Las proteinasas son vitales para la patogénesis bacteriana, lo que permite la invasión y la evasión inmune. La extracción en un solo paso de proteínas citoplasmáticas y de membrana de bacterias en su forma activa es desgarradora. Este artículo en video demuestra la extracción de proteínas celulares completas de Leptospira para el análisis de zimografía para detectar y caracterizar gelatinasas.
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Artículo de método
Extracción y análisis zimográfico de gelatinasas bacterianas en un solo paso
En este artículo
Resumen
Resumen
Las proteinasas de las bacterias patógenas contribuyen a la invasión y la patogénesis al degradar activamente los componentes de la matriz extracelular (ECM) y las barreras celulares del huésped, modificando la respuesta inmune del huésped y degradando el sistema de defensa del huésped. Esto hace que las proteinasas sean una de las moléculas más virulentas y su identificación y caracterización son esenciales para prevenir y controlar enfermedades. Muchas bacterias también poseen proteinasas unidas a la membrana externa. El aislamiento y la caracterización de las proteínas de la membrana externa en sus formas activas presentan desafíos significativos debido a su localización dentro de la membrana externa. En este estudio, demostramos un método de un solo paso para extraer gelatinasas asociadas a la membrana citoplasmática y externa de Leptospira y demostramos su actividad enzimática mediante zimografía. En este método, utilizamos desoxicolato de sodio para alterar la membrana celular y liberar las proteínas unidas y el ácido 6-aminocaproico para solubilizar la proteína de membrana liberada en su forma nativa. Además, mostramos un análisis zimográfico de las gelatinasas leptospirales. Este enfoque proporciona un marco versátil para aislar, purificar y caracterizar metaloproteasas, colagenasas y gelatinasas de varios patógenos bacterianos.
Introducción
La mayoría de los patógenos bacterianos deben encontrarse con la matriz extracelular (ECM) del huésped durante la invasión y la diseminación a los órganos diana durante la patogénesis. El colágeno forma el componente principal en la ECM de los tejidos animales1. Las gelatinasas son un grupo de proteasas que actúan sobre el colágeno y su forma hidrolizada, la gelatina. La degradación de la ECM es ejecutada principalmente por un grupo de proteasas, que incluye colagenasas y gelatinasas 2,3. Los patógenos bacterianos utilizan colagenasas y gelatinasas para remodelar o descomponer la ECM del huésped para su conveniencia en la invasión y la patogénesis 4,5. Las enzimas bacterianas que degradan la ECM son candidatas potenciales para la vacunación y los fármacos5.
Las proteasas bacterianas se encuentran en formas secretoras y unidas a la membrana 6,7,8,9. Muchos métodos para la extracción de enzimas celulares son ineficaces para aislar gelatinasas y colagenasas bacterianas unidas a la membrana, ya que estos procedimientos pueden no preservar de manera eficiente la forma nativa de las proteínas unidas a la membrana. De manera similar, existen métodos específicos de membrana que extraen solo proteasas y gelatinasas unidas a la membrana. Los métodos convencionales de extracción de proteínas totales, incluidas las proteínas de membrana, a menudo involucran detergentes e iones caotrópicos, que pueden afectar la actividad enzimática. Un procedimiento de extracción que mantenga la actividad enzimática y la solubilidad es esencial para la separación electroforética y permite el desarrollo de la zimografía para detectar la actividad de la proteasa.
El desoxicolato de sodio, un detergente iónico que puede lisar las células al alterar la membrana celular, permite la liberación del contenido celular y la proteína de la membrana. El ácido 6-aminocaproico puede solubilizar la proteína de membrana liberada en su forma nativa. La solubilización por ácido 6-aminocaproico tiene la ventaja de que no afecta a la electroforesis. Aquí, demostramos la extracción de proteinasas bacterianas celulares y unidas a la membrana utilizando desoxicolato de sodio y ácido 6-aminocaproico, estabilizándolas en su forma soluble nativa 10,11,12. Este método solubiliza eficazmente las proteínas de la célula y la membrana que se pueden utilizar directamente sin interferir con la electroforesis13,14. Se pueden realizar varias caracterizaciones enzimáticas cambiando los inhibidores de proteasa y los iones metálicos utilizados en el tampón de activación, según la aplicación.
