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Artículo de método

Planaria como modelo animal para convulsiones agudas experimentales

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DOI:

10.3791/67307

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14 de febrero de 2025

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1Department of Biomedical and Translational Sciences, Macon and Joan Brock Virginia Health Sciences Eastern Virginia Medical School, Old Dominion University

En este artículo

Resumen

Las convulsiones tienen un impacto negativo en diversas funciones y en la calidad de vida. Los gusanos planarios se expusieron a concentraciones variables de quimioconvulsivos para evaluar sus fenotipos convulsivos y su motilidad disruptiva. Este estudio propone el uso de gusanos planarios como modelo para las convulsiones agudas en humanos y tiene importancia en el desarrollo de fármacos para la epilepsia.

Resumen

La epilepsia es uno de los trastornos neurológicos más prevalentes, caracterizados por convulsiones espontáneas recurrentes. Las convulsiones representan una manifestación clínica de actividad incontrolada y excesivamente sincronizada de las células neuronales. El grado del daño cerebral causado por las convulsiones depende de su duración e intensidad. Lamentablemente, no existe un remedio eficaz para la epilepsia. El objetivo de esta investigación es evaluar si el gusano planaria Dugesia dorotocephala podría servir como modelo para ayudar a identificar y desarrollar tratamientos para la epilepsia que puedan dirigirse a las convulsiones agudas. En la actualidad, se utilizan varios modelos, como los modelos marinos, para evaluar los medicamentos anticonvulsivos (MAPE). Sin embargo, son muy caros y hay preocupaciones éticas. Alternativamente, los modelos de invertebrados ofrecen una oportunidad de investigación rentable en el proceso de descubrimiento de fármacos para la MAPE. Las planarias pertenecen a la familia de los gusanos planos y habitan en ambientes marinos de agua dulce y terrestres. Dugesia dorotocephala es la especie dominante de planarias acuáticas en América del Norte. D. dorotocephala se presenta como un modelo de invertebrado viable para estudios de epilepsia debido a su rentabilidad, neuronas similares a las de los vertebrados y comportamientos cuantificables, a diferencia de otros invertebrados o animales más grandes. Se han utilizado en diversos estudios de farmacología y toxicología ambiental relacionados con la edad, la memoria y la regeneración. En este estudio, las planarias fueron expuestas a diferentes concentraciones de pilocarpina, un quimioconvulsivo común para estudiar su comportamiento tras la exposición. Después de la observación, las planarias fueron sacrificadas y preservadas en formaldehído o en solución de Golgi para su evaluación neurohistológica. Se observaron seis fenotipos de comportamiento distintos en las planarias: oscilaciones dorsales, oscilaciones de la cabeza, expansión dorsal de la cola, forma de C, movimiento de la cabeza y movimiento de la cola. Las frecuencias de oscilación dorsal aumentaron significativamente entre los grupos experimentales en comparación con el control y mostraron dependencia de la dosis. Además, la pilocarpina alteró la motilidad de las planarias. Las convulsiones inducidas por pilocarpina en planarias pueden servir como modelo para evaluar las convulsiones agudas y la medicación anticonvulsiva, que es esencial en el desarrollo de intervenciones terapéuticas para pacientes humanos que sufren de epilepsia.

Introducción

La epilepsia, caracterizada por dos o más convulsiones en 24 horas sin una causa aparente, afecta a ~50 millones de personas en todo el mundo. Entre ellos, se ha informado de que entre 10 y 15 millones de personas tienen epilepsia resistente a los medicamentos2. Por lo tanto, la investigación de medicamentos para la epilepsia es crucial. La afección implica episodios breves de movimiento involuntario parcial o generalizado, que van desde la mirada fija hasta la rigidez y el temblordel cuerpo, y está relacionada con un aumento de la actividad eléctrica en el cerebro.

