Method Article

Ablación de osteoblastos mediada por láser de dos fotones en larvas de pez cebra en desarrollo

DOI:

10.3791/67279

⸱

September 6th, 2024

 , 
1CRTD - Center for Regenerative Therapies TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, Faculty of Medicine, TU Dresden

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un enfoque de ablación con láser de dos fotones llevado a cabo en larvas de pez cebra, que sirve como modelo para estudiar la regeneración ósea y los efectos de la respuesta inmune a la ablación.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El pez cebra (Danio rerio) tiene una capacidad sobresaliente para regenerar diferentes órganos y apéndices. La regeneración ósea en el pez cebra se ha estudiado utilizando diferentes métodos, como la amputación de aletas, el desplume de escamas, la trepanación del cráneo y los enfoques microscópicos. Utilizando una configuración de escaneo láser confocal equipada con un láser de dos fotones, se desarrolló un método de ablación láser como paradigma de lesión para extirpar células formadoras de hueso (osteoblastos) en el opérculo en desarrollo de larvas de pez cebra. El método descrito aquí permite la ablación de células de manera precisa, ya que el área, la forma y la profundidad se pueden ajustar con precisión. Además, este método permite obtener imágenes de la zona antes y justo después de la ablación, de modo que se pueden analizar los efectos a corto plazo de la lesión. En este montaje experimental, se estudió la respuesta inmunitaria tras la ablación de osteoblastos en la zona lesionada. Se observó un aumento en el reclutamiento de macrófagos después de la ablación, lo que indica la relevancia de su presencia durante la regeneración ósea.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El pez cebra regenera diversos órganos como la retina, el cerebro, el corazón y el páncreas. Además, el pez cebra regenera elementos esqueléticos, por lo que se ha utilizado para estudiar la regeneración de aletas, escamas y calvarias (casquetes craneales)2. Se han utilizado diferentes paradigmas experimentales para estudiar la regeneración tisular y ósea, como la resección (amputación) de aletas, la fractura de aletas, la trepanación de cráneo 3,4, la criolesión 5,6 o la ablación genética 7,8,9. Recientemente, los enfoques de ablación láser han sido ampliamente utilizados en el pez cebra para estudiar la respuesta de curación y regeneración después de una lesión 10,11,12,13,14.

La ablación mediada por láser se ha utilizado en diferentes áreas de la investigación biológica, como la mecanobiología, la biología del desarrollo, la investigación de la regeneración y la cirugía tumoral 10,11,12,15,16,17,18,19. Existen varias metodologías de ablación láser, como el uso de láseres YAG (itrio y aluminio, granate), UV (ultravioleta) o 2p (dos fotones)20. La ablación láser permite la extirpación de células individuales o de grandes porciones de tejidos de una manera muy precisa, permitiendo el estudio de diferentes procesos, como la respuesta del sistema inmune a la ablación tumoral21 o durante la regeneración del opérculo del pez cebra. En este último ejemplo, la ablación se confirmó por la desaparición de la señal de fluoróforo nuclear y citoplasmático y la tinción de necrosis10,22.

Es bien sabido que la respuesta inmune innata y su cinética regulada son esenciales para una adecuada regeneración de los tejidos. Los neutrófilos y los macrófagos son las primeras células en ser reclutadas para el sitio de la lesión, donde desempeñan diferentes funciones, como la liberación de citocinas y factores de crecimiento, la eliminación de desechos celulares y la remodelación de la matriz extracelular23. Este reclutamiento y posterior funcionalización de macrófagos también se ha observado en las aletas de pez cebraamputadas 24 y en el opérculo en desarrollo, que fue sometido a una "nanodisección" láser que condujo a la ablación osteoblástica10. En este último experimento, se observó la recuperación del número de osteoblastos, el desarrollo normal del opérculo y el reclutamiento de células inmunitarias innatas (neutrófilos, macrófagos y células similares a los osteoclastos) en el área lesionada después de la ablación mediada por láser UV y láser de dos fotones10. Los experimentos en pez cebra en los que el sistema inmune fue suprimido farmacológicamente mediante el uso de glucocorticoides mostraron un deterioro de la regeneración ante una inmunidad mal regulada, apoyando el papel funcional del sistema inmune en la reparación de tejidos 3,10,25,26.

