactivo de transfección adecuado siguiendo las recomendaciones del fabricante (Tabla suplementaria 4).
   NOTA: El reactivo de transfección óptimo dependerá de la construcción, el vector y el tipo de células utilizadas. En este estudio se utilizaron 2 μg de ADN en una placa de 3,5 cm utilizando un reactivo de transfección. Se deben realizar pruebas empíricas para determinar el reactivo de transfección óptimo. Dado que las construcciones transfectadas expresarán proteínas reguladas por luz azul, todos los pasos posteriores del manejo de células transfectadas deben realizarse bajo luz roja. Envuelva las placas con celdas transfectadas con papel de aluminio antes de colocarlas en la incubadora para evitar la iluminación accidental.
4. Después de 16-18 h de transfección, exponga las células a la luz azul¹⁰. Para realizar esto, coloque un sistema de lámpara de panel de diodo emisor de luz (LED) de 465 nm en la incubadora de cultivo de tejidos. Coloque un panel de plexiglás perforado a 10 cm por encima de la lámpara para obtener la iluminación deseada de 3 mW/^cm2 (Archivo Suplementario 1). Se necesita un panel perforado para mantener la circulación de aire ininterrumpida en la incubadora. Ilumina las celdas durante el período deseado.
5. Para la activación de LightR-Src y LightR-bRaf, utilice iluminación continua. Para una iluminación continua, encienda y apague el panel LED manualmente.
6. Para mantener el ciclo de activación/inactivación de FastLightR Src, utilice ciclos de encendido/apagado controlados manualmente o por un microcontrolador.
   NOTA: Se pueden utilizar varios kits de herramientas de software que proporcionan un entorno de desarrollo integrado (IDE) para escribir y cargar el código requerido. Estos kits de herramientas admiten la programación C/C++ y ofrecen acceso de entrada/salida de propósito general (GPIO), que es esencial para controlar la iluminación pulsada. En el Archivo Complementario 1 se describe detalladamente los protocolos y el código utilizados para estos fines.
7. Al final de los respectivos puntos de tiempo del experimento (Tabla suplementaria 4), recoja las células bajo luces rojas seguras. Aspire el medio y lave las celdas con PBS frío.
8. Para aislar la proteína, lisar las células con 500 μL de tampón de muestra Laemmli 2x suplementado con 2-Mercaptoetanol al 5% v/v. Incubar el lisado a 100 °C durante 5 min. Analizar los lisados celulares mediante electroforesis en gel de proteínas y Western blot²¹.
   NOTA: La composición de 2x tampón Laemmli es la siguiente: Para 500 mL: 5,18 g de Tris-HCL, 131,5 mL de glicerol, 52,5 mL de SDS al 20%, 0,5 g de azul de bromofenol, pH final 6,8.
9. Evaluar la actividad de LightR-Src evaluando el nivel de fosforilación de p130cas endógena en Tyr249 y paxillin en TyrY118^22,23 (Figura 2). Evaluar la actividad de LightR-bRaf evaluando el nivel de fosforilación de MEK1 en Ser217/221 y ERK1/2 en TyrY202/204^24,25.

3. Análisis funcional de la actividad de LightR-Cre

1. Para el análisis funcional de la actividad de LightR-Cre, placa 1 x 10⁶ células LinXE por placa de cultivo celular de 3,5 cm. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO₂ durante 16-18 h.
2. Transfecte las células siguiendo el protocolo descrito en la sección 2, Figura 2A y la Tabla complementaria 5. Co-transfecta un total de 2 μg de ADN, con una proporción de 1:9 de LightR-Cre-iRFP670 y un plásmido Reporter Floxed-STOP-mCherry².
3. Después de 16-18 h después de la transfección, ilumine las células. Una activación eficiente de LightR-Cre necesita una iluminación prolongada. Por lo tanto, para evitar la fototoxicidad, utilice iluminación pulsada durante 8 h con ciclos de 2 s ON y 20 s OFF utilizando un sistema de lámpara de panel LED de 465 nm controlado por un microcontrolador como se detalla en la sección 2 y en el Archivo Suplementario 1.
4. Realice imágenes mediante microscopía de epifluorescencia con un objetivo de aire de 20x. Para la visualización de LightR-Cre-iRFP670, utilice el conjunto de filtros Cy5, y para la visualización de mCherry a partir de la expresión Floxed-mCherry, utilice el conjunto de filtros RFP.
   NOTA: Para la obtención de imágenes, se utiliza un microscopio de epifluorescencia equipado con cubos de luz Cy5/RFP.