Históricamente, la investigación de la epilepsia se ha basado en roedores y otros mamíferos debido a sus similitudes evolutivas con los humanos. Sin embargo, estos métodos pueden llevar mucho tiempo y ser costosos, lo que requiere un enfoque alternativo 4,5. Criaturas no mamíferos como moscas de la fruta, sanguijuelas, renacuajos, peces cebra y lombrices intestinales se han utilizado en estudios y han mostrado resultados prometedores6. Además, se demostró que las planarias podrían proporcionar un modelo de estudio genómico comparativo entre los genomas de invertebrados y humanos, junto con la capacidad de probar patrones proconvulsivos, anticonvulsivos y anticonvulsivos (ASM) y de comportamiento6. Las planarias (Phylum Platyhelminthes), conocidas como gusanos planos y miembros de la clase Turbellaria, son conocidas principalmente por sus capacidades regenerativas; Sin embargo, esta investigación se concentra en su respuesta a las sustancias inductoras de convulsiones.

Las planarias comparten mecanismos neurológicos fundamentales con los humanos, como la capacidad de respuesta a la serotonina y la dopamina, mostrando una similitud del 95% con los genes relacionados con el sistema nervioso en el cerebro de los mamíferos y poseyendo una estructura cerebral reconocible7. Además, exhiben movimientos observables en condiciones de laboratorio y son rentables, eficientes en tiempo y éticos en comparación con los roedores u otros mamíferos. Estos comportamientos observables, como los movimientos en forma de tornillo, en forma de C y en forma de nuez, han sido ampliamente documentados durante décadas y están asociados con sustancias como la cocaína, la nicotina, la dopamina y la pilocarpina 7,8,9,10,11,12,13,14. Por lo tanto, las planarias emergen como un modelo viable para la investigación de medicamentos para la epilepsia en humanos.

Este método tiene como objetivo caracterizar las neuronas de las planarias que han sido expuestas a la pilocarpina mediante una tinción de Golgi. La tinción de Golgi se utiliza para visualizar neuronas bajo microscopía óptica y se ha utilizado para investigar si un cambio en la morfología está relacionado con las convulsiones 15,16,17. La literatura actual no tiene evidencia de que la tinción de Golgi se realice en cerebros de planarias. A pesar de que estudios previos han documentado efectos farmacológicos mediante la observación de fenotipos conductuales, este manuscrito es el primero en caracterizar las neuronas de planarias expuestas a pilocarpina mediante tinción de Golgi11,18. Esta técnica resulta valiosa para visualizar y comprender los cambios morfológicos asociados con las convulsiones. Este estudio observó un aumento significativo en la frecuencia del comportamiento de oscilación dorsal oscilante en gusanos planarios a medida que aumentaba la concentración de pilocarpina.

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Protocolo

NOTA: El diseño experimental general se describe en la Figura 1.

1. Ensayo de fenotipo de comportamiento

  1. Prepare concentraciones de pilocarpina de 1 mM y 2 mM disuelta en agua de manantial, así como controle solo con agua de manantial.
  2. Pipetee 3 mL de cada solución en una placa de pocillos de 4 x 3, con cada fila representando una concentración diferente de pilocarpina.
  3. Coloque una Dugesia dorotocephala criada en laboratorio que tenga aproximadamente 2 semanas de edad en cada uno de los 12 pocillos usando una pipeta de transferencia con la punta cortada.
    NOTA: Corta la punta para que el extremo sea lo suficientemente grande como para que quepa la planaria sin dañarla.
  4. Registre el comportamiento de las planarias durante 1 h utilizando cualquier cámara que registre bien los comportamientos y sea observable para el ojo humano, colocada sobre la placa de pocillos de 4 x 3 en condiciones normales de iluminación interior.
  5. Repita los pasos 1.1-1.4 con concentraciones de 3 mM, 4 mM y 6 mM de pilocarpina disuelta en agua de manantial.

2. Análisis de motilidad

NOTA: Se registraron comportamientos de planarias en pozos de 2.5 cm de diámetro. Las grabaciones de video de 1 hora de duración se dividieron en partes de 30 minutos y se recortaron utilizando software comercial para analizar las planarias individualmente.

