Ensamblaje y cuantificación de cocultivos que combinan levaduras heterótrofas con cianobacterias fototróficas secretoras de azúcar

Resumen

Este protocolo proporciona una guía completa para la configuración y el seguimiento cuantitativo de cocultivos, incluidas las cianobacterias fotoautótrofas secretoras de azúcar y las levaduras heterótrofas.

Resumen

Con la creciente demanda de biotecnologías sostenibles, se están explorando consorcios mixtos que contienen un microbio fototrófico y especies asociadas heterótrofas como método para la bioproducción impulsada por la energía solar. Un enfoque implica el uso de cianobacterias fijadoras de_CO2 que secretan carbono orgánico para apoyar el metabolismo de un heterótrofo cocultivado, que a su vez transforma el carbono en bienes o servicios de mayor valor. En este protocolo, se proporciona una descripción técnica para ayudar al experimentador en el establecimiento de un cocultivo que combine una cepa de cianobacterias secretoras de sacarosa con un socio fúngico, representado por especies de levadura modelo. El protocolo describe los requisitos previos clave para el establecimiento de cocultivos: la definición de la composición del medio, el seguimiento de las características de crecimiento de los socios individuales y el análisis de cultivos mixtos con múltiples especies combinadas en el mismo recipiente de crecimiento. Se resumen las técnicas básicas de laboratorio para la monitorización de cocultivos, como la microscopía, el contador de células y la citometría de flujo de una sola célula, y se proporcionan ejemplos de software no patentado que se puede utilizar para el análisis de datos de archivos estándar de citometría de flujo (FCS) en bruto de acuerdo con los principios FAIR (Findable, Accessible, Interoperable, Reusable). Por último, se incluyen comentarios sobre los cuellos de botella y las trampas que se encuentran con frecuencia cuando se intenta establecer un cocultivo con cianobacterias secretoras de azúcar y un nuevo socio heterótrofo. Este protocolo proporciona un recurso para los investigadores que intentan establecer un nuevo par de microbios cocultivados que incluya una cianobacteria y un microbio heterótrofo.

Introducción

Con la rápida expansión de las herramientas genómicas y las tecnologías de ADN en los últimos años, los esfuerzos de bioingeniería son cada vez más capaces de considerar a las comunidades mixtas de microbios como viables para las estrategias de bioproducción en lugar de centrarse únicamente en los cultivos axénicos. Los consorcios microbianos tienen múltiples ventajas potenciales en relación con los cultivos de una sola especie, incluida la especialización y la división del trabajo, la adaptabilidad y la robustez, y la eficiencia de la utilización del sustrato¹. Sin embargo, la ingeniería predecible de los consorcios multiespecie se complica por las incertidumbres causadas por los comportamientos de orden superior que emergen^{de las interacciones} entre especies. La señalización entre especies y el intercambio de metabolitos están en el corazón del principio de división del trabajo, pero también conducen a sinergias y antagonismos inesperados entre los participantes de los consorcios³. Es necesario un desarrollo considerable en este campo para aprovechar todo el potencial de los consorcios microbianos mixtos, incluido el uso de plataformas flexibles de cocultivo de 2 y 3 socios, que pueden utilizarse para caracterizar y comprender mejor la interactividad microbiana desde "abajo hacia arriba".

En la actualidad, se utilizan en el campo algunos tipos dominantes de plataformas de cocultivo, incluidos los socios auxótrofos complementarios y los microbios que secretan metabolitos que generalmente son beneficiosos para una amplia gama de especies microbianas. En esta última categoría, las cianobacterias han sido modificadas para convertirse en productoras primarias mejoradas mediante la introducción de vías que conducen a la secreción de carbohidratos fácilmente metabolizables y ahora se han explorado en una variedad de consorcios diseñados racionalmente. En resumen, en tales comunidades microbianas diseñadas, el socio cianobacteriano es capaz de utilizar la luz y el CO₂ como insumos primarios, y a través del proceso de fotosíntesis oxigénica, estas cepas pueden secretar azúcares de carbono central como un bien público. Una clase de estas cepas de cianobacterias modificadas son las que han sido modificadas para secretar el disacárido sacarosa⁴. Es probable que estas cepas hayan tenido éxito porque la sacarosa es un metabolito que está cerca del metabolismo central del carbono para muchas especies y también se hiperacumula con frecuencia como un "soluto compatible" para adaptarse a una variedad de estreses^{abióticos ambientales}. Un número mínimo de intervenciones genéticas puede conducir a una secreción eficiente de sacarosa en una variedad de organismos modelo de cianobacterias⁴.

Las cianobacterias secretoras de sacarosa son una plataforma útil para la investigación de consorcios microbianos diseñados racionalmente porque una amplia gama de especies heterótrofas pueden metabolizar la sacarosa como su fuente dominante de carbono y energía. De hecho, utilizando unas pocas cianobacterias modelo con capacidad de secreción de sacarosa, muchos laboratorios han diseñado racionalmente cocultivos y consorcios de especies mixtas que contienen uno o más microbios heterótrofos y que, en última instancia, se apoyan en los aportes primarios de luz y CO₂ sin suplementación de materias primas de carbono orgánico⁴. Las cepas heterótrofas pueden simplemente subsistir con los carbohidratos derivados de las cianobacterias, o pueden utilizarse para convertir la materia prima de sacarosa en bioproductos de mayor valor (por ejemplo, combustibles, polímeros, pigmentos, etc.). Además de ser una estrategia potencial para la bioproducción sostenible, estos cocultivos simplistas también pueden ser útiles como plataforma para la investigación de interacciones emergentes entre especies microbianas no relacionadas.

Este artículo de video se centra en las metodologías y los requisitos previos para utilizar cianobacterias productoras de azúcar como una plataforma flexible para el diseño de consorcios microbianos simples que pueden ser estables complementando solo entradas de carbono ligero e inorgánico. Si bien la configuración y el monitoreo de cultivos que contienen microorganismos únicos establecidos son en su mayoría sencillos y se pueden lograr fácilmente utilizando la densidad óptica (DO) o la metodología de retrodispersión, esto no es factible una vez que se combinan dos o más organismos en un recipiente. La razón principal es que estos métodos no distinguen entre los diferentes microorganismos, por lo tanto, solo proporcionan una imagen general del cultivo y no resuelven el crecimiento de los organismos individuales. Además, las cianobacterias tienen un amplio espectro de absorción en el rango de 400-750 nm, por lo que medir el OD₆₀₀ de un heterótrofo conduciría a resultados falsos debido a la ficocianina (que absorbe en 620 nm). Por lo tanto, se proporcionan protocolos específicos para la configuración de comunidades mixtas de cianobacterias-heterótrofos dentro del laboratorio, así como protocolos genéricos útiles para el análisis del rendimiento de estos consorcios a lo largo del tiempo. Si bien los protocolos se centran en un emparejamiento específico de una especie cianobacteriana secretora de sacarosa modelo con uno o más microbios heterótrofos modelo, la intención de este trabajo es proporcionar un recurso para los investigadores que deseen diseñar nuevos emparejamientos de especies y acelerar la fase de optimización para el establecimiento de dichos cultivos. Por lo tanto, además de los protocolos específicos de cada especie, se incluye información y estrategias que se pueden utilizar para adaptar y generalizar estos protocolos para comunidades personalizadas, según lo definan las necesidades del lector.

Debido a la flexibilidad de la plataforma de cocultivo descrita en este documento, se describen los protocolos para una serie de diferentes especies heterótrofas que se han reportado previamente en el cocultivo con cianobacterias secretoras de azúcar. Por ejemplo, se proporciona el protocolo paso a paso para un cocultivo de Synechococcus elongatus PCC 7942 con la levadura común de laboratorio Saccharomyces cerevisiae . Sin embargo, el artículo también incluye protocolos que son apropiados para analizar el rendimiento de los cocultivos que contienen otras especies modelo, incluida la forma de levadura de Ustilago maydis.

El artículo se centra en un conjunto básico de protocolos necesarios para establecer un cocultivo de cianobacterias/heterótrofos y realizar una caracterización básica del rendimiento de estos consorcios mixtos a lo largo del tiempo. Específicamente, se enfatizan la citometría de flujo unicelular y los métodos de conteo de partículas adecuados para realizar un censo preciso de diferentes especies, así como los enfoques de microscopía para evaluar la morfología celular. Estos protocolos pretenden servir de base para la adaptación a las necesidades y equipos disponibles. Es importante destacar que se proporcionan notas técnicas y otras consideraciones que son importantes para establecer y monitorear los cocultivos dentro del laboratorio. Por último, se incluyen ejemplos de alternativas no propietarias para el análisis de datos de archivos FCS⁶ sin procesar utilizando paquetes de Python. En resumen, el objetivo es hacer que las técnicas de cocultivo basadas en cianobacterias sean más accesibles a un público científico más amplio.

Protocolo

NOTA: Este protocolo contiene instrucciones detalladas sobre cómo configurar y cuantificar cocultivos de S. elongatus secretora de azúcar y especies de levadura modelo heterótrofa. En general, el protocolo es aplicable a cualquier especie de levadura susceptible de manipulación genética.