4. Preparación de muestras para la obtención de imágenes de células vivas

1. Placa 2 x 10⁵ células HeLa por placa de cultivo de tejidos de 35 mm en medio de cultivo celular e incubar durante 2 h a 37 °C y 5% de CO₂.
2. Una vez que las células se hayan unido y la confluencia sea de aproximadamente el 60%-70%, cotransfecte las células HeLa con una de las siguientes mezclas: (i) 0,85 μg de FastLightR-Src-mCherry-myc/0,15 μg de Stargazin-iRFP, o (ii) 0,75 μg de FastLightR-bRaf-Venus/0,25 μg de mCherry-ERK2
   NOTA: En los experimentos FastLightR-Src, el Stargazin-iRFP se utiliza para etiquetar la membrana plasmática para el análisis de propagación celular. Si se desea una mayor expresión de FastLightR-Src, se puede omitir stargazin-iRFP y, en su lugar, se puede usar 1 μg de FastLightR-Src. En estos casos, se debe utilizar un tinte de membrana para visualizar las células. Las tinciones de membrana plasmática se utilizan de forma rutinaria para etiquetar las membranas celulares.
3. Cubra la placa con papel de aluminio para evitar la iluminación accidental de las células e incube durante 16-18 h a 37 °C y 5% de CO₂.
4. Complete todos los pasos siguientes bajo la iluminación de luz roja para evitar la activación inadvertida de las construcciones. La exposición a la luz blanca inducirá la activación de las LightR-quinasas y podría afectar a los resultados posteriores.
5. El mismo día, rebozar 3 cubreobjetos de vidrio redondos (25 mm de diámetro, 0,17 mm de grosor) durante la noche con 5 mg/L de fibronectina en PBS a 37 °C.
6. Enjuague los cubreobjetos con PBS 16-18 h después de la transfección y coloque ~1 x 10^{5 5} células HeLa transfectadas en cada cubreobjetos. Incubar en medios de cultivo celular durante 2 h a 37 °C y 5% de_CO2.
   NOTA: La baja densidad de siembra es necesaria para garantizar que las células en el campo de visión no se toquen entre sí.
7. Prepare los medios de imagen añadiendo FBS a los medios de imagen L-15 de Levobitz hasta una concentración final del 5%. Filtre la solución a través de un filtro de 0,22 μm y caliéntela a 37 °C.
8. Precalentar el aceite mineral a 37 °C.
9. Lave los cubreobjetos que contienen las células con PBS dos veces. Si usas un tinte para membranas, tiñe las células siguiendo las instrucciones del fabricante antes de lavar los cubreobjetos.
10. Coloque con cuidado el cubreobjetos en una cámara de imágenes de células vivas. Agregue 1 mL de medio de imagen L-15 a la cámara.
11. Agregue 1 ml de aceite mineral sobre el medio para evitar la evaporación durante el proceso de obtención de imágenes.
12. Mantenga la cámara protegida de la luz a 37 °C hasta que esté preparada para la toma de imágenes.

5. Activación global e imágenes de FastLightR-Src (Figura 3)

1. Coloque un anillo de luz LED azul para microscopía en el condensador del microscopio, colocándolo aproximadamente 1,5 cm por encima del portamuestras. Conecte el relé de control de CA/CC para el anillo de luz a la computadora del microscopio.
   NOTA: Para los experimentos de este estudio, la iluminación se controló a través de una interfaz lógica de transistor-transistor (TTL) a través del software de imágenes. La iluminación epifluorescente también se puede usar para activar globalmente las construcciones LightR si no hay una fuente de iluminación externa disponible. Las longitudes de onda de excitación GFP, como el filtro de excitación de 490/20 nm, son efectivas para activar LightR.
2. Coloque la cámara en una platina de microscopio precalentada a 37 °C y seleccione celdas que expresen FastLightR-Src-mCherry y Stargazin-iRFP (Figura 3B) o FastLightR-bRaf-Venus y mCherry ERK-2 (Figura 5B).
3. Para el estudio de experimentos de iluminación global e imágenes, utilice objetivos de alto rendimiento compatibles con microscopio (40x) con corrección apocromática, corrección de campo plano y alta apertura numérica.
   1. Para estudios basados en iluminación global de la cinasa Src, utilice filtros de excitación de 561/10 nm y de emisión de 595/40 nm para visualizar FastLightR-Src-mCherry y utilice la excitación de 640/20 nm y el filtro de emisión 655LP para visualizar stargazin-iRFP.
   2. Para estudios basados en iluminación global de la quinasa bRaf, utilice filtros de excitación de 514/10 nm y de emisión de 540/21 nm para visualizar FastLightR-bRaf-Venus y utilice filtros de excitación de 561/10 nm y de emisión de 595/40 nm para visualizar mCherry-ERK-2.
   3. Utilice un espejo policromático multibanda en todos los canales de imágenes fluorescentes.
4. Dependiendo de las condiciones experimentales, considere las siguientes recomendaciones.
   1. Tome imágenes de las células durante al menos 10 minutos antes de la iluminación para establecer una actividad basal de las células.
      NOTA: Esta línea de base es necesaria para determinar si la activación de la quinasa FastLightR por iluminación induce algún cambio en el comportamiento de la célula o en la localización de la proteína. También se pueden realizar períodos más largos de imágenes basales para proporcionar una mayor significación estadística.
   2. Debido a la rápida cinética de inactivación de FastLightRs, la inclusión de muchas células para la obtención de imágenes puede provocar la desactivación de Src/bRaf entre las posiciones de la etapa y puede atenuar su respuesta. Para evitar este error, imagine 4 células/min mientras analiza la actividad de FastLightR-Kinase en el protocolo descrito e imagine cada célula seleccionada cada minuto durante un total de 110 minutos (Archivo complementario 2).
   3. Utilice la iluminación pulsada en lugar de la iluminación continua para reducir los posibles efectos fototóxicos de la luz azul. La iluminación durante 12 s para cada una de las 4 celdas/min es efectiva (Archivo Suplementario 2, Figura 3A).
      NOTA: Los ciclos de iluminación deben determinarse empíricamente para diferentes construcciones y tipos de fuentes de iluminación.
   4. Apague la iluminación durante la obtención de imágenes celulares para evitar el sangrado en los canales fluorescentes.
      NOTA: La obtención de imágenes de demasiadas células a la vez disminuirá el tiempo total de iluminación disponible para la muestra, lo que provocará una respuesta atenuada debido a una activación insuficiente.
5. Después de la imagen, guarde las películas como un archivo . Formato de archivo de pila TIF para análisis.
   NOTA: Debido a la iluminación menos uniforme con la epifluorescencia GFP en comparación con la luz anular, los experimentos con epifluorescencia GFP requerirán una iluminación más frecuente. Esto da como resultado que se obtengan imágenes de menos células por experimento.

