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Artículo de método

Identificación y cuantificación de metabolitos alterados en pacientes críticos mediante metabolómica basada en RMN

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DOI:

10.3791/67319

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29 de noviembre de 2024

 ,  ,  , 
1Centre of Biomedical Research, SGPGIMS Campus, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), 3Department of Critical Care Medicine, Sanjay Gandhi Postgraduate Institute of Medical Sciences

En este artículo

Resumen

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) se utiliza para identificar la desregulación de los metabolitos en pacientes con diversas enfermedades. Esta técnica permite la cuantificación de los metabolitos alterados, desentrañando los conocimientos fisiopatológicos. Aquí, describimos el procedimiento paso a paso del enfoque basado en RMN para la caracterización metabólica de los pacientes.

Resumen

La metabolómica está emergiendo como un enfoque importante para reflejar la respuesta del individuo a las condiciones fisiopatológicas. La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) ha evolucionado como una herramienta para identificar desregulaciones metabólicas en pacientes críticamente enfermos afectados por afecciones como el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), la pancreatitis aguda grave (SAP), la lesión renal aguda (LRA) y la sepsis. Los datos espectrales de la muestra de suero del grupo de estudio y control se registran utilizando un espectrómetro de RMN de 800 MHz y se procesan utilizando herramientas de procesamiento y análisis de RMN. Además, se realiza un riguroso análisis estadístico, como pruebas univariantes y multivariantes, para identificar metabolitos significativos, que luego se identifican y cuantifican con precisión mediante el software de cuantificación de metabolitos de RMN. Además, el análisis de las vías pone de manifiesto los ciclos bioquímicos desquiciados que dan lugar a la gravedad de la enfermedad. A través de este enfoque integral, los investigadores pretenden obtener una visión más profunda de las alteraciones metabólicas asociadas con estas enfermedades críticas, lo que podría allanar el camino para una mejor comprensión de la enfermedad y mejores estrategias de diagnóstico y tratamiento.

Introducción

A pesar de los continuos esfuerzos para proporcionar un diagnóstico eficiente de enfermedades en todo el mundo, la terapia dirigida aún no ha alcanzado su verdadero potencial. Diversos abordajes, como la transcriptómica, la proteómica, etc., han permitido identificar varios biomarcadores, pero estos no han tenido suficiente utilidad clínica debido a la falta de sensibilidad y especificidad 1,2. La terapia dirigida es un gran desafío en algunas enfermedades multifactoriales, lo que eventualmente conduce a una mayor mortalidad. Es necesario comprender mejor el mecanismo subyacente y la fisiopatología de las enfermedades complejas que existen con una amplia heterogeneidad. Por lo tanto, en este sentido, la evolución de la metabolómica ha revolucionado el desarrollo terapéutico, que eventualmente puede ayudar a adaptar los regímenes de tratamiento para diversas enfermedades críticas, como el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), la sepsis y la pancreatitis aguda grave (PAS).

La metabolómica es un enfoque integral destinado a identificar y cuantificar moléculas de peso molecular pequeño (metabolitos como aminoácidos, lípidos, péptidos, ácidos orgánicos y vitaminas) en varios biofluidos, células o extractos de tejidos. Estos metabolitos, que suelen pesar menos de 1500 Da, desempeñan un papel activo en los procesos bioquímicos, reflejando un esquema progresivo del estado biológico del organismo. Incluyen sustratos para procesos enzimáticos clave, intermediarios en vías biológicas y subproductos del metabolismo celular. En consecuencia, la metabolómica captura una huella digital detallada de las influencias dietéticas, las interacciones farmacológicas y los estados de enfermedad. Los cambios en los metabolitos son indicadores altamente sensibles del metabolismo y de las vías biológicas, lo que permite correlaciones con las expresiones fenotípicas y las anomalías fisiopatológicas resultantes 3,4. Las variaciones iniciales en los metabolitos pueden servir como indicadores tempranos de la gravedad de la enfermedad, mientras que los cambios temporales pueden ayudar a monitorear la eficacia del tratamiento, la progresión de la enfermedad y los resultados clínicos 5,6,7. Por lo tanto, la metabolómica mejora los ensayos clínicos y otros enfoques ómicos al redefinir las enfermedades a través de criterios de valoración clínicos, fisiológicos y bioquímicos 8,9,10,11,12,13. Las capacidades analíticas de la metabolómica se emplean para monitorear y determinar la susceptibilidad a la enfermedad a través de concentraciones alteradas de metabolitos14,15.

