Proporcionamos un protocolo paso a paso para evaluar la resistencia del álamo a los patógenos del cancro del tallo utilizando un método de inoculación de hojas in vivo . Este método es especialmente adecuado para la evaluación a gran escala de la resistencia a la enfermedad del cancro de Cytospora chrysosperma y Botryosphaeria dothidea en la progenie de cría de álamos en China.
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Artículo de método
Inoculación in vivo de hojas: un método alternativo para evaluar la resistencia a enfermedades de clones híbridos en la cría de álamos de la enfermedad del cancro del tallo
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Resumen
Resumen
Enfermedades del cancro del tallo causadas por el patógeno Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr.) y Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. Son las dos principales enfermedades forestales en las plantaciones de álamos en China, que a veces pueden destruir todas las plántulas de álamo o dañar gravemente los bosques maduros de álamos. El mejoramiento híbrido es el método más directo y eficiente para controlar y manejar las enfermedades de los árboles. Sin embargo, la evaluación de la resistencia a las enfermedades o la selección de clones resistentes a las enfermedades basados en la inoculación in vitro del tallo es ineficiente, requiere mucho tiempo y es costosa, lo que limita el desarrollo de la cría híbrida de la enfermedad del cancro del tallo del álamo. En este estudio, propusimos un método alternativo para evaluar la resistencia de las enfermedades a los patógenos del cancro del tallo a través de la inoculación de hojas in vivo . Los materiales de prueba utilizados en este método pueden estar en árboles jóvenes de álamo de 1 año o en las ramas anuales de álamos perennes en el invernadero o en el campo. El paso crítico de este método alternativo es la selección de las hojas inoculantes: las 5-7hojas recién maduras podrían ser las más adecuadas. El segundo paso crítico del método de inoculación de hojas es hacer heridas en las hojas de las plantas a través de perforaciones con agujas, proporcionando suficientes lesiones para medir la gravedad de la enfermedad. Para el número adecuado de hojas producidas en la etapa temprana de la cría del álamo, esta inoculación in vivo de la hoja contribuye a la detección rápida, precisa y a gran escala de los clones de álamo resistentes a enfermedades para los patógenos del cancro. Además, este método de inoculación de hojas también servirá como un método eficiente para detectar patotipos de patógenos de la enfermedad del cancro del tallo C. chrysosperma, B. dothidea u otros patógenos del cancro del tallo del álamo.
Introducción
Enfermedades del cancro del tallo del álamo, causadas principalmente por dos patógenos necrótrofos, Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr. y Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. De Not., amenazan severamente el desarrollo y la supervivencia de las plantaciones de álamos en el noreste, norte y noroeste (tres nortes) de China. El mejoramiento híbrido es el método más directo y eficiente para controlar y manejar las enfermedades de los árboles; Sin embargo, en comparación con los avances en la cría de clones híbridos de álamo de alto rendimiento, de crecimiento rápido u otros clones híbridos, la investigación sobre la mejora genética resistente a la enfermedad del cancro del álamo es escasa. Solo se han reportado estudios limitados de mejoramiento híbrido resistente a enfermedades 1,2,3, y no se ha cultivado ningún clon híbrido resistente al cancro en la forestación de álamos.
El paso crucial de la cría regular de híbridos es la selección de clones basada en la adquisición del fenotipo de la progenie híbrida. Sin embargo, la adquisición de fenotipos patológicos (patotipos) es un proceso lento, laborioso, agotador, costoso y dependiente de expertos. Para las plantas leñosas, es más desafiante debido a la naturaleza que consume tiempo, trabajo y economía causada por su largo ciclo de vida, crecimiento lento y cuerpo masivo. Por ejemplo, en álamo, el cribado de la resistencia al cancro de la progenie híbrida se realizó 5-7 años después de la hibridación mediante métodos convencionales de inoculación del tallo in vitro 1,2,3. Además, limitados por este método de cribado resistente a las enfermedades de baja eficiencia y alto consumo, los investigadores volvieron a seleccionar los clones resistentes al cancro de un pequeño subgrupo (por ejemplo, los clones de álamo seleccionados de alto rendimiento o de rápido crecimiento), no de toda la progenie híbrida. Por lo tanto, utilizando los métodos regulares de inoculación del tallo, no es seguro identificar los clones resistentes auténticos y no puede revelar la diversidad resistente a las enfermedades de la progenie reproductora, lo que limita la exploración de genes o módulos genéticos relacionados con la resistencia a las enfermedades. En comparación con el rápido desarrollo del mejoramiento genético de álamo de crecimiento rápido / alto rendimiento, esos programas de mejoramiento pueden obtener híbridos a través de la selección fenotípica o incluso la selección genómica en los primeros dos años de mejoramiento 4, el mejoramiento resistente al cancro del álamose desarrolló lentamente. El cribado (o detección) de la progenie híbrida resistente a las enfermedades, o el método de inoculación de patógenos, se ha convertido en el paso crucial que limita la velocidad en la cría de resistencia a la enfermedad del cancro del álamo.