6. Activación subcelular e imagen de FastLightR-Src (Figura 4)

1. Coloque la cámara en una platina de microscopio precalentada a 37 °C y seleccione una sola célula que exprese tanto FastLightR-Src-mCherry como Stargazin-iRFP.
2. Seleccione las regiones específicas (ROI) dentro de la celda que desea iluminar. Este estudio elige un área pequeña en la periferia de la célula seleccionada.
   NOTA: Para la iluminación local, se utiliza un láser de 445 nm enfocado por un módulo TIRF en modo FRAP o un dispositivo de microespejo controlado a través de la interfaz TTL a través del software de imagen. Cualquier sistema de iluminación con patrones funcionará para estos experimentos. Si se utiliza un sistema basado en escaneo, determine la intensidad y la homogeneidad del láser para una activación suficiente sin dañar la célula.
3. Visualice la celda seleccionada cada minuto durante 20 minutos en el estado basal antes de la iluminación, 50 minutos mientras se ilumina localmente, luego 20 minutos después de la activación para un total de 90 minutos (Archivo complementario 2).
4. Para la activación y desactivación, proporcione una cantidad adecuada de tiempo adecuado para la proteína objetivo para permitir la desactivación completa de la proteína LightR. Para FastLightR-Src, espere al menos 10 minutos de desactivación para que la actividad residual se distrague y permita 20 minutos de desactivación en la configuración experimental demostrada para la iluminación local.
5. Después de la imagen, guarde las películas como . Formato de archivo de pila TIF para análisis.

7. Análisis de dispersión celular

1. Preparar imágenes para el procesamiento y análisis de datos. Asegúrese de que las imágenes estén en un archivo . Formato de pila TIF. Guárdelos directamente desde el software de creación de imágenes o conviértalos con un programa de código abierto.
2. Descargue el paquete de scripts CellGeo de los archivos comprimidos de datos complementarios²⁶.
   NOTA: El paquete CellGeo contiene varios scripts diferentes. Elija el paquete deseado de la lista en función del tipo de análisis, tal como se describe en las secciones 7 a 9 del protocolo.
3. Abra y ejecute el script titulado MovThresh para crear una máscara de la celda.
   1. Seleccione Archivo > Importar (.tif) y seleccione las imágenes Stargazin-iRFP de las celdas.
   2. Escanee los marcos usando la barra de desplazamiento en la esquina inferior izquierda. Si el umbral sugerido es adecuado, vaya al paso 7.4.
   3. Si el umbral sugerido no se alinea con el comportamiento de la celda, elija curvas suavizadas o personalizadas debajo de Selección de curva. Cree la curva personalizada desplazándose por los marcos y, a continuación, ajustando el umbral en el lado derecho de la ventana.
   4. Haga clic en Volver a umbral.
   5. Haga clic en Archivo > Guardar como máscaras, Cambie el nombre del archivo y guárdelo con la opción Guardar como .
4. Abra el archivo de pila recién creado en un programa de análisis de imágenes de código abierto.
5. Seleccione Imagen > ajuste > umbral > aplicar.
6. Seleccione Analizar > Analizar partículas > Comprobar los resultados de la pantalla -> Aceptar.
7. Calcule el cambio en el área de cada celda dividiendo el área en un momento dado por el área promedio de la misma celda antes de la irradiación de luz azul.
8. Traza el cambio de área como un gráfico de líneas o de barras.
9. Calcule el valor medio y los intervalos de confianza del 90% para cada punto de tiempo de todas las celdas tratadas en las mismas condiciones.

8. Análisis de la dinámica del borde de la célula

1. Prepare los archivos de pila siguiendo los pasos descritos en la sección 7 del protocolo.
2. Abra y ejecute el script titulado ProActive.
   1. Seleccione Archivo > Importar máscaras > (.tif) y seleccione la máscara creada a través del script MovThresh .
   2. Seleccione la actividad de interés en el análisis en la esquina inferior derecha (Protrusivo, Retractivo o Total).
   3. Seleccione el tipo de normalización. Normalmente, se utiliza la normalización de área para estos análisis.
   4. Seleccione el marco de referencia inicial con el control deslizante de la izquierda. El control deslizante de retraso a la derecha determinará el retraso de tiempo entre dos puntos de tiempo utilizados para medir el área ganada y perdida por la celda.
   5. Si el fotograma seleccionado y el número de retardo son aditivamente mayores que el número de fotogramas de la película, la imagen de previsualización no se mostrará. Restablezca estos valores para que sean menores que el número total de fotogramas.
3. Modifique el umbral de protuberancia o retracción marcando la casilla Curva suave en la sección Resultados . Esto promedia los umbrales en una ventana específica, lo que puede resolver problemas en los que se detectan fluctuaciones menores como actividad.
4. Seleccione Ejecutar el intervalo para calcular la actividad durante el tiempo especificado por los reguladores de fotogramas y retrasos.
5. Guarde los datos numéricos seleccionando Archivo > Guardar como > resultados (.mat) y utilícelos para determinar la actividad protrusiva o retractiva media.
6. Determine los intervalos de confianza del 90% para cada punto de tiempo.
   NOTA: Esto guardará una matriz de varios valores diferentes. El archivo de texto "Cómo utilizar ProActive" incluido con el script proporciona una descripción detallada de lo que representa cada valor y cómo se han determinado²⁶.
7. Guarde la representación visual de la actividad seleccionando Archivo > Guardar como > imágenes (.tif).

