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Artículo de método

Enriquecimiento de proteínas subcelulares en Leptospira mediante un enfoque de fraccionamiento basado en Triton X-114

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DOI:

10.3791/67298

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8 de agosto de 2025

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1Department of Biochemistry, ICMR - Regional Medical Research Centre, 2Department of Chemistry & Molecular Biology, University of Gothenburg

En este artículo

Resumen

Aunque los procariotas carecen de un sistema orgánular, hay regiones subcelulares con proteínas localizadas. El análisis cuantitativo y cualitativo de las enzimas y proteínas en las regiones subcelulares es importante para desarrollar objetivos farmacológicos y vacunales. Aquí, ilustramos el fraccionamiento subcelular de proteínas Leptospiral utilizando Triton X-114 y su análisis.

Resumen

Los procariotas carecen de orgánulos subcelulares precisos, pero exhiben regiones distintas como el citoplasma, la membrana interna, el periplasma y la membrana externa, donde se organizan la mayoría de las funciones bioquímicas y fisiológicas. Por lo tanto, comprender las características funcionales de las proteínas requiere dilucidar su localización subcelular. Sin embargo, la extracción de proteínas subcelulares de bacterias gramnegativas plantea desafíos debido a su compleja bicapa de fosfolípidos. Aunque Triton X-114 se ha mostrado prometedor en la extracción de proteínas de membrana externa (OMP), un protocolo conciso sigue siendo difícil de alcanzar. Este protocolo demuestra un flujo de trabajo paso a paso para extraer proteínas subcelulares utilizando la espiroqueta Leptospira como modelo. Esta técnica, que presenta fraccionamiento subcelular y separación de fases, produce distintas fracciones para proteínas citoplasmáticas, de membrana externa e interna. El detergente Triton X-114 es muy adecuado para la separación de fases debido a su temperatura óptima del punto de enturbiamiento (~22 °C) y su baja concentración crítica de micelas (CMC), lo que permite una extracción y purificación eficientes de proteínas nativas con una desnaturalización mínima. En particular, el análisis revela la eficiencia en la discriminación de proteínas de las membranas internas y externas distintas del citoplasma.

Introducción

Los análisis proteómicos subcelulares (SCP) juegan un papel fundamental en la dilucidación de la patogénesis bacteriana al analizar el proteoma dentro de compartimentos subcelulares específicos de las células bacterianas. Este enfoque de proteómica subcelular caracteriza las proteínas bacterianas dentro de distintos compartimentos, reduciendo la complejidad al excluir proteínas altamente abundantes y proporcionando información sobre su organización y abundancia proporcional 1,2. Por ejemplo, empleando técnicas de fraccionamiento subcelular y LC-MS / MS, un estudio sobre Shewanella oneidensis reveló una parte sustancial de su proteoma, proporcionando detalles cruciales sobre la arquitectura del compartimento de la abundancia de células y proteínas. Este estudio sirve como marco fundamental para investigaciones posteriores sobre la organización subcelular dentro de bacterias gramnegativas3. En el ámbito de la patogénesis bacteriana, la delimitación del proteoma bacteriano durante la infección in vivo es imperativa para comprender los mecanismos que impulsan la patogenicidad4. La investigación del proteoma de Salmonella intracelular dentro de las células epiteliales en varias etapas de infección ha sido fundamental para revelar las estrategias adaptativas empleadas por los patógenos bacterianos dentro de su medio intracelular 4,5. Las estrategias SCP proporcionan información completa sobre la dinámica celular al evaluar la abundancia y translocación de proteínas dentro de varios compartimentos celulares. Este método facilita la identificación extensiva de proteínas de diversos compartimentos bacterianos, mejorando el análisis exhaustivo de los proteomas bacterianos 6,7.

