Identificación y cuantificación de metabolitos alterados en pacientes críticos mediante metabolómica basada en RMN

Summary

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) se utiliza para identificar la desregulación de los metabolitos en pacientes con diversas enfermedades. Esta técnica permite la cuantificación de los metabolitos alterados, desentrañando los conocimientos fisiopatológicos. Aquí, describimos el procedimiento paso a paso del enfoque basado en RMN para la caracterización metabólica de los pacientes.

Abstract

La metabolómica está emergiendo como un enfoque importante para reflejar la respuesta del individuo a las condiciones fisiopatológicas. La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) ha evolucionado como una herramienta para identificar desregulaciones metabólicas en pacientes críticamente enfermos afectados por afecciones como el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), la pancreatitis aguda grave (SAP), la lesión renal aguda (LRA) y la sepsis. Los datos espectrales de la muestra de suero del grupo de estudio y control se registran utilizando un espectrómetro de RMN de 800 MHz y se procesan utilizando herramientas de procesamiento y análisis de RMN. Además, se realiza un riguroso análisis estadístico, como pruebas univariantes y multivariantes, para identificar metabolitos significativos, que luego se identifican y cuantifican con precisión mediante el software de cuantificación de metabolitos de RMN. Además, el análisis de las vías pone de manifiesto los ciclos bioquímicos desquiciados que dan lugar a la gravedad de la enfermedad. A través de este enfoque integral, los investigadores pretenden obtener una visión más profunda de las alteraciones metabólicas asociadas con estas enfermedades críticas, lo que podría allanar el camino para una mejor comprensión de la enfermedad y mejores estrategias de diagnóstico y tratamiento.

Introduction

A pesar de los continuos esfuerzos para proporcionar un diagnóstico eficiente de enfermedades en todo el mundo, la terapia dirigida aún no ha alcanzado su verdadero potencial. Diversos abordajes, como la transcriptómica, la proteómica, etc., han permitido identificar varios biomarcadores, pero estos no han tenido suficiente utilidad clínica debido a la falta de sensibilidad y especificidad ^1,2. La terapia dirigida es un gran desafío en algunas enfermedades multifactoriales, lo que eventualmente conduce a una mayor mortalidad. Es necesario comprender mejor el mecanismo subyacente y la fisiopatología de las enfermedades complejas que existen con una amplia heterogeneidad. Por lo tanto, en este sentido, la evolución de la metabolómica ha revolucionado el desarrollo terapéutico, que eventualmente puede ayudar a adaptar los regímenes de tratamiento para diversas enfermedades críticas, como el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), la sepsis y la pancreatitis aguda grave (PAS).

La metabolómica es un enfoque integral destinado a identificar y cuantificar moléculas de peso molecular pequeño (metabolitos como aminoácidos, lípidos, péptidos, ácidos orgánicos y vitaminas) en varios biofluidos, células o extractos de tejidos. Estos metabolitos, que suelen pesar menos de 1500 Da, desempeñan un papel activo en los procesos bioquímicos, reflejando un esquema progresivo del estado biológico del organismo. Incluyen sustratos para procesos enzimáticos clave, intermediarios en vías biológicas y subproductos del metabolismo celular. En consecuencia, la metabolómica captura una huella digital detallada de las influencias dietéticas, las interacciones farmacológicas y los estados de enfermedad. Los cambios en los metabolitos son indicadores altamente sensibles del metabolismo y de las vías biológicas, lo que permite correlaciones con las expresiones fenotípicas y las anomalías fisiopatológicas resultantes ^3,4. Las variaciones iniciales en los metabolitos pueden servir como indicadores tempranos de la gravedad de la enfermedad, mientras que los cambios temporales pueden ayudar a monitorear la eficacia del tratamiento, la progresión de la enfermedad y los resultados clínicos ^5,6,7. Por lo tanto, la metabolómica mejora los ensayos clínicos y otros enfoques ómicos al redefinir las enfermedades a través de criterios de valoración clínicos, fisiológicos y bioquímicos 8,9,10,11,12,13. Las capacidades analíticas de la metabolómica se emplean para monitorear y determinar la susceptibilidad a la enfermedad a través de concentraciones alteradas de metabolitos^14,15.

