Artículo de método

Imágenes FRET de una sola molécula para observar la dinámica conformacional de la atlastina GTPasa similar a la dinamina

DOI:

10.3791/67263

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24 de enero de 2025

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1State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Life Sciences, Frontiers Science Center for Cell Responses, Nankai University, 2National Laboratory for Condensed Matter Physics, Institute of Physics, Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Las funciones de las proteínas de la superfamilia de la dinamina dependen de los cambios conformacionales junto con la hidrólisis de GTP. Se describe un sistema utilizando la técnica FRET de molécula única (smFRET) para monitorizar la dinámica conformacional de la atlastina GTPasa similar a la dinamina en diferentes estados de carga de nucleótidos.

Resumen

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La rotación del cuerpo rígido del dominio medio de tres hélices (3HB) en relación con el dominio GTPasa de la proteína atlastina (ATL) similar a la dinamina es un impulsor crucial de la fusión homotípica de la membrana dentro del retículo endoplásmico (RE). Las interrupciones en este proceso se han asociado con la paraplejia espástica hereditaria (HSP), un trastorno neurodegenerativo. Los estudios estructurales y bioquímicos sugieren que los cambios conformacionales en ATL están relacionados con la hidrólisis de GTP, pero la visualización en tiempo real de estas dinámicas conformacionales durante el ciclo de hidrólisis de GTP sigue siendo un desafío. Para comprender mejor los mecanismos mecánicos detrás de la función ATL, se utilizó la transferencia de energía por resonancia de Förster de una sola molécula (smFRET). Se emplearon tres estrategias específicas para inmovilizar la región citosólica N-terminal de ATL1 humano (ATL1cyto) en una cámara microfluídica recubierta de estreptavidina, lo que facilitó la aplicación de imágenes smFRET intramoleculares e intermoleculares. Esto permitió un monitoreo preciso de las conformaciones de proteínas en varios estados de carga de nucleótidos, proporcionando información directa sobre los comportamientos moleculares individuales. Este método también se puede aplicar para estudiar otras proteínas mecanoquímicas.

Introducción

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En las células eucariotas, las proteínas de la superfamilia de la dinamina median la remodelación de las membranas biológicas, incluida la tubulación, la fisión y la fusión de la membrana 1,2,3. Las mutaciones en estas proteínas conducen a una variedad de enfermedades humanas, como las enfermedades neurodegenerativas. Los miembros de la superfamilia de la dinamina suelen contener un dominio GTPasa, un dominio medio formado por haces helicoidales, un motivo para la unión a la membrana y un dominio efector GTPasa (GED). Una de estas GTPasas similares a la dinamina es la atlastina (ATL), que cataliza la fusión homotípica de la membrana del retículo endoplásmico (RE) para formar una red 4,5,6,7,8,9,10. Hay tres ATLs (ATL1-3) en los mamíferos. La molécula ATL consta de una región citosólica N-terminal (ATL cito), que incluye un dominio GTPasa y un dominio medio de tres hélices (3HB), seguido de dos regiones transmembrana, pero carece del típico GED. Alternativamente, ATL contiene una cola C-terminal que desempeña un papel crucial en la fusión de la membrana 11,12,13.

Se ha informado que la fusión eficiente de la membrana se basa en el reordenamiento del dominio dependiente de la hidrólisis GTP en elcytoATL 14,15,16,17,18,19,20. Sin embargo, en comparación con el complejo SNARE, que utiliza la energía de plegamiento de los cambios conformacionales para impulsar la fusión heterotípica de la membrana21, el proceso de fusión homotípica de la membrana mediado por ATL y otras proteínas similares a la dinamina específicas de la fusión22 sigue siendo difícil de alcanzar. Se han determinado tres estructuras cristalinas delcitocito, ATL1 humano, en diferentes condiciones de carga de nucleótidos 14,15,16,23. En las estructuras, los dos 3HBs en el dímero apuntan en diferentes direcciones, pero aún falta un modelo completo que explique cómo se acoplan la dinámica conformacional de lacitocitonucleosa ATL y su actividad GTPasa.

