Aquí, presentamos un protocolo para inducir la producción de raíces adventicias (AR) a través de la vía de inoculación de patógenos fúngicos en el floema o la cintura de la epidermis, que es adecuado para el estudio de la biología de las raíces y los procesos fisiológicos relacionados con la respuesta a la luz en el álamo.
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Artículo de método
Raíces adventicias de álamo inducidas por patógenos del cancro del tallo: un sistema experimental para estudiar la biología de las raíces y los procesos relacionados con la respuesta a la luz
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Resumen
Resumen
Valsa sordida y Botryosphaeria dothidea son dos patógenos fúngicos necrótrofos cruciales que dañan a muchos huéspedes de plantas, particularmente a las especies del género Populus. Estos dos patógenos fúngicos se encuentran principalmente en las ramas, tallos y ramitas del álamo, causando síntomas clásicos como lesiones de cancro, muerte regresiva del dosel y marchitamiento. La inoculación de patógenos es la vía más eficiente para estudiar el mecanismo de las enfermedades de las plantas. Además de las lesiones de cancro alrededor de los sitios de inoculación en los tallos, se observó un nuevo fenómeno de desarrollo, abundantes raíces adventicias (AR) de color rojo brillante, en especies de álamo después de las inoculaciones del patógeno del cancro del tallo. En este estudio, describimos el método para inducir ARs utilizando patógenos fúngicos en álamos. El paso crucial de este método es la inoculación del patógeno después de la manipulación del anillado (floema o epidermis). El segundo paso crucial es la aplicación del material hidratante. En comparación con la manipulación de la humectación con Parafilm, envolver los sitios inoculados con una envoltura de plástico de polietileno (PE) puede producir AR coloridos, numerosos y robustos en 20 días después de la inoculación del anillado. Finalmente, los AR blancos brotaron de los anillos inoculados en los tallos de álamo después del tratamiento de sombreado (envolviendo los tallos con papel de aluminio). Este método introduce un nuevo sistema experimental para estudiar el desarrollo y la morfogénesis de las raíces, que es crucial para comprender la biología del desarrollo de las raíces, la morfogénesis y la respuesta bajo el estrés de las enfermedades. Además, cuando se combina con el tratamiento de sombreado, este estudio puede proporcionar un sistema experimental conveniente para investigar los procesos relacionados con la respuesta a la luz, por ejemplo, la biosíntesis de flavonoides, antocianinas u otros metabolitos relacionados, y genes o factores de transcripción involucrados en estos procesos.
Introducción
Las enfermedades del cancro del tallo del álamo causadas por patógenos fúngicos necrótrofos, Valsa sordida y Botryosphaeria dothidea, son las dos enfermedades cruciales de los árboles en el norte de China que dañaron gravemente el desarrollo de las plantaciones ecológicas y económicas de las especies de álamo. Las enfermedades del cancro del álamo siempre ocurren en la corteza de los troncos y ramas, mientras que las lesiones del cancro son sus síntomas típicos. Después de la aparición de enfermedades, las lesiones de cancro en expansión dañaron progresivamente el floema, el cambium y el xilema de los huéspedes. Además, afectaban al transporte de productos asimilados y agua a través del sistema vascular. Sin embargo, aún no está claro cómo los patógenos del cancro impiden el transporte del floema y el xilema.
Para revelar los mecanismos de transporte de carbohidratos y agua en álamos infectados por patógenos del cancro, propusimos los métodos de inoculación de anillamiento de floema o epidermis 1,2, que combinaron la manipulación clásica de la faja de jardín y el método de inoculación de patógenos (inoculación de heridas en bloque de micelios). Estos métodos pueden simular el proceso de infestación y el bloqueo de agua y carbohidratos inducido por patógenos del cancro.
Nuestra investigación ilustró que los patógenos fúngicos causaron la muerte regresiva del dosel del álamo al inducir inicialmente la inanición de carbono, no la falla hidráulica 1,3,4,5. Sorprendentemente, hemos observado una rizogénesis especial en los tallos de álamo que se asoció con la inoculación de patógenos del cancro del tallo: copiosas raíces adventicias rojas (AR) crecen desde el extremo inferior de los tallos superiores (opuesto al borde superior del floema o los anillos de anillamiento de la epidermis). Además, nuestros experimentos demostraron que la producción de ARs es universal en la interacción entre el álamo y el patógeno del cancro. Pueden producirse a partir de especies de álamos o clones a diferentes edades (1, 2 o incluso 6 años) y pueden ser inducidos por diferentes patógenos del cancro (V. sordida y B. dothidea) o sus aislados. Además, hemos estudiado los mecanismos de color de los ARs de álamo, y los resultados mostraron que está asociado con la biosíntesis de flavonoides y antocianinas, así como con la regulación de la expresión génica de genes relacionados con la luz (o módulos de genes) en condiciones de iluminación6. Por lo tanto, estos ARs de álamo inducidos por patógenos pueden utilizarse como un sistema experimental estable e ideal para el estudio de la interacción planta-patógeno, la biología de las raíces y la función y expresión de genes relacionados con la luz.