En este contexto, tanto la espectrometría de masas (MS) como la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) se han convertido en las principales plataformas analíticas para el perfil de metabolitos en muestras biológicas. Estos métodos se utilizan para la identificación y cuantificación de metabolitos tanto dirigidos como no dirigidos 16,17,18. Cada plataforma tiene sus ventajas y limitaciones, pero la naturaleza no destructiva de la RMN la hace preferible en diversos estudios in vivo y para la caracterización de la estructura de compuestos desconocidos, particularmente en las etapas iniciales de la investigación metabolómica. El fraccionamiento, la derivatización y la ionización de la muestra necesarios antes de la EM pueden introducir sesgos y, a menudo, provocar la pérdida de la muestra, lo que afecta a las características dinámicas que la espectroscopia de RMN puede capturar con una preparación mínima o nula de la muestra. La principal limitación de la RMN es su menor sensibilidad en comparación con la EM, que ofrece un límite inferior de detección, lo que dificulta la detección de metabolitos menos abundantes¹⁹. Sin embargo, avances como los imanes superconductores de alta resolución, las sondas de RMN enfriadas criogénicamente y las técnicas que mejoran la sensibilidad han mitigado esta limitación 20,21,22. Como enfoque complementario a la genómica y la proteómica, el perfil metabólico mediante espectroscopia de RMN está ganando adeptos como técnica preferida 23,24,25. La mínima preparación de muestras, reproducibilidad y repetibilidad de la RMN la convierten en una herramienta valiosa para capturar las características dinámicas inherentes de los metabolitos a pesar de sus desafíos de sensibilidad²⁶.

Varios grupos de investigación han realizado metabolómica con éxito, identificando el perfil metabólico desregulado de los pacientes con diversas enfermedades²⁷ como el SDRA 28,29,30,31,32,33, la neumonía ³⁴, la sepsis⁷, los cálculos biliares³⁵ y la pancreatitis³⁶. Los estudios metabolómicos basados en RMN en pacientes críticamente enfermos han sido fundamentales para rastrear la progresión del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) al síndrome de disfunción orgánica múltiple (MODS), que es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en la unidad de cuidados intensivos (UCI)³⁷. En un estudio de Stringer et al., se utilizaron muestras de plasma para examinar las alteraciones metabólicas en pacientes con lesión pulmonar aguda (LIA) inducida por sepsis en comparación con pacientes control³⁸. Los metabolitos clave encontrados elevados en este estudio piloto reflejaron las vías metabólicas involucradas y su asociación con las puntuaciones clínicas. Esta investigación se extendió a la metabolómica sérica para diferenciar la sepsis de las primeras etapas de los mecanismos de lesión pulmonar en el SDRA³². Además, otro estudio en ARDS identificó potentes biomarcadores séricos que diferencian claramente entre la lesión pulmonar aguda/SDRA y los controles sanos, ofreciendo información sobre los cambios metabólicos sistémicos correspondientes al inicio agudo de la lesión pulmonar^39,40.

La espectroscopia de RMN es una técnica analítica automatizada y de alto rendimiento que proporciona información sólida e imparcial sobre la huella metabólica, revelando la fisiopatología subyacente³⁸. La aplicación clínica y la interpretación biológica de los datos de RMN dependen de la obtención de espectros de alta calidad que contengan información valiosa. Por lo tanto, es crucial garantizar la recopilación, el procesamiento y el análisis de datos precisos, uniformes y bien formulados. Por lo tanto, el objetivo de este estudio es aprovechar los pasos esenciales de la metabolómica basada en RMN para la identificación y cuantificación de metabolitos. Este estudio destaca los pasos clave del protocolo requerido para el estudio de la metabolómica clínica (Figura 1), como la selección de las muestras adecuadas, la recolección y el almacenamiento, el procesamiento y la preparación de las muestras, la adquisición y el análisis de datos, la identificación y cuantificación del metabolito de interés y, finalmente, la interpretación de los resultados en un contexto clínico para obtener información relevante. Cada uno de estos pasos es esencial para aprovechar la espectroscopia de RMN en metabolómica para descubrir conocimientos biológicos y clínicos significativos.

Protocol

La aprobación ética (código IEC: 2022-71-PhD-126) se obtuvo del IEC del Instituto de Postgrado de Ciencias Médicas Sanjay Gandhi (SGPGIMS), Lucknow. Se obtuvieron los consentimientos escritos e informados de los pacientes o sus familiares para realizar el estudio y publicar los datos con fines de investigación. Además, la investigación se llevó a cabo siguiendo los lineamientos institucionales.