En el modelo anterior, las moléculas monoméricas de ATL forman dímeros a través de diferentes membranas de una manera dependiente de GTP para impulsar la fusión de membranas. Aquí, se describen tres estrategias para aplicar la transferencia de energía de resonancia de Förster de una sola molécula (smFRET) para observar directamente y detectar con precisión el comportamiento de lascitomoléculas ATL1 individuales. smFRET es una técnica poderosa ampliamente utilizada para investigar la dinámica conformacional y las interacciones de biomoléculas individuales en tiempo real, como la activación de β-arrestinamediada por GPCR 24, la remodelación de la cromatina por Snf225 y los reordenamientos de dominio de la proteína MxA similar a la dinamina junto con los ciclos de hidrólisis de GTP26. Dado que smFRET solo puede detectar eficazmente cambios en la distancia de ~3 nm a ~8 nm, se requieren experimentos smFRET intermoleculares e intramoleculares para analizar exhaustivamente las conformaciones delcitocito. Generamos tres construcciones decitocitos ATL1 con todas las cisteínas nativas sustituidas por alaninas y K400 (ATL1 cyto-K) o el par T51/K400 (ATL1 cyto-TK) mutado a cisteína para el marcaje de fluoróforos. En la Figura 1B-D se muestran las estrategias para inmovilizar eldímero o monómero del citocitotransmisor ATL1 en una cámara microfluídica recubierta de estreptavidina (Figura 1A) para experimentos smFRET intermoleculares o intramoleculares. Este método proporciona más detalles sobre la dinámica conformacional de las proteínas similares a la dinamina en cada paso de la hidrólisis GTP27.

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Protocolo

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Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de cubreobjetos modificados para la cámara de inmovilización de proteínas

  1. Preparación
    1. Prepare 50 mL de solución de piraña (compuesta de ácido sulfúrico concentrado y peróxido de hidrógeno en una proporción de 3:1) agregando lentamente peróxido de hidrógeno al ácido sulfúrico concentrado para evitar temperaturas excesivas. Colóquelo con cuidado en una campana extractora.
    2. Prepare la solución de etóxido de sodio. Disuelva 2 g de NaOH en 15 mL de ddH2O, agregue 35 mL de etanol absoluto y mezcle completamente. Dejar a temperatura ambiente.
    3. Prepare una solución con alto contenido de sal (0,1 M de NaHCO3 y 0,6 M de K2SO4). Disolver completamente y alícuota 500 μL/tubo. Conservar a -20 °C.
    4. Alícuota SVA-mPEG y SVA-mPEG-biotina en aproximadamente 30 mg por tubo y 3 mg por tubo. Conservar a -20 °C.
    5. Personalice los portaobjetos de microscopio (75 mm × 26 mm × 1 mm) con 6 pares de orificios de 1,2 mm de diámetro.
  2. Limpieza de la superficie del cubreobjetos
    1. Use pinzas para levantar ocho cubreobjetos y colóquelos en un frasco para teñir. Agregue acetona (~ 50 mL) para cubrir los cubreobjetos, coloque el frasco de tinción en un limpiador ultrasónico durante 30 minutos y luego enjuague los cubreobjetos tres veces con ddH2O.
    2. Lave los cubreobjetos con metanol como en el paso 1.2.1.
    3. Añadir la solución de piraña (paso 1.1.1) al tarro de tinción y calentarlo en un hervidor al baño maría a 95 °C durante 2 h. Después de que el frasco de tinción se haya enfriado a temperatura ambiente, enjuague los cubreobjetos al menos seis veces con ddH2O.
    4. Agregue la solución de etóxido de sodio en el frasco de tinción, colóquelo en un limpiador ultrasónico durante 15 minutos y luego enjuague tres veces con ddH2O.
    5. Añadir ddH2O al tarro de tinción para cubrir los cubreobjetos, colocar en un limpiador ultrasónico durante 15 min, y posteriormente enjuagar 3 veces con ddH2O.
  3. Modificación de la aminosilanización de la superficie de cubreobjetos.
    1. Sujete los cubreobjetos en el frasco de tinción en un banco limpio, séquelos con nitrógeno y colóquelos en otro frasco de tinción (secado de antemano).
    2. Hornee el frasco de tinción en un horno de secado a 120 °C durante 30 minutos y luego enfríe a temperatura ambiente en un desecador.
    3. Agregue 47,5 mL de metanol, 2,5 mL de ácido acético y 0,5 mL de 3-Aminopropiltrietoxisilano (APTES) al vaso de precipitados (secado con anticipación), mezcle uniformemente, agregue al frasco de tinción e incube durante 10 minutos.
    4. Enjuague los cubreobjetos en el frasco de tinción con ddH2O al menos tres veces y sonique durante 5 min.
    5. Saque los cubreobjetos uno por uno, enjuague con ddH2O, séquelos con nitrógeno y colóquelos en una placa de Petri de 10 cm de diámetro para prepararlos para la modificación del PEG.
      NOTA: La modificación de APTES debe realizarse en un ambiente seco.
  4. Modificación de la superficie de cubreobjetos con SVA-mPEG-Biotina y SVA-mPEG
    NOTA: La modificación con biotina de la superficie del cubreobjetos ayuda a retener las proteínas biotiniladas (o proteínas que se unen a la biotina-anti-His) a través de la estreptavidina.
    1. Disuelva completamente el SVA-mPEG y el SVA-mPEG-Biotina envasados en la solución con alto contenido de sal (1 mg correspondiente a 10 μL de solución con alto contenido de sal). Agregue la solución de SVA-mPEG-biotina a la solución SVA-mPEG en una proporción de 1:100.
      NOTA: Use un vórtice para agitar la solución y asegurarse de que SVA-mPEG o SVA-mPEG-Biotina se disuelva por completo. La solución acuosa de SVA-mPEG o SVA-mPEG-Biotina debe prepararse antes de su uso.
    2. Deje caer la solución de mezcla preparada en un cubreobjetos y cúbralo con otro cubreobjetos. Este proceso debería evitar la generación de burbujas. Incube los cubreobjetos completamente con la humedad adecuada durante más de 2 h o toda la noche.
    3. Separe los cubreobjetos una vez completada la modificación, enjuáguelos con ddH2O y séquelos con nitrógeno. Marque la superficie del cubreobjetos que no haya sido modificada con SVA-mPEG y SVA-mPEG-biotina.
    4. Coloque con cuidado el cubreobjetos modificado en un tubo de microcentrífuga de 50 ml. Conservar a -20 °C después de aspirar.
      NOTA: El cubreobjetos modificado se puede almacenar al vacío durante 1 mes.