Aquí, se describe una metodología de ablación mediada por láser de dos fotones para estudiar la biología de la regeneración ósea en huesos de pez cebra en desarrollo. En particular, el efecto del abordaje de la ablación osteoblástica en el opérculo se muestra en términos de la respuesta inmunitaria, que se investiga mediante el seguimiento del reclutamiento de macrófagos en el sitio de ablación.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo de estudio recibió la aprobación de la Landesdirektion Sachsen, permisos números 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. Las cepas de pez cebra utilizadas se mantuvieron de acuerdo con la legislación nacional y en condiciones estandarizadas como se describió anteriormente27,28. Los detalles de todos los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de materiales y soluciones

  1. Mantener los embriones en 1x medio E3. Prepare el medio 1x E3 diluyendo 170 mL de un caldo E3 60x en 10 L de agua desionizada y agregando 2 mL de azul de metileno al 0,1%.
    1. Prepare el material de papel 60x E3 mezclando 17,2 g de NaCl, 0,76 g de KCl, 2,90 g de CaCl2,2 H2O, 4,90 g de MgSO4,7 H2O en 1 L de agua desionizada esterilizada en autoclave.
  2. Para la inclusión de larvas, prepare alícuotas de 1% de agarosa de bajo punto de fusión (LMA) con anticipación y manténgalas a temperatura ambiente.
    1. Para preparar alícuotas, disuelva LMA en 1x medio E3, por ejemplo, 500 mg de LMA en 50 mL de 1x E3 en un matraz Erlenmeyer, caliente la solución en el microondas hasta que la agarosa se disuelva por completo y dispense en alícuotas de 1 mL en tubos de 1,5 mL.

2. Cría y recolección de embriones de pez cebra

NOTA: Aquí se utilizaron larvas dobles de pez cebra transgénicas que informaron la presencia de osteoblastos comprometidos [osterix:nGFP = Tg(Ola.Sp7:NLS-GFP)zf132]29 y macrófagos [mpeg:mCherry = Tg(mpeg:mCherry)gl23]30 (Figura 1A).

  1. Instale el pez cebra parental con los transgenes individuales deseados en jaulas de apareamiento estándar la noche antes del apareamiento.
    NOTA: Las jaulas de apareamiento estándar permiten que los huevos pasen a un compartimento inferior donde el pez cebra parental no puede alcanzarlos.
    1. Mantenga a los machos y las hembras separados hasta el apareamiento usando un divisor en la jaula de apareamiento. Retire el divisor en la mañana del día siguiente para iniciar el apareamiento.
  2. Al mediodía, a más tardar, retire el pez cebra parental de los tanques de cría y recoja los embriones, filtrando el agua de la jaula de apareamiento a través de un colador.
    NOTA: En caso de que la edad exacta de las larvas sea decisiva, coseche los embriones en intervalos regulares de aproximadamente 30 min. Los acoplamientos de embrague deben usarse en experimentos con diferentes grupos experimentales.
  3. Colocar los embriones en una placa de 100 mm de diámetro que contenga 1x medio E3 y mantenerlos en una incubadora a 28 °C31.
  4. Retire los óvulos no fertilizados y los embriones muertos del plato con una pipeta de plástico con la ayuda de un microscopio estereoscópico y cambie 1 medio E3 al día.
  5. Antes del experimento, clasifique las larvas positivas para los transgenes reporteros utilizando un microscopio estereoscópico de fluorescencia.

3. Incrustación de larvas en agarosa de bajo punto de fusión

  1. Derretir las alícuotas de LMA en un termobloque o baño de agua a 65 °C. Una vez que el LMA se haya derretido, manténgalo a 42 °C hasta que se incruste (Figura 1B). Agregue 50 μL de MS-222 al 0,4 % de MS-222 al 1 mL fundido de alícuota de LMA para lograr una concentración de MS-222 del 0,02 % para anestesia.
  2. Anestesiar 4 dpf (días después de la fertilización) larvas (o larvas más viejas) en medio MS-222 E3 al 0,02%.
  3. Transfiera las larvas anestesiadas a una placa de micropocillos con fondo de vidrio utilizando una pipeta Pasteur de plástico de 3 mL y elimine el exceso de medios E3 con la misma pipeta (Figura 1B). Evite la desecación de las larvas.
    NOTA: Más de una larva puede estar incrustada en un plato simultáneamente; Se recomienda incrustar de 3 a 5 larvas para permitir tiempo suficiente para la colocación.
  4. Tome la agarosa LMA derretida del baño de agua/termobloque y agregue una gota (refrescante) de LMA al plato, cubriendo el fondo de vidrio donde se colocaron las larvas. Preste atención a que el LMA no esté demasiado caliente, sino que aún esté líquido.
  5. Luego, coloque las larvas en la posición lateral deseada antes de que la agarosa se solidifique. En este caso, asegúrese de que el opérculo esté lo más cerca posible del fondo de vidrio de la placa como preparación para la configuración del microscopio inverso (Figura 1B).
  6. Deje que la agarosa se solidifique y luego agregue medios E3 (que contengan un máximo de 0.02% MS-222) al plato para evitar que la agarosa se seque (Figura 1B).