1. Diseño del estudio y autorización ética

1. Determine el tamaño de la muestra para cada grupo. Revisar cuidadosamente y establecer los criterios de selección de los participantes. Además, si el diseño del estudio requiere la inclusión de muestras humanas o animales, obtenga la autorización ética del comité de ética institucional (IEC) correspondiente antes de comenzar la recolección de muestras.
2. Seleccionar pacientes con SDRA categorizados como leves, moderados y graves, según los criterios diagnósticos de la definición de Berlín 2012 basada en la presión parcial de oxígeno en la sangre arterial (PaO2) a la relación entre la fracción de oxígeno inspirado (FiO2) (P/F). Los pacientes con SDRA con un rango de P/F de 300-200 se consideran leves, los de 200-100 como moderados y por debajo de 100 como graves³⁸. En este caso, nos hemos centrado en dos grupos: pacientes con SDRA leve y moderado (ver Tabla 1).
   NOTA: El estudio implica el uso de suero obtenido de muestras de sangre para realizar metabolómica basada en RMN. En este estudio, los participantes incluidos como referencia tenían una edad media de 42 años (± 10,9 años), con una distribución por sexo de 2 hombres y 6 mujeres.

Categoría	Relación P/F
Leve	300-200
Moderado	200-100
Muy fuerte	100-0

Tabla 1: Categorización de los pacientes con SDRA.

2. Selección, recolección y procesamiento de muestras

1. Realice el aislamiento del suero siguiendo los pasos que se describen a continuación.
   1. Para experimentar, recoja 2 ml de muestras de sangre de las arterias utilizando una aguja estéril en un vial simple (sin aditivos) y estéril. Deje que la muestra se coagule durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para este estudio, se seleccionaron 4 pacientes diagnosticados con SDRA leve y 4 pacientes con SDRA moderado.
   2. Centrifugar la muestra a 3100 x g durante 15 min para separar el suero²⁵. Transfiera el suero a tubos de microcentrífuga estériles, haciendo alícuotas de menor volumen (es decir, 400-500 μL), etiquételos adecuadamente (nombre del paciente, número de RC, punto de día, etc.) y guárdelos a -80 °C para análisis futuros.
      NOTA: En este punto, el experimento se puede pausar y reanudar en un momento conveniente.
2. Procese la muestra de suero antes de los experimentos de RMN siguiendo los siguientes pasos.
   1. Descongele la muestra antes de realizar los experimentos de RMN. Mezclar 250 μL de alícuota del suero con 250 μL de solución tampón de fosfato salino (que contiene 100%_D2O, 0,9% NaCl, 50 mM tampón fosfato sódico, pH 7,4) para minimizar la variación del pH.
   2. Agite la mezcla durante unos segundos (~15 s) para asegurarse de que se mezcle homogéneamente. Finalmente, transfiera la muestra preparada a un tubo de RMN limpio con un inserto coaxial que contenga propionato de trimetilsilil (TSP) a una concentración de 0,05 mM, que sirve como patrón externo para la calibración y cuantificación⁴¹.
      NOTA: Como referencia, se utiliza un compuesto inerte y no reactivo que no interactúa con los analitos. Otros compuestos de referencia comúnmente utilizados incluyen tetrametilsilano (TMS) y trimetilsililpropanosulfonato de sodio (DSS).

3. Experimentación con RMN

NOTA: La atención se centra en la identificación de moléculas pequeñas en las muestras de suero, por lo tanto, utilizamos la secuencia de pulso Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG), que suprime las señales de las macromoléculas. Todas las muestras de suero de este estudio se registraron utilizando un espectrómetro de RMN de 800 MHz equipado con un cabezal de sonda inversa de banda ancha TCI de 5 mm de triple resonancia refrigerado criogénicamente y un gradiente z blindado.