9. Análisis de desplazamiento centroide

1. Para el análisis de desplazamiento de centroide, utilice cualquier software que pueda determinar las coordenadas del centroide.
2. En el software de análisis, abra la pila de imágenes enmascaradas de la celda de interés como se describe en la sección 7 del protocolo.
3. Seleccione Medir > análisis de morfometría integrado y, a continuación, haga clic en Preferencias > Dibujar marca de centroide > Comprobar y, a continuación, seleccione Medir.
   1. Registre las coordenadas del centroide antes del movimiento (A).
   2. Registre las coordenadas del centroide al final del experimento (B).
   3. Registre las coordenadas del centro del patrón de iluminación (C).
4. Ahora que se han recogido los tres puntos, determine el ángulo BAC⁸. θ₁ corresponde al ángulo ABC y θ₂ corresponde al ángulo CBA (Figura 4Cii). Para ello, utilice la siguiente ecuación:
   cosθ = cos(θ₁ - θ₂) = cosθ₁cosθ₂ + sinθ₁sinθ₂
   NOTA: Se puede utilizar una calculadora para determinar los ángulos y las distancias directamente desde las coordenadas para facilitar su uso.
5. Determine el desplazamiento del centroide multiplicando la distancia que recorrió el centroide de celda en píxeles por el factor de conversión, donde 1 píxel es igual a 0,4 μm. La conversión específica de píxeles a distancia dependerá de la ampliación y la configuración de la cámara en el sistema.
6. Una vez que se hayan determinado el ángulo de desplazamiento del centroide y la distancia, abra un software de gráficos capaz de producir imágenes de coordenadas polares.
7. Inserte el ángulo de desplazamiento del centroide como la medición θ y la distancia recorrida como el radio. Utilice el ANOVA para probar intervalos de confianza del 95%.
8. Traza los resultados y guarda la imagen.

Resultados

El LightR-Src se diseña y genera siguiendo la estrategia descrita en la Figura 1A,B. El análisis bioquímico de LightR-Src accede a la fosforilación de sustratos endógenos conocidos de Src, p130Cas (Y249)²² y paxilina (Y118)²³ en respuesta a la luz azul a 60 min de iluminación continua (Figura 2B). En particular, no se observa una activación de fondo de la cinasa Src cuando LightR-Src se expresa solo en la oscuridad durante 16-18 h después de la transfección. Además, el mutante catalíticamente inactivo de LightR-Src con mutación D388R no induce la fosforilación del sustrato Src, lo que demuestra que la fosforilación es llevada a cabo por LightR-Src activo y no causada por el efecto inespecífico de la iluminación de luz azul (Figura 2B). Reconociendo los informes de actividad oscilatoria de la quinasa Src²⁷ en células vivas, investigamos si LightR-Src podría ajustarse para exhibir activación cíclica. El LightR-Src original mostró una cinética de desactivación lenta (Figura 2C), lo que provocó la generación de una nueva variante, Fast-LightR-Src, que alberga la mutación I85V en ambos VVD. La Figura 2D ilustra que Fast-LightR-Src muestra una cinética de desactivación notablemente más rápida y se inactiva completamente dentro de los 10 minutos posteriores al apagado de la luz, en comparación con más de una hora para LightR-Src. Con FastLightR-Src, también pudimos lograr ciclos repetidos de activación/inactivación (Figura 2E). Estos resultados demuestran colectivamente la capacidad de la herramienta LightR para lograr una regulación específica y estrictamente controlada de la actividad de Src en células vivas.

La aplicación de FastLightR-Src también permite evaluar los efectos de la activación transitoria de Src en la morfodinámica celular. La activación de FastLightR-Src en las células HeLa induce la propagación celular, y este proceso se detiene tan pronto como FastLightR-Src se inactiva. Tras la activación, observamos la translocación de FastLightR-Src desde el compartimento perinuclear a las adherencias focales y la membrana plasmática, un comportamiento exhibido por la quinasa Src^11,12 de tipo salvaje. Las células iluminadoras que expresan el mutante catalíticamente inactivo D388RLightR-Src no muestran tales efectos de propagación (Figura 3B, C). Esto confirma aún más que FastLightR-Src funciona de manera similar a su contraparte de tipo salvaje. La iluminación local de una región celular da como resultado la activación localizada de FastLightR-Src indicada por la acumulación local de LightR Src en la adhesión focal y acompañada por la formación de protuberancias locales en la membrana (Figura 4B (i), (ii)) y desplazamiento del centroide de la célula (Figura 4C (i), (ii)) que resulta en el movimiento de la célula hacia la luz. Una vez establecida la aplicación de la herramienta LightR para la regulación de la quinasa Src, mostramos la amplia utilidad de LightR extendida a la regulación de la quinasa bRaf y la recombinasa de ADN Cre. El análisis de LightR-bRaf muestra la fosforilación inducida por la luz del sustrato endógeno de bRaf, MEK1, y la fosforilación posterior de las quinasas ERK1/2^24,25 a niveles comparables a los del mutante bRaf constitutivamente activo (V600E) (Figura 5A). Por el contrario, el D575RLightR-bRaf catalíticamente inactivo no muestra fosforilación de MEK1 y ERK1/2, comparable a las muestras de LightR-bRaf no iluminadas, lo que confirma la especificidad de la regulación de LightR-bRaf. Las imágenes de células vivas demostraron que los ciclos repetidos de activación/inactivación de FastLightR-bRaf inducen la translocación repetida de ERK2 dentro y fuera del núcleo, lo que corrobora los resultados conocidos de la activación de bRaf²⁸ (Figura 5B). La activación de LightR-Cre da como resultado la recombinación exitosa de un gen mCherry reportero, lo que demuestra la aplicabilidad de LightR a diferentes clases de enzimas (Figura 5C).