2. Preparación de portaobjetos de microscopio para cámara de inmovilización de proteínas

  1. Lave los portaobjetos del microscopio como se describe en el paso 1.2 para los cubreobjetos.
  2. Sople los portaobjetos del microscopio para secarlos con nitrógeno y colóquelos en tubos de microcentrífuga de 50 ml.
  3. Guarde los portaobjetos del microscopio como se describe en el paso 1.4.4.

3. Expresión y purificación de proteínas

  1. Preparación
    1. Plásmidos: clonar el miembro de la familia de la atlastina de interés o la mutación patogénica de interés en un vector de expresión bacteriana, por ejemplo, pET-28a, y añadir un Avitag27. Introducir cisteínas en posiciones relevantes por mutagénesis dirigida al sitio (por ejemplo, T51C y K400C27).
    2. Prepare los siguientes búferes.
      1. Medio de cultivo Luria-Bertani (LB): Mezclar 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 10 g de cloruro de sodio en 1 L de autoclave ddH2O. a 121°C durante 20 min.
      2. Tampón de lisis: Mezclar 25 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 1x cóctel completo de inhibidores de proteasa sin EDTA, 10 mM de imidazol y 0,5 mM de TCEP. Conservar a 4 °C.
      3. Tampón de lavado: Mezclar 25 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 30 mM de imidazol y 0,5 mM de clorhidrato de Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP). Conservar a 4 °C.
      4. Tampón de elución: Mezclar 25 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 150 mM de imidazol y 0,5 mM de TCEP. Conservar a 4 °C.
      5. Tampón de purificación: 25 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 0,5 mM de TCEP. Conservar a 4 °C.
  2. Purificación de proteínas
    1. Transfiera los plásmidos27 a células de E. coli Rosetta (DE3) (Biomed) utilizando métodos de choque térmico de transformación bacteriana. Suspender las células transferidas en un medio de cultivo LB con una concentración final de 50 μg/μL de kanamicina añadida.
      1. Cultivo a 37 °C hasta que la absorbancia del medio de cultivo a 600 nm sea de 0,6-0,8. Añadir isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG) a una concentración final de 50 μM para inducir la expresión de la proteína a 16 °C durante 20-24 h.
        NOTA: La tasa de crecimiento de los cultivos de células bacterianas u otros cultivos de células microbianas se puede controlar midiendo la densidad óptica (absorbancia) del cultivo de crecimiento celular a 600 nm.
    2. Recolección de células por centrifugación a 4000 × g durante 20 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante.
    3. Vuelva a suspender el pellet celular con 30 mL de tampón de lisis. Interrumpa las celdas tres veces con una trituradora de celdas de alta presión.
    4. Clarificar los lisados por centrifugación a 2.00.000 × g durante 1 h a 4 °C utilizando un rotor de ultracentrífuga.
    5. Aísle la proteína utilizando una columna de Ni-NTA. Lave la columna de Ni-NTA con tampón de lavado para 5 volúmenes de columna. Proteína de elución con tampón de elución para un volumen de 1 columna. Recoja el eluido y concéltelo usando filtros centrífugos hasta ~ 500 μL.
    6. Además, purifique la proteína mediante cromatografía de exclusión por tamaño27. Recoja el eluido (500 μL por tubo).
    7. Confirmar la proteína diana por su peso molecular determinado por electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE)27. Recoja la proteína objetivo para su posterior modificación.