figure-protocol-1
Figura 1: Representación esquemática del procedimiento de incrustación. (A) Tg(osterix:nGFP) transgénico doble; Se utilizaron larvas de pez cebra con osteoblastos operculares marcados en verde y macrófagos marcados en rojo. (B) El flujo de trabajo del procedimiento de incrustación, como se describe en el paso 3 del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Imagen in vivo de las larvas y ablación con láser

  1. Para ablacionar con láser osteoblastos en el opérculo en desarrollo de pez cebra transgénico Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30, utilice un microscopio de barrido láser de dos fotones invertido con un objetivo de agua de 25x/0,95 o una configuración equivalente.
  2. Coloque la placa con las larvas incrustadas en la etapa microscópica del microscopio invertido y coloque la región deseada para la ablación en el centro del campo de visión. El opérculo se puede identificar fácilmente con la ayuda de la señal de fluorescencia GFP.
  3. Una vez que el opérculo esté enfocado y centrado en el campo de visión del microscopio, elija la configuración de la pila z (a menudo se utilizan intervalos z de 1-2 μm) para obtener una imagen de toda la anchura del opérculo. Al mismo tiempo, elija el área en un plano z específico que se va a ablacionar (generalmente en la zona posterior del opérculo). La ablación con láser de dos fotones solo se ejerce en este plano.
    NOTA: Una resolución más alta en la dimensión z conducirá a tiempos de imagen más largos, pero permitirá análisis volumétricos de los datos adquiridos más adelante.
  4. Obtener una imagen del área de interés del opérculo antes de la ablación. Para la detección de GFP, utilice un láser de luz blanca a 488 nm y un detector híbrido que vaya de 495 nm a 550 nm o equivalente. Obtenga imágenes de los macrófagos mediante excitación de 555 nm (láser de luz blanca), con un rango de detección de mCherry de 595 a 780 nm en un detector híbrido (o equivalente).
    1. Utilice el formato de imagen 512 x 512 para obtener una buena relación calidad/tiempo (se pueden utilizar otros formatos si se desea una resolución más alta o, alternativamente, una velocidad más alta).
      NOTA: Se puede utilizar y ajustar una incubadora con control de temperatura instalada en el microscopio, por ejemplo, a 28 °C.
  5. Dibuje una región circular con un diámetro de 25 μm (se pueden seleccionar otras formas y tamaños según el experimento) en un plano 2D seleccionado, enfocando el opérculo con la herramienta ROI.
  6. Para realizar la ablación, aplique una potencia de ablación (medida sin objetivo) a 450 mW y exponga el área seleccionada al láser de dos fotones a una velocidad de escaneo de 400 Hz y una duración total de 10 s. Durante la ablación, el área se puede visualizar utilizando un detector híbrido en el rango de 401-443 nm o equivalente.
  7. Después de la ablación, confirme la ablación estructuralmente mediante la obtención de imágenes de nuevo de la misma pila z con los mismos ajustes que se utilizaron antes de la ablación. El área ablacionada ya no contiene células fluorescentes.

5. Recuperación de larvas e imágenes para monitorear el reclutamiento de células inmunitarias

  1. Si es necesario realizar la obtención de imágenes del reclutamiento de células inmunitarias con retraso, recupere las larvas de la imagen y la anestesia. Retire las larvas con cuidado de la LMA con pinzas o una aguja de disección.
    1. Primero, retire una capa de agarosa que cubre las larvas. En segundo lugar, retire la agarosa en contacto directo con las larvas. Omita este paso si se están llevando a cabo imágenes inmediatas del reclutamiento de células inmunitarias.
  2. Vuelva a colocar las larvas en un plato con medios E3 puros y compruebe su recuperación. La recuperación es evidente por la natación de las larvas.
  3. A las 4 o 6 hpl (horas después de la lesión), se tomen imágenes del área del opérculo de nuevo utilizando los mismos ajustes en el mismo microscopio para comprobar los efectos de la ablación en el reclutamiento de macrófagos. Para ello, repita la incrustación (paso 3) y la creación de imágenes como se realizó antes (paso 4).
  4. Después de la toma de imágenes, retire las larvas de la LMA. El sacrificio de las larvas puede realizarse mediante incubación en agua helada o con una sobredosis de MS-222 en E3, dependiendo de los requisitos legales. A continuación, las muestras pueden utilizarse para estudios de seguimiento o eliminarse.