La distribución subcelular de las proteínas no solo dicta su actividad funcional, sino que también mejora su diversidad funcional8. Por ejemplo, las enzimas exhiben variados mecanismos reguladores y niveles de actividad dependiendo de su localización subcelular. Las transglutaminasas (TGasas), por ejemplo, muestran distintas funciones o mecanismos reguladores en diferentes compartimentos subcelulares en los tubos polínicos: las TGasas citoplasmáticas incorporan aminas primarias en proteínas citosólicas (p. ej., actina y tubulina) de una manera dependiente de Ca (2+), interactuando con el citoesqueleto; las TGasas de membrana están asociadas con Golgi y membranas plasmáticas, lo que sugiere un papel en la administración exocitótica; y las TGasas asociadas a la pared celular regulan el crecimiento apical mediante la colocalización con marcadores de pared celular. Estas distinciones funcionales están mediadas por roles específicos de compartimentos9. Además, la reparación de proteínas oxidadas en la envoltura bacteriana subraya el papel crítico de los sistemas enzimáticos dentro de compartimentos celulares específicos expuestos a especies reactivas de oxígeno10. Considere la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS), cuya localización subcelular es modulada por modificaciones lipídicas, influyendo en su interacción con diversas membranas celulares11. La compartimentación enzimática mantiene distintos ambientes propicios para las interacciones entre enzimas y sustratos, facilitando así los procesos metabólicos específicos del compartimento12.

Las bacterias y otros procariotas no tienen orgánulos subcelulares claros; Hay regiones distintas, que incluyen citoplasma, membrana interna, periplasma y membrana externa. La mayoría de las funciones bioquímicas y fisiológicas del organismo están organizadas en varios compartimentos subcelares13. Por lo tanto, la localización subcelular de las proteínas es importante para predecir sus características funcionales. Sin embargo, la extracción de proteínas subcelulares de bacterias gramnegativas plantea desafíos debido a su compleja bicapa de fosfolípidos de doble membrana. Los métodos de extracción convencionales, que emplean detergentes como el dodecil sulfato de sodio (SDS) y aditivos como la urea, a menudo comprometen la integridad de las proteínas de la membrana, lo que afecta los análisis posteriores14,15. Además, la composición lipídica juega un papel importante en la configuración de las alteraciones conformacionales de las proteínas de membrana. El éxito de la solubilización depende de factores como la relación detergente-lípido-proteína, ya que el proceso implica la inserción de detergente en la bicapa lipídica seguida de la solubilización de proteínas16. La elección del detergente es fundamental para solubilizar eficazmente las proteínas de membrana, teniendo en cuenta factores como la temperatura del punto de turbidez y el tiempo de incubación17. El ambiente lipídico puede influir en los cambios conformacionales de las proteínas de membrana18,19.