En este contexto, tanto la espectrometría de masas (MS) como la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) se han convertido en las principales plataformas analíticas para el perfil de metabolitos en muestras biológicas. Estos métodos se utilizan para la identificación y cuantificación de metabolitos tanto dirigidos como no dirigidos 16,17,18. Cada plataforma tiene sus ventajas y limitaciones, pero la naturaleza no destructiva de la RMN la hace preferible en diversos estudios in vivo y para la caracterización de la estructura de compuestos desconocidos, particularmente en las etapas iniciales de la investigación metabolómica. El fraccionamiento, la derivatización y la ionización de la muestra necesarios antes de la EM pueden introducir sesgos y, a menudo, provocar la pérdida de la muestra, lo que afecta a las características dinámicas que la espectroscopia de RMN puede capturar con una preparación mínima o nula de la muestra. La principal limitación de la RMN es su menor sensibilidad en comparación con la EM, que ofrece un límite inferior de detección, lo que dificulta la detección de metabolitos menos abundantes19. Sin embargo, avances como los imanes superconductores de alta resolución, las sondas de RMN enfriadas criogénicamente y las técnicas que mejoran la sensibilidad han mitigado esta limitación 20,21,22. Como enfoque complementario a la genómica y la proteómica, el perfil metabólico mediante espectroscopia de RMN está ganando adeptos como técnica preferida 23,24,25. La mínima preparación de muestras, reproducibilidad y repetibilidad de la RMN la convierten en una herramienta valiosa para capturar las características dinámicas inherentes de los metabolitos a pesar de sus desafíos de sensibilidad26.

Varios grupos de investigación han realizado metabolómica con éxito, identificando el perfil metabólico desregulado de los pacientes con diversas enfermedades27 como el SDRA 28,29,30,31,32,33, la neumonía 34, la sepsis7, los cálculos biliares35 y la pancreatitis36. Los estudios metabolómicos basados en RMN en pacientes críticamente enfermos han sido fundamentales para rastrear la progresión del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) al síndrome de disfunción orgánica múltiple (MODS), que es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en la unidad de cuidados intensivos (UCI)37. En un estudio de Stringer et al., se utilizaron muestras de plasma para examinar las alteraciones metabólicas en pacientes con lesión pulmonar aguda (LIA) inducida por sepsis en comparación con pacientes control38. Los metabolitos clave encontrados elevados en este estudio piloto reflejaron las vías metabólicas involucradas y su asociación con las puntuaciones clínicas. Esta investigación se extendió a la metabolómica sérica para diferenciar la sepsis de las primeras etapas de los mecanismos de lesión pulmonar en el SDRA32. Además, otro estudio en ARDS identificó potentes biomarcadores séricos que diferencian claramente entre la lesión pulmonar aguda/SDRA y los controles sanos, ofreciendo información sobre los cambios metabólicos sistémicos correspondientes al inicio agudo de la lesión pulmonar39,40.

La espectroscopia de RMN es una técnica analítica automatizada y de alto rendimiento que proporciona información sólida e imparcial sobre la huella metabólica, revelando la fisiopatología subyacente38. La aplicación clínica y la interpretación biológica de los datos de RMN dependen de la obtención de espectros de alta calidad que contengan información valiosa. Por lo tanto, es crucial garantizar la recopilación, el procesamiento y el análisis de datos precisos, uniformes y bien formulados. Por lo tanto, el objetivo de este estudio es aprovechar los pasos esenciales de la metabolómica basada en RMN para la identificación y cuantificación de metabolitos. Este estudio destaca los pasos clave del protocolo requerido para el estudio de la metabolómica clínica (Figura 1), como la selección de las muestras adecuadas, la recolección y el almacenamiento, el procesamiento y la preparación de las muestras, la adquisición y el análisis de datos, la identificación y cuantificación del metabolito de interés y, finalmente, la interpretación de los resultados en un contexto clínico para obtener información relevante. Cada uno de estos pasos es esencial para aprovechar la espectroscopia de RMN en metabolómica para descubrir conocimientos biológicos y clínicos significativos.

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Protocolo

La aprobación ética (código IEC: 2022-71-PhD-126) se obtuvo del IEC del Instituto de Postgrado de Ciencias Médicas Sanjay Gandhi (SGPGIMS), Lucknow. Se obtuvieron los consentimientos escritos e informados de los pacientes o sus familiares para realizar el estudio y publicar los datos con fines de investigación. Además, la investigación se llevó a cabo siguiendo los lineamientos institucionales.