1. Establecimiento de cocultivos que combinen cianobacterias fototróficas y levaduras heterótrofas

1. Preparativos para el cocultivo: medios y precultivo
   NOTA: Prepare todos los medios y soluciones madre con agua filtrada ultrapura. Toda la cristalería (vasos medidores, cilindros graduados, botellas de almacenamiento y matraces de cultivo) debe limpiarse y esterilizarse en autoclave. Los medios estériles se pueden almacenar a temperatura ambiente (RT). Es necesario disponer de un dispositivo compatible con los requisitos del cultivo fotoautótrofo.
   1. Prepare el medio de cocultivo al menos 3-4 días antes del inicio previsto del cocultivo. La mayoría de las recetas de medios de cocultivo son variaciones^{del medio} BG-11 7 común utilizado para el cultivo rutinario de muchas especies modelo de cianobacterias. Este protocolo utiliza como ejemplo el medio CoYBG-11 previamente reportado (⁸; Ver Tabla 1). Esterilizar en autoclave (121 °C, 20 min) o esterilizar con filtro (tamaño de poro de 0,22 μm) el medio preparado, según corresponda.
      NOTA: Consulte la sección de Discusión para obtener sugerencias sobre cómo adaptar un medio apropiado para otros emparejamientos de especies.
   2. Preparación de reactivos moleculares: Para la inducción de la expresión de cscB y la exportación de sacarosa ^9,10,11, prepare un stock de 1 M de isopropil-β-tiogalactósido (IPTG).
      NOTA: El uso de antibióticos durante el cocultivo no es óptimo, pero si todas las cepas tienen casetes de resistencia, se pueden usar. En ese caso, prepare las existencias de antibióticos de acuerdo con las necesidades de las cepas empleadas.
   3. Preparación de un precultivo de cianobacterias: Al menos 3 días antes del inicio del cocultivo, transfiera las células de un precultivo de la cepa secretora de azúcar de las cianobacterias que crecen en medio BG-11 a un matraz fresco con deflectores que contenga medio CoY^BG-11 (Tabla 1).
      NOTA: Múltiples especies y cepas de cianobacterias han sido modificadas para secretar azúcares. Para una revisión exhaustiva de las cepas disponibles en el momento de escribir este artículo, consulte⁴. Esta referencia también enumera las especies heterótrofas (véase 1.1.4) para las que se ha informado previamente del cocultivo de cianobacterias.
      1. Mida el OD₇₅₀ del precultivo. Calcule el volumen requerido del precultivo para lograr un OD_{objetivo 750} de 0.3 (C₁) utilizando la ecuación V₁ = C₂ x V₂/C₁ donde C₂ = OD objetivo, V₂ = volumen objetivo y V₁ = volumen requerido de precultivo. Por ejemplo, cuando se inocula un cultivo de 30 mL (V₂), la cantidad x de cultivo líquido a utilizar es V₁ (mL) = (0,3 x 30)/(DO₇₅₀ medido).
         NOTA: La densidad óptica es una aproximación de la densidad celular y depende de las condiciones de crecimiento y la morfología celular; Por lo tanto, es necesario que los investigadores utilicen métodos para correlacionar la densidad óptica con el número absoluto de células (ver secciones 2.1, 2.2 y 2.3) para una evaluación adecuada del rendimiento del cocultivo. En el caso de las cianobacterias, las longitudes de onda de luz dentro del espectro fotosintéticamente activo (es decir, 400-700 nm) no deben utilizarse para determinar la densidad óptica porque son absorbidas por la clorofila y otros pigmentos; Por lo tanto, las longitudes de onda de rojo lejano se utilizan de forma rutinaria (por ejemplo, 750 nm).
      2. Incubar el cultivo diluido en una fotoincubadora adecuada. Incubación típica
         las condiciones para el modelo de cianobacterias son las siguientes: 30 °C, 150 rpm (tiro de 25 mm), 2% de espacio de cabeza de CO₂ , ~200 μmol de fotones ^m-2·^s-1 iluminación LED, 75% de humedad.
         NOTA: Se recomienda encarecidamente la suplementación con CO₂ para optimizar la cantidad de sacarosa liberada.
      3. Repita este proceso de dilución todos los días durante al menos 3 días antes de configurar el cocultivo para asegurarse de que las cianobacterias estén en crecimiento exponencial. Esto ayudará a mejorar la consistencia en el rendimiento del co-cultivo entre experimentos de diferentes días.
   4. Al menos 2 días antes del inicio del cocultivo, prepare un precultivo heterótrofo. Como se ha señalado, varias especies y subcepas de levadura se han cultivado previamente en cocultivo con cianobacterias ^8,12,13.
      1. Transfiera las células en una dilución 1:100 (250 μL) de un cultivo líquido de la especie heterótrofa que crece en un caldo de cultivo rico (ver Tabla 1) a 50 mL de medio^{CoY BG-11} suplementado con 20 g/L de sacarosa en un matraz deflector de 250 mL.
      2. Incubar durante la noche a la misma temperatura que las condiciones de cultivo utilizadas para la pareja cianobacteriana.
   5. Comprobar el diámetro exterior₆₀₀ al menos 24 h antes del momento previsto de inoculación del cocultivo para asegurarse de que la cepa heterótrofa ha crecido lo suficiente para las necesidades experimentales (véase 1.2): diluir en medio fresco para mantener el crecimiento exponencial si es necesario.
2. Inoculación y mantenimiento en cocultivo
   NOTA: Consulte la sección de Discusión para obtener consideraciones sobre la relación de inoculación entre los microorganismos fototróficos y heterótrofos.
   1. Para la inoculación del cocultivo, enriquecer ambos precultivos por centrifugación.
      1. Calcule el volumen de suspensión celular concentrada para lograr la densidad inicial deseada para ambas especies utilizando la ecuación estándar C₁ x V₁ = C₂ x V₂ , donde C₁ = OD de cultivo enriquecido. Por ejemplo, para hacer un cultivo de 25 mL de S. elongatus con una DO inicial de₇₅₀ de 0,5 (a partir de un cultivo axénico de 1,5 OD) y de S. cerevisiae con una DO inicial de₆₀₀ de 0,05 (a partir de un cultivo axénico de 0,7 DO), según la ecuación anterior, se necesitan 8,33 mL de cultivo inicial de S. elongatus , 1,79 mL de cultivo heterótrofo enriquecido, y 14,88 mL de medio^{CoY BG-11} .
      2. Centrifugar los cultivos utilizando 13.000 x g durante 10 min en RT. En condiciones estériles, decantar y desechar el sobrenadante.
         NOTA: Se puede usar menos fuerza centrífuga relativa (RCF; xg) para pellet S. cerevisiae ya que son células más grandes (2x-3x veces) en comparación con S. elongatus, pero tenga cuidado de que el sobrenadante se vuelva transparente. Para la recolección de la biomasa cianobacteriana, también se pueden usar menos de 13,000 x g , pero requeriría un tiempo más largo para la centrifugación (por ejemplo, se pueden usar 4,000 x g durante 20 min).
      3. Vuelva a suspender el pellet de cianobacterias en 25 mL de medio CoY^BG-11 estéril. Utilice las mismas condiciones de centrifugación que antes, posteriormente, deseche y decante el sobrenadante.
      4. Repita este proceso dos veces para S. elongatus y 4 veces más para S. cerevisiae.
         NOTA: Es importante lavar los gránulos de cianobacterias y heterótrofos (S. cerevisiae) para eliminar los componentes residuales del medio. Dado que S. cerevisiae había estado creciendo anteriormente en presencia de sacarosa, el aumento de la cantidad de pasos de lavado asegurará que se elimine el posible azúcar residual.
      5. Una vez verificada la DO, se combinan los volúmenes de S. elongatus y S. cerevisiae en un matraz deflector de 250 mL en condiciones estériles y se añade CoY^BG-11 hasta un volumen final de 50 mL. Diluir a partir del stock de 1 M de IPTG previamente preparado hasta una concentración final de 1 mM (esto es para inducir a las cianobacterias a exportar sacarosa al medio). Para un cultivo de 50 mL, utilice 50 μL de la culata IPTG de 1 M.
         NOTA: Los matraces con deflectores suelen ser mejores porque proporcionan una mejor aireación y mezcla para las cianobacterias.
      6. Colocar el matraz del paso anterior a 200 μmol de fotones·^m-2·^s-1 Iluminación LED complementada con 2% de CO₂ a 30 °C con agitación orbital a 150 rpm (25 mm de alcance) y 75% de humedad.
         NOTA: Las condiciones mencionadas anteriormente pueden variar y deben optimizarse en función del resultado experimental.
      7. Monitorizar el crecimiento del cultivo mediante muestreo estéril (1 mL) cada 12 h o 24 h (ver sección 2). Opcionalmente, utilice las muestras para realizar microscopía estándar de células vivas y para determinar las unidades formadoras de colonias (UFC¹⁴) de las células de levadura en un medio adecuado para rastrear la morfología y la aptitud de las células y para controlar la cantidad de células heterótrofas vivas, así como la contaminación.
         NOTA: Las UFC no se recomiendan como método para monitorear la densidad celular precisa de las especies de cianobacterias, que pueden experimentar un estrés significativo en la transición del cultivo en el medio líquido a sólido. Por lo tanto, deben elegirse placas de agar con un medio rico apropiado para el crecimiento de las especies de socios de levadura, como el extracto de levadura peptona dextrosa (YEPD)¹⁵.