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Protocolo
1. Extracción de gelatinasas bacterianas
NOTA: Consulte la Tabla 1 para la preparación de reactivos y materiales.
- Cultivar el organismo en un medio Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH) que contenga 10 mg/ml de albúmina sérica bovina a 30 °C. Tomar 10 mL de cultivo de Leptospira en la fase logarítmica media de crecimiento que contenga 3,5 × 108 células/mL para las proteinasas de extracción13,14. Utilice el recuento microscópico directo con una cámara de recuento Petroff-Hausser bajo un microscopio de campo oscuro para observar la fase de crecimiento de registro medio.
- Cosechar las células por centrifugación a 6.000 × g durante 10 min y desechar el sobrenadante en un recipiente para su descontaminación mediante autoclave a 121 °C durante 60 min.
- Transfiera el pellet suspendiéndolo en 1 ml de tampón de lavado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifugue a 6.000 × g durante 5 min. Repita este lavado.
- Extraiga la proteína del gránulo añadiendo 100 μL de tampón de extracción para un gránulo de Leptospira a partir de 10 mL de cultivo y vórtice durante 5 min. Continúe la extracción incubando a 4 °C durante 1 h. Recoger la proteína extraída por centrifugación a 15.000 × g a 4 °C durante 10 min, y desechar el pellet en un recipiente para su descontaminación mediante autoclave a 121 °C durante 60 min.
- Utilice el extracto de proteína directamente para la zimografía añadiendo un volumen igual de tampón de muestra 2x.
- Utilice el ensayo de estimación de Bradford para determinar la concentración de proteínas.
- Si la concentración de proteína es baja, precipitarla con acetona mezclando la proteína con un volumen 4x de acetona para la precipitación e incubarla durante la noche a -20 °C. Al día siguiente, centrifugar la muestra a 10.000 × g durante 10 min, secar al aire el pellet resultante y volver a suspenderlo en PBS o disolverlo en el tampón deseado y almacenarlo a -20 °C durante un máximo de 1 mes. Utilice la liofilización para el almacenamiento o transporte a largo plazo.
NOTA: Debido a las proteasas activas en el extracto y la ausencia de inhibidores de la proteasa, las proteínas pueden degradarse en la muestra.
2. Zimografía de gelatinasas
- Preparación del gel SDS PAGE copolimerizado con gelatina
- Gel resolutivo
- Haga la mezcla de gel de resolución agregando los componentes en las cantidades requeridas para moldear el gel. A 3,86 ml de agua en un vaso de precipitados de 50 ml, agregue 2,5 ml de Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 ml de la solución madre de gelatina al 10%, 3,34 ml de solución de acrilamida-bis acrilamida (ABA), 0,1 ml de SDS al 10%, 0,006 ml de TEMED y 0,1 ml de persulfato de amonio al 10% y mezcle bien sin formación de espuma ni burbujas. El sistema mencionado (placas de vidrio regulares; 18 x 8 cm) requiere 10 ml de mezcla de gel de resolución.
NOTA: Si la gelatina es de una alícuota congelada, descongélela hasta que se derrita para aclarar la solución sin grumos. Agregue persulfato de amonio justo antes de la fundición porque la polimerización comenzará inmediatamente después de agregar persulfato de amonio. - Vierta la mezcla de gel de resolución en la cámara de fundición hasta ~ 3-5 mm por debajo de la marca para el fondo de los pocillos. Evite las burbujas de aire.
- Vierta lentamente un poco de agua para obtener una capa uniforme de 1 mm en la parte superior del gel y elimine las burbujas. Deje que el gel se asiente durante 1 h.