4. Biotinilación de proteínas

  1. Preparación
    1. Prepare las siguientes soluciones de stock.
      1. Disuelva el tetrahidrato de acetato de magnesio (MgOAc·4H2O) en 25 mM de tampón HEPES (pH 7,7) a una concentración de 100 mM (10×). Alícuota 100 μL por tubo y almacenar a -20 °C.
      2. Disolver la sal disódica (ATP) de adenosina 5-trifosfato enddH2O a una concentración de 100 mM (10×). Ajuste el pH a 7.4 usando NaOH. Alícuota 100 μL por tubo y almacenar a -80 °C.
      3. Disolver la d-biotina en ddH2O a una concentración de 500 μM. Alícuota 100 μL por tubo y almacenar a -20 °C.
      4. Disolver la estreptavidina en ddH2O a una concentración de 1 mg/mL. Alícuota 20 μL por tubo y almacenar a -20 °C.
    2. Tampón de biotinilación de proteínas: Añadir 25 mM de HEPES (pH 7,7), 200 mM de ácido L-glutámico potásico y 0,5 mM de TCEP. Conservar a 4 °C.
    3. Purificar la biotina ligasa BirA y almacenar a -80 °C.
  2. Biotinilación de proteínas
    1. Cambie el tampón proteico por el tampón de biotinilación proteica. Para la biotinilación, mezcle 100 μL de 100 mM de ATP, 100 μL de 100 mM de MgOAc, 100 μL de 500 μM de d-biotina, 10 μL de 100 μM de biotina ligasa BirA, 50 μM de proteína hasta un volumen final de 1 mL e incube durante la noche a 4 °C.
    2. Elimine la d-biotina libre utilizando un filtro centrífugo MWCO de 10 K.
    3. Incubar 20 μL de proteína biotinilada con 20 μL 15 μM de estreptavidina durante 20 min en hielo. Detectar la eficiencia de la biotinilación de proteínas por SDS-PÁGINA27.

5. Marcaje de fluoróforos de proteínas

  1. Preparación
    1. Disuelva los fluoróforos LD555 (donante) y LD655 (aceptor) en dimetilsulfóxido (DMSO) hasta una concentración final de 5 mM. Conservar a -20 °C.
    2. Prepare el tampón de etiquetado: Mezcle 25 mM de HEPES (pH 7.4), 150 mM de KCl y 5 mM de MgCl2. Conservar a 4 °C.
    3. Cambie el tampón de proteínas por el tampón de etiquetado.
  2. Etiquetado de fluoróforos
    1. Para los ensayos smFRET intramoleculares, mezcle ATL1cyto-TK con LD555 y LD655 en una proporción de 1:1.2:1.2 hasta un volumen final de 100 μL (el volumen total de fluoróforos no debe exceder 1 μL) e incube durante 5 h a 4 °C.
    2. Para experimentos intermoleculares smFRET, incubar ATL1cito-K o ATL1cito-T con DL555 en una proporción de 1:1,2, e incubar simultáneamente ATL1cito-K biotinilado con DL655 en una proporción de 1:1,2, durante 5 h a 4 °C (el mismo volumen de incubación que en 5.2.1).
      NOTA: La co-incubación de proteínas y colorantes permite flexibilidad en las posiciones de etiquetado para LD555 (donante) y LD655 (aceptador). El hecho de que LD555 esté etiquetado como T51C o K400C no afecta a los resultados del experimento FRET. Se proporciona un diagrama esquemático del donante que se marca en el sitio T51C (Figura 1C, D).
    3. Eliminar el exceso de fluoróforos libres utilizando columnas de desalinización por centrifugación MWCO de 7 K27.
    4. Agregue TCEP a las proteínas marcadas con fluoróforos a una concentración final de 0,5 mM.
    5. Detecte la eficiencia de etiquetado de proteínas utilizando un espectrofotómetro. Mida la absorbancia de proteínas a 280 nm, la absorbancia de LD555 a 555 nm y la absorbancia de LD555 a 655 nm, y calcule las concentraciones molares utilizando sus coeficientes de extinción, respectivamente. Eficiencia de marcaje de proteínas = (concentración molar de colorante fluorescente/concentración molar de proteína) x 100%.