  1. Comience un nuevo experimento utilizando un software de análisis de comportamiento automatizado. Abra el sistema de seguimiento de comportamiento automatizado mejorado. Haga clic en Nuevo en Nuevo experimento. Asigne un nombre al experimento.
  2. Configure la configuración experimental como se describe a continuación.
    1. Haga clic en Configuración del experimento en el símbolo del menú. Asegúrese de que la configuración sea la predeterminada: origen de vídeo (a partir de un archivo de vídeo), Número de arenas (1), Entidades rastreadas (detección de punto central), Técnica de detección de punto corporal (basada en contornos), Opciones de análisis (ninguna), Unidades (cm, s, grados).
  3. Configure la configuración de la arena como se describe a continuación.
    1. Haz clic en Configuración de la Arena en la pestaña Configuración de la Arena en el panel de Configuración de la parte superior izquierda. Cuando se le pida que cargue un vídeo, seleccione el metraje grabado de las planarias en la ubicación del archivo almacenado. Una vez seleccionado el video, haz clic en Grabar.
    2. Siga las instrucciones en el panel superior derecho de la pantalla. Haga clic en 1. Dibuje la escala para calibrar. En la imagen de vídeo del pocillo, arrastre una línea de escala de borde a borde del pocillo de muestra. Introduzca la distancia real del pozo (2,5 cm).
    3. Haga clic en 2. Selecciona Forma y Dibujar Arena. Asegúrese de que la Arena 1 esté seleccionada en el panel derecho. Mueva el cursor del ratón a la parte superior central de la pantalla y haga clic en el icono del círculo.
    4. Crea un círculo en la imagen de vídeo cargada arrastrándola de un perímetro de la arena a otro. Asegúrate de que la arena esté en la zona naranja. Ajusta la forma para que se adapte a la arena. Asegúrese de que la etiqueta de la Arena 1 esté dentro de los límites de la arena.
    5. En la parte inferior del panel derecho, cambie la Forma, el Tamaño y la Posición (Ancho: 2.75, Altura: 2.75, X:0, Y:0) a las medidas deseadas.
    6. Haga clic en 3. Seleccione Forma y Zonas de dibujo (opcional). Ahora se seleccionará el grupo de zona 1 dentro del panel derecho. Mueva el cursor del ratón a la parte superior central de la pantalla y seleccione el icono del círculo. Crea un círculo más pequeño en la imagen de la arena arrastrándolo dentro.
    7. En el panel inferior derecho, cambie la Forma, el Tamaño y la Posición a las medidas deseadas (Ancho: 1,75, Altura: 1,75, X:0, Y:0).
    8. Haga clic en el botón Agregar etiqueta de zona en la misma barra de menú que el círculo. Haga clic en el centro del círculo más pequeño. Haga clic con el botón derecho en la etiqueta Zona 1 en el panel derecho para cambiar el nombre del Centro de zona.
    9. Vuelva a hacer clic en el botón Agregar etiqueta de zona . Haz clic en el perímetro de la arena, fuera de la zona central. Haga clic con el botón derecho en Zona 2 en el panel derecho para cambiar el nombre de la zona Perímetro.
    10. Haga clic en 4. Valide la configuración para garantizar que la configuración de la arena sea válida.
  4. Configure la configuración del control de prueba como se describe a continuación.
    1. Haga clic en Configuración de control de prueba en la pestaña Configuración de control de prueba en el panel de configuración superior izquierdo. Aparecerán seis cuadros de componentes. Haga clic en Configuración dentro del cuarto cuadro con la etiqueta Condición, que incluye Tiempo (1) y Tiempo infinito (condición nunca cumplida).
    2. Haz clic en la burbuja junto a Después y, a continuación, introduce la duración (30 min) en el cuadro de texto de la derecha. También habrá un menú desplegable a la derecha del cuadro de texto de tiempo para seleccionar entre h, min y s.