1. Diseño del estudio y autorización ética

  1. Determine el tamaño de la muestra para cada grupo. Revisar cuidadosamente y establecer los criterios de selección de los participantes. Además, si el diseño del estudio requiere la inclusión de muestras humanas o animales, obtenga la autorización ética del comité de ética institucional (IEC) correspondiente antes de comenzar la recolección de muestras.
  2. Seleccionar pacientes con SDRA categorizados como leves, moderados y graves, según los criterios diagnósticos de la definición de Berlín 2012 basada en la presión parcial de oxígeno en la sangre arterial (PaO2) a la relación entre la fracción de oxígeno inspirado (FiO2) (P/F). Los pacientes con SDRA con un rango de P/F de 300-200 se consideran leves, los de 200-100 como moderados y por debajo de 100 como graves38. En este caso, nos hemos centrado en dos grupos: pacientes con SDRA leve y moderado (ver Tabla 1).
    NOTA: El estudio implica el uso de suero obtenido de muestras de sangre para realizar metabolómica basada en RMN. En este estudio, los participantes incluidos como referencia tenían una edad media de 42 años (± 10,9 años), con una distribución por sexo de 2 hombres y 6 mujeres.

CategoríaRelación P/F
Leve300-200
Moderado200-100
Muy fuerte100-0

Tabla 1: Categorización de los pacientes con SDRA.

2. Selección, recolección y procesamiento de muestras

  1. Realice el aislamiento del suero siguiendo los pasos que se describen a continuación.
    1. Para experimentar, recoja 2 ml de muestras de sangre de las arterias utilizando una aguja estéril en un vial simple (sin aditivos) y estéril. Deje que la muestra se coagule durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para este estudio, se seleccionaron 4 pacientes diagnosticados con SDRA leve y 4 pacientes con SDRA moderado.
    2. Centrifugar la muestra a 3100 x g durante 15 min para separar el suero25. Transfiera el suero a tubos de microcentrífuga estériles, haciendo alícuotas de menor volumen (es decir, 400-500 μL), etiquételos adecuadamente (nombre del paciente, número de RC, punto de día, etc.) y guárdelos a -80 °C para análisis futuros.
      NOTA: En este punto, el experimento se puede pausar y reanudar en un momento conveniente.
  2. Procese la muestra de suero antes de los experimentos de RMN siguiendo los siguientes pasos.
    1. Descongele la muestra antes de realizar los experimentos de RMN. Mezclar 250 μL de alícuota del suero con 250 μL de solución tampón de fosfato salino (que contiene 100%D2O, 0,9% NaCl, 50 mM tampón fosfato sódico, pH 7,4) para minimizar la variación del pH.
    2. Agite la mezcla durante unos segundos (~15 s) para asegurarse de que se mezcle homogéneamente. Finalmente, transfiera la muestra preparada a un tubo de RMN limpio con un inserto coaxial que contenga propionato de trimetilsilil (TSP) a una concentración de 0,05 mM, que sirve como patrón externo para la calibración y cuantificación41.
      NOTA: Como referencia, se utiliza un compuesto inerte y no reactivo que no interactúa con los analitos. Otros compuestos de referencia comúnmente utilizados incluyen tetrametilsilano (TMS) y trimetilsililpropanosulfonato de sodio (DSS).

3. Experimentación con RMN

NOTA: La atención se centra en la identificación de moléculas pequeñas en las muestras de suero, por lo tanto, utilizamos la secuencia de pulso Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG), que suprime las señales de las macromoléculas. Todas las muestras de suero de este estudio se registraron utilizando un espectrómetro de RMN de 800 MHz equipado con un cabezal de sonda inversa de banda ancha TCI de 5 mm de triple resonancia refrigerado criogénicamente y un gradiente z blindado.

  1. Coloque la muestra en el imán. Escriba el comando wrpa (mencione el número de experimento) y presione enter para configurar un experimento de protones con el programa de pulso cpmg. Mencione el nombre del paciente y otros detalles necesarios haciendo clic en la opción Título.
  2. Bloquee el campo magnético escribiendo el comando Bloquear , presione enter y seleccione la opción 90% H2O y 10% D2O más. Ajuste y adapte la sonda manualmente por ATMM para optimizar la eficiencia de los pulsos de radiofrecuencia y maximizar la sensibilidad. Realice calzas degradadas 1D haciendo clic en topshim.
  3. Establezca los siguientes parámetros de adquisición, incluido un retardo de relajación de 5 s, un ancho de barrido espectral de 12 partes por millón (ppm) y un tiempo de eco de 300 μs. Todos estos parámetros se pueden modificar fácilmente seleccionando la opción Parámetros de adquisición en el panel superior.
  4. Aplique un ensanchamiento de línea de 0,3 Hz mediante una función de ventana exponencial, recopilando datos en 64.000 puntos a lo largo de 128 escaneos. Estos parámetros se pueden modificar de manera similar seleccionando la opción Parámetros de adquisición en el panel superior. Al hacer clic en Parámetros de adquisición, aparecerá una lista de especificaciones y los atributos mencionados, junto con otros parámetros, se pueden modificar durante la optimización.
  5. Adquiera los espectros de RMN utilizando herramientas de procesamiento y análisis de RMN. Una vez obtenidos los espectros finales, escriba el comando apk y absn y presione enter para realizar la corrección de fase y la corrección de línea base, respectivamente. Haga clic en la opción Calibrar eje presente en el panel superior y luego calibre el pico TSP a 0 ppm de forma automática o manual.
  6. Transfiera los datos adquiridos del sistema a la estación de trabajo, donde se realizan los procesamientos y análisis posteriores.
    NOTA: La fase experimental ya se ha completado y se puede pausar. El preprocesamiento, el análisis y la interpretación de datos se pueden realizar cómodamente.

