Las funciones de las proteínas de la superfamilia de la dinamina dependen de los cambios conformacionales junto con la hidrólisis de GTP. Se describe un sistema utilizando la técnica FRET de molécula única (smFRET) para monitorizar la dinámica conformacional de la atlastina GTPasa similar a la dinamina en diferentes estados de carga de nucleótidos.
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Artículo de método
Imágenes FRET de una sola molécula para observar la dinámica conformacional de la atlastina GTPasa similar a la dinamina
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Resumen
Resumen
La rotación del cuerpo rígido del dominio medio de tres hélices (3HB) en relación con el dominio GTPasa de la proteína atlastina (ATL) similar a la dinamina es un impulsor crucial de la fusión homotípica de la membrana dentro del retículo endoplásmico (RE). Las interrupciones en este proceso se han asociado con la paraplejia espástica hereditaria (HSP), un trastorno neurodegenerativo. Los estudios estructurales y bioquímicos sugieren que los cambios conformacionales en ATL están relacionados con la hidrólisis de GTP, pero la visualización en tiempo real de estas dinámicas conformacionales durante el ciclo de hidrólisis de GTP sigue siendo un desafío. Para comprender mejor los mecanismos mecánicos detrás de la función ATL, se utilizó la transferencia de energía por resonancia de Förster de una sola molécula (smFRET). Se emplearon tres estrategias específicas para inmovilizar la región citosólica N-terminal de ATL1 humano (ATL1cyto) en una cámara microfluídica recubierta de estreptavidina, lo que facilitó la aplicación de imágenes smFRET intramoleculares e intermoleculares. Esto permitió un monitoreo preciso de las conformaciones de proteínas en varios estados de carga de nucleótidos, proporcionando información directa sobre los comportamientos moleculares individuales. Este método también se puede aplicar para estudiar otras proteínas mecanoquímicas.
Introducción
En las células eucariotas, las proteínas de la superfamilia de la dinamina median la remodelación de las membranas biológicas, incluida la tubulación, la fisión y la fusión de la membrana 1,2,3. Las mutaciones en estas proteínas conducen a una variedad de enfermedades humanas, como las enfermedades neurodegenerativas. Los miembros de la superfamilia de la dinamina suelen contener un dominio GTPasa, un dominio medio formado por haces helicoidales, un motivo para la unión a la membrana y un dominio efector GTPasa (GED). Una de estas GTPasas sim....
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Protocolo
Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de cubreobjetos modificados para la cámara de inmovilización de proteínas
- Preparación
- Prepare 50 mL de solución de piraña (compuesta de ácido sulfúrico concentrado y peróxido de hidrógeno en una proporción de 3:1) agregando lentamente peróxido de hidrógeno al ácido sulfúrico concentrado para evitar temperaturas excesivas. Colóquelo con cuidado en una campana extractora.
- Prepare la solución de etóxido de sodio. Disuelva 2 g....
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Resultados
Los experimentos smFRET se realizaron en un microscopio TIRF capturando la intensidad de fluorescencia de los fluoróforos cada 30 ms. En la Figura 2A-C se muestran imágenes representativas de moléculascitométricas ATL1 marcadas con LD555 (donante) y/o LD655 (aceptor) en ausencia o presencia de diferentes nucleótidos. Se registraron las intensidades de fluorescencia de los dos fluoróforos en partículas individuales y se extrajeron cientos de trayec.......
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Discusión
La tecnología FRET se basa en la transferencia de energía entre dos colorantes fluorescentes (donante y aceptor). En el caso de su proximidad entre sí (generalmente 1-10 nm), el donante excitado transfiere su energía al aceptor, lo que resulta en una disminución en la intensidad de fluorescencia del donante y un aumento en la intensidad de fluorescencia del aceptor.
En los experimentos smFRET, las moléculas se diluyen a concentraciones muy bajas y se inmoviliz.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
X.B. cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32371287), los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (63223043 y 63233053) y el Proyecto de Formación de Talentos de la Universidad de Nankai (035-BB042112). Y.L. cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (12022409 y T2221001) y el Programa de Investigación Clave de Ciencias de Frontera de CAS (ZDBS-LY-SLH015). L.M. cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32271274 y 31770812).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Filtros centrífugos 10 K | Amicon | UFC901096 | |
| 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| 45 Ti | |||
| de 532 nm | Olympus | ||
| Láser de 640 nm | Olympus | ||
| 7 K Columnas de desalinización por centrifugado MWCO | Thermo Scientific | 89882 | |
| Adenosina 5-trifosfato sódico sal (ATP) | Roche | 11140965001 | |
| Ácido benzoico | Sigma-Aldrich | 242381 | |
| Biotina-PEG-SVA-5000 | Laysan Bio | 170-124 | |
| Anticuerpo anti His biotinilado | Bioss Anticuerpos | bs-0287R-bio | |
| d-biotina | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| Cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA | Cámara Roche | 11873580001 | |
| EMCCD | Andor | IX897 | |
| Guanosina 5′-difosfato sódico sal (GDP) | Sigma-Aldrich | G7127 | |
| Guanosina 5'-O-[gamma-tio]trifosfato (GTPγ S) | Roche | 10220647001 | |
| Objetivo de inmersión en aceite de alta apertura numérica | Nikon | Nikon, Nikon, 100x, N.A. 1.49, inmersión en aceite | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.net/ij/ | |
| Isopropil-Β-D-Tiogalactósido | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| LD555-MAL | Lumidyne | 4 | |
| LD655-MAL | Lumidyne | 10 | |
| L-ácido glutámico potasio | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| Acetato de magnesio tetrahidratado | Sigma-Aldrich | M0631 | |
| Matlab | The MathWorks, Natick, MA | https://www.mathworks.com/ | |
| Cubreobjetos de microscopio | Fisherbrand | 18834 | ( 24 mm y tiempos; 60 mm) |
| microscopio | personalizados, (75 mm &veces; 26 mm &veces; 1 mm) con 6 pares de orificios pasantes de 1,2 mm de diámetro | ||
| mPEG-SVA-5000 | Laysan Bio | 170-106 | |
| Ni Sepharose 6 Fast Flow | Cytiva | 17531802 | |
| Origin | Software | https://www.originlab.com/ | |
| Partículas de poliestireno | QDSphere | AG1265 | |
| Protocatecuato 3,4-dioxigenasa | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Estreptavidina | Sangon Biotech | A610492 | |
| Superdex 200 Aumento (10/300 GL) | Cytiva | 28990944 | |
| Microscopio TIRF | Nikon | Ti2 | |
| Tris(2-carboxietil)clorhidrato de fosfina (TCEP) | Thermo | 75259 |
Referencias
- Jimah, J. R., Hinshaw, J. E. Structural insights into the mechanism of dynamin superfamily proteins. Trends Cell Biol. 29 (3), 257-273 (2019).
- Kalia, R., Frost, A. Open and cut: Allosteric motion and membrane fission by dynamin superfamily proteins.
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Reimpresiones y permisos