      NOTA: Los ajustes de detección para el metraje grabado dependerán de la calidad del metraje. Los siguientes métodos se pueden manipular para observar los mejores resultados, específicos para el material de archivo individual.
  5. Configure la configuración de detección como se describe a continuación.
    1. Haga clic en Configuración de detección en la pestaña Configuración de detección en el panel de configuración superior izquierdo. Haga clic en el botón Seleccionar video en el panel superior derecho. Cargue el video deseado para basar la configuración de detección.
    2. Haga clic en la pestaña Avanzado en el mismo panel derecho. Ahora, en la pestaña Método, asegúrese de que esté configurado en Escala de grises. Cambie el rango (0 - 100).
    3. En la pestaña Suavizado del panel derecho, asegúrese de que el suavizado de píxeles de vídeo sea Ninguno, la Corrección de fotogramas eliminados esté Desactivada y la Reducción de ruido de pista esté Desactivada.
    4. En la pestaña Contorno del sujeto del panel derecho, ajuste la configuración de la secuencia y cambie Erosión, Dilatación y Erosión a 1, 1 y 0, respectivamente.
    5. En la pestaña Tamaño del sujeto, cambie Mínimo (0) y Máximo (125000). Haga clic en Guardar en la parte inferior derecha.
  6. Configure una secuencia de pruebas de video para la observación como se describe a continuación.
    1. Haga clic en Lista de prueba en el panel de configuración superior izquierdo. Cargue secuencias de vídeo de especímenes en la secuencia deseada haciendo clic en los puntos suspensivos de la columna Archivo de vídeo del sistema. Para agregar más pruebas, haga clic en Agregar pruebas cerca de la parte superior izquierda del panel Lista de pruebas.
  7. Configura la configuración de adquisición.
    1. Haga clic en Adquisición en la pestaña Adquisición superior izquierda. En Configuración de adquisición, en el panel derecho, haga clic en Realizar seguimiento de todas las pruebas planificadas.
    2. Para comenzar la adquisición, haga clic en el botón rojo en la parte inferior central de la pantalla junto a Listo para iniciar. La adquisición de video ahora comenzará y tomará una cierta cantidad de tiempo, dependiendo de la cantidad y la duración de las pruebas de video cargadas.
  8. Configure la configuración del análisis como se describe a continuación.
    1. Haga clic en Perfil de análisis en la pestaña Análisis del panel izquierdo. Haga clic en las variables dependientes seleccionadas por defecto, Velocidad y Distancia recorrida, y elimínelas.
    2. En el panel de variables dependientes, en la pestaña Ubicación, haga clic en En zona. Haga clic en las casillas Centro y Zona perimetral para que estén marcadas como verificación.
    3. Haga clic en la pestaña Estadísticas de prueba dentro del cuadro En zona. Haga clic para desmarcar Latencia a Primero. Haga clic en Agregar.
    4. En la pestaña Cuerpo, haga clic en el botón Rotación. Haga clic en el sentido de las agujas del reloj y deje el Umbral (50,00 grados) y la distancia mínima movida (2,00 cm) como predeterminados. Haga clic en Agregar.
    5. Vuelva a hacer clic en el botón Rotación y haga clic en Sentido contrario a las agujas del reloj. Haga clic en Agregar.
  9. Analice las pistas como se describe a continuación.
    1. En la pestaña Resultados, haga clic en Visualización de seguimiento. En el panel derecho, en Filtro, desmarque Último. La barra de control de reproducción en el panel central inferior de la pantalla mostrará la visualización de la pista de los especímenes durante momentos específicos de observación.
  10. Analice y exporte los resultados. Los resultados se pueden encontrar en el resto de las pestañas del panel inferior izquierdo. Para exportar datos, haga clic en Datos sin procesar o Estadísticas en Exportar en el panel izquierdo.