6. Imágenes FRET de una sola molécula

  1. Preparación
    1. Prepare el tampón de incubación: Mezcle 25 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de KCl y 5 mM de MgCl2. Conservar a 4 °C.
    2. Preparar 1 mg/mL de estreptavidina (disuelta enddH2O) y 1 mg/mL de anticuerpo anti-His biotinilado para la inmovilización de proteínas.
    3. Preparar 25 mM de ácido benzoico (pH 7,4; disuelto en el tampón como se describe en 7.1.1) y 100 mM de protocatecuato 3,4-dioxigenasa (PCD) (disuelto en una solución de glicerina al 40%) para minimizar el fotoblanqueo durante los experimentos con smFRET.
    4. Prepare 100 mM de sal sódica de guanosina 5'-difosfato (GDP), guanosina 5'-O-[gamma-tio]trifosfato (GTPγS) y soluciones madre de AlCl3 disueltas en ddH2O. Prepare 1 M de solución madre de NaF disuelta en ddH2O.
    5. Saque el cubreobjetos conservado al vacío y el portaobjetos del microscopio y péguelos con cuidado con cinta adhesiva de doble cara personalizada en un banco limpio. Instale mangueras y puntas para formar una cámara microfluídica con seis canales27.
      NOTA: No exponga el cubreobjetos modificado al aire durante períodos prolongados de tiempo. Prepare la cámara microfluídica27 antes de comenzar los experimentos smFRET.
  2. Corrección de mapeo
    NOTA: Durante el experimento, las señales de fluorescencia deben recogerse de los canales donante y aceptor, respectivamente. Debido al uso de microscopios, puede haber ligeras desviaciones en los campos de monitoreo de los canales donante y aceptor. Para reducir la desviación en los campos de monitoreo, se debe realizar la calibración del mapeo antes de comenzar el experimento.
    1. Mezcle bien el 10% de partículas de poliestireno (diámetro 3 μm), agregue 10 μL de partículas a un portaobjetos de microscopio (no modificado) y cúbralo con un cubreobjetos (no modificado).
    2. Seleccione un campo de visión con tantas partículas de poliestireno como sea posible. Capture un vídeo bajo un campo brillante utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF).
      NOTA: Se utilizó un objetivo de inmersión en aceite de alta apertura numérica (100x) para obtener imágenes de alta resolución. Para los experimentos smFRET, las señales se capturaron a intervalos de fotogramas de 30 ms utilizando una cámara EMCCD.
    3. Utilice un script personalizado para alinear la ubicación central de la misma partícula de poliestireno en el canal donante y el canal aceptor y guarde el archivo de mapa como un archivo txt. El código personalizado de MATLAB utilizado en este estudio está disponible en https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET).
  3. Inmovilización de las proteínas en la cámara
    1. Para experimentos smFRET intermoleculares, mezcle lacito-K o ATL1cito-T ATL1 marcada con LD555 y lacito-K-biotina ATL1 marcada con LD655 en una proporción de 1:1 con una concentración final de 1 mM de GTPγS o GDP/AlF4-, e incube durante 1 h en hielo para dimerizar la proteína.
    2. Para los experimentos smFRET intermoleculares de ATL1cyto-T y ATL1cyto-K , mezcle ATL1cyto-T marcado con LD555 y ATL1cyto-K-biotina marcado con LD655 en una proporción de 1:1 con una concentración final de 1 mM de GTPγS o GDP/AlF4-, e incube durante 1 h en hielo para obtener proteínas dimerizadas.
    3. En el caso de los ensayos smFRET intramoleculares, incubar elcito-TK ATL1 marcado con LD555 y LD655 con 1 mM de GDP durante 1 h en hielo antes de realizar los experimentos de smFRET en condiciones de GDP.
    4. Para experimentos intermoleculares de estreptavidina (diluida con 200 μL de tampón de incubación) durante 10 min para inmovilizar las proteínas. Para los ensayos smFRET intramoleculares, añadir 10 μg/mL de anticuerpo anti-His biotinilado (diluido con 200 μL de tampón de incubación) e incubar durante 10 min para inmovilizar las proteínas. Enjuague el canal una vez con un tampón de incubación antes de agregar cada solución.
    5. Diluir el dímero ATL1 a ~0,3 nM o el monómero a ~1 nM en tampón de incubación de 200 μL e incubar durante 10 minutos para inmovilizar las proteínas en el canal. Enjuague el canal con tampón de incubación dos veces. Añadir ácido benzoico y PCD al canal a una concentración final de 2,5 mM (diluido con tampón de 200 μL).
      NOTA: Para simular las diferentes etapas de lasmoléculas del citograma ATL1 en el proceso de hidrólisis de GTP, se añadieron nucleótidos (GDP, GTPγS y GDP/AlF4-) a una concentración final de 1 mM a los tampones en cada paso después de inmovilizar la proteína en el canal. La adición de GTPγS imita la unión de GPP, LA ADICIÓN DE GDP/AlF 4 imita la hidrólisis de GTP, la adición de GDP imita la liberación de Pi y el apo sado representa la liberación de PIB.
  4. Imágenes smFRET
    1. Ajuste el plano focal. Utilice las perillas de enfoque grueso y fino, ajuste el plano focal para enfocar la muestra con nitidez. En este caso, se utilizó un sistema de enfoque automatizado para lograr el enfoque óptimo.
    2. Configure la fuente de excitación. Utilice el láser de 532 nm como fuente de luz de excitación. Ajuste la potencia del láser a un nivel adecuado para excitar los fluoróforos. En este caso, se utilizó una potencia láser de 20-40 mW.
    3. Conecte la cámara EMCCD al microscopio. Configure la cámara para grabar a un intervalo de fotogramas de 30 ms. Asegúrese de que la cámara esté configurada para capturar imágenes en modo de 16 bits para obtener datos de alta resolución.
    4. Grabe la película, asegurándose de que el enfoque permanezca estable durante toda la adquisición. Prolongue el tiempo de irradiación láser de 532 nm tanto como sea posible hasta que la mayoría de las moléculas fluorescentes se apaguen al registrar las señales de fluorescencia.
    5. Guarde las películas grabadas en formato TIFF de 16 bits para su posterior análisis.