6. Análisis de imágenes y análisis estadístico

  1. Procese las imágenes utilizando un software de procesamiento de imágenes como Fiji32. Dependiendo de la resolución z de los datos adquiridos, los análisis se pueden realizar en 2D o 3D.
  2. Cuantifique los macrófagos manualmente incluyendo células que estén claramente separadas, por ejemplo, discerniendo los cuerpos celulares principales, o alternativamente cuantificando las células con una etiqueta nuclear o midiendo el área en caso de que las células se superpongan (siguiente paso).
  3. Para cuantificar el área, cree una máscara que abarque los macrófagos. Para ello, utilice la herramienta Imagen > Ajustar > umbral y cree un ROI (Herramientas de análisis > > Administrador de ROI > agregar) en Fiji. Excluya las partículas pequeñas en el fondo para la cuantificación.
    1. A continuación, mida el área (Analizar > medir). Considere si es necesario incluir en la medición áreas de fluorescencia celular superpuesta.
      NOTA: Aquí, el área de ablación circular se omitió de las mediciones del área, ya que los macrófagos reclutados no se pueden distinguir en esta área.
  4. Genere gráficos que representen los resultados de las mediciones utilizando un software adecuado. Para comparar los datos antes y después de la ablación, realice una prueba estadística adecuada (en este caso, se realizó una prueba t de una cola pareada).
    NOTA: Las figuras se pueden preparar utilizando software de edición de fotos y diseño gráfico.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La ablación con láser se realizó como se indica en el protocolo anterior. La señal GFP de los osteoblastos en el área ablacionada desapareció instantáneamente después de la ablación. Para estudiar la respuesta de la ablación osteoblástica en términos de respuesta inmune, se visualizó la presencia de macrófagos en larvas de 6 dpf antes y a 6 hpl. Antes de la ablación, se observaron muy pocos macrófagos en el área del opérculo10 (Figura 2). A 6 hpl, se detectó una fuerte acumulación de macrófagos en la región del opérculo ablacionado y un mayor número de macrófagos en el campo de visión, incluyendo el opérculo y el área que rodea al opérculo10 (Figura 2).

figure-results-1
Figura 2: Reclutamiento de macrófagos a 6 hpl en larvas de pez cebra de 6 dpf. Área del opérculo sin ablación y a 6 hpl. Los osteoblastos operculares están marcados en verde, los macrófagos en magenta y el círculo discontinuo indica el área ablacionada con láser. Barra de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

También se analizó el reclutamiento de macrófagos en larvas de 4 dpf con opérculos mucho más pequeños a 4 hpl, observándose resultados similares (Figura 3). La cuantificación del número de macrófagos (fuera del sitio de ablación inmediata con láser) mostró un aumento dentro del marco de tiempo investigado (4,00 ± 2,37 macrófagos antes de la ablación frente a 7,00 ± 2,76 macrófagos a 4 hpl ) (Figura 3B). Asimismo, el área de macrófagos (medida en μm2, 785,8 μm2 ± 723,1 μm2 antes de la ablación frente a 1553 μm2 ± 869,9 μm2 a 4 hpl) aumentó (Figura 3C). Como los macrófagos a veces son difíciles de distinguir, se recomienda medir el área de los macrófagos en lugar del número de macrófagos, como se hizo aquí.