Compuesto químico	BG-11 (concentración mg/L)	CoY BG-11 (concentración mg/L)
NaNO3	1500	1500
K2HPO4	40	40
MgSO4·7H2O	75	75
CaCl2 · 2H2O	36	36
Ácido cítrico	6	6
Citrato de amonio férrico	6	6
EDTA (sal disódica)	1	1
Na2CO3	20	20
Composición de trazas metálicas
H3BO3	2.86	2.86
ZnSO4·7H2O	0.222	0.222
Co(NO3)2 · 6H2O	0.0494	0.0494
MnCl2·4H2O	1.81	1.81
CuSO4 · 5H2O	0.079	0.079
NaMoO4·2H2O	0.39	0.39
Adicional
HEPPSO	7160	7160
Base nitrogenada de levadura (YNB), sin aminoácidos, sin sulfato de amonio	–	3608, 120013
Agente de valoración de pH 8,3	KOH	KOH
KPO3	–	118
Sacarosa (solo para heterótrofos)	–	13690

Tabla 1: Composición de medios de BG-11 y^{CoY BG-11}. Dadas las concentraciones de levadura-nitrógeno base, las concentraciones en^{CoY, BG-11} se derivan de los recursos publicados ^8,12,13.

2. Herramientas y metodología para monitorear el crecimiento de los co-cultivos

NOTA: Este protocolo es una guía para el análisis y monitoreo de cocultivos, desde técnicas simples pero laboriosas como la microscopía y las cámaras de recuento hasta aplicaciones de alto rendimiento como contadores de partículas y citometría de flujo de una sola célula. Aparte del cocultivo propiamente dicho, es aconsejable incluir cultivos axénicos de los microorganismos individuales para permitir un análisis exhaustivo. Como punto de partida general para el análisis, determine el OD de las referencias culturales. En esta sección, se detallan diferentes metodologías que se pueden utilizar para convertir las medidas relativas de la densidad celular (es decir, OD) en valores absolutos de número de celdas por volumen. La medición de OD₇₅₀ se utiliza a menudo para determinar la densidad celular de los cultivos de cianobacterias (debido a la absorción de longitudes de onda de 400-700 nm), mientras que OD₆₀₀ se utiliza para organismos heterótrofos. Ambas mediciones proporcionan valores guía aproximados con unidades arbitrarias. Tenga en cuenta que los valores pueden diferir mucho entre los instrumentos.