7. Adquisición y análisis de datos

  1. Cargue el archivo txt del mapa para su corrección antes de extraer las trayectorias FRET de las películas grabadas. Seleccione las trayectorias FRET y guarde todos los datos de la trayectoria FRET en formato txt para su posterior análisis.
  2. Extraiga los datos de los archivos txt y calcule los valores de FRET utilizando scripts caseros en Matlab2022a. El código personalizado de MATLAB está disponible en https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET.
    NOTA: El valor FRET se calcula utilizando la ecuación IDL655/(γILD555+ILD655). ILD555 e ILD655 representan las intensidades de fluorescencia LD555 y LD655, respectivamente. γ es un parámetro que se obtiene mediante la fórmula γ = FA/FD. FA representa la disminución de la intensidad del aceptor, y FD es el incremento de la intensidad del donante.
  3. Ajuste los datos smFRET de GaussAmp en Origin 2022 para obtener el histograma de distribución.
    NOTA: Para datos con múltiples estados FRET (los datos bajo la condición GTPγS en smFRET intermolecular o los datos de smFRET intramolecular bajo la condición GDP o Apo), se puede utilizar el ajuste multipico.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los experimentos smFRET se realizaron en un microscopio TIRF capturando la intensidad de fluorescencia de los fluoróforos cada 30 ms. En la Figura 2A-C se muestran imágenes representativas de moléculascitométricas ATL1 marcadas con LD555 (donante) y/o LD655 (aceptor) en ausencia o presencia de diferentes nucleótidos. Se registraron las intensidades de fluorescencia de los dos fluoróforos en partículas individuales y se extrajeron cientos de trayec...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La tecnología FRET se basa en la transferencia de energía entre dos colorantes fluorescentes (donante y aceptor). En el caso de su proximidad entre sí (generalmente 1-10 nm), el donante excitado transfiere su energía al aceptor, lo que resulta en una disminución en la intensidad de fluorescencia del donante y un aumento en la intensidad de fluorescencia del aceptor.