NOTA: La formación de gel se puede confirmar buscando una separación de fases entre la capa de agua y el gel; El gel no se puede verter incluso si el casete de gel está inclinado.
- Haga la mezcla de gel de resolución agregando los componentes en las cantidades requeridas para moldear el gel. A 3,86 ml de agua en un vaso de precipitados de 50 ml, agregue 2,5 ml de Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 ml de la solución madre de gelatina al 10%, 3,34 ml de solución de acrilamida-bis acrilamida (ABA), 0,1 ml de SDS al 10%, 0,006 ml de TEMED y 0,1 ml de persulfato de amonio al 10% y mezcle bien sin formación de espuma ni burbujas. El sistema mencionado (placas de vidrio regulares; 18 x 8 cm) requiere 10 ml de mezcla de gel de resolución.
- Gel apilable
- Prepare el gel apilable mezclando los siguientes componentes. A 1,84 ml de agua en un vaso de precipitados de 10 ml, agregue 2,5 ml de Tris-Cl (pH 6,6), 0,35 ml de ABA, 0,03 ml de SDS al 10% y 0,006 ml de TEMED. El sistema de 8 x 10 cm de 1 mm de espesor requiere 3 ml de mezcla de gel de resolución.
- Desde el casete de gel, decanta el agua formada en la parte superior del gel inclinando la configuración de gel hacia un lado y secando el agua recolectada de la esquina con una tira estrecha de papel de filtro.
- Agregue 0,03 ml de APS al 10% a la mezcla mencionada en el paso 2.1.2.1 y mezcle sin formar burbujas.
- Vierta el gel de apilamiento sobre el gel de resolución e inmediatamente coloque el peine en su posición sin formar burbujas de aire debajo de los dientes del peine, dejando un grosor de 3-5 mm de gel de apilamiento entre el gel de resolución y la parte inferior de los dientes del peine. Espere al menos 3 h para la polimerización completa y la reticulación de la gelatina.
- Saque el espaciador inferior y fije el gel en el aparato de electroforesis.
- Coloque lentamente el gel en el tanque que contiene 1x tampón de electrodo, asegurándose de que no haya aire atrapado en el fondo del gel.
- Gel resolutivo
- Preparación de la muestra
- Agregue un volumen igual de tampón de muestra al extracto e incube a 37 ° C durante 30 min para permitir que SDS se una a la proteína. Utilice una muestra que contenga 2 μl de suero humano con un volumen igual de tampón de muestra como control positivo.
- Carga del ejemplo
- Cargue cuidadosamente la muestra en los pocillos con una pipeta de punta estrecha o una jeringa Hamilton (0,5-1 ml). Agregue gradualmente tampón de electrodos para llenar las partes restantes de los pocillos, la parte superior del gel y el tanque superior de la unidad de electroforesis sin alterar las muestras cargadas.
NOTA: La jeringa Hamilton debe lavarse a fondo entre las muestras para evitar la contaminación cruzada.
- Cargue cuidadosamente la muestra en los pocillos con una pipeta de punta estrecha o una jeringa Hamilton (0,5-1 ml). Agregue gradualmente tampón de electrodos para llenar las partes restantes de los pocillos, la parte superior del gel y el tanque superior de la unidad de electroforesis sin alterar las muestras cargadas.
- Electroforesis de carrera
- Comience la electroforesis a 6 mA por gel y déjela correr hasta que el frente de tinte entre en el gel de resolución. Luego, aumente la corriente a 12 mA por gel y continúe hasta que el frente del tinte alcance 1 cm por encima del fondo del gel.
NOTA: El tiempo de ejecución puede cambiar según la concentración de ABA utilizada y el tamaño de la proteína objetivo.
- Comience la electroforesis a 6 mA por gel y déjela correr hasta que el frente de tinte entre en el gel de resolución. Luego, aumente la corriente a 12 mA por gel y continúe hasta que el frente del tinte alcance 1 cm por encima del fondo del gel.