1. Coloque la muestra en el imán. Escriba el comando wrpa (mencione el número de experimento) y presione enter para configurar un experimento de protones con el programa de pulso cpmg. Mencione el nombre del paciente y otros detalles necesarios haciendo clic en la opción Título.
2. Bloquee el campo magnético escribiendo el comando Bloquear , presione enter y seleccione la opción 90% H₂O y 10% D₂O más. Ajuste y adapte la sonda manualmente por ATMM para optimizar la eficiencia de los pulsos de radiofrecuencia y maximizar la sensibilidad. Realice calzas degradadas 1D haciendo clic en topshim.
3. Establezca los siguientes parámetros de adquisición, incluido un retardo de relajación de 5 s, un ancho de barrido espectral de 12 partes por millón (ppm) y un tiempo de eco de 300 μs. Todos estos parámetros se pueden modificar fácilmente seleccionando la opción Parámetros de adquisición en el panel superior.
4. Aplique un ensanchamiento de línea de 0,3 Hz mediante una función de ventana exponencial, recopilando datos en 64.000 puntos a lo largo de 128 escaneos. Estos parámetros se pueden modificar de manera similar seleccionando la opción Parámetros de adquisición en el panel superior. Al hacer clic en Parámetros de adquisición, aparecerá una lista de especificaciones y los atributos mencionados, junto con otros parámetros, se pueden modificar durante la optimización.
5. Adquiera los espectros de RMN utilizando herramientas de procesamiento y análisis de RMN. Una vez obtenidos los espectros finales, escriba el comando apk y absn y presione enter para realizar la corrección de fase y la corrección de línea base, respectivamente. Haga clic en la opción Calibrar eje presente en el panel superior y luego calibre el pico TSP a 0 ppm de forma automática o manual.
6. Transfiera los datos adquiridos del sistema a la estación de trabajo, donde se realizan los procesamientos y análisis posteriores.
   NOTA: La fase experimental ya se ha completado y se puede pausar. El preprocesamiento, el análisis y la interpretación de datos se pueden realizar cómodamente.

4. Preprocesamiento de datos

1. Llevar a cabo el preprocesamiento de datos utilizando herramientas de procesamiento y análisis de RMN y software de cuantificación de metabolitos de RMN.
   1. A veces, solo la corrección automática no es suficiente, y en ese caso, también es necesaria la corrección manual. Para realizar la corrección de fase manualmente, haga clic en la opción Procesar en la barra de menú superior de las herramientas de procesamiento y análisis de RMN. A continuación, haga clic en Ajustar fase, arrastre el ratón y observe hasta que los espectros se corrijan de fase. Una vez hecho esto, haga clic en la opción Guardar y volver (presente en forma de icono) disponible en la misma barra de menú.
   2. Para realizar la corrección manual de la línea de base (método de Whittaker), abra el archivo espectral en el módulo del procesador del software de cuantificación de metabolitos de RMN. Seleccione la opción Corrección de línea base. A continuación, seleccione la opción Método Whittaker. Ahora coloque los puntos en la base de los picos en todo el espectro (de 0,0 a 10 ppm, generalmente en el caso del suero o según la disponibilidad del metabolito en los espectros) para ajustar la base. Una vez que se haya corregido la línea de base de todos los archivos espectrales, guárdelos en una sola carpeta. El procesamiento posterior, ya sea utilizando el procesador o el módulo de perfil del software de cuantificación de metabolitos de RMN, se puede realizar utilizando el mismo archivo guardado en el formato específico.
   3. Realice la agrupación utilizando el módulo de generación de perfiles del mismo software. Seleccione la opción Herramientas, luego Proceso por lotes y, a continuación, Agrupación espectral.
2. Para generar la hoja de agrupación final que se utilizará para el análisis estadístico, seleccione la carpeta que contiene todos los archivos espectrales corregidos de línea base después de hacer clic en Agrupación espectral.
3. Divida los espectros en un número determinado de bins de igual tamaño con un ancho espectral definido, que oscila entre 0,01 y 0,04 ppm (se puede optimizar según el estudio). Este proceso simplifica y organiza los datos espectrales, lo que facilita un análisis más coherente. Especifique el tamaño del cubo junto con los valores de ppm inicial y final, y designe la carpeta en la que se guardarán las hojas de discretización de salida.
4. Excluir las regiones de desplazamiento químico correspondientes al agua y al disolvente TSP (4,8-5,2 y 0,0-0,7 ppm) para evitar interferencias espectrales 42,43,44.
5. Esta hoja de cálculo contiene los nombres de las muestras en una fila y los diferentes valores de bin junto con ppm en las otras filas. Antes de utilizar esta hoja para el análisis estadístico, modifíquela organizando las muestras en grupos para el análisis y guardándola solo en formato delimitado por comas (CSV).
   NOTA: Por ejemplo, al comparar el grupo leve con el grupo moderado de pacientes con SDRA, organizamos los datos con etiquetas leves y moderadas, agregamos un número de serie y guardamos el archivo en formato CSV.