4. Preprocesamiento de datos

  1. Llevar a cabo el preprocesamiento de datos utilizando herramientas de procesamiento y análisis de RMN y software de cuantificación de metabolitos de RMN.
    1. A veces, solo la corrección automática no es suficiente, y en ese caso, también es necesaria la corrección manual. Para realizar la corrección de fase manualmente, haga clic en la opción Procesar en la barra de menú superior de las herramientas de procesamiento y análisis de RMN. A continuación, haga clic en Ajustar fase, arrastre el ratón y observe hasta que los espectros se corrijan de fase. Una vez hecho esto, haga clic en la opción Guardar y volver (presente en forma de icono) disponible en la misma barra de menú.
    2. Para realizar la corrección manual de la línea de base (método de Whittaker), abra el archivo espectral en el módulo del procesador del software de cuantificación de metabolitos de RMN. Seleccione la opción Corrección de línea base. A continuación, seleccione la opción Método Whittaker. Ahora coloque los puntos en la base de los picos en todo el espectro (de 0,0 a 10 ppm, generalmente en el caso del suero o según la disponibilidad del metabolito en los espectros) para ajustar la base. Una vez que se haya corregido la línea de base de todos los archivos espectrales, guárdelos en una sola carpeta. El procesamiento posterior, ya sea utilizando el procesador o el módulo de perfil del software de cuantificación de metabolitos de RMN, se puede realizar utilizando el mismo archivo guardado en el formato específico.
    3. Realice la agrupación utilizando el módulo de generación de perfiles del mismo software. Seleccione la opción Herramientas, luego Proceso por lotes y, a continuación, Agrupación espectral.
  2. Para generar la hoja de agrupación final que se utilizará para el análisis estadístico, seleccione la carpeta que contiene todos los archivos espectrales corregidos de línea base después de hacer clic en Agrupación espectral.
  3. Divida los espectros en un número determinado de bins de igual tamaño con un ancho espectral definido, que oscila entre 0,01 y 0,04 ppm (se puede optimizar según el estudio). Este proceso simplifica y organiza los datos espectrales, lo que facilita un análisis más coherente. Especifique el tamaño del cubo junto con los valores de ppm inicial y final, y designe la carpeta en la que se guardarán las hojas de discretización de salida.
  4. Excluir las regiones de desplazamiento químico correspondientes al agua y al disolvente TSP (4,8-5,2 y 0,0-0,7 ppm) para evitar interferencias espectrales 42,43,44.
  5. Esta hoja de cálculo contiene los nombres de las muestras en una fila y los diferentes valores de bin junto con ppm en las otras filas. Antes de utilizar esta hoja para el análisis estadístico, modifíquela organizando las muestras en grupos para el análisis y guardándola solo en formato delimitado por comas (CSV).
    NOTA: Por ejemplo, al comparar el grupo leve con el grupo moderado de pacientes con SDRA, organizamos los datos con etiquetas leves y moderadas, agregamos un número de serie y guardamos el archivo en formato CSV.

5. Análisis estadístico

NOTA: La hoja de agrupación obtenida del paso anterior sirve como archivo de entrada para el análisis estadístico. En este estudio se utilizó el módulo de análisis estadístico (un factor) del software de análisis estadístico metabolómico.