3. Eutanasia

  1. Prepare una solución de 22 mM de eugenol en agua de manantial. Coloque las planarias en placas de Petri con 9 mL de solución de eugenol de 22 mM utilizando la pipeta de transferencia de corte, manteniendo cada concentración separada. Eutanasia durante 3 minutos o hasta que haya cesado todo movimiento.
  2. Coloque las planarias en una placa de Petri fresca llena de 9 ml de agua de manantial para enjuagar 1x-2x, y colóquela en la solución de Golgi que se describe a continuación (tinción de Golgi) o paraformaldehído al 4% (tinción de inmunofluorescencia).

4. Análisis histológico

  1. Tinción de Golgi
    1. Después de sacrificar las planias, colóquelas en un vaso de precipitados o en una placa de Petri llena de una mezcla 1:1 de las soluciones A y B del kit de tinción de Golgi. Reemplace las soluciones A y B al día siguiente colocando planarias en un nuevo vaso de precipitados lleno con una mezcla de soluciones A y B.
    2. Deje reposar las planarias durante 1 semana en las soluciones A y B.
    3. Retire las planarias de las soluciones A y B y colóquelas en la solución C de otro vaso de precipitados. Reemplace la solución C al día siguiente. Deje reposar las planarias durante un mínimo de 72 h y hasta 1 semana en la solución C.
    4. Retire las planarias de la solución C con una pipeta de transferencia e incruste colocando una pequeña cantidad de compuesto OCT en un mandril, agregando las planarias y luego rodeando las planarias con compuesto OCT. Corte transversalmente las planarias en secciones de 5 μM con la máquina de criostato a -24 ° C.
    5. Monte las planarias en portaobjetos recubiertos de gelatina con una pipeta de transferencia y una solución C y deje que se sequen en la oscuridad a RT durante un máximo de 3 días.
    6. Tiñir los portaobjetos con la solución de tinción (1 parte de solución D, 1 parte de solución E, 2 partes de agua de manantial) sumergiendo los portaobjetos en vasos de precipitados con las soluciones de la siguiente manera: Solución de tinción durante 10 minutos, luego en agua de manantial 2 veces durante 4 minutos cada una, luego etanol al 50% durante 4 minutos, luego etanol al 75% durante 4 minutos, luego etanol al 95% durante 4 minutos, luego en etanol 100% 4x durante 4 min, y finalmente en xileno 3x durante 4 min.
    7. Portaobjetos de cubreobjetos con medios de montaje histológicos y observe el tejido bajo microscopía de campo claro.
  2. Tinción de inmunofluorescencia
    1. Después de la eutanasia de las planarias, colóquelas en paraformaldehído al 4% durante al menos 24 h. También se puede almacenar en una nevera después de este paso.
    2. Transfiera la planaria al 20% de sacarosa del 4% de PFA y déjela reposar durante 1 día. Retire las planarias de la sacarosa y colóquela en el tampón PBS durante 5 minutos.
    3. Enjuague con 3-4 lavados de tampón PBS y transfiéralo a 20% de sacarosa para almacenarlo hasta que esté listo para teñir.
    4. Coloque en soluciones de alcohol al 70%, 95% y 100% durante 1 minuto cada una. Coloque en xileno durante 1 min.
    5. Coloque en alcohol al 95% y al 70% durante 1 minuto cada uno. Coloque en el tampón PBS 3 veces durante 5 minutos cada uno. Coloque en una solución de metanol y peróxido de hidrógeno 60:40 durante 10-15 minutos.
    6. Enjuague en PBS 3 veces durante 5 minutos cada uno. Añada el volumen de paraformaldehído al 4% utilizado anteriormente en 4.2.1 a este tampón PBS.
    7. Enjuague en PBS 3 veces durante 5 minutos cada uno. Bloquear durante 1 h con leche en polvo, cubriendo con ella las planarias.
    8. Diluir el anticuerpo primario (1H6) a 5 μg/mL con PBS e incubar los portaobjetos durante la noche a 4 °C en la solución de anticuerpos. Al día siguiente, enjuague las planarias en PBS durante 10 min.
    9. Diluir el anticuerpo secundario (IgG anti-ratón de cabra) a 1 μg/mL en PBS e incubar los portaobjetos durante la noche en RT en la solución de anticuerpos. Al día siguiente, enjuague las planarias en PBS durante 15 min.
      NOTA: Los diferentes anticuerpos tienen diferentes concentraciones óptimas; Determine esto antes de comenzar el experimento.
    10. Monte las planas enteras en el portaobjetos, cúbralas con un cubreobjetos, selle con medios de montaje acuosos y observe el tejido bajo un microscopio fluorescente.