5. Análisis estadístico

NOTA: La hoja de agrupación obtenida del paso anterior sirve como archivo de entrada para el análisis estadístico. En este estudio se utilizó el módulo de análisis estadístico (un factor) del software de análisis estadístico metabolómico.

1. Antes del análisis estadístico, realice el paso de normalización utilizando suma, registro y Pareto, pero puede variar entre los diferentes estudios⁴⁵.
2. Realizar análisis univariados y multivariados para distinguir los diferentes grupos y determinar la precisión de los metabolitos identificados.
   1. Realice el análisis de componentes principales (PCA), el análisis discriminante parcial por mínimos cuadrados (PLS-DA) y el análisis discriminante ortogonal parcial por mínimos cuadrados (OPLS-DA) para observar la discriminación entre los grupos, lo que produce puntuaciones de importancia variable de proyección (VIP) para cada metabolito responsable de la diferencia en el perfil metabólico.
   2. Realizar métodos univariantes, como la prueba t de Student y el ANOVA, para identificar los metabolitos significativos en función del criterio de tener un valor p inferior a 0,05. Ambas pruebas producen diagramas de bigotes de caja que muestran la diferencia en la concentración relativa de los metabolitos.
   3. Realice un análisis de biomarcadores, que arroja un gráfico de área bajo la curva de características operativas del receptor (AUROC). El valor de AUC (área bajo la curva) > 0,8 se considera significativo⁴⁶.
   4. Seleccione la lista final de metabolitos significativos utilizando el criterio VIP score>1, p-value corregido de Bonferroni<0.05⁴⁴ y AUC > 0.8⁴⁶.
3. Identifique los metabolitos como se describe a continuación.
   1. La agrupación proporciona metabolitos significativos en forma de valores de ppm en lugar de nombres. Identificar los metabolitos correspondientes a valores específicos de ppm utilizando bases de datos como el Banco de Resonancia Magnética Biológica (BMRB)⁴⁷y la Base de Datos de Metaboloma Humano (HMDB).
   2. Aparte de estos, utilice la literatura publicada previamente^42,44 para la identificación y validación.
   3. Utilice el módulo de perfil del software de cuantificación de metabolitos de RMN para confirmar los metabolitos identificados con sus valores de ppm.

6. Cuantificación de metabolitos mediante software de cuantificación de metabolitos por RMN

NOTA: El módulo de perfilado del software se utiliza ampliamente para cuantificar los metabolitos identificados.

1. Antes de comenzar la cuantificación, calibrar el compuesto de referencia seleccionado para el estudio (tsp utilizado en este estudio) utilizando el módulo del procesador. Haga clic en la opción Calibrar CSI (indicador de forma química). Mencione la concentración del compuesto de referencia (0,05 mM para este estudio). A continuación, arrastre el pico del software al pico de referencia espectral y ajuste su altura y anchura correctamente. Una vez que los picos de referencia espectral coincidan con el pico del software, haga clic en Aceptar.
2. Abra los espectros deseados en el módulo de perfilado y seleccione la biblioteca de compuestos adecuada para el estudio.
3. En la parte inferior de la pantalla, se muestra una lista de metabolitos. Seleccione el metabolito de interés de esta lista. Una vez seleccionado, las posibles ppm del metabolito elegido aparecerán en la esquina superior de los espectros.
4. Seleccione el valor de ppm en la esquina superior y amplíe los espectros a la escala específica de ppm del metabolito.
5. En este punto, aparecerán dos picos en la pantalla: uno que representa los datos registrados y el otro, que se muestra como una línea de puntos, que representa el pico del software. Alinea ambos picos. Arrastre el pico del software y ajuste su altura y posición para que coincida con el pico presente en la muestra.
6. Una vez alineados correctamente, la concentración del metabolito puede obtenerse a partir del valor que se muestra en el epígrafe concentración en mM para ese metabolito (Figura 1).
7. Siga el mismo procedimiento para todos los metabolitos y muestras y exporte los valores cuantificados en una hoja de cálculo. Para generar el archivo de salida, haga clic en la opción Operaciones por lotes en el menú Herramientas . Especifique la carpeta deseada para guardar el archivo de salida.

7. Análisis de la vía

NOTA: Los metabolitos significativos identificados después del análisis se utilizan para determinar las principales vías que influyen directamente en el resultado en los grupos de enfermedades. El módulo de análisis de vías del software de análisis estadístico metabolómico y la base de datos KEGG se emplean generalmente para este propósito.