Los detergentes son esenciales para extraer las proteínas de membrana de las membranas biológicas y garantizar su solubilidad en soluciones acuosas, un requisito previo para la posterior purificación de proteínas. Sin embargo, la purificación de las proteínas de membrana a menudo es un desafío porque se eliminan de su entorno de membrana lipídica nativa y se colocan en un tampón detergente, que solo replica parcialmente las propiedades físicas y químicas de la membrana20. Después de la extracción, las proteínas de membrana generalmente se purifican en procesos posteriores utilizando diálisis, precipitación de proteínas y algunos métodos de cromatografía como proteínas solubles20,21. La separación de fases ofrece una potente alternativa o complemento a los protocolos de purificación basados en cromatografía y se puede aplicar directamente a las proteínas solubilizadas. Básicamente, la separación de fases permite que las proteínas integrales de la membrana se dividan en proteínas citosólicas y de fase de enriquecimiento de detergente en la fase acuosa agotada por detergente20,22. Se ha descrito que varios detergentes se utilizan en la solubilización de proteínas de membrana en estudios anteriores20. Estos incluyen la familia Triton (Triton X-100 y Triton X-114), la familia Tween (Tween-20 y -80), detergentes aniónicos, detergentes catiónicos, detergentes monoéter de polioxietilenglicol, etc., pero tienen pros y contras en términos de estructura y función de las proteínas20. Las propiedades fisicoquímicas de estos detergentes influyen en gran medida en la partición de fases y la solubilización de las proteínas de membrana20. Los detergentes son moléculas anfipáticas con un grupo de cabeza polar y una cadena de hidrocarburos hidrófobos. En bajas concentraciones, existen como monómeros en el agua. Por encima de la concentración crítica de micelas (CMC), forman micelas cuyo tamaño depende del tipo de detergente, y el número de agregación indica el número de moléculas por micela (también llamado peso molecular de la micela). Otro factor importante es el "punto de enturbiamiento", que se puede alcanzar cambiando la temperatura de una solución acuosa de detergente micelar que se vuelve turbia y eventualmente forma dos fases distintas. Este proceso se conoce como separación de fases o extracción de puntos de enturbiamiento. Un CMC alto puede producir más proteínas de membrana correspondientes a altas concentraciones de detergente con una unión más débil, que se puede dializar contra un tampón con una concentración de detergente definida20. Sin embargo, alcanzar un CMC alto en la mayoría de los detergentes requiere una temperatura de punto de enturbiamiento alta, lo que puede afectar la estructura y función de la proteína extraída y afectar los procesos posteriores. Incluso la alta concentración de detergente en esta fase puede ser perjudicial para las proteínas y crear problemas en la manipulación de líquidos para pipetear un volumen preciso debido a la alta viscosidad. Por ejemplo, el tritón X-100 tiene un alto rendimiento de proteínas de membrana en la micela detergente por encima de la temperatura del punto de enturbiamiento de 64-65 °C. Para mantener la temperatura de trabajo, 9%-23% (NH4)2Así que4 o la adición de NaCl del 16% al 25% se puede reducir a temperatura ambiente (RT), lo que resulta en una alta concentración de detergente, lo que probablemente afecta la estabilidad de las proteínas. Del mismo modo, la extracción basada en Tween utiliza una temperatura de punto de enturbiamiento alta (76 °C para la interpolación 20 y 93 °C para la interpolación 80). El detergente aniónico SDS se usa con frecuencia en aplicaciones de proteínas, pero generalmente desnaturaliza las proteínas20. Los investigadores, con el objetivo de extraer eficientemente las proteínas de membrana, identificaron Triton X-114 como un detergente clásico debido a su temperatura óptima de punto de enturbiamiento de aproximadamente 22 °C, ideal para estudios de proteínas de membrana. Introducido por primera vez por Bordier en 1981, Triton X-114 se ha utilizado ampliamente desde entonces para la extracción y purificación de proteínas de membrana en diversas fuentes, incluidos tejidos animales y vegetales, así como microorganismos20,22. La CMC baja de Triton X-114 evita su eliminación por diálisis; sin embargo, su naturaleza suave minimiza la desnaturalización de las proteínas de membrana en la fase enriquecida con detergente. Además, Triton X-114 forma micelas más pequeñas (n = 7-8) en comparación con Triton X-10020. El protocolo de estudio de James G. Pryde empleó Triton X-114 para la extracción de proteínas de membrana de células de mamíferos cultivadas. Mediante el uso de una temperatura de punto de enturbiamiento superior a 20 °C (incubación a 30 °C durante 3 min), las proteínas integrales de membrana se dividieron en la fase enriquecida con detergente, mientras que las proteínas periféricas y citosólicas se recuperaron de la fase acuosa agotada en detergente22. Además, David A. Haake et al. utilizaron Triton X-114 para extraer proteínas de membrana externa (OMP) de Leptospira interrogans, con y sin CaCl2 como aditivo23,24. Estudios posteriores confirmaron que Triton X-114 extrae eficazmente las OMP de los compartimentos subcelulares sin aditivos como glicerol o CaCl225,26. Sin embargo, la inclusión de sales puede aumentar la concentración de detergente, lo que puede afectar los estudios de proteoma a gran escala que utilizan espectrometría de masas de alto rendimiento20. En nuestro trabajo sobre el análisis del proteoma subcelular, empleamos Triton X-114 junto con espectrometría de masas en tándem, logrando un enriquecimiento significativo en todos los compartimentos subcelulares, incluidas las proteínas citoplasmáticas, de la membrana interna y de la membrana externa25,26. El objetivo principal del presente protocolo es enriquecer eficientemente los compartimentos subcelulares de una célula bacteriana gramnegativa típica al tiempo que minimiza los problemas en los procesos posteriores. Además, el protocolo está diseñado para ser rentable y eficiente en el tiempo. Aquí, elaboramos el protocolo optimizado desarrollado en laboratorio para el aislamiento de proteínas subcelulares y discutimos cada cuello de botella encontrado durante el proceso de extracción.