En los experimentos smFRET, las moléculas se diluyen a concentraciones muy bajas y se inmoviliz...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

X.B. cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32371287), los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (63223043 y 63233053) y el Proyecto de Formación de Talentos de la Universidad de Nankai (035-BB042112). Y.L. cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (12022409 y T2221001) y el Programa de Investigación Clave de Ciencias de Frontera de CAS (ZDBS-LY-SLH015). L.M. cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32271274 y 31770812).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Filtros centrífugos 10 KAmiconUFC901096
3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) Sigma-Aldrich440140
45 Ti
de 532 nmOlympus
Láser de 640 nmOlympus
7 K Columnas de desalinización por centrifugado MWCOThermo Scientific89882
Adenosina 5-trifosfato sódico sal (ATP)Roche11140965001
Ácido benzoicoSigma-Aldrich242381
Biotina-PEG-SVA-5000Laysan Bio170-124
Anticuerpo anti His biotiniladoBioss Anticuerposbs-0287R-bio
d-biotinaSigma-AldrichB4501
Cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTACámara Roche11873580001
EMCCDAndorIX897
Guanosina 5′-difosfato sódico sal (GDP)Sigma-Aldrich  G7127
Guanosina 5'-O-[gamma-tio]trifosfato (GTPγ S)Roche10220647001
Objetivo de inmersión en aceite de alta apertura numéricaNikonNikon, Nikon, 100x, N.A. 1.49, inmersión en aceite
ImageJNIHhttps://imagej.net/ij/
Isopropil-Β-D-TiogalactósidoSigma-AldrichI5502
LD555-MALLumidyne4
LD655-MALLumidyne10
L-ácido glutámico potasioSigma-AldrichG1501
Acetato de magnesio tetrahidratadoSigma-AldrichM0631
MatlabThe MathWorks, Natick, MAhttps://www.mathworks.com/
Cubreobjetos de microscopioFisherbrand18834 ( 24 mm y tiempos; 60 mm)
microscopiopersonalizados, (75 mm &veces; 26 mm &veces; 1 mm) con 6 pares de orificios pasantes de 1,2 mm de diámetro
mPEG-SVA-5000Laysan Bio170-106
Ni Sepharose 6 Fast FlowCytiva17531802
OriginSoftwarehttps://www.originlab.com/
Partículas de poliestirenoQDSphereAG1265
Protocatecuato 3,4-dioxigenasaSigma-AldrichP8279
EstreptavidinaSangon BiotechA610492
Superdex 200 Aumento (10/300 GL)Cytiva28990944
Microscopio TIRFNikonTi2
Tris(2-carboxietil)clorhidrato de fosfina (TCEP)Thermo75259
rotor láser Portaobjetos de de origen

