Deleción génica mediada por CRISPR-Cas9 en células madre pluripotentes humanas cultivadas en condiciones libres de alimentadores

Muhammad Abid Sheikh; Farah Helena Afandi; Grazia Iannello; Barbara Corneo; Bright Starling Emerald; Suraiya Anjum Ansari

doi:10.3791/67296

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Artículo de método

Deleción génica mediada por CRISPR-Cas9 en células madre pluripotentes humanas cultivadas en condiciones libres de alimentadores

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DOI:

10.3791/67296

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1 de noviembre de 2024

Muhammad Abid Sheikh¹ , Farah Helena Afandi¹ , Grazia Iannello² , Barbara Corneo² , Bright Starling Emerald³^,⁴^,⁵ , Suraiya Anjum Ansari¹^,⁴^,⁵

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine and Health Sciences, United Arab Emirates University, ²Columbia Stem Cell Initiative, Stem Cell Core, Columbia University Irving Medical Center, ³Department of Anatomy, College of Medicine and Health Sciences, United Arab Emirates University, ⁴Zayed Center for Health Sciences, United Arab Emirates University, ⁵ASPIRE Precision Medicine Research Institute Abu Dhabi (PMRI-AD), United Arab Emirates University

En este artículo

Resumen

El método presentado describe la generación de un knockout génico mediado por CRISPR en la línea H9 de células madre embrionarias humanas (hESC), que expresa de manera estable sgRNAs dirigidos al gen L2HGDH utilizando un sistema de entrega de genes mediado por lentivirales altamente eficiente.

Resumen

El sistema CRISPR-Cas9 para la edición del genoma ha revolucionado los estudios de la función génica en células de mamíferos, incluidas las células madre. Sin embargo, la aplicación práctica de esta técnica, particularmente en células madre pluripotentes, presenta ciertos desafíos, como ser intensivo en tiempo y mano de obra y tener una baja eficiencia de edición. Aquí, describimos la generación de un knockout génico mediado por CRISPR en una línea de células madre embrionarias humanas (hESC) que expresa de manera estable sgRNAs para el gen L2HGDH, utilizando un sistema de entrega de genes mediado por lentivirales altamente eficiente y estable. Los sgRNAs dirigidos al exón 1 del gen L2HGDH se sintetizaron químicamente y se clonaron en el vector lentiCRISPR v2-puro, que combina la expresión constitutiva de sgRNAs con Cas9 en un sistema de vector único altamente eficiente para lograr títulos lentivirales más altos para la infección por hESC y una selección estable utilizando puromicina. Las células seleccionadas con puromicina se expandieron aún más y se obtuvieron clones de células individuales utilizando el método de dilución limitada. Los clones individuales se expandieron y se obtuvieron varios clones homocigotos knockout para el gen L2HGDH, como lo confirmó una reducción del 100% en la expresión de L2HGDH mediante el análisis de Western blot. Además, mediante MSBSP-PCR, se mapeó el sitio de mutación de CRISPR aguas arriba de la secuencia de reconocimiento de PAM de Cas9 en los clones homocigotos seleccionados. Se realizó la secuenciación Sanger para analizar las inserciones/deleciones exactas, y se realizó la caracterización funcional de los clones. Este método produjo un porcentaje significativamente mayor de deleciones homocigóticas en comparación con los métodos de administración de genes no virales informados anteriormente. Aunque este informe se centra en el gen L2HGDH, este enfoque sólido y rentable se puede utilizar para crear knockouts homocigotos para otros genes en células madre pluripotentes para estudios de función génica.

Introducción

Las células madre embrionarias humanas (hESCs) y las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) son células madre con el potencial de diferenciarse en todos los tipos de células del cuerpo. Estas células sirven como herramientas valiosas para estudiar el desarrollo humano, así como para comprender los mecanismos subyacentes de diversas enfermedades, lo que ofrece una gran promesa para la medicina regenerativa, el modelado de enfermedades y el descubrimiento de fármacos. Dichos estudios implican investigar cómo genes específicos contribuyen al desarrollo, funcionamiento y regulación de los organismos ^1,2....