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Protocolo

NOTA: Este protocolo utiliza Leptospira interrogans para el experimento de extracción de proteínas subcelulares. Si bien este protocolo se puede adaptar para su uso con otras bacterias gramnegativas, puede ser necesaria una optimización según los objetivos específicos de la investigación. La Tabla de Materiales y la Tabla 1 proporcionan la lista de productos químicos y equipos, junto con las composiciones de tampones y soluciones reactivas, respectivamente, mientras que la Tabla 2 describe las instalaciones de laboratorio.

1. Cepa de Leptospira y condiciones de cultivo

  1. Obtenga el serogrupo L. interrogans Icterohaemorrhagiae serovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130.
    NOTA: Esta cepa se obtuvo del Consejo Indio de Investigación Médica - Centro Regional de Investigación Médica en Port Blair, India, un centro colaborador de la OMS especializado en el diagnóstico, referencia, investigación y capacitación de la leptospirosis.
  2. Cultivar Leptospira (inóculo que contiene ~1 × 106 células/ml) en 50 ml de medio Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH) suplementado con albúmina sérica bovina (BSA) al 1%.
  3. Incubar a 30 °C hasta que el cultivo alcance la fase de crecimiento logarítmico medio (3,5 × 108 células/ml). Pruebe las alícuotas del medio cultivado en placas de agar nutritivo para asegurarse de que el medio no esté contaminado.
    NOTA: Utilice microscopía de campo oscuro y una cámara de recuento Petroff-Hausser para contar las células. Para obtener más información, consulte un artículo27 publicado anteriormente.

2. Recolección de células

  1. Después de un período de incubación de 7 días, transfiera tres réplicas biológicas del cultivo de L. interrogans a tubos de centrífuga en volúmenes iguales (25 ml cada uno).
    NOTA: El cultivo de Leptospira se manipuló dentro de una campana de flujo de aire laminar en una instalación de laboratorio BSL-2 durante la transferencia.
  2. Centrifugar todos los tubos a 2500 × g durante 45 min a 4 °C. Decantar cuidadosamente el sobrenadante en un vaso de precipitados que contenga desinfectante y desecharlo. Utilice el gránulo celular para el siguiente paso.
  3. Lave los gránulos celulares tres veces con solución salina tamponada con fosfato (1 ml cada vez) suplementada con 5 mM de MgCl2, centrifugando a 10.000 × g durante 10 min a 4 °C después de cada lavado.
    NOTA: Este paso eliminará el BSA no deseado presente en el medio EMJH de la superficie del sedimento celular.