figure-results-2
Figura 3: Reclutamiento de macrófagos a 4 hpl en larvas de pez cebra de 4 dpf. (A) Área del opérculo sin ablación y a 4 hpl. Los osteoblastos operculares están marcados en verde, los macrófagos en magenta y el círculo discontinuo indica el área ablacionada con láser. Barra de escala: 50 μm. (B) Cuantificación del número de macrófagos en el área del opérculo directamente antes (0 hpl) y después de la ablación (4 hpl). (C) Cuantificación del área de macrófagos (excluido el sitio de ablación láser). Pruebas t pareadas de una cola. Cada punto representa los datos de una larva, y se muestra la media ± SD, n = 6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La ablación láser se ha aplicado en diversas disciplinas de la investigación biológica. En particular, ha sido útil como método para estudiar la regeneración de tejidos 10,11,12. Por ejemplo, el reclutamiento y los cambios fenotípicos de las células inmunitarias innatas se analizaron recientemente a lo largo del tiempo utilizando ensayos de ablación con láser UV o láser de dos fotones, junto con la recuperación de osteoblastos en el sitio de ablación con láser10. Se realizaron imágenes en vivo del reclutamiento de células inmunitarias hasta 12 h después de la lesión (HPL); Sin embargo, se pueden prever períodos de imagen más largos con los ajustes adecuados en la anestesia y la aprobación de las autoridades respectivas. En Geurtzen et al., los análisis se realizaron hasta varios días después de la ablación láser y ayudaron a definir el medio inflamatorio en el sitio de la ablación, así como a establecer el papel de apoyo de los macrófagos en la regeneración ósea10. Son concebibles muchas otras aplicaciones, como el estudio del papel de las especies reactivas de oxígeno liberadas33 tras la muerte celular en el tejido óseo.

Una de las ventajas de utilizar la ablación celular mediada por láser de dos fotones es la posibilidad de combinarla con imágenes confocales. El software utilizado aquí (ver Tabla de Materiales) se puede configurar en un modo (Modo de datos en vivo) en el que la obtención de imágenes y la ablación se producen consecutivamente, lo que acelera el proceso. Otra ventaja de la tecnología es la precisión de la ablación. El tamaño y la forma de la ablación se pueden ajustar fácilmente en el software de una manera muy precisa. En el entorno experimental que aquí se presenta, se eligió un área circular con un diámetro de 25 μm para la ablación. Sin embargo, otros experimentos de ablación en Drosophila emplearon ablaciones lineales de 25 μm con el fin de reducir la tensión tisular en el epitelio embrionario mediante el corte de las uniones celulares vecino-vecinas34. Esta precisión permite la ablación de un número específico y controlado de células, células individuales o incluso membranas celulares.

En particular, el tipo de lesión realizada con un láser de dos fotones no se asemeja a las lesiones y la muerte celular que ocurren naturalmente, lo que debe tenerse en cuenta en la investigación de la regeneración, pero también en otras disciplinas. En particular, las ablaciones con láser crean lesiones muy focalizadas al destruir completamente (quemar) las células en la región de interés20 con un daño mínimo en los tejidos circundantes, mientras que las lesiones mecánicas u otros tipos de lesiones tienden a afectar a varios tipos y capas de tejido a una escala más amplia. Esto puede conducir a múltiples consecuencias que involucran diferentes tipos de muerte celular (por ejemplo, necrosis, apoptosis, autofagia)35 y diferentes resultados regenerativos. Además, las reacciones a la ablación con láser pueden diferir en términos celulares y moleculares. Por ejemplo, se demostró que, aunque las células que rodean el sitio de la lesión láser pueden perder la integridad de la membrana plasmática, pueden sobrevivir al daño y restaurar la integridad36. La ablación láser también conduce a áreas de la matriz extracelular dañadas, que pueden ser el resultado de "explosiones térmicas" en el centro mismo del rayo láser aplicado y también de una fuerte exposición al calor en las células directamente vecinas10,37. Sin embargo, las células que rodean los sitios de ablación con láser muestran un mayor número de cuerpos apoptóticos, como se muestra para el tejido cardíaco ablacionado con láser38, y se desencadena una respuesta inmune, como se muestra aquí. Además de las diferencias descritas, otra limitación de los ensayos de ablación asistida por láser podría ser la profundidad a la que se puede realizar la lesión y el tamaño limitado de las muestras. Es posible que las estructuras ocultas en los especímenes gruesos no se ablacionen adecuadamente y sea difícil obtener imágenes del producto. Esto, sin embargo, dependerá en gran medida del microscopio y el láser utilizados, así como del objetivo y la incrustación.

Incrustar las larvas de manera que el opérculo se coloque muy cerca del fondo de vidrio del plato es esencial en caso de que se utilice una configuración invertida, como en el protocolo presentado. Además, es muy importante probar la temperatura de la LMA antes de aplicarla para cubrir las larvas (paso 3.4) ya que la agarosa caliente dañará las larvas. Para evitarlo, tome la alícuota LMA del termobloque temprano, por ejemplo, mientras retira los medios E3 sobrantes del plato con fondo de vidrio, y pruebe la temperatura, como en la piel de la muñeca. Se supone que la LMA está tibia pero no caliente.