Figura 1: Estrategia de desarrollo del enfoque LightR. (A) Estructuras cristalinas de dos monómeros Vivid en el estado oscuro (PDB: 2PD7) y el dímero en el estado iluminado (PDB: 3RH8). (B) Representación de dibujos animados del diseño LightR. Dos fotorreceptores VVD conectados en tándem insertados en el dominio catalítico interrumpen la actividad catalítica de la proteína en la oscuridad. La dimerización de VVD en respuesta a la luz azul restaura la actividad de la proteína. (C) Estructuras cristalinas de (i) Src (PDB 1Y57) y (ii) dominios catalíticos bRaf (PDB 4MNF). (ii) Estructura de la recombinasa Cre (PDB 1MA7). Las flechas amarillas indican el sitio de inserción de LightR e indican un aminoácido sustituido. (D) Diagrama esquemático de la estrategia de clonación para la inserción del dominio LightR en una secuencia de enzima diana¹⁹. En el paso 1, se utilizan cebadores específicamente diseñados para la síntesis por PCR de un fragmento LightR flanqueado por sitios de recocido en el gen objetivo antes y después del sitio de inserción. En el paso 2, se muestra que el fragmento de LightR así producido se utiliza como un "megacebador" para la inserción de LightR en el gen de la enzima objetivo mediante mutagénesis dirigida al sitio de cambio rápido. Los paneles A-C han sido adaptados y modificados con permiso de Shaaya et ^al.10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Caracterización bioquímica de las proteínas LightR modificadas. (A) Representación esquemática del protocolo experimental para la caracterización bioquímica de LightR Src. (B) Las células LinXE que expresan transitoriamente la construcción LightR Src con un mCherry y una etiqueta myc en el extremo C-terminal se iluminaron continuamente con luz azul durante 60 minutos, utilizando una configuración de LED de 465 nm. Los lisados celulares se sondearon para la fosforilación de sustratos de Src, paxilina y p130Cas. Los resultados de Western Blot muestran la fosforilación de la paxilina endógena y p130Cas en respuesta a la activación de LightR-Src en células vivas. (C,D) Las células LinXE que expresaban transitoriamente las construcciones LightR-Src indicadas que llevaban la etiqueta mCherry-myc en tándem en el extremo C-terminal se expusieron continuamente a la luz azul durante tiempos especificados (0 min y 30 min) y luego se colocaron en la oscuridad durante períodos de tiempo indicados. Los lisados celulares se sondearon para la fosforilación de sustratos Src, mostrando la comparación de la cinética de activación y desactivación entre (C) LightR-Src y (D) FastLightR-Src. (E) Las células LinXE que expresan transitoriamente las construcciones LightR-Src indicadas que llevan la etiqueta mCherry-myc en tándem en el extremo C-terminal se expusieron continuamente a la luz azul durante 20 minutos, seguidas de una incubación repetida en la oscuridad durante 10 minutos y a la luz durante 20 minutos. Se recolectaron lisados celulares y se sondearon para la fosforilación de sustratos de Src, mostrando la eficiencia del ciclo de la quinasa Src entre los estados de activación e inactivación. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces con resultados similares. Los números que se muestran al lado de cada panel de Western blot B-E representan los pesos moleculares de las proteínas, medidos en kilodaltons (kDa). Los paneles B-E han sido adaptados y modificados con permiso de Shaaya et ^al.10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Control y efecto de la iluminación global y temporal en la actividad de FastLightR-Src. (A) Representación en dibujos animados del esquema experimental de iluminación cíclica global y temporal y los análisis de datos posteriores. (B,C) La regulación de la morfología celular y la localización de FastLightR-Src por luz azul se representa en imágenes representativas de células HeLa obtenidas a partir de una serie de lapso de tiempo utilizando microscopía de fluorescencia de campo amplio. Estas células coexpresaban transitoriamente FastLightR-Src-mCherry-myc (N = 10 células) o D388RLightR-Src-mCherry-myc (N = 9 células) inactivas catalíticamente junto con Stargazin-iRFP670 (marcador de membrana plasmática). Se realizaron imágenes de células vivas cada minuto mientras las células se iluminaban globalmente con luz azul (contornos azules). (B) Las flechas amarillas resaltan la localización de FastLightR-Src en estructuras que se asemejan a adherencias focales. Las imágenes se obtuvieron a partir de una serie de células HeLa de lapso de tiempo utilizando microscopía de fluorescencia de campo amplio. (C) La cuantificación de los cambios en el área de la celda inducidos por la activación de FastLightR-Src frente a D388RLightR-Src se muestra en cada panel. La ventana de iluminación se indica como rectángulos azules. Los gráficos representan intervalos de confianza de media ± 90%. Los paneles B y C han sido adaptados y modificados con permiso de Shaaya et ^al.10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Control y efecto de la iluminación subcelular local en la actividad de FastLightR-Src. (A) Representación de dibujos animados del esquema experimental de control de iluminación subcelular local. (B) (i) Secuencia de lapso de tiempo que ilustra una celda HeLa que expresa FastLightR-Src-mCherry, iluminada localmente con luz azul (representada por un círculo azul). Las imágenes se capturaron cada minuto utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (objetivo de 60x). Las imágenes se presentan como imágenes de contraste invertido obtenidas a intervalos de tiempo especificados. (ii) Imágenes de proyección celular que muestran protuberancias formadas durante intervalos de tiempo especificados. El umbral y el enmascaramiento de la morfología celular a lo largo de la línea de tiempo experimental representa la plataforma para analizar la propagación celular y la dinámica del borde celular. El área iluminada especificada de la celda está delimitada por un círculo azul. (C) (i) Gráfico polar para células que representan la distancia de migración del centroide (d) y el ángulo de desviación (θ) en relación con la iluminación de luz azul local. Los puntos negros representan células HeLa individuales que expresan D388RLightR-Src (N = 6 células) o FastLightR-Src (N = 10 células) catalíticamente inactivas. (ii) Representación esquemática que demuestra la distancia de desplazamiento del centroide (d) recorrida por el centroide de la célula desde el inicio (1) hasta la conclusión (2) de la estimulación local con luz azul. El ángulo de desviación (θ) indica el grado de divergencia del movimiento del centroide de la célula con respecto a la ubicación de la luz azul. El sombreado gris claro indica la región que sobresale de la célula en respuesta a la estimulación local de FastLightR-Src. El área iluminada especificada de la celda se indica mediante un círculo azul sólido. Los paneles B y C han sido adaptados y modificados a partir de Shaaya et ^al.10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Amplia aplicabilidad del enfoque LightR. (A) Regulación de LightR-bRaf. Las células LinXE que expresan transitoriamente LightR-bRaf-Venus, D575R LightR-bRaf Venus catalíticamente inactivas o bRaf (V600E)-Venus constitutivamente activas se expusieron a luz azul continua durante el período de tiempo especificado. Los lisados celulares se probaron para la fosforilación de las proteínas indicadas. (B) Las imágenes representativas obtenidas de una serie de imágenes de células vivas en lapso de tiempo utilizando microscopía de fluorescencia de campo amplio ilustran la regulación de la respuesta global a la luz azul en las células LinXE que coexpresan transitoriamente FastLightR-bRaf-Venus y mCherry-ERK2. Estas células se iluminaron globalmente con luz azul (50 ms pulsos por segundo, 50 pulsos por minuto) durante duraciones especificadas resaltadas en azul. Se realizaron imágenes de células vivas de mCherry-ERK2 cada minuto. Las flechas amarillas resaltan las etapas de la localización nuclear de ERK2 inducida por la activación con luz azul de bRaf diseñado. (C) Las células LinXE se transfectaron transitoriamente con un reportero Floxed-stop-mCherry y LightR-Cre-iRFP670. Las células se sometieron a condiciones de oscuridad o a luz azul pulsante (2 s encendidos, 10 s apagados) durante un máximo de 8 h. Las imágenes de todos los puntos de tiempo de cada canal se adquirieron utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio (objetivo 10x) en configuraciones idénticas y se ajustaron a niveles de brillo y contraste consistentes para facilitar la comparación de los niveles de expresión de proteínas entre muestras. El experimento se repitió al menos tres veces, arrojando resultados similares. La figura ha sido adaptada y modificada a partir de Shaaya et ^al.10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla complementaria 1: Secuencia LightR. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 2: Descripción de los sitios de inserción de LightR y lista de verificación para el diseño de LightR-Protein. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 3: Imprimaciones para la clonación de LightR. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 4: Condiciones de transfección para el análisis bioquímico de la actividad de LightR-Protein. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 5: Condiciones de transfección para el análisis basado en imágenes de la actividad de LightR-Protein. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Fichero complementario 1: Iluminación pulsada mediante Entorno de Desarrollo Integrado (IDE). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Ajustes de iluminación del microscopio. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Nuestro estudio presenta un enfoque optogenético para la investigación de diversas vías de señalización y demuestra su amplia aplicabilidad en el abordaje de diferentes cuestiones biológicas. El sistema de herramientas LightR proporciona varias ventajas esenciales: (1) Regulación alostérica de la actividad de las proteínas, (2) Control temporal estricto de la actividad que se puede ajustar para lograr diferentes cinéticas de activación e inactivación, (3) Resolución espacial de la actividad a nivel subcelular, (4) Especificidad de la modulación de la señalización y la actividad biológica y (5) Amplia gama de aplicabilidad a varias proteínas objetivo. En particular, LightR integra de forma única todos estos beneficios en una sola herramienta, lo que supone un importante paso adelante.