5. Análisis de imágenes

  1. Abra la aplicación de software de análisis de imágenes de código abierto. Instale el complemento colour_deconvolution2.jar en la aplicación de software de análisis de imágenes de código abierto arrastrando el complemento a la aplicación.
  2. Seleccione la imagen que desea analizar y arrástrela a la aplicación de software de análisis de imágenes de código abierto. Ve a la pestaña Imagen y haz clic en color. Haga clic en Deconvolución de color2 v2.1.
  3. En la opción vectores, haga clic en H DAB. En la opción de salida, haga clic en 8bit_Transmittance. Asegúrate de que las LUT simuladas, el producto cruzado para el color 3, Mostrar matrices y Ocultar leyenda estén seleccionados. Haga clic en Aceptar.
  4. Seleccione la imagen en blanco y negro para asegurarse de que la aplicación de software de análisis de imágenes de código abierto pueda analizar la imagen de manera efectiva.
  5. Ve a la pestaña Imagen y haz clic en Ajustar. Haga clic en Umbral. Ajuste el umbral para que la tinción de DAB o el primer plano sean de color rojo con un fondo blanco. Asegúrese de que el umbral sea el mismo para cada imagen si se están cuantificando varias imágenes.
  6. Haga clic en Analizar. Haga clic en Establecer medidas. Seleccione Área, Valor de gris mínimo y máximo, Límite al umbral, Etiqueta de visualización, Mediana y Valor medio de gris. Haga clic en Aceptar. Haga clic en Analizar. Haga clic en Medir. Obtener el resultado.
  7. Repita los pasos 1.2 a 1. U6nthasta todas las imágenes están cuantificadas. Haga clic en la imagen de resultados. Haga clic en Archivo. Haga clic en Guardar como. Guarde el archivo como una hoja de cálculo y vea los datos en el software de la hoja de cálculo.

6. Análisis estadístico

  1. Calcular la media y los errores estándar de la media (SEM) para el comportamiento de las planarias utilizando el Análisis de Varianza (ANOVA) y la prueba t de Student para significación estadística (p < 0.05).

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Resultados

Se observó el siguiente comportamiento en las planarias expuestas a diferentes concentraciones de pilocarpina:
Oscilaciones dorsales: formación en forma de burbuja que viaja desde el extremo craneal del cuerpo de la planaria hasta el extremo caudal.
Oscilaciones de la cabeza: formación en forma de burbuja por la cabeza de la planaria que forma una apariencia similar a la de un renacuajo.
Forma de C: la cabeza se mueve en el sentido de las agujas del reloj y la cola se mueve en e...

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Discusión

Este estudio demostró el comportamiento inducido por pilocarpina en planarias a diferentes concentraciones. El comportamiento más pertinente fue la expansión dorsal oscilante, ya que este comportamiento no ha sido documentado en otros estudios sobre el comportamiento convulsivo en las planarias 9,10,11,12. Todavía se desconoce el mecanismo por el cual la piloc...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que declarar.

Agradecimientos

Queremos agradecer al Fondo de Incentivos para la Investigación EVMS (PI: A.E. Musto) y al Dr. Jorge Jacot por sus útiles sugerencias para optimizar el protocolo de inmunofluorescencia.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de centrífuga de 1,5 mL Solución
de paraformaldehído al 4%HimediaTCL119
Medios de montaje acuososClini SciencesNB-47-02240-30ML
Vasos de precipitados (uno para cada concentración probada)
Carolina SpringwaterCarolina Carolina132450
Cryostat
primarios y secundarios diluidos
Etanol (100%)sigma Aldrich
EthosVision XT 16noldus
Fiji Versión 2.9.0
Portaobjetos recubiertos de gelatinasigma Aldrich 643203
Golgi Anticuerpo 1H6DSHBAB_2619608
Tinción de Golgi kit_Asociado en NeurocienciaPK 401/401A
Peróxido de hidrógeno
Medios de montajeThermo Fischer
OCT Compound
PBS tampónsigma AldrichP4417
Leche en polvo
Papel de estaño
Pipetas de transferencia Xileno
Anticuerpos Metanol Scientific

Referencias

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