  1. Antes del análisis estadístico, realice el paso de normalización utilizando suma, registro y Pareto, pero puede variar entre los diferentes estudios45.
  2. Realizar análisis univariados y multivariados para distinguir los diferentes grupos y determinar la precisión de los metabolitos identificados.
    1. Realice el análisis de componentes principales (PCA), el análisis discriminante parcial por mínimos cuadrados (PLS-DA) y el análisis discriminante ortogonal parcial por mínimos cuadrados (OPLS-DA) para observar la discriminación entre los grupos, lo que produce puntuaciones de importancia variable de proyección (VIP) para cada metabolito responsable de la diferencia en el perfil metabólico.
    2. Realizar métodos univariantes, como la prueba t de Student y el ANOVA, para identificar los metabolitos significativos en función del criterio de tener un valor p inferior a 0,05. Ambas pruebas producen diagramas de bigotes de caja que muestran la diferencia en la concentración relativa de los metabolitos.
    3. Realice un análisis de biomarcadores, que arroja un gráfico de área bajo la curva de características operativas del receptor (AUROC). El valor de AUC (área bajo la curva) > 0,8 se considera significativo46.
    4. Seleccione la lista final de metabolitos significativos utilizando el criterio VIP score>1, p-value corregido de Bonferroni<0.0544 y AUC > 0.846.
  3. Identifique los metabolitos como se describe a continuación.
    1. La agrupación proporciona metabolitos significativos en forma de valores de ppm en lugar de nombres. Identificar los metabolitos correspondientes a valores específicos de ppm utilizando bases de datos como el Banco de Resonancia Magnética Biológica (BMRB)47y la Base de Datos de Metaboloma Humano (HMDB).
    2. Aparte de estos, utilice la literatura publicada previamente42,44 para la identificación y validación.
    3. Utilice el módulo de perfil del software de cuantificación de metabolitos de RMN para confirmar los metabolitos identificados con sus valores de ppm.

6. Cuantificación de metabolitos mediante software de cuantificación de metabolitos por RMN

NOTA: El módulo de perfilado del software se utiliza ampliamente para cuantificar los metabolitos identificados.

  1. Antes de comenzar la cuantificación, calibrar el compuesto de referencia seleccionado para el estudio (tsp utilizado en este estudio) utilizando el módulo del procesador. Haga clic en la opción Calibrar CSI (indicador de forma química). Mencione la concentración del compuesto de referencia (0,05 mM para este estudio). A continuación, arrastre el pico del software al pico de referencia espectral y ajuste su altura y anchura correctamente. Una vez que los picos de referencia espectral coincidan con el pico del software, haga clic en Aceptar.
  2. Abra los espectros deseados en el módulo de perfilado y seleccione la biblioteca de compuestos adecuada para el estudio.
  3. En la parte inferior de la pantalla, se muestra una lista de metabolitos. Seleccione el metabolito de interés de esta lista. Una vez seleccionado, las posibles ppm del metabolito elegido aparecerán en la esquina superior de los espectros.
  4. Seleccione el valor de ppm en la esquina superior y amplíe los espectros a la escala específica de ppm del metabolito.
  5. En este punto, aparecerán dos picos en la pantalla: uno que representa los datos registrados y el otro, que se muestra como una línea de puntos, que representa el pico del software. Alinea ambos picos. Arrastre el pico del software y ajuste su altura y posición para que coincida con el pico presente en la muestra.
  6. Una vez alineados correctamente, la concentración del metabolito puede obtenerse a partir del valor que se muestra en el epígrafe concentración en mM para ese metabolito (Figura 1).
  7. Siga el mismo procedimiento para todos los metabolitos y muestras y exporte los valores cuantificados en una hoja de cálculo. Para generar el archivo de salida, haga clic en la opción Operaciones por lotes en el menú Herramientas . Especifique la carpeta deseada para guardar el archivo de salida.

7. Análisis de la vía

NOTA: Los metabolitos significativos identificados después del análisis se utilizan para determinar las principales vías que influyen directamente en el resultado en los grupos de enfermedades. El módulo de análisis de vías del software de análisis estadístico metabolómico y la base de datos KEGG se emplean generalmente para este propósito.

  1. Introduzca la lista obtenida de metabolitos significativos en el módulo. Se genera una lista que contiene los nombres de las rutas.
  2. Seleccione las vías finales en función de un criterio de tener un factor de impacto superior a 0,1. Los valores de impacto significativos indican vías relacionadas con la enfermedad30.
  3. Analice a fondo las vías resultantes para dilucidar la desregulación asociada con la gravedad de la enfermedad. Uno de los deméritos de este método es su ineficiencia para identificar las vías desreguladas cuando los metabolitos significativos son inferiores a 3.
  4. Para hacer frente a la misma, el metabolito identificado y su correlación con la gravedad de la enfermedad también se puede determinar utilizando la literatura previamente publicada. Realice un estudio exhaustivo de la literatura y observe si el metabolito identificado también sigue la misma tendencia según su interés.

figure-protocol-1
Figura 1: Pasos fundamentales en la metabolómica basada en RMN. La figura presenta los pasos clave en la metabolómica basada en RMN: recolección y preparación de muestras, realización de espectroscopia de RMN, preprocesamiento de datos, realización de análisis estadísticos, identificación y cuantificación de metabolitos e interpretación de la importancia biológica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Resultados

Para llevar a cabo un estudio de metabolómica, es fundamental determinar el tamaño de la muestra y los grupos específicos que se van a analizar. La selección de un tamaño de muestra adecuado es esencial para obtener resultados significativos que se correlacionen con precisión con la gravedad de la enfermedad48. Sin embargo, en este trabajo en particular, utilizamos un tamaño de muestra pequeño para demostrar los pasos involucrados en la identificación y cuantificación de metabolitos utilizando met...