En este protocolo, introducimos un nuevo método de inoculación para patógenos del cancro del tallo del álamo, el método de inoculación de hojas in vivo . Con este método, podemos probar de manera rápida y eficiente la resistencia a la enfermedad del chancro de docenas de especies de álamos (cultivares o clones) en 5-7 días. El ensayo de validación ilustró que la inoculación in vivo de la hoja es consistente con la inoculación tradicional del tallo in vitro en la detección de resistencia de la enfermedad del cancro del tallo, lo que sugiere que el método de inoculación de la hoja es adecuado para el cribado de la resistencia a gran escala de las enfermedades del cancro del álamo, como la selección completa del genotipo de la progenie de resistencia en la cría de la enfermedad del cancro del tallo. Este método resuelve el problema patológico de la selección de descendientes resistentes en la cría híbrida de enfermedades del cancro del álamo.
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Protocolo
1. Cultivo de hongos para el patógeno del cancro
- Prepare el agar papa dextrosa (PDA; extracción de papa 6,0 g, dextrosa 20,0 g, agar 20,0 g) medio de cultivo para cepas fúngicas; disolver los materiales anteriores en agua hasta 1000 mL, disolver completamente el medio a 100 °C durante 10 min.
- Vierta el medio PDA en tubos de 25 mL (cada uno contiene 15.0 mL); esterilizar todos los tubos a 121,1 °C durante 30 min. Vierta el medio en placas de cultivo (9,0 cm de diámetro) y enfríe las placas a temperatura ambiente (RT).
- Cortar el micelio del patógeno fúngico, que se cultiva en medio PDA a 28 °C durante 7 días, en cubos cuadrados de ~0,5 cm; inocule los cubos de hongos en el centro de las placas de PDA (los lados del micelio miran hacia el medio).
- Cultivar los patógenos fúngicos en una incubadora termostática (28 °C, en oscuridad) durante 7-10 días.
- Corte el medio PDA con micelio fúngico en cubos cuadrados (longitud lateral 1,0-1,2 cm).
2. Preparación de materiales de álamo
- Para clones de álamo de 1 año (cultivados > 3 meses), seleccione las hojas recién maduras y completamente extendidas (siempre 5-7hojas , desde la parte superior del arbolito/ramas) de las ramas principales como materiales inoculados, asegúrese de que estén libres de plagas, enfermedades y daños mecánicos.
- Para ramas de 1 año de edad de clones híbridos de álamo perenne (cultivadas > 2 meses), seleccionelas hojas superiores de 5-7 de las ramas seleccionadas como materiales inoculados. Asegúrese de que las hojas estén sanas y tengan la misma condición de luz (sombra o luz) entre todos los clones de álamo probados.
3. Pretratamiento de las hojas de inoculación
- Rocíe las hojas de álamo con agua limpia y, después del secado, limpie las hojas seleccionadas con alcohol al 75% 1 h o 1 día antes de las manipulaciones de inoculación.
4. Inoculación foliar in vivo
- Para hojas pequeñas (ancho de hoja < 8,0 cm), inocule dos cubos cuadrados de micelio fúngico y cubos de PDA (o agar agua, WA) (1,0-1,2 cm de longitud lateral) en la superficie superior de las 5-7 hojas superiores de los clones de álamo; El micelio mira hacia las hojas. Asegúrese de que los sitios de inoculación estén ubicados en el centro de las medias hojas, a ~ 1-2 cm de distancia de las venas centrales, evitando oscurecer las venas secundarias. Cada clon inocula 12 sitios en 6 hojas (10 sitios para micelio y 2 sitios para inoculación de PDA).