3. Extracción de proteínas subcelulares

  1. Extracción Triton X-114
    1. Tratar el pellet de células de Leptospira , obtenido después de la cosecha, con un tampón de extracción que contenga 10 mM de Tris-Cl (pH 8), 1% de Triton X-114 y 150 mM de NaCl a razón de 1 mL por pellet cosechado (Tabla 1) (Opcional: se puede agregar un cóctel inhibidor de la proteasa según el propósito experimental).
      NOTA: El procedimiento consiste simplemente en exponer las bacterias a una solución detergente añadiendo el tampón de extracción para extraer las proteínas de la membrana.
    2. Mezcle suavemente el tampón de extracción con el pellet utilizando una micropipeta por debajo de 25 °C hasta que la solución se vuelva visualmente turbia.
    3. Incubar la mezcla durante la noche a 4 °C.
    4. Mezclar de nuevo el extracto resultante con una micropipeta y centrifugarlo a 15.000 × g durante 30 min a 4 °C.
    5. Decantar el sobrenadante en otro vial y retener el pellet celular para los procesos de extracción posteriores.
      NOTA: Este sobrenadante contiene una mezcla de proteínas hidrófilas e hidrofóbicas abundantemente del citoplasma y la membrana externa, y se utiliza para la separación de fases.
    6. Agregue 50 μL de tampón que contenga 10 mM de Tris-Cl (pH 8), urea 8 M, un cóctel inhibidor de la proteasa y dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1% al sedimento celular.
    7. Agite la mezcla continuamente durante 5 min después de agregar el tampón de extracción, luego incube a 4 °C durante otros 5 min.
    8. Centrifugar de nuevo la mezcla a 15.000 × g durante 30 min a 4 °C y designar el sobrenadante resultante como fracción de pellets (P).
      NOTA: Se encontró que la fracción de gránulos contenía una alta abundancia de proteínas de la membrana interna en Leptospira25,26.
  2. Partición de fase
    1. Ajustar la concentración de Triton X-114 del sobrenadante obtenido de la extracción al 2%. Por ejemplo, si el volumen de sobrenadante es de 900 μL, agregue 9 μL de detergente Triton X-114 para lograr la concentración deseada.
    2. Incubar la mezcla a 37 °C durante 1 h, luego centrifugar a 2000 × g durante 5 min a 30 °C. Esta centrifugación de baja velocidad puede acelerar la separación de fases.
    3. Deje que la mezcla se separe en dos fases distintas: acuosa y detergente. Asegure una centrifugación adecuada a baja velocidad para lograr una separación visible. Si es necesario, déjelo reposar durante 1 minuto antes del aislamiento. Si no se produce la separación, repita el paso 3.2.2 según sea necesario.
      NOTA: La separación de fases se puede observar visualmente, mediante mediciones de turbidez con un espectrofotómetro o mediante dispersión de luz estática. Para aumentar la precisión del ensayo de punto de enturbiamiento, agregue un colorante hidrofóbico (5-hexadecanoil-aminoeosina) con una concentración de 500 nM a la solución y analícelo con espectroscopia ultravioleta-visible (UV-VIS).
    4. Aísle la fase acuosa superior perforando la interfaz con una jeringa estéril y transfiriéndola a un vial separado. Aísle la fase detergente inferior con una micropipeta y guárdela en un vial separado.
      NOTA: Manipule el vial que contiene ambas fases con cuidado durante el proceso de separación. Antes de perforar el vial con una jeringa, abra su tapa para evitar la rotura de la aguja o la dificultad para extraer la fase acuosa superior. El uso de una jeringa garantiza una medición de volumen más precisa de cada fase después de la separación y minimiza la contaminación cruzada de proteínas entre las fases.
    5. Etiquete las fases como acuosas (A) y detergentes (D) y guárdelas a -20 °C para su uso futuro.

4. Estimación de proteínas

  1. Evaluar las concentraciones de proteínas de cada fracción de Triton X-114 (acuosa, detergente y pellet) utilizando el ensayo bicinconínico28 o cualquier otro método adecuado.

5. Electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) electroforesis en gel

NOTA: Las proteínas de cada fracción (acuosa, detergente, pellet) deben tratarse con beta-mercaptoetanol para reducirlas, luego separarse con SDS-PAGE al 10% (tres réplicas biológicas). La receta para el SDS-PAGE del 10% se puede encontrar en la Tabla 1. Para la orientación de muestras de proteínas, cualquier análisis de actividad enzimática debe realizarse en una forma nativa que pueda resolverse en PAGE nativo.