- Marcando la orientación de las bandas de la norma
- Después de completar la electroforesis, desmonte con cuidado las placas de vidrio con una herramienta de separación de placas o una espátula de plástico y marque la orientación de la carga de la muestra cortando la esquina inferior derecha del gel y marque las bandas marcadoras prefabricadas perforando agujeros cerca o escaneando el gel.
- Renaturalización de enzimas resueltas
- Sumerja el gel en una solución renaturalizante que contenga Triton X-100 en una bandeja de gel e incube durante 30 min a temperatura ambiente sin agitar.
NOTA: Triton X-100 renaturaliza las proteínas, ya que el gel de zimograma que contiene proteínas resueltas puede desnaturalizarse y perder actividad en presencia de SDS.
- Sumerja el gel en una solución renaturalizante que contenga Triton X-100 en una bandeja de gel e incube durante 30 min a temperatura ambiente sin agitar.
- Incubación para la actividad de la proteasa
- Reemplace la solución de renaturalización con un tampón de activación que sumerja completamente el gel e incube a 37 ° C durante 18 h en una incubadora.
NOTA: Modifique el tampón de activación agregando inhibidores o activadores de proteinasas de interés para caracterizar la actividad de la proteinasa según sea necesario.
- Reemplace la solución de renaturalización con un tampón de activación que sumerja completamente el gel e incube a 37 ° C durante 18 h en una incubadora.
- Tinción del zimograma
- Después de la incubación, retire el tampón de activación y enjuague brevemente el gel con agua durante 1 minuto para eliminar cualquier resto de Triton X-100 y evitar que forme espuma durante la agitación.
- Agregue la solución de tinción a la bandeja, asegurándose de que el gel esté completamente sumergido. Agite el gel suavemente a baja velocidad para evitar daños. Continúe teñiendo hasta que el gel se vuelva completamente azul.
- Elimine el exceso de manchas de la superficie del gel enjuagándolo con agua durante 1 min. Agregue la solución decolorante a la bandeja y agite suavemente. Reemplace la solución decolorante con una solución nueva varias veces hasta lograr el contraste de banda deseado contra el fondo azul.
NOTA: Mientras realiza la decoloración, controle continuamente el gel para asegurarse de que no se decolore por completo, lo que permite la observación y el registro de las bandas proteolíticas. - Escanee el gel en un sistema de documentación de gel o escáner de documentos, y determine la masa molecular de las bandas de proteínas comparándolas con los estándares de proteínas.
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Resultados
El resultado muestra el zimograma de la proteína leptoespiral y las gelatinasas del suero humano. Los resultados, que se muestran en la Figura 1, representan las proteasas como bandas blancas claras sobre un fondo azul. Las bandas representan áreas donde la gelatina copolimerizada se degrada y, por lo tanto, no se tiñe, mientras que otras áreas de todo el gel se tiñen de azul debido a la presencia de gelatina. Además, muestra que, aunque la gelatina también es una proteína, no se eluye en la...