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Discusión

La metabolómica identifica y cuantifica eficientemente los metabolitos, centrándose en los ciclos metabólicos que se alteran durante la enfermedad. La calidad de los resultados depende de la ejecución meticulosa de cada paso en el enfoque metabolómico. Cada etapa, desde la selección y recolección de muestras hasta la identificación de la vía, es fundamental para identificar con precisión los factores primarios que contribuyen a la enfermedad. Antes de realizar la metabolómica, es esencia...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún interés financiero contrapuesto.

Agradecimientos

AS agradece a la Academia de Investigación Científica e Innovadora (AcSIR) por el registro (Nº de registro 10BB22A71002). AS también reconoce a la Organización de Investigación y Desarrollo de Defensa (DRDO) por la beca. Agradecemos al Centro de Investigación Biomédica (CBMR) por proporcionar la instalación de espectrómetro de RMN de 800 MHz y la financiación a través del proyecto intramuros (CBMR/IMR/0008/2021). También agradecemos al Departamento de Medicina de Cuidados Críticos (CCM), SGPGIMS, por su apoyo constante. Agradecemos la ayuda de muchas enfermeras, así como, lo que es más importante, los pacientes inscritos en este estudio. Este estudio fue financiado por el proyecto intramuros (CBMR/IMR/0008/2021) del Centro de Investigación Biomédica (CBMR) y por el proyecto extramuros (No. LSRB/01/15001/LSRB-404/PEE&BS/2023) de la Organización de Investigación y Desarrollo de Defensa (DRDO).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CentirfugeSigma aldrich3-18KS
Chenomx NMR suite Suite de resonancia magnética, v9, Chenomx Inc., Edmonton, CanadáSoftware de cuantificación de metabolitos de RMN
Inserto coaxialSigma aldrichZ278513
Óxido de DeuterimSigma aldrich 151882
EppendorfTarsons500020
MetaboanalistaGrupoSoftware de análisis estadístico de metabolómica
Tubo de RMNWilmadZ4120075 mm de diámetro
Pipeta Eppendorf research plus31230000390-100 μ l
Viales de recogida de muestrasViales de enfriamiento criogénico Tarsons523194
Azida de sodioSigma aldrichS2002
Cristal de cloruro de sodioSigma aldrichS9625
Fosfato de sodio dibásicoSigma aldrich567550
Fosfato de sodio monobásicoSigma aldrichS0751
Topspin 3.6.4Herramienta de procesamiento y análisis de RMNBruker
Tsp saltSigma aldrich269913
Tubos de de Investigación Wishart