El diseño de LightR como interruptor alostérico ofrece varias ventajas. La capacidad de LightR para controlar la actividad de las proteínas cuando se inserta en un pequeño bucle flexible proporciona una versatilidad considerable para su aplicación en varias proteínas con diversas estructuras y funciones. Al ser un interruptor alostérico, LightR regula solo el dominio objetivo de la proteína de interés y no afecta a los otros dominios de la proteína. Por lo tanto, este método permite una regulación específica de la actividad sin comprometer las funciones esenciales de la proteína, como las interacciones con sus socios de unión o la localización nativa dentro de las células. Los sistemas optogenéticos de dos componentes se han aplicado con éxito para la regulación de la localización de proteínas, interacciones u otras funciones esenciales mediante el uso del control mediado por luz de la homo o heterodimerización 29,30,31,32,33,34,35 . Sin embargo, estos sistemas a menudo requieren una expresión equimolar optimizada de dos proteínas, lo que hace que su aplicación sea más desafiante. La regulación alostérica mediante el sistema LightR se logra dentro de una sola proteína y, por lo tanto, proporciona un enfoque mucho más versátil para la interrogación de la señalización celular.

La amplia gama de aplicabilidad del interruptor LightR a diferentes clases de proteínas se logra, en parte, mediante la optimización de diferentes módulos dentro del dominio LightR. Los enlazadores que conectan LightR a la proteína de interés y el enlazador que conecta dos dominios VVD dentro de LightR (enlazador inter-VVD) pueden influir en la eficiencia de la regulación. La elección del enlazador flexible inter-VVD (GGS)4G(GGS)3 proporciona suficiente flexibilidad y longitud para garantizar la asociación y disociación de los monómeros VVD dentro del dominio LightR. Hasta el momento, este enlazador ha garantizado el éxito de la regulación de todas las proteínas objetivo. Sin embargo, en los casos en que el dominio LightR no inactiva suficientemente la proteína en la oscuridad, se puede introducir un enlazador más rígido que mantendrá los dominios VVD más separados para mejorar la apertura de la pinza LightR, manteniendo así la enzima inactiva. El enlazador debe conservar la flexibilidad suficiente para permitir la dimerización de las VVD y la activación de la proteína diana. Para conectar LightR a la proteína de interés, utilizamos enlazadores flexibles cortos, GPGGSGG y GSGGPG, añadidos a los extremos N y C del dominio LightR. Proporcionan suficiente flexibilidad en la conexión, evitando así la interrupción irreversible de la proteína objetivo. Sin embargo, son lo suficientemente cortos como para permitir la distorsión de la proteína objetivo en la oscuridad y, al mismo tiempo, facilitar la restauración de la función de la proteína en la luz. Estos enlazadores son compatibles con la regulación de LightR para muchas aplicaciones de proteínas. Sin embargo, en ciertos casos en los que estos enlazadores pueden no proporcionar suficiente inactivación de la proteína en la oscuridad, el acortamiento de los enlazadores podría ser beneficioso. Dicho acortamiento del enlazador podría reducir la flexibilidad y mejorar la distorsión causada por la abrazadera LightR abierta en la oscuridad, minimizando así cualquier fuga. Sin embargo, este ajuste podría comprometer la actividad máxima de la enzima debido a posibles distorsiones estructurales en el estado iluminado. Alternativamente, el reemplazo de múltiples aminoácidos en el bucle de inserción podría proporcionar beneficios similares de flexibilidad equilibrada en casos en los que la inestabilidad conformacional no es una preocupación significativa.