1. Cuantificación microscópica con cámaras de recuento
   NOTA: Las cámaras de recuento (es decir, Neubauer (mejorado)/hemocitómetros) son un medio sencillo y económico para determinar la composición de cocultivos compuestos por células que pueden distinguirse fácilmente morfológicamente. i.e., por sus formas de celda (Figura 1A). Consta de un portaobjetos de microscopio de vidrio grueso y un cubreobjetos. Si el cubreobjetos se coloca correctamente en la parte superior del portaobjetos, crea dos cámaras de volumen de precisión con rejillas grabadas (Figura 1B-D). Al contar un área definida de una cuadrícula, se puede calcular la concentración de celda de una suspensión. Las cámaras de conteo están disponibles en diferentes profundidades. Dependiendo del grosor de la celda, se debe elegir una profundidad de cámara adecuada. En el caso de las células fúngicas como U. maydis o S. cerevisiae, Una profundidad de 0,1 mm funciona bien. Esta profundidad de la cámara es demasiado grande para las células más pequeñas, como las cianobacterias, y las células flotan en la cámara. Una cámara con una profundidad de 0,02 mm es adecuada tanto para cianobacterias como para cocultivos de cianobacterias y hongos.
   1. Asegúrese de que la cámara de conteo y el cubreobjetos estén libres de polvo y células.
      NOTA: Se recomienda limpiar con etanol al 70% (v/v) y pañuelos desechables sin pelusa directamente antes de usar.
   2. Para colocar correctamente el cubreobjetos, deslícelo sobre las dos barras de soporte con un poco de presión, pero tenga cuidado para evitar roturas.
      NOTA: Se requiere un cubreobjetos grueso específico para esta aplicación (consulte el manual de la cámara). Dado que el vidrio de la cubierta a veces se rompe durante el montaje, es bueno tener repuestos a mano.
   3. Cuando el cubreobjetos esté colocado correctamente, observe los llamados anillos de Newton (Figura 1B) entre las dos superficies de vidrio, y asegúrese de que el cubreobjetos ya no se deslice.
      NOTA: Una suave inhalación en el cubreobjetos antes del montaje suele mejorar el resultado.
   4. Mezcle bien la suspensión celular y aplique unos pocos microlitros (~ 2-10 μL dependiendo de la profundidad de la cámara) de la suspensión celular al borde de la cámara y deje que se llene completamente mediante la fuerza capilar. Utilice una dilución adecuada de la suspensión de células para permitir un recuento fiable, por ejemplo, lo que da como resultado de 20 a 200 células por cuadrado grande (Figura 1D, rectángulo rojo).
   5. Utilice un objetivo apropiado (por ejemplo, 10x) de un microscopio óptico (campo claro o modo de contraste de fase) y concéntrese en las líneas de la cuadrícula de la cámara de conteo. La orientación la proporciona la cuadrícula. Comience a contar las celdas en los cuadrados adecuados para el tamaño de celda dado.
      NOTA: Utilice una ayuda técnica, como un contador de mano o una aplicación de teléfono inteligente adecuada para contar (por ejemplo, un "contador de cosas" general o aplicaciones especializadas en hemocitómetros que proporcionen funciones extremadamente útiles). Defina una regla para contar las celdas ubicadas en los bordes de la cuadrícula para evitar recuentos dobles. Por ejemplo, las celdas ubicadas en los bordes superior e izquierdo de cada cuadrado se pueden contar mientras se excluyen las de los bordes derecho e inferior. Existen reglas alternativas¹⁶. Si se utiliza un microscopio de fluorescencia, las células también se pueden distinguir en función de su autofluorescencia o marcadores fluorescentes.
   6. Después de contar, por ejemplo, los cuatro cuadrados grandes de las esquinas, determine el valor medio de cada tipo de celda. Con estos valores medios, el área del cuadrado utilizado y la profundidad de la cámara dada (consultar información del fabricante), se calculan las concentraciones de celdas (ver Resultados Representativos).
      NOTA: Dependiendo del tamaño de la celda, se pueden usar diferentes cuadrados para contar. En el caso de las células de levadura y cianobacterias, los cuatro cuadrados grandes de las esquinas funcionan bien (Figura 1D, rectángulo rojo).
   7. Después de su uso, limpie la cámara teniendo en cuenta los requisitos de las muestras (por ejemplo, inactivar adecuadamente los organismos modificados genéticamente).
2. Cuantificación mediante contadores de partículas
   NOTA: Dependiendo de las características de las células en un cocultivo, se puede aplicar un contador de partículas para determinar el número de celdas de los socios. Para la aplicabilidad de este método, las células deben diferir fuertemente en su tamaño; Por ejemplo, se puede lograr la discriminación de células bacterianas y de levadura. Es necesario incluir cultivos axénicos de los microorganismos individuales del consorcio para permitir la interpretación de los resultados. Los cocultivos que albergan células con tamaños similares o más de 2 socios deben analizarse con la metodología descrita en las secciones 2.1 o 2.3.
   1. Preparativos
      1. Ajustar la DO del cultivo a 0,1 y diluir la muestra 1.000 veces con un tampón de medición isotónico (consulte el manual del dispositivo) en un volumen total de 10 mL. Prepare triplicados técnicos de todas las muestras.
      2. Seleccione un tamaño de poro adecuado del capilar para el experimento.
         NOTA: El tamaño de los poros debe estar dentro del rango de las células más pequeñas del cocultivo, pero también debe incluir las células más grandes. No sea demasiado pequeño porque el poro podría obstruirse debido a la agregación celular, que puede ocurrir debido a la división celular. Los tamaños de poro disponibles difieren. Un capilar de 45 μm, por ejemplo, comienza a detectar células con un diámetro de 0,7 μm. (U. maydis y S. cerevisiae 3,5 μm-5,5 μm, S. elongatus/Synechocystis sp. ~1-2,5 μm).
   2. Cuantificación de células en un contador de partículas
      1. Encienda el dispositivo. Finalmente, realice una autoprueba para el control de calidad (consulte el manual del dispositivo específico).
      2. Cargue las muestras en los recipientes de muestras, asegure la tapa y mezcle la muestra inclinando ligeramente el recipiente.
         NOTA: Trate de evitar la formación de espuma y burbujas. Utilice siempre una taza para cada medida. Los vasos se pueden limpiar y reutilizar varias veces. Deseche las tazas si hay algún residuo que no se pueda eliminar. Si la muestra permanece en la taza durante períodos más largos, mézclela nuevamente antes de medir.
      3. Registre en un rango de 0-30 μm debido a que los agregados celulares pueden ser más grandes que las células individuales.
         NOTA: En primer lugar, utilice cada uno de los cultivos axénicos de los socios de cocultivo para tener una idea del tamaño de las células y determinar si se pueden distinguir por su tamaño.
      4. Después de la evaluación, determine la composición del cocultivo de la misma manera.
3. Cuantificación en consorcio mediante citometría de flujo de célula única
   NOTA: La citometría de flujo de una sola célula es un método de alto rendimiento que se puede emplear para determinar el número de células de socios individuales en el cocultivo, dado que los socios se pueden discriminar por tamaño/sus propiedades de dispersión de luz y/o fluorescencia. Es importante destacar que, para el establecimiento del método, se necesitan cultivos axénicos de los socios de cocultivo para analizar sus propiedades en el citómetro y ajustar las puertas de población en consecuencia. En el caso de las cepas portadoras de un indicador fluorescente, se necesitan cepas sin el indicador fluorescente como controles negativos. Una familiaridad básica con las aplicaciones de citómetros facilitará la implementación exitosa del protocolo a continuación^{17,18,19,20,21}. En este ejemplo, se analiza una mezcla artificial de 3 microorganismos (ver Resultados representativos): Synechocystis (que expresa un fluoróforo reportero citosólico, mVenus) y las dos levaduras S. cerevisiae y U. maydis. Para una discriminación precisa de S. cerevisiae y U. maydis, se han introducido marcadores de fluorescencia en forma de proteína verde fluorescente citoplasmática (GFP) (U. maydis eGFP) y proteína fluorescente roja (RFP) mKate2 (S. cerevisiae mKate2) utilizando técnicas básicas de clonación molecular. Si es posible, se deben preferir las cepas con integración genómica de los reporteros para evitar la necesidad de presiones de selección continuas.
   1. Preparación de la muestra
      1. Medir la DO de los cultivos en una determinada etapa de crecimiento a analizar.
      2. Ajuste el diámetro exterior de las muestras a un rango adecuado para la medición. Utilice una DO_{aproximada de 750} de 0,05-0,5 para las cianobacterias y una DE₆₀₀ de 0,2-1,5 para la levadura utilizando un medio de cultivo fresco (volumen final: al menos 500 μL). Para los cocultivos, apunte a un OD₇₅₀ entre ~0,1 y 0,5 y registre el factor de dilución. Para el cálculo, aplique la fórmula proporcionada en el paso 1.1.3.1. Esto asegurará que el recuento de células se mantenga en un rango de 1.000 a 10.000 células/s a un caudal de 10 μL/min (equivalente a 6.000 - 60.000 células/μL).
         NOTA: Para la dilución, se pueden utilizar medios o tampones sin autofluorescencia y partículas (por ejemplo, BG-11). Tenga cuidado con los medios que contengan ingredientes complejos, como el extracto de levadura, que podrían aparecer como partículas en la medición.
      3. Transfiera 300 μL de cada suspensión de celda de muestra a un pocillo individual en una placa de 96 pocillos (pocillo redondo estándar, transparente, fondo plano).
         NOTA: Alternativamente, transfiera 0.5-2 mL a un tubo de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) si se utiliza el modo de muestra semiautomático en lugar del modo de lector de placas.
   2. Medición de citometría
      1. Ponga en marcha el citómetro y realice el programa de puesta en marcha y el control de calidad (QC) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      2. Carga (cargador de placas o muestreo semiautomático) y ejecución de las muestras. Comience con las muestras de control utilizando los cultivos axénicos de cada socio de cocultivo para identificar cada especie en función de sus propiedades antes de intentar separarlas en una muestra de cocultivo.
      3. Diagramas de puntos abiertos y/o histogramas para los canales de fluorescencia y dispersión (por ejemplo, dispersión directa [FSC] o dispersión lateral [SSC], altura [-H] o área [-A]) relevantes para las muestras.
      4. Busque la(s) población(es) de células requerida(s) y ajuste el umbral para excluir el ruido técnico y las partículas pequeñas del medio.
         NOTA: Se recomienda buscar la población de células en un diagrama de puntos FSC-H sobre el ancho FSC o FSC-H sobre SSC-H y ajustar la escala de lineal a logarítmica para células pequeñas como bacterias (generalmente 1-3 μm). Establezca el umbral en el canal FSC-H o SSC-H. Para celdas con menos de 1 μm de diámetro, utilice el SSC violeta (VSSC) en el láser violeta a 405 nm para una mejor resolución.
      5. Ajuste la ganancia para cada canal de interés manualmente a un rango de 25-2,500. Ajuste las ganancias de manera que el control negativo (por ejemplo, sin el marcador fluorescente) esté en un rango de 1 x 10^2-1 x 10³ y el control positivo (por ejemplo, con el marcador fluorescente) esté en un rango de 1 x 10^5-1 x 10⁶ para obtener la mejor separación y mantenerse dentro del rango de 1 x 10^1-1 x 10⁷.
         NOTA: Las ganancias estándar del control de calidad también se pueden mantener como una buena referencia.
      6. Para determinar la concentración de células en la muestra, registre un volumen de muestra definido utilizando la función de registro (por ejemplo, 10 μL a un caudal de 10 μL/min). Posteriormente, divida los recuentos de células individuales medidos para este volumen por el volumen registrado para obtener un recuento de células por μL para cada población.
         NOTA: Tenga en cuenta el factor de dilución inicial al calcular la concentración de células en el cultivo/muestra.
   3. Activación/selección de poblaciones celulares
      NOTA: Independientemente del dispositivo utilizado para ejecutar las mediciones, el análisis y la compuerta se pueden realizar en el software operativo del citómetro o en el software de análisis comercial, como se ejemplifica a continuación²². Además, el análisis de datos de citometría de flujo utilizando software no propietario se puede realizar de manera eficiente con varias herramientas de código abierto, como FlowCytometryTools²³ o FlowKit, utilizando FlowUtils²⁴ paquetes en Python. En el espíritu de la ciencia abierta, este protocolo comparte un JupyterNotebook ejemplar que muestra el uso de estos paquetes para la exploración básica de datos. Por supuesto, el software alternativo puede ser igualmente adecuado para realizar la bioinformática de citometría de flujo²⁵.
      1. Seleccione ciertas poblaciones de células dibujando puertas alrededor de ellas en un diagrama de puntos o estableciendo segmentos divisores o de línea alrededor de los picos en un histograma (Figura 4).
         NOTA: La función de puerta automática del programa se puede utilizar como referencia.
      2. Separe las señales para organismos fototróficos y heterótrofos en función de la autofluorescencia del organismo fototrófico (causada principalmente por la clorofila) en la región roja del espectro. Ejemplo: Utilice el histograma del canal APC-H (excitación (ex.) a 638 nm, emisión (em.) a 660/10 nm) y establezca un divisor vertical entre el pico derecho (fototrófico = población positiva de autofluorescencia de clorofila) y el pico izquierdo (heterótrofo = población negativa de autofluorescencia de clorofila) (Figura 4A).
         NOTA: Los marcadores fluorescentes también se pueden usar para distinguir dos (o más) socios fototróficos dentro del mismo cultivo (por ejemplo, mVenus para Synechocystis).
      3. Separe los dos organismos heterótrofos en función de sus marcadores fluorescentes o propiedades de dispersión (FSC, SSC, si es posible).
         NOTA: La separación basada en las propiedades de dispersión solo es aplicable si las células tienen, por ejemplo, un tamaño o morfología de celda diferente que da lugar a cambios visibles en la dispersión (por ejemplo, Synechocystis: células esféricas con ~1,5-3 μm de diámetro frente a células alargadas de U. maydis con una longitud de 10 μm y aproximadamente 1-2 μm de diámetro²⁶).
      4. Ejemplo: Utilice el histograma del canal FITC-H (por ejemplo: 488 nm, em.: 525/40 nm) que muestra solo la población "heterótrofa" para distinguir entre las células heterótrofas que contienen GFP (por ejemplo, U. maydis eGFP) y las que no tienen GFP (por ejemplo, S. cerevisiae RFP/mKate2) (Figura 4B). Alternativamente, utilice el histograma del canal PC5.5-H (por ejemplo: 561 nm, em.: 710/50 nm) que muestra solo la población "heterótrofa" para distinguir entre las células heterótrofas que contienen RFP (por ejemplo, S. cerevisiae RFP / mKate2) y las que no tienen RFP (por ejemplo, U. maydis GFP) (Figura 4C).
         NOTA: Tenga en cuenta que dos (o más) tipos de celdas diferentes pueden "pegarse" durante la medición. Estos "dobletes" o "múltiples" se pueden detectar fácilmente en diagramas de puntos de ambos marcadores fluorescentes (por ejemplo, APC-H sobre FITC-H para identificar dobletes de fotótrofo y socios heterótrofos marcados con GFP).
      5. Para el análisis básico de datos en Python, siga las instrucciones de este Jupyter (https://git.rwth-aachen.de/computational-life-science/cytoflow).
         NOTA: Este cuaderno admite tres pasos de análisis de datos. i) Importar datos: Importación de archivos FCS. ii) Realizar el control de calidad: Comprobar la integridad de los datos y el número de eventos. iii) Visualizar datos: Utilice gráficos como histogramas, diagramas de dispersión y gráficos de densidad para visualizar los datos. Además, se muestra el procedimiento de cómo realizar el comgate para aislar poblaciones de interés reproduciéndose en la Figura 4 .
         Para facilitar el análisis de los cocultivos en proyectos a largo plazo, se recomienda al investigador utilizar los métodos anteriores para contar el número de células y crear curvas estándar para comparar los valores de OD con los recuentos absolutos de células. La densidad óptica es una medida relativa que puede variar según la especie, la cepa, las condiciones de crecimiento y el espectrómetro. Por lo tanto, la generación de curvas estándar "internas" es necesaria para la conversión precisa de los valores OD a números de celda.