Referencias

  1. Rubenfeld, G. D. Confronting the frustrations of negative clinical trials in acute respiratory distress syndrome. Ann. Am. Thorac. Soc. 12 (Supplement 1), S58-S63 (2015).
  2. Ware, L. B., et al. Prognostic and pathogenetic value of combining clinical and biochemical indices in patients with acute lung injury. Chest. 137 (2), 288-296 (2010).
  3. Johnson, C. H., Julijana, I., Gary, S. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (7), 451-459 (2016).
  4. Patti, G. J., Oscar, Y., Gary, S. Metabolomics: the apogee of the omics trilogy. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (4), 263-269 (2012).
  5. Nicholson, J. K., John, C. L. Metabonomics. Nature. 455 (7216), 1054-1056 (2008).
  6. Schnackenberg, L. K., Beger, R. D. Monitoring the health to disease continuum with global metabolic profiling and systems biology. Pharmacogenomics. 7 (7), 1077-1086 (2006).
  7. Pandey, S., Siddiqui, M. A., Azim, A., Sinha, N. Metabolic fingerprint of patients showing responsiveness to treatment of septic shock in intensive care unit. Magn Reson Mater Phys Biol Med. 36 (4), 659-669 (2023).
  8. Mamas, M., Dunn, W. B., Neyses, L., Goodacre, R. The role of metabolites and metabolomics in clinically applicable biomarkers of disease. Arch. Toxicol. 85, 5-17 (2011).
  9. Dunn, W. B., Broadhurst, D. I., Atherton, H. J., Goodacre, R., Griffin, J. L. Systems level studies of mammalian metabolomes: the roles of mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Chem Soc Rev. 40 (1), 387-426 (2011).
  10. Dettmer, K., Bruce, D. H. Metabolomics--a new exciting field within the" omics" sciences. Environ Health Perspect. 112 (7), A396-A397 (2004).
  11. Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data. Trends Biotechnol. 22 (5), 245-252 (2004).
  12. Lindon, J. C., Nicholson, J. K., Holmes, E., Everett, J. R. Metabonomics: metabolic processes studied by NMR spectroscopy of biofluids. Concepts Magn Reson Educ J. 12 (5), 289-320 (2000).
  13. Bernini, P., et al. Individual human phenotypes in metabolic space and time. J Proteome Res. 8 (9), 4264-4271 (2009).
  14. Nicholson, J. K., et al. Metabolic phenotyping in clinical and surgical environments. Nature. 491 (7424), 384-392 (2012).
  15. Vinayavekhin, N., Homan, E. A., Saghatelian, A. Exploring disease through metabolomics. ACS Chem Biol. 5 (1), 91-103 (2010).
  16. Dunn, W. B., Ellis, D. I. Metabolomics: current analytical platforms and methodologies. TrAC Trends Anal Chem. 24 (4), 285-294 (2005).
  17. Dunn, W. B., Bailey, N. J. C., Johnson, H. E. Measuring the metabolome: current analytical technologies. Analyst. 130 (5), 606-625 (2005).
  18. Bingol, K. Recent advances in targeted and untargeted metabolomics by NMR and MS/NMR methods. High-throughput. 7 (2), 9(2018).
  19. Emwas, A. H. M. The strengths and weaknesses of NMR spectroscopy and mass spectrometry with particular focus on metabolomics research. Methods Mol Biol. 1277, 161-193 (2015).
  20. Markley, J. L., et al. The future of NMR-based metabolomics. Curr Opin Biotechnol. 43, 34-40 (2017).
  21. Marchand, J., Martineau, E., Guitton, Y., Dervilly-Pinel, G., Giraudeau, P. Multidimensional NMR approaches towards highly resolved, sensitive and high-throughput quantitative metabolomics. Curr Opin Biotechnol. 43, 49-55 (2017).
  22. Eghbalnia, H. R., et al. Increasing rigor in NMR-based metabolomics through validated and open source tools. Curr Opin Biotechnol. 43, 56-61 (2017).
  23. Vignoli, A., et al. High-throughput metabolomics by 1D NMR. Angew Chem Int Ed. 58 (4), 968-994 (2019).
  24. Sundekilde, U. K., Eggers, N., Bertram, H. C. NMR-based metabolomics of food. Methods Mol Biol. 2037, 335-344 (2019).
  25. Garcia-Perez, I., et al. Identifying unknown metabolites using NMR-based metabolic profiling techniques. Nat Protoc. , 1-30 (2020).
  26. Dona, A. C., et al. A guide to the identification of metabolites in NMR-based metabonomics/metabolomics experiments. Comput Struct Biotechnol J. 14, 135-153 (2016).
  27. Siddiqui, M. A., Pandey, S., Azim, A., Sinha, N., Siddiqui, M. H. Metabolomics: an emerging potential approach to decipher critical illnesses. Biophys Chem. 267, 106462(2020).
  28. McNicholas, B. A., et al. Impact of early acute kidney injury on management and outcome in patients with acute respiratory distress syndrome: a secondary analysis of a multicenter observational study. Crit. Care Med. 47 (9), 1216-1225 (2019).
  29. Ambruso, S. L., et al. Inter-organ communication in homeostasis and disease: Lung metabolomics after ischemic acute kidney injury reveals increased oxidative stress, altered energy production, and ATP depletion. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 321 (1), L50(2021).
  30. Viswan, A., et al. Metabolomics based predictive biomarker model of ARDS: A systemic measure of clinical hypoxemia. PloS One. 12 (11), e0187545(2017).