En este estudio, presentaremos y proporcionaremos el protocolo para establecer un sistema experimental de ARs de álamo a través de la vía de inoculación de anillado; además, señalamos los factores cruciales que afectan la formación de ARs y exponemos la posible aplicación de la inoculación de anillado en el estudio de la biología de la raíz de álamo y otros procesos fisiológicos relacionados con la respuesta a la luz.
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Protocolo
1. Inducción de ARs de álamo mediante inoculación con anillado
- Cultivo del patógeno del cancro fúngico
- Disuelva 6 g de extracto de papa, 20 g de dextrosa y 20 g de agar en 1000 ml de agua para preparar el medio de agar papa dextrosa (PDA). Esterilizar el medio a 121,1 °C durante 30 min y verter el medio en placas de Petri (9 cm de diámetro), conteniendo cada placa unos 20 mL de medio PDA.
- Inocular el cubo de micelio fúngico activado (~0,5 cm) en el centro de la placa de Petri PDA.
- Incubar las placas de PDA inoculadas en la oscuridad a 28 °C durante 7-10 días.
- Corte el medio PDA incubado con micelio fúngico en tiras (1,2 cm de ancho; aproximadamente 3-6 cm de largo).
- Preparación de materiales de álamo
- Seleccione árboles jóvenes de álamo de 1 a 2 años de edad y crecimiento vigoroso.
- Seleccione tallos/ramas maduros de árboles jóvenes de álamo (1-2 cm de diámetro, libres de enfermedades e infestaciones de plagas).
- Lave las regiones de inoculación (a unos 30 cm de altura sobre el suelo o la base de las ramas) de los tallos/ramas de álamo; Esterilizar los tallos/ramas con una solución de alcohol al 75%.
- Inducción de ARs mediante inoculación de anillado del floema
- Ciñir cuidadosamente la epidermis y el floema de los tallos/ramas de álamo esterilizados, retirar los anillos de floema ceñidos (1 cm de ancho, incluido el cambium parcial) y exponer los tejidos blancos del cambium/xilema interno.
NOTA: Los pasos 1.3.2-1.3.4 detallan métodos alternativos de inoculación. - Cubrir completamente la región de anillado con correas de micelio (1,2 cm de ancho) como tratamiento de inoculación de anillado de floema (GP). Las hifas fúngicas se enfrentan al xilema expuesto.
- Raspe y dañe el tejido de cambium interno expuesto con cuchillos esterilizados y, a continuación, inocule las correas de PDA (1,2 cm de ancho) en las regiones de anillado como tratamiento de eliminación de cambium (GR).
- Inocular las regiones de anillado directamente con las correas medianas PDA no cultivadas (1,2 cm de ancho) como control de anillado (GC).
- Envuelva los tallos/ramas inoculados con cinta de injerto elástica, incolora y transparente (o película de plástico PE). Envuelve 4 capas para mantener la humedad.
- Ate los tallos/ramas inoculados con palos (de metal, plástico o madera) (de más de 50 cm) para protegerlos del viento.
- Cultive los materiales de álamo anillado con riego regular durante el experimento.
- Observe desde el exterior y registre la formación de álamos ARs 14-30 días después de la inoculación.
- Ciñir cuidadosamente la epidermis y el floema de los tallos/ramas de álamo esterilizados, retirar los anillos de floema ceñidos (1 cm de ancho, incluido el cambium parcial) y exponer los tejidos blancos del cambium/xilema interno.
- Inducción de ARs a través de la inoculación de la epidermis
- Seleccione y prepare los materiales inoculados como se describe en el paso 1.2.
- Ciña con cuidado la epidermis de los tallos/ramas de álamo.
- Retire los anillos de la epidermis (1,0 cm de ancho) y exponga el tejido verde del floema.