- Para hojas grandes (ancho de hoja ≥ 8,0 cm), inocule cuatro cubos cuadrados de micelio fúngico y cubos de PDA (o WA) en las 5-7 hojas de álamo superiores. Cada clon inocula 12 sitios en 3 hojas (10 sitios para micelio y 2 sitios para la inoculación de PDA.
- Envuelva las hojas inoculadas con cinta adhesiva transparente (6,0 cm de ancho) y presiónelas suavemente para que se adhieran a las hojas, evitando el movimiento y la pérdida de agua de los cubos de micelio (o PDA) durante el experimento.
- Perfore las hojas y los cubos de micelio (o PDA) en cinco sitios hasta que las agujas penetren en los cubos desde la superficie superior hasta la inferior de las hojas de álamo. Un sitio se encuentra en el centro y los otros cuatro se encuentran a 1-2 mm cerca de los cuatro vértices de los cubos.
NOTA: Se recomienda una colaboración en equipo de 3 personas para la manipulación de la inoculación de hongos. La manipulación de la inoculación de una población híbrida de álamo (>100 genotipos) se puede realizar en 4 h mediante trabajo en equipo. Las manipulaciones de perforación se llevaron a cabo después de que todas las hojas analizadas fueron inoculadas y envueltas para aliviar el impacto de los diferentes tiempos de perforación en la gravedad de la enfermedad. - Inspeccione el cambio de ubicación y la pérdida de agua de los inoculantes de micelio, y observe la aparición de lesiones necróticas alrededor de los sitios de la herida perforante desde la superficie inferior de las hojas hasta el3er día de inoculación.
- Dentro de los 3 días posteriores a la inoculación, observe el cambio de ubicación y la pérdida de agua de los cubos de micelio. Defina y marque los cubos de micelio movidos y secos como inoculaciones ineficaces y descarte de la identificación final de los patotipos, definiendo los otros cubos como inoculaciones efectivas.
NOTA: Este protocolo define los clones de álamo probados con más de cinco cubos de inoculación efectivos como clones inoculados inválidos; Por lo tanto, cada clon de álamo proporcionó al menos 30 sitios de inoculación efectivos, que se convertirán en 30 manchas necróticas independientes.
- Dentro de los 3 días posteriores a la inoculación, observe el cambio de ubicación y la pérdida de agua de los cubos de micelio. Defina y marque los cubos de micelio movidos y secos como inoculaciones ineficaces y descarte de la identificación final de los patotipos, definiendo los otros cubos como inoculaciones efectivas.
- Retire todas las hojas inoculadas al final del experimento (~5-7 días después de la inoculación), llévelas de vuelta al laboratorio en bolsas de plástico para muestras y guárdelas a 4 °C.
5. Adquisición del patopatía foliar y evaluación de la resistencia del álamo a las enfermedades del cancro del tallo en el laboratorio
- Retire con cuidado las cintas adhesivas transparentes y los inoculantes de micelio (o PDA) de las hojas.
- Observe e identifique los patotipos de las hojas de cada clon de álamo, incluida la forma y el color de las manchas necróticas, y puede incluir la estructura fúngica similar a hifas, picnidios y conidios que se formaron en la superficie de las hojas alrededor de los sitios de perforación.
- Fotografíe las hojas (con una regla adicional) con una cámara, o escanee las hojas (con una regla adicional) con un escáner para obtener imágenes con una resolución de más de 300 ppp y, a continuación, guarde las imágenes en formato JPEG, TIFF o PNG.
6. Identificación y análisis estadístico de la incidencia de enfermedades
- Abra las imágenes de hojas enfermas en el software ImageJ 1.54g (http://imagj.org).
- Establezca la escala de acuerdo con la regla en las imágenes de hojas.
- Identifique y mida las lesiones con la herramienta de varita (trazado).
- Registre y exporte los valores de área como una hoja de cálculo después de medir las áreas de todos los puntos necróticos.
- Establecer los criterios para la determinación de la enfermedad:
- Si el área de la lesión alrededor de los cubos de micelio cubiertos por los sitios de perforación es significativamente mayor que la cubierta por los cubos de PDA, entonces defina estos sitios como sitios de enfermedad.
- Si las características morfológicas de los sitios de perforación cubiertos por cubos de micelio cambiaron significativamente en comparación con los sitios cubiertos por PDA, incluidos los colores de la lesión, la estructura productora de hifas, picnidios y conidios, defina el sitio también como un sitio de enfermedad.