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Discusión
Durante la preparación del gel de acrilamida, la gelatina copolimeriza con la matriz polimérica de acrilamida. En consecuencia, la gelatina copolimerizada permanece inmovilizada dentro del gel y no migra durante la electroforesis, a pesar de que es una proteína. Después de la electroforesis, las proteínas nativas extraídas con desoxicolato y tampón de ácido 6-aminocaproico se separan según su masa y carga. Después de eliminar el SDS, estas proteínas se renaturalizan en presencia de Trito...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Los autores expresan su gratitud a la División SERB, Departamento de Ciencia y Tecnología, Nueva Delhi, por su apoyo a través de No.SR/S0/HS/0108/2012 de subvención, a MGM
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ácido 6-aminocaproico | Merck | A2504 | |
| Ácido acético | Sigma | 695092 | |
| Acetona | Sigma | 32201 | |
| Acrilamida | Sigma | A-3553 | |
| Persulfato de amonio | Sigma | A-3678 | |
| Bis Acrilamida | Sigma | M7279 | |
| Albúmina sérica bovina fracción V (BSA) | Sigma | A-8022 | |
| Azul de bromofenol | Sigma | B-8026 | |
| CaCl2 | Merck | C4901 | |
| Coomassie azul brillante | Sigma | 1.12553 | |
| Desoxicolato | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Ellinghausen– McCullough– Johnson– Harris (EMJH) medio, Difco | Difco | 279410 | |
| Gelatina | Merck | G9382 | |
| Glicerol | Merck | G5516 | |
| Glicina G8790 | Sigma | G-8898 | |
| Leptospira interrogans serovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130 (ATCC BAA-1198), mantenida en el biorepositorio de ICMR-RMRC Portblair | Mantenido en el biorepositorio del ICMR-RMRC Port Blair | Temperatura óptima de crecimiento 30 ° C | |
| Cloruro de magnesio M8266 | Sigma | M8266 | |
| Metanol | Sigma | 17995-7 | |
| Solución salina tamponada con fosfato | Sigma | P4417 | |
| Herramienta de separación de placas | Wonder Wedgle | ||
| Rotor | Termocientífico | FIBERLite F15 8x50 cy | |
| Dodecil sulfato de sodio (SDS) | Sigma | L-4396 | |
| TEMED | Sigma | T-9281 | |
| Tritón X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Base Trizma (TRIS) | Sigma | T6066 |
Referencias
- Yue, B. Biology of the extracellular matrix. J Glaucoma. 23 (8 Suppl 1), S20-S23 (2014).
- Cabral-Pacheco, G. A., et al. The roles of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human diseases. Int J Mol Sci. 21 (24), 1-53 (2020).
- Ambili, M., Jayasree, K., Sudhakaran, P. R. 60K gelatinase involved in mammary gland involution is regulated by β-oestradiol. Biochim Biophys Acta. 1403 (3), 219-231 (1998).
- Zhang, Y. -Z., Ran, L. -Y., Li, C. -Y., Chen, X. -L. Diversity, structures, and collagen-degrading mechanisms of bacterial collagenolytic proteases. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6098-6107 (2015).
- Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Crit Rev Microbiol. 42 (1), 106-126 (2016).
- Madathiparambil, M. G., Cattavarayane, S., Perumana, S. R., Manickam, G. D., Sehgal, S. C. Presence of 46 kDa gelatinase on the outer membrane of Leptospira. Curr Microbiol. 62 (5), 1478-1482 (2011).
- Kramer, R. A., Zandwijken, D., Egmond, M. R., Dekker, N. In vitro folding, purification and characterization of Escherichia coli outer membrane protease OmpT. Eur J Biochem. 267 (3), 885-893 (2000).
- Kum, S. L., Ho, J. C. S., Parikh, A. N., Liedberg, B. Amphiphilic membrane environments regulate enzymatic behaviors of Salmonella outer membrane protease. ACS Bio Med Chem Au. 2 (1), 73-83 (2022).
- Sarma, A., et al. Extracellular proteome analysis shows the abundance of histidine kinase sensor protein, DNA helicase, putative lipoprotein containing peptidase M75 domain and peptidase C39 domain protein in Leptospira interrogans grown in EMJH medium. Pathogens. 10 (7), 852(2021).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Levy, D., Gulik, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. Phospholipid vesicle solubilization and reconstitution by detergents. Symmetrical analysis of the two processes using octaethylene glycol mono-n-dodecyl ether. Biochemistry. 29 (40), 9480-9488 (1990).
- Lichtenberg, D., Ahyayauch, H., Alonso, A., Goñi, F. M. Detergent solubilization of lipid bilayers: a balance of driving forces. Trends Biochem Sci. 38 (2), 85-93 (2013).
- Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).
- Zeug, A., et al. Current microscopic methods for the neural ECM analysis. Prog Brain Res. 214, 287-312 (2014).
- Madathiparambil, M. G., et al. A zymography analysis of proteinase activity present in Leptospira. Curr Microbiol. 62 (3), 917-922 (2011).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