Figura 1: Cuantificación microscópica de células morfológicamente distinguibles. (A) Una cámara de recuento de Neubauer. (B) Los anillos de Newton indican la posición correcta del cubreobjetos especial. (C) Representación esquemática de la arquitectura de la cámara con la cavidad central de volumen definido para el recuento de células. (D) La cuadrícula de la cámara de conteo de Neubauer representada consta de nueve cuadrados grandes con un tamaño de 1 mm² (rojo). Los cuatro cuadrados grandes de las esquinas se dividen a su vez en 16 cuadrados (azul). El cuadrado grande central está dividido en 25 cuadrados grupales con un tamaño de 0,04 mm² (naranja). Cada casilla de grupo consta de 16 casillas más pequeñas (verde). La cifra se generó a partir de la información pública de los fabricantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

Establecimiento de cocultivos de S. elongatus fototrófico y levaduras heterótrofas
Anteriormente hemos reportado resultados detallados del co-cultivo de Synechococcus elongatus PCC 7942 con una variedad de subcepas de S. cerevisiae. Para una descripción completa de los resultados del cocultivo con este par de cianobacterias/levaduras, véase^{el punto 8}. En aras de la brevedad y la precisión, estos resultados no se reproducen aquí. Brevemente, los resultados anteriores indican una serie de consideraciones que son importantes para el establecimiento de cocultivos de levaduras cianobacterianas a largo plazo. La capacidad de la levadura para sobrevivir en condiciones en las que las cianobacterias proporcionan las únicas formas de carbono fijo depende en gran medida de la eficiencia con la que la cepa de levadura puede utilizar la sacarosa. Las cepas de S. cerevisiae que evolucionaron o se diseñaron para metabolizar la sacarosa de manera más eficiente^27,28 tuvieron más probabilidades de sobrevivir a la transición al modo de crecimiento de cocultivo, lograron densidades celulares más altas y exhibieron una mayor robustez en experimentos de cocultivo de cianobacterias a largo plazo (días a semanas)⁸. La fase inicial de la inoculación de un cocultivo fue especialmente importante para la viabilidad de la levadura, probablemente debido a las tensiones de la dilución del cultivo, el cambio de la composición del medio y/o la retirada de una fuente de carbono más concentrada. Por lo tanto, los esfuerzos para facilitar la transición de un medio de crecimiento más rico a una disponibilidad mínima de carbono al inicio del cocultivo pueden mejorar el rendimiento experimental y la consistencia (véase el paso 1.2.1.1). Además, S. cerevisiae exhibió respuestas al estrés consistentes con hiperoxia cuando se inoculó en cultivos densos de S. elongatus, consistente con la formación de_O2 como subproducto primario de la fotosíntesis oxigénica. Por lo tanto, los esfuerzos para prevenir el crecimiento excesivo de la pareja cianobacteriana y/o los ciclos de luz alternos "día/noche" podrían extender sustancialmente la viabilidad de S. cerevisiae en cocultivos a largo plazo. Véase la sección de Discusión para un resumen adicional de los fenómenos comunes en los cocultivos en relación con las muestras de control axénicas.

Seguimiento del crecimiento de los cocultivos utilizando diferentes metodologías
En la siguiente sección, se describe la cuantificación ejemplar de un consorcio tripartito mezclado artificialmente de Synechocystis y las dos levaduras S. cerevisiae y U. maydis utilizando tres métodos diferentes. Para la mezcla, se determinaron DO₇₅₀ (para cianobacterias) y OD₆₀₀ (para heterótrofos) de cultivos individuales y se ajustaron a DE 0,1. Los cultivos individuales se mezclaron en una proporción de 1:1:1 utilizando densidad óptica (que es distinta de los recuentos de células, ver arriba). Para facilitar la discriminación de las levaduras en el citómetro, se utilizaron cepas indicadoras de S. cerevisiae modificada genéticamente FY1679-O1B²⁹ que producen constitutivamente mKate2 citoplasmática (genotipo: URA3Δ/pTDH3::mKate2; cepa: S. cerevisiae mKate2³⁰) y U. maydis cepa AB33³¹ que produce constitutivamente eGFP (genotipo: pep4Δ/pRpl40::egfp; cepa: U. maydis eGFP³²) se utilizaron. Cabe destacar que la cepa de cianobacterias estaba equipada con un plásmido replicativo que promueve la expresión constitutiva y fuerte de la proteína fluorescente amarilla versión mVenus (Synechocystis sp. PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenus, cepa Synechocystis mVenus, similar a la³³) y además, exhibe la típica autofluorescencia fuerte debido a la presencia de la maquinaria fotosintética.

Cuantificación microscópica mediante cámaras de recuento: Todos los tipos de células de la mezcla artificial utilizada de tres microorganismos pueden distinguirse fácilmente microscópicamente (Figura 2A): Synechocystis y S. cerevisiae están representadas por células esféricas que, sin embargo, difieren mucho en su diámetro (Synechocystis: diámetro aproximado de 1,5-3 μm, S. cerevisiae: diámetro aproximado de 3-6 μm), mientras que las células de U. maydis tienen una morfología alargada en forma de cigarro y una longitud de al menos 10 μm (Figura 2A). Estos claros rasgos morfológicos permiten la cuantificación exacta de cada socio en la mezcla. Como ejemplo ilustrativo, se cuentan 37, 18, 36 y 21 células de S. cerevisiae en los cuatro cuadrados grandes, respectivamente (Figura 2B). El valor medio es de 28 celdas. Dado que un cuadrado grande del hemocitómetro usado tiene un área de 1^mm2 y la profundidad de la cámara era de 0,02 mm, esto da como resultado 28 células por 0,02 μL. Esto corresponde a 1.400 células/μL, lo que equivale a 1,4 x 10⁶ células/mL. Se contaron los otros tipos de células y se determinaron las concentraciones en consecuencia (Figura 2C, Tabla 2).

Figura 2: Cuantificación microscópica de un consorcio tripartito formado por Synechocystis y las levaduras S. cerevisiae y U. maydis. (A) Imagen microscópica de contraste diferencial (CID) de una mezcla artificialmente combinada de los microorganismos indicados. Todas las especies se pueden distinguir fácilmente por su morfología. Barra de escala: 10 μm. (B) Resultados de recuento ejemplares para una mezcla ensamblada artificialmente de las cepas indicadas basada en cultivos axénicos con un OD de 0,1. Se analizaron los cuatro cuadrados grandes en los bordes de la cuadrícula (marca roja en la Figura 1D). (C) El valor medio de las diferentes celdas contadas en los cuatro cuadrados se utilizó para calcular la concentración de celdas en la suspensión utilizando la siguiente ecuación: Valor medio/(profundidad de la cámara [0,02 mm] x tamaño del cuadrado contado [1 mm²] x 1.000). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Cuantificación mediante contadores de partículas: Los contadores de partículas determinan el número de partículas en una suspensión en función de su tamaño. En el conjunto de datos de ejemplo, se utilizó un contador de partículas con un capilar de 45 μm. Dado que las células de S. cerevisiae y U. maydis muestran dimensiones similares, no se pueden distinguir en el contador de partículas, mientras que las células más pequeñas de Synechocystis se pueden separar claramente. Por lo tanto, el análisis de cultivos individuales muestra picos en posiciones idénticas que se refieren a 3 a 6 μm para las dos levaduras (Figura 3A). Durante la medición, se aplica una presión negativa, lo que hace que las células entren en el capilar. Esto cambia brevemente la resistencia eléctrica para que el dispositivo pueda determinar el tamaño de partícula en función de la alteración. En el cultivo mixto, se pueden detectar dos picos distintos, uno asociado con las células cianobacterianas más pequeñas y el otro que representa una fracción conjunta de las dos especies de levadura (Figura 3B). Es importante destacar que, además de los picos que reflejan las células vivas, se detectaron picos adicionales a aproximadamente 1 μm (Figura 3), que corresponden a restos celulares y partículas más pequeñas. Las señales que aparecerían a diámetros mayores de lo esperado pueden ser causadas por agregaciones de células. Cabe destacar que la forma de los picos refleja la homogeneidad de las células: un pico agudo muestra células muy homogéneas, lo que es poco probable para un cocultivo. En un co-cultivo, se espera ver un pico muy amplio o incluso dos picos si los socios del co-cultivo son claramente diferentes en tamaño. Para los cultivos axénicos de hongos heterótrofos, el pico podría ser un pico medio ancho.