- Calcule las áreas promedio de las manchas de lesiones PDA efectivas de cada clon híbrido de álamo. De acuerdo con las áreas promedio, divida todas las manchas inoculadas con micelio de un clon de álamo en dos categorías: de inicio y no de inicio. A continuación, calcule la tasa de incidencia de la enfermedad del clon de álamo analizado (Fórmula 1: Tasa de incidencia de la enfermedad (%) = Número de puntos de punción enfermos/Número total de puntos de pinchazos eficientes × 100).
- Calcule el área promedio de las manchas enfermas en las hojas (n = 50). De acuerdo con los valores de las áreas promedio de manchas enfermas de hojas en todos los clones de álamo analizados, se estableció un estándar de clasificación de enfermedades de 5 niveles.
- Calcule el índice de enfermedad de cada clon de álamo (Fórmula 2) en función del estándar de clasificación de enfermedades anterior (Fórmula 2: Índice de enfermedad = ∑(Número de sitios de punción por nivel × Valores de gravedad en todos los niveles)/(Valor del nivel de gravedad más alto × Número total de sitios de punción eficientes) × 100).
- Verifique la distribución normal del número de clones de álamo a través de diferentes niveles de resistencia utilizando la prueba de Shapiro-Wilk utilizando cualquier software de análisis de datos apropiado.
- De acuerdo con el índice de enfermedad, identifique todos los clones de álamo analizados en cinco (o siete) grupos: muy alta resistencia (VHR), alta resistencia (HR), resistencia (R), sin resistencia y sin susceptibilidad (NRNS), susceptibilidad (S), alta susceptibilidad (HS) y muy alta susceptibilidad (VHS) grupo5.
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Resultados
En este protocolo, el flujo de trabajo esquemático se llevó a cabo en 48 clones híbridos de álamo infectados por el patógeno del cancro del tallo C. chrysosperma (Figura 1). Los clones híbridos de álamo forman parte de la progenie de hibridación de P. deltoides, cultivada en el vivero de la Academia China de Silvicultura (CAF), en Pekín.
El patógeno del cancro del tallo C. chrysosperma aislado CZC es una cepa fúngica típica (con patogeni...
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Discusión
Este protocolo proporciona un método de inoculación rápido y eficiente para los patógenos de resistencia al cancro del álamo, que es adecuado para los campos de investigación que requieren el cribado de resistencia a enfermedades a gran escala, como el mejoramiento híbrido de la resistencia al cancro del álamo y el cribado de patogenicidad de los patógenos del cancro del tallo.
El primer punto clave del método es evaluar la resistencia a las enfermedades medi...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada conjuntamente por el Fondo de Investigación Basal de la Institución Científica Central de Interés Público del Laboratorio Estatal Clave de Genética y Mejoramiento de Árboles (subvención número CAFYBB2020ZY001-2) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención número 32171776) a Jiaping Zhao.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Papel de aluminio | Biosharp | BS-QT-027B | |
| C. chrysosperma isolate | China Centro de Recolección de Cultivos Forestales | CFCC86775 | Separación y conservación por nuestro laboratorio |
| Cytospora chrysosperma | Laboratorio de Fisiología Vegetal, Instituto de Nueva Tecnología Forestal, Academia China de Silvicultura | Número de acceso NCBI: MK994101 para rRNA-ITS y MN025273 para EF1 y alfa; gen Número CGMCC:40575 | Separación y conservación por nuestro laboratorio |
| Epson Perfection V370 Photo | Epson | V370 | ; Escanee las hojas en la imagen |
| PDA (agar de papa y dextrosa) | Solarbio | P8931 | Proporciona nutrición para el crecimiento de hongos |
| Película | Para fijar hongos en las hojas | ||
| Populus alba var. Pyramidalis | Laboratorio de Fisiología Vegetal, Instituto de Silvicultura Nueva Tecnología, Academia China de Silvicultura | Cultivado por nuestro laboratorio | |
| SPSS | IBM | Software de análisis de datos | |
| Incubadora termostática | Shanghai Kuntian Laboratory Instrument Co., Ltd | KTD-6000 | Proporcionar un entorno para el crecimiento de hongos |
| Cámara TG-6 resistente | OLYMPUS | Para tomar fotos de hojas enfermas |
Referencias
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