  1. Vuelva a suspender la muestra de proteína en acetona helada utilizando cuatro veces el volumen de la muestra. Incubar la mezcla a -20 °C durante un mínimo de 2 h, luego centrifugar a 14.000 × g durante 10 min. Además, vuelva a suspender la fracción de pellets en acetona helada al 80% y luego incube durante 5 min a 4 °C. Centrifugar a 14.000 × g durante 10 min para eliminar el exceso de cristales de sal de urea.
  2. Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante y coloque el gránulo de proteína en un baño seco hasta que toda la acetona residual se evapore de los viales.
  3. Incubar las muestras de proteínas en un tampón de muestra de 20 μl que contenga beta-mercaptoetanol y, a continuación, calentarlas a 95 °C durante 10 min en un baño de agua o en un baño seco.
    NOTA: Aquí, las muestras de proteínas representan la fracción acuosa (A) que contiene proteínas citoplasmáticas, la fracción detergente (D) que contiene proteínas de la membrana externa y la fracción de gránulos (P) que contiene proteínas de la membrana interna.
  4. Cargue las muestras que contienen A, D y P en cada pocillo del gel SDS-PAGE al 10 % junto con un marcador de proteína (M) y una proteína total (T) prefabricados.
    NOTA: La proteína total se puede preparar juntando las tres fracciones en un solo vial utilizando 20 μL de tampón de muestra.
  5. Utilice 1 tampón de electrodos en el aparato de electroforesis (Tabla 1). Establezca los parámetros de funcionamiento del gel en 6 mA para el gel de apilamiento y 12 mA para el gel de resolución. Ejecute la electroforesis a temperatura derecha.
  6. Tiñe el gel con Coomassie Brilliant Blue G u otras tinciones de proteínas disponibles en el laboratorio.

6. Inmunotransferencia

  1. Después de la separación del gel, incube el gel sin teñir en tampón de transferencia (25 mM de base de Tris, 190 mM de glicina, 20% de metanol) durante 5 min.
  2. Incube papeles secantes del tamaño adecuado en tampón de transferencia inmunoblot durante 5 min, luego ensamble como la capa inferior del sándwich.
  3. Utilice membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) o membranas de nitrocelulosa para transferir proteínas de los geles sin teñir. Comience sumergiendo la membrana de PVDF en metanol absoluto durante 30 s, seguido de un remojo de 5 minutos en el tampón de transferencia de inmunotransferencia. Posteriormente, intégrelo en el sándwich secante.
  4. Ahora, coloque el gel sin teñir que se ha retirado del tampón de transferencia y utilícelo en el sándwich secante de transferencia.
  5. Finalmente, cubra el sándwich colocándolo sobre otro papel secante encima, libere las burbujas de aire atrapadas con un rodillo secante y ejecute la transferencia utilizando un método de transferencia semiseco.
    NOTA: Se pueden utilizar otros enfoques, incluida la transferencia seca y húmeda, según las instalaciones del laboratorio.
  6. Sumerja la membrana en un tampón de bloqueo (leche desnatada al 8% en TBS-0,1% Tween 20 [TBS-T]) durante 2 h, seguido de incubación nocturna a 4 °C con antisueros monoespecíficos* dirigidos a la lipoproteína LipL41 de Leptospira (1:5000), o proteína central de filamento flagelar de 35 kDa (FlaB) (1:4000) (*anticuerpo personalizado). Enjuague la membrana tres veces con TBS-T, dejando que cada enjuague continúe durante 5 min.
    NOTA: Utilice cualquier anticuerpo de interés. El factor de dilución de los anticuerpos puede variar.
  7. Incube la membrana con un anticuerpo secundario anti-conejo de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) IgG (dilución 1: 20000) durante 2 h a RT.
  8. Exponga la membrana al reactivo de electroquimioluminiscencia (ECL) para visualizar bandas de proteínas.
  9. Coloque la membrana debajo de una película de rayos X sensible al azul dentro de una habitación oscura.
    NOTA: También se puede utilizar cualquier otro método de desarrollo.

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Resultados

En este experimento, empleamos la espiroqueta Leptospira como organismo modelo para extraer compartimentos subcelulares. Empleamos una metodología estratégica anclada en el punto de enturbiamiento y la concentración micelial crítica (CMC), aprovechando la efectividad de Triton X-114, un detergente no iónico (Figura 1). Antes de continuar, se realizó una estimación de proteínas para evaluar la concentración en cada fracción para una sola réplica biológica. Observamos una relación de ...

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Discusión

Las técnicas de fraccionamiento subcelular juegan un papel fundamental en el aislamiento de componentes celulares discretos para su posterior análisis. Triton X-114, un detergente no iónico, se usa comúnmente en estas técnicas debido a su capacidad para dividir muestras en distintas fases, lo que permite la separación de varios componentes celulares32. Triton X-114 ha sido particularmente útil en la extracción de proteínas de membrana (en forma nativa) de una vari...