Figura 3: Cuantificación de un consorcio tripartito formado por Synechocystis mVenus y las levaduras S. cerevisiae mKate2 y U. maydis eGFP utilizando un contador de partículas. (A) Salida visual de los análisis de los cultivos axénicos de las tres cepas como se indica en los gráficos (contador de células con capilar de 45 μm). (B) Archivo de salida visual ejemplar para el análisis del consorcio tripartito artificial en condiciones idénticas. El contador de partículas no admite la discriminación de las dos especies de levadura que están representadas por el segundo pico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Cuantificación mediante citometría unicelular: Con el citómetro de flujo de una sola célula, las diferentes poblaciones de células se pueden distinguir fácilmente en función de sus propiedades de (auto)fluorescencia y dispersión de la luz. Las células fototróficas (Synechocystis) se pueden diferenciar de las células heterótrofas (U. maydis y S. cerevisiae) en función de la autofluorescencia roja de los pigmentos fotosintéticos que se mide en el canal APC-H (Figura 4A). Sobre la base de esa separación inicial de células fototróficas y heterótrofas, las dos poblaciones heterótrofas se pueden distinguir en función de sus marcadores fluorescentes eGFP en el canal FITC-H y mKate2 en el canal PC5.5 (Figura 4B, C). En un diagrama de puntos que muestra las propiedades de dispersión de las tres poblaciones (FSC-H y FSC-Width), las poblaciones también se pueden distinguir con solo algunas superposiciones menores de las poblaciones (Figura 4D).

Con este método, se analizaron 10 μL de las muestras diluidas con un caudal de 10 μL/min, lo que permitió una cuantificación de aproximadamente 70.000 células en 1 min. Aproximadamente el 60% de esas células pudieron asignarse a Synechocystis (4,23 x 10⁶ células/mL), mientras que el 40% restante se distribuyó equitativamente entre U. maydis (1,35 x 10⁶ células/mL) y S. cerevisiae (1,36 x 10⁶ células/mL, Figura 4E, Tabla 2).

Figura 4: Cuantificación de un consorcio tripartito formado por la cianobacteria Synechocystis mVenus y las levaduras U. maydis eGFP y S. cerevisiae mKate2 mediante citometría de flujo unicelular. Ejemplos de gráficos obtenidos después de la medición de un cultivo mixto de Synechocystis mVenus (verde oscuro), U. maydis eGFP (verde claro) y S. cerevisiae mKate2 (rojo) en una proporción de 1/3 OD₇₅₀ / 1/3 OD₆₀₀ / 1/3 OD₆₀₀ en un citómetro (A) que muestra un histograma del recuento de eventos y fluorescencia en el canal APC-H (ej.: 638 nm, EM.: 660/10 nm) de todas las células utilizadas para diferenciar células fototróficas y heterótrofas en función de su autofluorescencia. (B) Un histograma del recuento de eventos y fluorescencia en el canal FITC-H (ej.: 488 nm, em.: 525/40 nm) de todas las células heterótrofas utilizadas para diferenciar las células eGFP de U. maydis y las células mKate2 de S. cerevisiae en función de sus propiedades de fluorescencia verde. (C) Un histograma del recuento de eventos y la fluorescencia en el canal PC5.5-H (por ejemplo: 561 nm, em.: 710/50 nm) de todas las células heterótrofas utilizadas para diferenciar las células eGFP de U. maydis y las células mKate2 de S. cerevisiae en función de sus propiedades de fluorescencia roja. (D) Un diagrama de puntos de las señales de dispersión en el ancho FSC sobre el canal FSC-H utilizado para identificar las poblaciones celulares sin propiedades de fluorescencia. (E) Las estadísticas de población, incluidos los recuentos de eventos, porcentajes y medias aritméticas y desviaciones estándar (DE) de los canales de fluorescencia relevantes. La cantidad total de células, junto con su tamaño y fluorescencia, se determinó en un volumen de 10 μL con un caudal de 10 μL/min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para visualizar comparativamente el resultado de los diferentes métodos de cuantificación, los números de celda determinados se presentan en las dos tablas siguientes (Tabla 2 y Tabla 3). Las concentraciones finales de células determinadas utilizando los tres métodos descritos anteriormente se encuentran en un rango similar para todos los métodos. El citómetro proporciona el tamaño de muestra más alto, seguido por el contador de partículas y la cuantificación microscópica, con una disminución de aproximadamente un orden de magnitud entre los métodos.

Co-cultura 1:1:1		Fotómetro	Citómetro		Contador de partículas		Cámara de recuento de microscopía
Organismo		DE750/600	Recuento de células	células/mL	Recuento de células	células/mL	Recuento de células	células/mL
Saccharomyces cerevisiae mKate2		0.0333	13,618	1.36 x 106	1,546*	2,58 x 106*	112	1,40 x 106
Ustilago maydis eGFP		0.0333	13,541	1.35 x 106			89	1.11 x 106
Synechocystis sp. PCC 6803 mVenus		0.0333	42,330	4.23 x 106	3,094	5.16 x 106	271	3.39 x 106

Tabla 2: Comparación de los diferentes métodos de cuantificación: Cultivo mixto artificial. Nótese que U. maydis y S. cerevisiae no pueden distinguirse utilizando un contador de partículas (*).

Cultura única		Fotómetro	Citómetro		Contador de partículas		Cámara de recuento de microscopía
Organismo		DE750/600	Recuento de células	células/mL	Recuento de células	células/mL	Recuento de células	células/mL
Saccharomyces cerevisiae mKate2		0.1	38,936	3.89 x 106	1,928	3.21 x 106	403	4.03 x 106
Ustilago maydis eGFP		0.1	36,927	3.69 x 106	2,465	4.11 x 106	307	3.07 x 106
Synechocystis sp. PCC 6803 mVenus		0.1	127,864	1,28 x 107	8,186	1.36 x 107	428	1.07 x 107

Tabla 3: Comparación de los diferentes métodos de cuantificación: Calibración con cultivos simples/axénicos.

Discusión

El manejo de microorganismos en cultivos de un solo eje en un contexto de laboratorio se ha establecido durante décadas para muchos modelos microbianos. Sin embargo, aunque la forma de vida predominante en la naturaleza son las comunidades microbianas, la combinación de dos o más socios en un solo recipiente de cultivo está menos establecida, y las lagunas en el conocimiento y la metodología existentes presentan desafíos. También es más difícil predecir el comportamiento de las células en una comunidad, ya que surgen interacciones emergentes e intercambio de metabolitos entre las células, lo que influye fuertemente en el destino del cocultivo^34,35. Por lo tanto, el establecimiento del cocultivo no es trivial, incluso a nivel de la definición del medio de crecimiento, la identificación de condiciones comunes de crecimiento, el intercambio entre especies de metabolitos/señales traza y la composición resultante del cocultivo a lo largo del tiempo. Los avances de los últimos años en el ensamblaje de cianobacterias fototróficas secretoras de azúcar con socios heterótrofos permiten ahora deducir las primeras reglas y metodología que pueden proporcionar una guía útil para el diseño de nuevos pares de cocultivo. Sobre la base de ese conocimiento, en la primera parte de este protocolo se proporciona una guía paso a paso para el ensamblaje de cocultivos que contienen una cianobacteria secretora de sacarosa y una o más levaduras.

Una consideración crítica cuando se intenta establecer por primera vez un cocultivo entre microbios no relacionados es la composición de un medio de crecimiento común que satisfaga todos los requisitos de nutrientes para las dos o más especies. Debido a las limitaciones de espacio, no es factible proporcionar un protocolo completamente detallado para este proceso aquí, que también puede requerir un alto grado de personalización en algunos casos, pero a continuación se describen consideraciones importantes a tener en cuenta. Un enfoque inicial sencillo consiste en comparar el medio de crecimiento típico de cianobacterias (p. ej., BG11; ver Tabla 1) con cualquier medio mínimo establecido compuesto para las especies heterótrofas de interés. La suplementación del medio cianobacteriano estándar con los componentes faltantes que están contenidos en el medio mínimo heterótrofo es un buen punto de partida para las pruebas iniciales ^8,36. Tenga en cuenta que debido a que los medios mínimos a menudo se complementan con una fuente significativa de carbono orgánico para el crecimiento heterótrofo (por ejemplo, 1%-4% de glucosa), a menudo están diseñados para soportar una densidad celular heterótrofa más alta de la que probablemente se logrará en los experimentos iniciales de cocultivo. Del mismo modo, algunos componentes comunes del medio también pueden actuar como una fuente de carbono orgánico independientemente del fotosintato proporcionado por el socio cianobacteriano (por ejemplo, citrato), lo que puede complicar el análisis posterior de los cocultivos de cianobacterias/heterótrofos. Por lo tanto, puede que no sea necesario complementar el medio cianobacteriano mínimo con la concentración total de elementos faltantes al diseñar un medio de cocultivo. Por ejemplo, muchos organismos varían en su eficiencia de uso de diferentes formas de nitrógeno ambiental (por ejemplo, N₂, nitrato, nitrito, urea) y pueden ser completamente incapaces de utilizar algunas de las fuentes de nitrógeno más oxidadas. Del mismo modo, muchos microbios pueden requerir suplementos de vitaminas esenciales (por ejemplo, vitamina_B12), cofactores o aminoácidos esenciales porque carecen de vías biosintéticas completas para la síntesis directa de estos compuestos. Por estas razones, puede ser más práctico comenzar simplemente "fusionando" el medio mínimo establecido de la pareja cianobacteriana (por ejemplo, BG11) junto con un medio mínimo bien definido del heterótrofo (por ejemplo, definido sintético [SD]). Se pueden utilizar ciclos posteriores de eliminación/reducción reiterativa de componentes superfluos para optimizar el medio y reducir la abundancia de cualquier compuesto que pueda ser inhibidor del crecimiento de uno de los socios. Un punto de partida útil es amortiguar el medio a un pH neutro o ligeramente básico, ya que estas tienden a ser condiciones favorecidas por la mayoría de las especies modelo de cianobacterias.