- Raspe ligera y verticalmente el tejido del floema cuatro veces y exponga la estructura interna del floema.
- Inocular la región de la epidermis ceñida con el micelio fúngico (eGP) y las correas de PDA (eGC). Realice manipulaciones de inoculación similares a los pasos 1.3.2-1.3.4.
- Envuelva los tallos inoculados con cinta de injerto (o película de plástico PE) como se describe en el paso 1.3.5.
- Maneje los álamos y observe los AR, como se describe en los pasos 1.3.6 a 1.3.8.
2. Establecimiento de un sistema experimental para la investigación de genes relacionados con la luz mediante el método de inoculación con anillado
- Inducir ARs de álamo utilizando el método de inoculación de anillado por floema (pasos 1.3.2-1.3.4).
- Alternativamente, inducir ARs de álamo utilizando el método de inoculación de anillado de la epidermis como se describe en el paso 1.4.5.
- Envuelva las regiones inoculadas por patógenos de los tallos/ramas de álamo (15 cm de altura) con papel de aluminio (tratamiento de sombreado, S) o sin envoltura de papel de aluminio (tratamiento de iluminación, L).
- Ate los tallos/ramas a palos de >50 cm de largo para evitar que se rompan con el viento. Cultive y maneje los álamos con regularidad y manténgalos bien regados durante el experimento como se describe en los pasos 1.3.6-1.3.7.
- Retire el papel de aluminio de los tallos a ~ 20 días después de la inoculación.
- Observe y fotografíe inmediatamente los ARs de álamo sombreados (S) y sin sombrear (L) de papel de aluminio.
- Cultive los álamos sombreados a la luz del sol u otras fuentes/condiciones de luz artificial.
- Retire las cintas de injerto (o películas de plástico PE) y coseche los AR de álamo entre 1 y 5 días después de la exposición a la luz.
- Envuelva todas las muestras de RA con papel de aluminio. En el caso de los álamos que se sometieron a un tratamiento de sombreado, coseche las muestras en la oscuridad.
- Remoje las muestras de AR en nitrógeno líquido y guárdelas a -80 °C para su posterior investigación.
- Coseche los ARs de álamo expuestos a la luz o no expuestos (realizados en la oscuridad) después de envolverlos con papel de aluminio, y almacenarlos a 4 °C para ensayos morfológicos y otros ensayos in situ .
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Resultados
En la Figura 1 se muestra el flujo de trabajo de los patógenos del cancro del tallo que inducen raíces adventicias a través de la inoculación de anillado. Los experimentos realizados aquí mostraron que tanto los patógenos del cancro del tallo, V. sordida, B. dothidea, como sus aislados (de diferentes huéspedes, regiones o patogenicidad) pueden inducir la formación de AR en especies de álamo. En este protocolo, utilizamos los aislados de V. sordida CZC, CFCC86775, y...
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Discusión
Las especies de álamo son aptas para producir ARs o raíces laterales (LRs) a partir de esquejes de tallo, lo que contribuye a su reproducción y como modelo para el estudio de la biología de las raíces en plantas madereras 7,8. Además, las investigaciones indicaron que la inoculación de microorganismos específicos, como bacterias beneficiosas (Agrobacterium rhizogenes 9,10
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada conjuntamente por el Fondo de Investigación Basal de la Institución Científica Central de Interés Público del Laboratorio Estatal Clave de Genética y Mejoramiento de Árboles (subvención número CAFYBB2020ZY001-2) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención número 32171776) a Jiaping Zhao.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agar-agar | Solarbio | A8190 | Proporcionar nutrición para el crecimiento de hongos |
| Papel de aluminio | Biosharp | BS-QT-027B | Para proporcionar sombra al área infectada |
| Cuchillo de anillar | Empresas de herramientas de hardware MoGong | Ceñir la epidermis de los tallos/ramas del álamo | |
| Cinta de injerto | CAPI | 5cm | Para fijar hongos en las plantas |
| PD (Extracción de patata, dextrosa) | Solarbio | P7360 | Proporcionar nutrición para el crecimiento de hongos |
| Película plástica de PE | MiaoJie | 413703 | Para fijar hongos en las plantas |
| Placas de Petri | Bkman biological Co., Ltd | 90 mm | Preparar el medio PDA |
| Incubadora termostática | Instrumentos de laboratorio Kuntian de Shanghai Co., Ltd | KTD-6000 | Proporcionar un entorno para el crecimiento de hongos |
Referencias
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