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jimah, J. R., Hinshaw, J. E. Structural insights into the mechanism of dynamin superfamily proteins. Trends Cell Biol. 29 (3), 257-273 (2019).
  2. Kalia, R., Frost, A. Open and cut: Allosteric motion and membrane fission by dynamin superfamily proteins. Mol Biol Cell. 30 (17), 2097-2104 (2019).
  3. Ramachandran, R., Schmid, S. L. The dynamin superfamily. Curr Biol. 28 (8), R411-R416 (2018).
  4. Bryce, S., et al. Human atlastin-3 is a constitutive ER membrane fusion catalyst. J Cell Biol. 222 (7), e202211021(2023).
  5. Crosby, D., et al. Reconstitution of human atlastin fusion activity reveals autoinhibition by the C terminus. J Cell Biol. 221 (2), e202107070(2022).
  6. Hu, J., et al. A class of dynamin-like GTPases involved in the generation of the tubular er network. Cell. 138 (3), 549-561 (2009).
  7. Jang, E., et al. Human atlastins are sufficient to drive the fusion of liposomes with a physiological lipid composition. J Cell Biol. 222 (4), e202109090(2023).
  8. Liu, X., et al. Atlastin-1 regulates morphology and function of endoplasmic reticulum in dendrites. Nat Commun. 10 (1), 568(2019).
  9. Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like gtpase atlastin. Nature. 460 (7258), 978-983 (2009).
  10. Rismanchi, N., Soderblom, C., Stadler, J., Zhu, P. P., Blackstone, C. Atlastin GTPases are required for Golgi apparatus and er morphogenesis. Hum Mol Genet. 17 (11), 1591-1604 (2008).
  11. Faust, J. E., et al. The atlastin C-terminal tail is an amphipathic helix that perturbs the bilayer structure during endoplasmic reticulum homotypic fusion. J Biol Chem. 290 (8), 4772-4783 (2015).
  12. Liu, T. Y., et al. Lipid interaction of the c terminus and association of the transmembrane segments facilitate atlastin-mediated homotypic endoplasmic reticulum fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), E2146-E2154 (2012).
  13. Moss, T. J., Andreazza, C., Verma, A., Daga, A., Mcnew, J. A. Membrane fusion by the GTPase atlastin requires a conserved c-terminal cytoplasmic tail and dimerization through the middle domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (27), 11133-11138 (2011).
  14. Bian, X., et al. Structures of the atlastin GTpase provide insight into homotypic fusion of endoplasmic reticulum membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 3976-3981 (2011).
  15. Byrnes, L. J., et al. Structural basis for conformational switching and GTP loading of the large g protein atlastin. EMBO J. 32 (3), 369-384 (2013).
  16. Byrnes, L. J., Sondermann, H. Structural basis for the nucleotide-dependent dimerization of the large g protein atlastin-1/spg3a. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (6), 2216-2221 (2011).
  17. Morin-Leisk, J., et al. An intramolecular salt bridge drives the soluble domain of gtp-bound atlastin into the postfusion conformation. J Cell Biol. 195 (4), 605-615 (2011).
  18. Pendin, D., et al. GTP-dependent packing of a three-helix bundle is required for atlastin-mediated fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16283-16288 (2011).
  19. Winsor, J., Hackney, D. D., Lee, T. H. The crossover conformational shift of the GTPase atlastin provides the energy driving ER fusion. J Cell Biol. 216 (5), 1321-1335 (2017).
  20. Yan, L., et al. Structures of the yeast dynamin-like GTPase sey1p provide insight into homotypic er fusion. J Cell Biol. 210 (6), 961-972 (2015).
  21. Rizo, J. Molecular mechanisms underlying neurotransmitter release. Annu Rev Biophys. 51, 377-408 (2022).
  22. Gao, S., Hu, J. Mitochondrial fusion: The machineries in and out. Trends Cell Biol. 31 (1), 62-74 (2021).
  23. Kelly, C. M., Byrnes, L. J., Neela, N., Sondermann, H., O'donnell, J. P. The hypervariable region of atlastin-1 is a site for intrinsic and extrinsic regulation. J Cell Biol. 220 (11), e202104128(2021).
  24. Asher, W. B., et al. GPCR-mediated beta-arrestin activation deconvoluted with single-molecule precision. Cell. 185 (10), 1661-1675.e16 (2022).
  25. Li, M., et al. Mechanism of DNA translocation underlying chromatin remodelling by snf2. Nature. 567 (7748), 409-413 (2019).
  26. Chen, Y., et al. Conformational dynamics of dynamin-like MXA revealed by single-molecule fret. Nat Commun. 8, 15744(2017).
  27. Shi, L., et al. Dissecting the mechanism of atlastin-mediated homotypic membrane fusion at the single-molecule level. Nat Commun. 15 (1), 2488(2024).
  28. Guelly, C., et al. Targeted high-throughput sequencing identifies mutations in atlastin-1 as a cause of hereditary sensory neuropathy type i. Am J Hum Genet. 88 (1), 99-105 (2011).
  29. Montagna, A., Vajente, N., Pendin, D., Daga, A. In vivo analysis of CRISPR/Cas9 induced atlastin pathological mutations in drosophila. Front Neurosci. 14, 547746(2020).
  30. Ulengin, I., Park, J. J., Lee, T. H. ER network formation and membrane fusion by atlastin1/spg3a disease variants. Mol Biol Cell. 26 (9), 1616-1628 (2015).
  31. Zhao, X., et al. Mutations in a newly identified GTPase gene cause autosomal dominant hereditary spastic paraplegia. Nat Genet. 29 (3), 326-331 (2001).

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