En este punto, a menudo es útil realizar pruebas preliminares del crecimiento del heterótrofo soportado en el nuevo medio de cocultivo cuando se suministra un exceso de sacarosa. Por supuesto, al seleccionar un heterótrofo potencial, es importante elegir uno que sea capaz de catabolizar las fuentes primarias de carbono orgánico que serán suministradas por el socio cianobacteriano. Es útil señalar aquí que la sacarosa, como el carbohidrato dominante suministrado en^{muchos cultivos} cianobacterianos/heterótrofos modificados 4, no es un carbohidrato que sea utilizado tan universalmente por los microbios heterótrofos como la glucosa: los transportadores de sacarosa dedicados deben ser codificados por las especies heterótrofas o pueden ser necesarias invertasas extracelulares para convertir la sacarosa en fructosa y glucosa que a menudo son reconocidas por los transportadores de mayor afinidad⁸. Una observación importante comúnmente reportada por múltiples laboratorios que investigan comunidades microbianas mixtas es que surgen sinergias y antagonismos de orden superior entre los socios fototróficos y heterótrofos ^4,8,13. Por ejemplo, otros metabolitos secretados naturalmente (por ejemplo, ácidos orgánicos, formas reducidas de nitrógeno) o cofactores (por ejemplo, sideróforos) pueden permitir tasas de crecimiento más altas de uno o ambos socios cuando se cultivan en el mismo medio en relación con los controles axénicos. Por el contrario, se ha informado que los subproductos metabólicos potencialmente dañinos, como la hiperoxigenación del medio por la división fotosintética del agua, causan inhibición del crecimiento entre especies para uno o ambos socios⁸. Por lo tanto, los controles axénicos pueden proporcionar un punto de referencia útil, pero el rendimiento del cocultivo puede variar de las expectativas debido a estas propiedades emergentes.

Dependiendo del socio heterótrofo y de la capacidad de S. elongatus para excretar sacarosa (en función del nivel de inducción, la concentración de IPTG utilizada), se deben ensayar diferentes proporciones de ambos organismos. El éxito de los cultivos depende principalmente de la capacidad de S. elongatus para mantener el crecimiento de la pareja heterótrofa (es decir, si puede producir suficiente fuente de carbono). Mientras que el crecimiento excesivo de la cepa heterótrofa suele estar limitado por la falta de carbono orgánico proporcionado en la composición del medio de cocultivo, las cianobacterias pueden superar al heterótrofo, lo que puede dar lugar a interacciones inhibitorias emergentes (por ejemplo, condiciones hiperóxicas ^8,13). Al intentar determinar inicialmente las proporciones apropiadas de densidad celular para la levadura cianobacteria, una buena regla aproximada es que la pareja cianobacteriana puede soportar un volumen celular igual al de las células heterótrofas que la acompañan. Dado que las levaduras eucariotas tienden a tener volúmenes celulares considerablemente mayores que las cianobacterias secretoras de sacarosa modelo, esto probablemente significa que la densidad de las células cianobacterianas será considerablemente mayor (por ejemplo, 50-100 veces para S. cerevisiae) en un estado estacionario. Por lo tanto, un buen punto de partida al establecer un nuevo cocultivo con el laboratorio específico del investigador y las condiciones de la especie sería calcular el volumen promedio de células tanto para la cianobacteria como para la levadura (basado en los valores publicados; por ejemplo, ver B10NUMB3R5³⁷) para estimar la relación volumétrica. Los matraces iniciales se pueden sembrar con esta proporción de células. Para explorar el espacio de solución, el investigador puede desear mantener constante la concentración de cianobacterias (por ejemplo, OD₇₅₀ = 0,3) mientras varía la concentración de células de levadura hacia arriba o hacia abajo en aproximadamente un orden de magnitud en incrementos basados en el rendimiento permitido por el espacio de cultivo fototrófico disponible del investigador. Por supuesto, esta "regla general" volumétrica depende de la velocidad a la que el socio fototrófico es capaz de secretar fotosintatos orgánicos (por ejemplo, sacarosa) que pueden ser utilizados por el socio heterótrofo. Una vez que se han establecido las condiciones de cocultivo, el monitoreo cuidadoso del rendimiento de crecimiento de ambos socios a lo largo del tiempo proporcionará datos valiosos sobre las proporciones ideales de especies, especialmente si los cocultivos tempranos se pueden mantener durante días o semanas, lo que permite al investigador identificar la proporción de estado estacionario alcanzada cerca del final de un cocultivo. Esta información se puede utilizar al seleccionar la densidad de inoculación inicial para cada especie asociada en experimentos posteriores para ayudar al cultivo a alcanzar más rápidamente la proporción ideal de especies autodeterminada.

En la segunda parte del protocolo, se proporcionan instrucciones detalladas para el análisis de cocultivo. Una cuantificación fiable de los cocultivos es clave para su implementación exitosa: el crecimiento (o al menos la actividad metabólica) del socio fototrópico secretor de carbono es esencial para mantener los heterótrofos. Si bien la proporción de cianobacterias:heterótrofos utilizada para inocular el cultivo puede no ser siempre crítica para optimizar, ya que los cocultivos a largo plazo tienden a converger hacia proporciones estables, puede ser importante integrar métodos para controlar el crecimiento desenfrenado de cualquiera de los socios a través de la dilución del cultivo o la encapsulación de una o más especies 36,38,39,40. Como se mencionó anteriormente, los subproductos de la pareja cianobacteriana pueden ser inhibidores del heterótrofo a altas concentraciones (por ejemplo,_O2), y algunos productos del metabolismo heterótrofo también pueden ser perjudiciales para la salud de las cianobacterias. La mayoría de los cocultivos publicados utilizan heterótrofos que tienen una tasa de crecimiento más rápida que la mayoría de las especies de cianobacterias modelo; Por lo tanto, la tasa de crecimiento heterótrofo tiende a estar limitada por el suministro de carbono orgánico producido por la cianobacteria. No obstante, la determinación de la dinámica de abundancia de las especies a lo largo del tiempo es un valor crítico para dilucidar las fallas en la estabilidad y optimizar los cocultivos robustos en el cultivo a largo plazo.

Se proporcionan protocolos para la cuantificación mediante cámaras de recuento, contadores de partículas y citometría de flujo de una sola célula. Sin embargo, todas las técnicas son herramientas valiosas para la caracterización de coculturas, con diferentes requisitos previos, ventajas y limitaciones. Las cámaras de recuento son muy ampliamente aplicables para la cuantificación del cocultivo, siempre que todos los socios del cultivo puedan distinguirse visualmente por sus formas celulares u otras propiedades. La gran ventaja es el bajo precio de este dispositivo, de modo que es básicamente alcanzable para todos los laboratorios. Además de obtener información sobre la composición del cocultivo y la proporción de los diferentes socios, se puede obtener una impresión de la morfología y la aptitud de la célula, y se pueden detectar posibles contaminantes. Sin embargo, la aplicación de la cámara de recuento también requiere mucho tiempo, conlleva una gran carga de trabajo y solo puede soportar un bajo rendimiento.

Tanto los contadores de partículas como la citometría de flujo de una sola célula proporcionan las enormes ventajas de un alto rendimiento y un manejo cómodo que ahorra tiempo. Mientras que el contador de células se basa en claras diferencias en el tamaño de las células de los socios en el cocultivo, la citometría de una sola célula también puede discriminar las etiquetas de fluorescencia, lo que resulta en la capacidad de cuantificar cocultivos con más de dos miembros del mismo tamaño o incluso dos mutantes diferentes del mismo organismo en función de diferentes marcadores fluorescentes. En el ejemplo proporcionado de un ensamblaje artificial de Synechocystis con S. cerevisiae y U. maydis, se utilizaron los reporteros de fluorescencia intracelular mKate2 y eGFP para discriminar las dos levaduras. Los mismos reporteros fluorescentes también podrían utilizarse para distinguir dos cepas modificadas genéticamente del mismo organismo (por ejemplo, S. cerevisiae) que no podrían separarse basándose únicamente en sus propiedades de dispersión de la luz. Se han implementado estrategias similares para rastrear consorcios de bacterias sintéticas⁴¹. Dependiendo del tipo de célula, el número de socios en un consorcio y su rango potencial de autofluorescencia(s), la selección de marcadores fluorescentes necesita atención adicional para evitar la superposición de cualidades espectrales, particularmente dadas las propiedades autofluorescentes de las cianobacterias. ⁴²

Abogamos aquí por cómo adherirse a los principios rectores de FAIR en términos de almacenamiento, gestión e intercambio de datos científicos. FAIR es un acrónimo que significa Findable, Accessible, Interoperable, and Reusable⁴³. A medida que estos principios ganan una mayor aceptación, prometen transformar el panorama de la investigación biológica, promoviendo un enfoque más abierto, colaborativo y eficiente para la gestión y el uso de datos. Si bien los componentes críticos de la accesibilidad pueden garantizarse depositando datos en Annotated Research Context (ARC)⁴⁴, es importante permitir la reproducción de los pasos de procesamiento de datos con software de acceso abierto. Los archivos FCS sin procesar almacenan datos y metadatos (información sobre láseres y detectores, incluidas longitudes de onda, filtros, etc.) sobre experimentos de citometría de flujo⁴⁵. Pueden cargarse y leerse fuera del software propietario que permite un análisis de datos sofisticado, por ejemplo, hay una serie de paquetes disponibles para trabajar con datos sin procesar dentro del entorno de Python. El paquete desarrollado demuestra cómo cargar, leer y visualizar archivos .fcs sin procesar que contienen datos de citometría fuera del software propietario utilizando uno de los muchos paquetes disponibles en Python²³. El uso de software abierto como el descrito anteriormente elimina la necesidad de costosas tarifas de licencia asociadas con el software propietario, proporciona un control total sobre el procesamiento de datos (por ejemplo, transformación, compensación, compuertas) y, además, permite la integración de numerosas herramientas en un solo lugar.