Una vez que las larvas están cubiertas con LMA, es importante colocarlas rápidamente en la posición correcta antes de que la LMA comience a solidificarse. La posición lateral es la más fácil de lograr; En el estudio presentado, la posición deseada fue lateral con una ligera inclinación hacia el lado ventral. En caso de que el LMA se solidifique antes de que las larvas se coloquen correctamente, es posible eliminar el LMA (como en el paso 5.1) y repetir la incrustación. Del mismo modo, es importante que la zona que se va a fotografiar (y ablacionar con láser) esté lo más cerca posible del fondo de cristal de la antena para obtener la máxima calidad de imagen y ablación celular, aunque esto también dependerá de la distancia de trabajo del objetivo.

Es posible incrustar más de una larva en el mismo plato para la obtención de imágenes. Esto ahorrará tiempo y hará un mejor uso de la LMA. El número de larvas que se pueden incrustar dependerá de la experiencia del experimentador, pero se recomiendan de 3 a 5 larvas.

La ablación láser también se puede realizar con configuraciones microscópicas verticales que emplean lentes de inmersión. En este caso, es importante incrustar las larvas con una vista ligeramente ventral (desde arriba) para permitir una buena calidad de imagen y el éxito de la ablación láser del opérculo. Además, solo una capa delgada de LMA debe cubrir las larvas para permitir una buena excitación y detección de señales fluorescentes.

En este protocolo, se describe una configuración de ablación mediada por láser de dos fotones para osteoblastos como una metodología para realizar lesiones en huesos en desarrollo, específicamente en el opérculo. Este método se puede adaptar para extirpar células en otros huesos de pez cebra en desarrollo. Además, en general es un enfoque útil para estudiar la regeneración de los tejidos lesionados11,12. La facilidad para realizar ablaciones y cortes de tejidos de diferentes tamaños y formas permite su uso en diferentes configuraciones experimentales y campos de investigación 15,17,18,19,21,34. En conjunto, la ablación mediada por láser de dos fotones es un método muy adaptable, para diferentes tejidos, organismos e incluso entornos in vitro, y representa una herramienta importante en la investigación biológica.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) Transregio 67 (proyecto 387653785), la DFG SPP 2084 μBone (proyecto KN 1102/2-1) a FK. Este trabajo contó con el apoyo de la Instalación de Microscopía Óptica (proyecto DFG 413875620), una instalación central de la Plataforma Tecnológica CMCB de la Universidad Técnica de Dresde. Las obras de la Universidad Técnica de Dresde se cofinanciaron con ingresos fiscales basados en el presupuesto acordado por el Parlamento sajón (en lo sucesivo, «Landtag»).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cloruro de calcio dihidratado, CaCl2· H2OCarl Roth5239.1
Placa de cultivo celular, PS, 100/20 mmGreiner Bio-one664160
Dumont #55 FocepsFST11295-51 Forma depunta recta, 11 cm, 0,05 x 0,02 mm
Placa Falcon de 6 pocillosCorning
Plato de micropocillos con fondo de vidrioMatTekP35G-1.5-14-CPlato de 35 mm, cubreobjetos n.º 1,5, diámetro de vidrio de 14 mm,
láser multifotónico Insight X3Spectra-Physics
Leica Application SuiteLAS X, Leica Microsystems
Agarosa de bajo punto de fusión Biozyme840101Biozym Placa Agarosa
Sulfato de magnesio heptahidratado, MgSO4· 7H2OSigma-AldrichM5921
Jaulas dede muchas variedades, p. ej. Tecniplast
MethyleneblueCarl RothA514.1
MS-222SIGMA AldrichA5040
Cloruro de potasio, KClPanReac AppliChem 131494Cloruro
de sodio, NaClCarl Roth3957.1
SP8 HALCÓN Leica MicrosystemsEquipado con un láser multifotónico Insight X3 y el software Leica Application Suite
Aguja de disección de acero inoxidableBochem12010140 mm
SZX16OlympusEquipado con una base de iluminación LED SZX2-ILLTQ
Armarios termostáticos TS - WTWxilemaTS 608/2-iPara incubación (embrión)
Transferencia pipeta, 3,5 mLSARSTEDT861171155 x 15 mm, LD-PE, transparente
Zeiss SteREO Discovery.V12 versión 4.7.1.0.Zeissequipado con cámara Axiocam MRm y software AxioVision
353502 sin recubrimiento apareamiento Sistema de microscopio estereoscópico de

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