  31. Metwaly, S. M., Brent, W. W. Systems biology ARDS research with a focus on metabolomics. Metabolites. 10 (5), 207(2020).
  32. Stringer, K. A., et al. Metabolic consequences of sepsis-induced acute lung injury revealed by plasma 1H-nuclear magnetic resonance quantitative metabolomics and computational analysis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 300 (1), L4-L11 (2011).
  33. Singh, A., Siddiqui, M. A., Pandey, S., Azim, A., Sinha, N. Unveiling Pathophysiological Insights: Serum Metabolic Dysregulation in Acute Respiratory Distress Syndrome Patients with Acute Kidney Injury. J Proteome Res. 23 (10), 4216-4228 (2024).
  34. Slupsky, C. M. NMR-based analysis of metabolites in urine provides rapid diagnosis and etiology of pneumonia. Biomark Med. 4 (2), 195-197 (2010).
  35. Siddiqui, M. A., et al. NMR spectroscopy-based analysis of gallstones of cancerous and benign gallbladders from different geographical regions of the Indian subcontinent. Plos One. 18 (6), e0286979(2023).
  36. Li, J., et al. 1HNMR-based metabolomic profile of rats with experimental acute pancreatitis. BMC Gastroenterol. 14, 1-7 (2014).
  37. Mao, H., et al. Systemic metabolic changes of traumatic critically ill patients revealed by an NMR-based metabonomic approach. J Proteome Res. 8 (12), 5423-5430 (2009).
  38. Stringer, K. A., Jones, A. E., Puskatich, M. A., Karnovsky, A., Serkova, N. J. 1H-nuclear magnetic resonance (NMR)-detected lipids associated with apoptosis differentiate early acute respiratory distress syndrome (ARDS) from sepsis. C63. LUNG INJURY AND REPAIR: TWO TO TANGO. Am J Resp Crit Care Med. 189, A5000(2014).
  39. Viswan, A., Singh, C., Kayastha, A. M., Azim, A., Sinha, N. An NMR based panorama of the heterogeneous biology of acute respiratory distress syndrome (ARDS) from the standpoint of metabolic biomarkers. NMR Biomed. 33 (2), e4192(2020).
  40. Singh, C., et al. Metabolic profiling of human lung injury by 1 H high-resolution nuclear magnetic resonance spectroscopy of blood serum. Metabolomics. 11, 166-174 (2015).
  41. Pandey, S., Siddiqui, M. A., Trigun, S. K., Azim, A., Sinha, N. Gender-specific association of oxidative stress and immune response in septic shock mortality using NMR-based metabolomics. Mol Omics. 18 (2), 143-153 (2022).
  42. Nagana, G. A., Gowda, Y. N., Raftery, D. Expanding the limits of human blood metabolite quantitation using NMR spectroscopy. Anal Chem. 87 (1), 706-715 (2015).
  43. Gowda, G. A. N., Raftery, D. Quantitating metabolites in protein precipitated serum using NMR spectroscopy. Anal Chem. 86 (11), 5433-5440 (2014).
  44. Gowda, G. A. N., Raftery, D. NMR-based metabolomics. Adv Exp Med Biol. 1280, 19-37 (2021).
  45. Xia, J., Psychogios, N., Young, N., Wishart, D. S. MetaboAnalyst: a web server for metabolomic data analysis and interpretation. Nucleic Acids Res. 37 (suppl_2), W652-W660 (2009).
  46. orbacıoğlu, ŞK., Aksel, G. Receiver operating characteristic curve analysis in diagnostic accuracy studies: A guide to interpreting the area under the curve value. Turk J Emerg Med. 23 (4), 195(2023).
  47. Ulrich, E. L., et al. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36 (suppl_1), D402-D408 (2007).
  48. Nyamundanda, G., Gormley, I. C., Fan, Y., Gallagher, W. M., Brennan, L. MetSizeR: selecting the optimal sample size for metabolomic studies using an analysis based approach. BMC bioinformatics. 14, 1-8 (2013).
  49. Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat Protoc. 2 (11), 2692(2007).
  50. Dona, A. C., et al. Precision high-throughput proton NMR spectroscopy of human urine, serum, and plasma for large-scale metabolic phenotyping. Anal Chem. 86 (19), 9887-9894 (2014).
  51. Ala-Korpela, M. Potential role of body fluid 1H NMR metabonomics as a prognostic and diagnostic tool. Expert Rev Mol Diagn. 7 (6), 761-773 (2007).
  52. Takeda, I., et al. Understanding the human salivary metabolome. NMR Biomed. 22 (6), 577-584 (2009).
  53. Callejon-Leblic, B. em, García-Barrera, T., Pereira-Vega, A., Gómez-Ariza, J. L. Metabolomic study of serum, urine and bronchoalveolar lavage fluid based on gas chromatography mass spectrometry to delve into the pathology of lung cancer. J Pharm Biomed Anal. 163, 122-129 (2019).
  54. Van Oort, P. M. P., et al. Exhaled breath metabolomics for the diagnosis of pneumonia in intubated and mechanically-ventilated intensive care unit (ICU)-patients. Int J Mol Sci. 18 (2), 449(2017).
  55. Serkova, N. J., Niemann, C. U. Pattern recognition and biomarker validation using quantitative 1H-NMR-based metabolomics. Expert Rev Mol Diagn. 6 (5), 717-731 (2006).
  56. Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times. Rev Sci Instrum. 29 (8), 688-691 (1958).
  57. Xi, Y., Rocke, D. M. Baseline correction for NMR spectroscopic metabolomics data analysis. BMC bioinformatics. 9, 1-10 (2008).

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