Un valioso beneficio adicional de utilizar la citometría de una sola célula junto con un clasificador de células es la oportunidad de recolectar también células de un tipo distinto mediante FACS. Esto puede ser extremadamente valioso para aplicar cualquier tecnología -ómica para obtener información detallada sobre la interacción de las especies dentro del cocultivo, como RNASeq o metabolómica. La clara desventaja de estos dispositivos son sus altos precios, por lo que la asequibilidad y disponibilidad de dichas máquinas puede ser una limitación aparente en algunos laboratorios.

Curiosamente, una comparación directa de los métodos presentados para la cuantificación de los tres socios en un consorcio reveló una muy buena concordancia entre las diferentes técnicas, lo que indica que la mezcla que se ha ensamblado en base a las mediciones de DO se cuantifica de manera confiable por todos los métodos descritos. Curiosamente, el número total de cianobacterias era aproximadamente 3-4 veces mayor que el número de las dos especies de levadura, un fenómeno probablemente debido a su menor tamaño celular. Esta observación está en buena consonancia con el conocimiento común de que los DO no proporcionan información sobre el número real de células sin calibración⁴⁶. Las levaduras, sin embargo, mostraron recuentos a un nivel comparable (Tabla 2 y Tabla 3). Además, la comparación con la cuantificación de los cultivos individuales demuestra que los tres métodos son herramientas fiables para discriminar los tipos de células, con la excepción del contador de partículas que no separó las dos especies de levadura.

En esencia, las aplicaciones de citometría de una sola célula son claramente la herramienta más poderosa para monitorear la composición de los cocultivos, lo que permite el recuento de 1.000-10.000 células por segundo. Esto es especialmente cierto si el número de parejas aumenta a más de dos o si las parejas son similares en forma y/o diámetro. En particular, hay muchas alternativas que permiten el seguimiento de los cocultivos. Por ejemplo, el crecimiento de microbios marcados con fluorescencia en cocultivos puede ser rastreado continuamente por fluorimetría o microbiorreactores⁴⁷. Sin embargo, a menudo se limitan a un cocultivo de dos parejas y requieren un diseño experimental cuidadoso, por ejemplo, en la elección de los marcadores de fluorescencia. La secuenciación de amplicones (secuenciación de ARNr 16S) y otras técnicas de secuenciación de próxima generación en combinación con bioinformática sofisticada es otra opción para la caracterización de comunidades sintéticas 48,49,50. Estas técnicas son adecuadas para enfoques de alto rendimiento y pueden abordar las interacciones establecidas en cultivos a largo plazo, cuestiones evolutivas o seguimiento de mutaciones con múltiples socios microbianos.

Tomados en conjunto, los cocultivos microbianos simplistas que están diseñados racionalmente proporcionan un poderoso enfoque "de abajo hacia arriba" para interrogar la dinámica entre especies que puede ser más difícil de abordar dentro de las comunidades de múltiples especies que dominan el mundo natural 51,52,53. En este documento, se proporciona un protocolo simplificado que puede ser fácilmente adaptado por la comunidad científica para el establecimiento y análisis de nuevos pares de cianobacterias y socios heterótrofos. Es evidente que se necesita mucha investigación tanto para capitalizar los posibles conocimientos fundamentales que se pueden obtener de los cocultivos microbianos artificiales como para determinar si los consorcios microbianos diseñados sintéticamente pueden igualar el potencial que a menudo se les atribuye en la literatura para aplicaciones biotecnológicas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Objetivo 10x Ph1	Carl Zeiss AG	46 04 01-9904
525/40 nm Filtro de paso de banda	Beckman Coulter, Inc.	A01-1-0051	Filtro FITC (en láser de 488 nm)
Filtro de paso de banda de 660/10 nm	Beckman Coulter, Inc.	A01-1-0055	Canal APC (en láser de 638 nm)
Filtro de paso de banda de 710/50 nm	Beckman Coulter, Inc.	B71092	PC5.5 canal (en láser de 561 nm)
Accuvettes para Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	A35473	Vasos de muestra con tapa Tubo de
apertura 30 μ M para Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	C92760	Autoclave capilar
	Lab Associates	EQM-ARBP	para la esterilización de material
Matraces con deflectores ROTILABO®, Cuello recto, 250 ml	Carl Roth GmbH + Co. KG	LY95.1
BG11 / CoYBG11 componentes	diferentes proveedores		ver Tabla 1
Filtro estéril con tapa de botella	Sigmaaldrich Z222593		a medios estériles si no desea utilizar autoclave
Capillary 45 µ m	Omni Life Science	OLS 5651738
Contador de células CASY Modelo TTC	Sistemas
Vasos CASY	Omni Life Science	OLS 5651794
CASYclean	Omni Life Science	OLS 5651786	Solución de limpieza
CASYon Omni	Life Science	OLS 5651808	Solución isotónica
Tubos de centrífuga (50 mL)	Sigmaaldrich	CLS430828
CO2	BOC	270182-L	para el suministro de cultivos y cocultivos axénicos de cianobacterias
CONTRAD® 70	Beckman Coulter, Inc.	81911	Solución de limpieza profunda
Cubreobjetos 20 × 26 x 0,4 mm	VWR International GmbH	631-1190	Cubridores para cámara de recuento
Cubetas	Sarstedt	67.742
Cianobacterias BG-11 Solución de agua dulce	Merck KGaA	C3061
CytExpert Software v. 2.6	Beckman Coulter, Inc.		software de aplicación de citómetro
CytoFLEX Sheath Fluid	Beckman Coulter, Inc.	B51503	Citómetro de fluido de karité
CytoFLEX S	Beckman Coulter, Inc.
Limpiador DxH para Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	628022	Solución de limpieza
Centrífuga de tubo Eppendorf (pequeña)	Labstac	CEN16-15	para centrifugar menos de 2 ml de cultivo
Etanol	Carl Roth GmbH + Co. KG	K928.1
Tubos FACS	Beckman Coulter, Inc.	2523749	tubos para modo semiautomático
Agente de limpieza FlowClean, 500 ml	Beckman Coulter, Inc.	C48093	Solución de limpieza diaria
Cilindros graduados	Sigmaaldrich	Z131121	para la preparación de medios
HEPPSO	Merck KGaA	R426725
Infors MultiTron fotoincubadora	Infors AG		luz LED blanca
IPTG	Merck KGaA	I6758	Prepare alícuotas, almacene a -20° C, descongelar y mantener en hielo
Isoton II para Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	8448011	Solución isotónica
Kaluza v. 2.2	Beckman Coulter, Inc.	B16406	Software de análisis de datos por citometría
KimWipes	VWR International GmbH	115-2221	Pañuelos sin pelusa
KOH	Merck KGaA	221473
KPO3	Noah Chemicals	7790-53-6
Vasos de medición	VWR	213-3747
Microplaca de ensayo, 96 pocillos, tapa deslizante, base plana, PS, transparente	SARSTEDT AG & Co. KG	82.1581.001
Base de microscopio	Carl Zeiss AG	47 09 18-9902/16
Cabezal de microscopio	Carl Zeiss AG	47 30 14
Sistema de purificación de agua Milli-Q	Merck Millipore	C85358
Mulitisizer 4e contador de partículas	Beckman Coulter, Inc.	B23005	Alternativa al contador de celdas CASY
Neubauer mejorado, profundidad 0,02 mm	Assistent Alemania		Cámara de recuento
Neubauer mejorada, profundidad 0,1 mm	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	640010	Cámara de recuento
Lista para usar Control de calidad diario Fluorosferas	Beckman Coulter, Inc.	C65719	Referencia para botellas QC
SCHOTT	Dutscher	90347	para almacenamiento
Specord® 200 Plus Espectrofotómetro	Analytic Jena GmbH		OD600/750
Sacarosa	Merck KGaA	84100
Centrífuga de sobremesa (grande)	Labstac	CEN18-06R	colector de biomasa
de cultivo Levadura Base de nitrógeno, sin aminoácidos, sin sulfato de amonio	Thermo Fisher Scientific Inc.