Muchos procesos críticos de señalización se activan transitoriamente o se regulan de manera oscilatoria 36,37,38,39,40,41,42,43. La capacidad de ajuste de la herramienta LightR nos permite imitar patrones de señalización complejos y, por lo tanto, proporciona un enfoque poderoso para la interrogación de procesos biológicos controlados temporalmente. Logramos esto modulando la cinética de apagado de LightR a través de la introducción de la mutación I85V en ambos dominios VVD. Esta mutación reduce la vida media del dímero VVD en estado oscuro de 18.000 s a 780 s¹⁹, lo que facilita una inactivación más rápida en FastLightR-Enzyme.

La cinética de inactivación rápida también permite la regulación de la actividad de las proteínas a resolución subcelular. Las enzimas LightR, con una cinética más lenta, podrían dificultar la observación de los efectos de la activación subcelular debido a la difusión intracelular de la construcción activada. Con la cinética de apagado rápido, cualquier enzima FastLightR que se difunda más allá de la zona de iluminación local se inactivará rápidamente. Al activar selectivamente regiones subcelulares específicas, los investigadores pueden obtener información sobre las funciones locales de las proteínas para comprender mejor su contribución a las complejas vías celulares y redes de señalización.

Si bien los FastLightR son invaluables para el control óptico confinado espacial y temporalmente de las actividades de las proteínas dentro de las células, todavía hay aplicaciones en las que podría ser deseable una cinética más lenta. LightR con cinética de ralentización podría implementarse en estudios en los que se requiere una actividad inducible por luz azul sostenida y mejorada. Estas aplicaciones solo requerirán pulsos de iluminación poco frecuentes para mantener una actividad optogenética continua, minimizando así también problemas como la fototoxicidad. Para diferentes escenarios, una amplia gama de modificaciones cinéticas^10,18 podrían implementarse solas o en tándem entre sí para ofrecer una solución prometedora para ajustar el rendimiento de LightR para optimizar su aplicación para un experimento específico.

La aplicabilidad de las enzimas LightR está determinada por su capacidad para imitar la función biológica de sus homólogas endógenas. Como tal, es fundamental evaluar la especificidad de su sustrato, la señalización posterior y la localización subcelular. La especificidad de la actividad de LightR-Src se confirma a través de la fosforilación de sustratos de Src, incluyendo paxilina y p130Cas^22,23. FastLightR-Src se desplaza entre la región perinuclear y las adherencias focales bajo iluminación cíclica, lo que da como resultado la propagación de las células. Este fenómeno se asemeja con éxito a las observaciones anteriores realizadas con la quinasa nativa Src y confirma aún más la eficacia de la presente herramienta en la exploración de la biología de Src 11,12,44,45,46,47. LightR-bRaf también demuestra especificidad en la orientación de complejos de señales como las quinasas MEK y ERK^24,25. Además, FastLightR-bRaf exhibe oscilaciones cíclicas del transbordador nuclear ERK en respuesta a la luz azul, que es una consecuencia conocida de la activación de bRaf²⁸. La capacidad de las enzimas LightR para imitar de cerca las funciones de las proteínas endógenas proporciona una herramienta invaluable para interrogar su función.

La discusión anterior describe la capacidad de las quinasas LightR para replicar vías de señalización celular precisas dentro de compartimentos celulares definidos. En consonancia con este éxito con las quinasas, LightR-Cre sirve como modelo ilustrativo que demuestra la funcionalidad de la recombinasa Cre original derivada del bacteriófago P1. La recombinasa Cre pertenece a la familia de las integrasas de recombinasas específicas del sitio, y funciona facilitando la recombinación entre dos sitios de reconocimiento llamados loxP en el ADN objetivo. Dicha recombinación da como resultado un reordenamiento del ADN a través de un evento de cruzamiento. Sobre la base de la orientación direccional del sitio loxP en el ADN objetivo, el evento de cruce puede conducir a la eliminación, duplicación o translocación de elementos cromosómicos⁴⁸. La recombinasa Cre ha sido ampliamente utilizada para la generación de modelos in vivo de regulación génica inducible^49,50. Sin embargo, otros sistemas de cre recombinasa espontáneos, químicamente inducibles u optogenéticamente inducibles proporcionan un control limitado de cuándo y dónde se induce la recombinación del ADN en el modelo animal. LightR-Cre supera estas limitaciones al permitir un estricto control temporal y espacial de la recombinación de ADN. Además, la capacidad de ajuste de LightR nos permite eliminar la actividad de fugas no deseada y garantizar la regulación de Cre con alta precisión. Estas capacidades abren nuevas oportunidades para el modelado de la patología de la enfermedad y el desarrollo de nuevas terapias.

La regulación precisa de LightR en quinasas y ADN recombinasa proporciona una prueba adicional de que esta herramienta se puede aplicar a varias proteínas con la misma estrategia. Además de activar varias clases de enzimas, LightR puede unirse potencialmente a otros tipos de proteínas, donde la modulación alostérica podría aprovecharse para localizar proteínas en regiones subcelulares específicas, inducir interacciones proteína-proteína, diseñar biosensores inducibles por luz azul y más. Debido a las ventajas alostéricas de la segmentación por dominios específicos, los LightRs también pueden combinarse con otros enfoques quimiogenéticos y optogenéticos en la misma proteína para lograr un mayor grado de sintonización para estudiar los procesos biológicos.