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Divulgaciones

Los autores han declarado que no tienen intereses financieros en conflicto.

Agradecimientos

Los autores expresan su sincero agradecimiento al Consejo Indio de Investigación Médica, Nueva Delhi, India, por el apoyo financiero prestado a través de la subvención No. Leptos/22/2013-ECD-I-2012-2400 y al Departamento de Ciencia y Tecnología, Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería, Nueva Delhi, India, por su apoyo financiero a través de la subvención No. SR/SO/HS/0108/2012 a M.G.M. Además, los autores extienden su agradecimiento al Consejo Indio de Investigación Médica, Nueva Delhi, India, por otorgar una beca de investigación senior a través de la subvención No. ICMR-SRF 2020-0756/PROTEOMICS- BMS, Beca/131/2022-ECD-II-2021-8230 a H.P y AS respectivamente y Departamento de Ciencia y Tecnología, Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería, Nueva Delhi, India, Subvención No. PDF/2017/000343 a S.A.D.C.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido acético  Sigma  695092
Acetona    Sigma  32201
Acrilamida    Sigma  A-3553
Persulfato de amonio    Sigma  A-3678
Equilibrar  SHIMADUZ  Z741079
Bis Acrilamida    Sigma  M7279
Albúmina sérica bovina fracción V (BSA)  Sigma  A-8022
Azul de bromofenol    Sigma  B-8026
Tubo de centrífuga (50 ml)Tarson500020
Matraz cónico con tapón (150 mL)Tarson431030
Centrífuga de enfriamiento  Eppendorf  5355316200
Coomassie azul brillante    Sigma1.12553
Microscopio de campo oscuro  ZEISS  GmbH37081
Toallitas delicadas para tareasCiencia Kimtech34155
Baño seco  Eppendorf  535531620
Ellinghausen– McCullough– Johnson– Harris (EMJH) medio, Difco  Difco  279410
Bandejas de gel: Las bandejas de gel deben tener al menos 2 cm de dimensiones más anchas y tener una superficie lisa y plana con tapa.  Hoefer  No aplicable
Vaso de vidrio (150 ml)Tarson421030
Glicina G8790    Sigma  G-8898
Papel de filtro secante ImmobilonMilliporeIBFP0813C
Configuración semiseca de inmunotransferencia  ATTA  AE-6675
Incubadora: para incubar las bandejas de gel durante 18 horas a 37 ° C.  EYELA  SLI-700
Flujo de aire laminar  No aplicable  No aplicable
Luminol  Sigma  09253
Cloruro de magnesio M8266  Sigma  M8266
Agitador magnético  TARSON  6040
Metanol    Sigma  17995-7
Puntas de micropipeta (10 µ L– 10 ml)AxygenT-10, T-200-C, T-1000-C, T-10ML-C
Micropipetas  Eppendorf  EP2231300010
Microtubos (1,5 ml Safe-Lock)EppendorfEP022363212
Mini giro  Genaxy  GEN-MINI-6K
Lector multimodoBMG LABTECH  S / N 413-3877
Leche descremada en polvo bovinaSigma-AldrichM7409
Ácido P-cumárico    Sigma  C9008
Solución salina tamponada con fosfato    SigmaP4417 
Refrigerador  LG  GC-B217BLJ2
Balancín - Agitador oscilante o rotativo con baja velocidad para teñir el gel.  TARSON  4080
CONFIGURACIÓN DE PÁGINA SDS- Aparato de electroforesis  Hoefer, Inc.  SE300-10A-1.0  Modelo Hoefer ' miniVE' que puede moldear gel de 10 cm x 8 cm de espesor de 1 mm.
Cloruro de sodio      Sigma  5886
Dodecil sulfato de sodio (SDS)    Sigma  L-4396
TEMED    Sigma  T-9281
Tritón X-114    Sigma648468
Trizma Base (TRIS) T6066    Sigma  T6066
Vórtice  TARSON  3020

Referencias

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Enriquecimiento de proteínas subcelulares en Leptospira mediante un enfoque de fraccionamiento basado en Triton X-114
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