Hemos aplicado con éxito LightR a muchas otras proteínas (manuscritos en preparación). A pesar de este éxito, el desarrollo de una proteína LightR funcional puede enfrentarse a posibles desafíos, especialmente en la selección de un sitio de inserción adecuado e imitación precisa de la función biológica de la proteína objetivo. Cuando la estructura cristalina no está disponible, los investigadores deben confiar en las estructuras predichas o en la información de la secuencia de aminoácidos, lo que requiere más resolución de problemas para diseñar proteínas con múltiples sitios de inserción o sustituciones de aminoácidos. Además, la actividad de la proteína modificada debe ajustarse con precisión para replicar con precisión la función biológica dentro de la célula. El éxito de estos experimentos depende de la imitación funcional precisa de la proteína modificada, con su homólogo endógeno, que a menudo requiere una rigurosa resolución de problemas y puede variar según el tipo de célula, la clase y el tipo de proteína objetivo, así como la fuerza y la duración de la activación de la luz azul.

En conclusión, el sistema LightR representa una poderosa herramienta para lograr un control espacio-temporal preciso sobre la función de las proteínas. Su robustez, capacidad de ajuste y versatilidad lo hacen invaluable para estudiar procesos celulares complejos, desentrañar vías de señalización y dilucidar mecanismos reguladores de genes. Al proporcionar a los investigadores un control sin precedentes sobre la actividad de las proteínas, el sistema LightR promete avanzar en nuestra comprensión de los procesos biológicos fundamentales y allanar el camino para intervenciones terapéuticas innovadoras.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
#1.5 Cubreobjetos de vidrio 25 mm Redondos	Warner Instruments	64-0715
Tubos de 1,5 mL	Científico de EE. UU.	cc7682-3394
2x Tampón			para 500 mL: 5,18 g de  Tris-HCL, 131,5 mL de glicerol, 52,5 mL de SDS al 20%, 0,5 g de azul de bromofenol, pH final 6,8
4-20% Gel prefabricado Mini-PROTEAN TGX	Biorad 4561096
5x Tampón Phusion Plus	Thermo Scientific	F538L
60 LED Microscopio Anillo de Luz Boli Optics		ML46241324	LED Azul, 60 mm de diámetro, 5 W
Agarose	GoldBiotech	A-201
Anti-Erk 1/2 Anticuerpo	Señalización Celular	9102
Anti-GAPDH Anticuerpo	invitrogen	AM4300
Anti-GFP	Clontech	632380
Anti-mCherry Anticuerpo	invitrogen	M11217
Anti-MEK	Señalización Celular	9122
Anti-p130Cas	BD Biosciences	610271
Señalización celular	anti-paxilina	2542
Anti-fosfo-Erk 1/2 T202/Y204	Señalización celular	de anticuerpos 9101
Anti-fosfo-pY249 Señalización celular p130Cas		4014
Anti-fosfo-Y118	Señalización celular	2541
Célula Anto-fosfo-S217/221 MEK	Señalización	9121
Arduino Fuente de alimentación compatible	Ordenador corporativo	LJH -186
Arduino Uno Rev3 Arduino	&	lrm;
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Triple Inactivado por Calor 0.1 y micro; m con filtro estéril
bRaf-V600E-Venus			Regalo del Dr. John O'Bryan, MUSC
BSA	GoldBiotech	A-420
Carbenicillina (disodio)	Gold Biotechnology	C-103-25
CellMask Rojo intenso colorante de membrana plasmática	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
Escalera de ADN	Biografía de oro	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
Enzima Dpn1	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Reactivos de Cleland
EGTA	Acros
FastLightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162155
Fibronectina de plasma bovino	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Reactivo de transfección	Promega	E2692	Reactivo de transfección
Gel Tinción de ácido nucleico verde	GoldBio	G-740-500
Tinte de carga en gel púrpura 6x	NEB	B7024A Kit de
extracción de gel GeneJET	Thermo Scientific	K0692	Kit de extracción de gel
Kit de minipreparación de plásmidos GeneJET	Thermo Scientific	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
Células HEK 293T	ATCC	CRL-11268
Células HeLa	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
Iot Relay	Registradores digitales	DLI 705020645490	relé de control CA/CC para iluminación
Kanamycin Monosulfato	Biotechnology	K-120-25
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
LED Grow Light System	HQRP	884667106091218	sistema de lámparas de panel LED
LightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Addgene	#162158
MATLAB	Mathworks	R2024a	Software para ejecutar CellGEO Scripts
Metamorph	Molecular Devices		Imaging Analysis Software
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Aceite Mineral	Sigma	Kit de minipreparación M5310
	Elección de genes	96-308
Mini-PROTEAN TGX Geles Prefabricados 12 pocillos	Bio-Rad	4561085
Agua de grado de biología molecular	Corning	46-000-CV
Espejo policroico multibanda	89903BS	Chroma
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
PBS sin Ca y Mg	Corning	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgene	#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	#122963
pCEFL-ERK2			Regalo del laboratorio del Dr. Channing Der,
UNC PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8 tiras y tapas, tiras rígidas tapas de cúpula unidas individualmente
Phusion Plus ADN Polimerasa	Thermo Scientific	F630S
pmiRFP670-N1	Addgene	#79987
Polygon 400 Iluminador con patrón	Mightex	DSI-G-00C
Primers	Membranas de
BioRad 1620219		Immun-Blot PVDF/Sándwiches de papel de filtro
T0.25% Tripsina, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sodio	Corning	25-053-CI
Tris-Acetato-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	Para electroforesis
UPlanSApo 40x Microscopio Objetivo	Olympus	1-U2B828
USB TTL Box	National Instruments	6501	Para interfaz TTL
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100