1. Introduzca la lista obtenida de metabolitos significativos en el módulo. Se genera una lista que contiene los nombres de las rutas.
2. Seleccione las vías finales en función de un criterio de tener un factor de impacto superior a 0,1. Los valores de impacto significativos indican vías relacionadas con la enfermedad³⁰.
3. Analice a fondo las vías resultantes para dilucidar la desregulación asociada con la gravedad de la enfermedad. Uno de los deméritos de este método es su ineficiencia para identificar las vías desreguladas cuando los metabolitos significativos son inferiores a 3.
4. Para hacer frente a la misma, el metabolito identificado y su correlación con la gravedad de la enfermedad también se puede determinar utilizando la literatura previamente publicada. Realice un estudio exhaustivo de la literatura y observe si el metabolito identificado también sigue la misma tendencia según su interés.

Figura 1: Pasos fundamentales en la metabolómica basada en RMN. La figura presenta los pasos clave en la metabolómica basada en RMN: recolección y preparación de muestras, realización de espectroscopia de RMN, preprocesamiento de datos, realización de análisis estadísticos, identificación y cuantificación de metabolitos e interpretación de la importancia biológica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Results

Para llevar a cabo un estudio de metabolómica, es fundamental determinar el tamaño de la muestra y los grupos específicos que se van a analizar. La selección de un tamaño de muestra adecuado es esencial para obtener resultados significativos que se correlacionen con precisión con la gravedad de la enfermedad⁴⁸. Sin embargo, en este trabajo en particular, utilizamos un tamaño de muestra pequeño para demostrar los pasos involucrados en la identificación y cuantificación de metabolitos utilizando metabolómica basada en RMN, que estaba destinada principalmente como referencia. En este estudio, examinamos las diferencias metabólicas entre los pacientes en las etapas leve y moderada del SDRA en el día 1 de su ingreso en la UCI, incluyendo un total de 8 sujetos. Siguiendo el protocolo, se adquirieron y procesaron los espectros de RMN de todas las muestras y, finalmente, se creó una hoja de cálculo con los resultados del binning.

A continuación, se realizó un riguroso análisis estadístico, donde se utilizaron las hojas de agrupación como archivos de entrada, normalizando los datos mediante suma, registro y Pareto. Se realizó PCA (Figura 2A) y OPLS-DA (Figura 2B), donde el primero mostró agrupamiento, pero el segundo reveló una clara discriminación entre los grupos y resaltó las diferencias metabólicas. El análisis estadístico de la prueba de permutación (20x) arrojó valores de R2Y=0.99 y Q2=0.47. Posteriormente, realizamos una prueba t de student (Figura 2C) y un análisis de biomarcadores (Figura 2D) para identificar metabolitos desregulados. Siguiendo los criterios descritos en el apartado de protocolo, filtramos los resultados a los metabolitos significativos (Tabla 2).

Figura 2: Análisis multivariado y univariado. (A) Análisis de componentes principales (PCA) y (B) Análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS-DA) de pacientes con SDRA leve (representado por color rojo) y pacientes con SDRA moderado (representado por color verde). (C) Los diagramas de caja y bigotes resaltan las diferencias en la concentración relativa de metabolitos entre los pacientes con SDRA leve y moderado detectados por espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protones en muestras de suero. El eje x representa los grupos de estudio, y el eje y muestra la concentración relativa cuando se compararon los pacientes con SDRA leve (representados por color rojo) y los pacientes con SDRA moderado (representados por color verde) el día 1 de ingreso en la UCI. (D) El diagrama de área bajo la curva (AUC) de metabolitos significativos que predicen la gravedad obtenido después de realizar un análisis de biomarcadores comparando pacientes con SDRA leve y moderado el día 1 de ingreso en la UCI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

S.No.	Nombre	Ubicación espectral (ppm)	Valor p	VIP	Valor de AUC
1	Lactato	1.34	0.04	1.99	1
2	Isoleucina	1.42	0.03	2.01	0.875

Tabla 2: Listado de metabolitos significativos obtenidos tras comparar pacientes con SDRA leve y moderado en el día 1 de ingreso en UCI.

Dado que los resultados se obtuvieron en valores de ppm, se asignaron los metabolitos utilizando la literatura previa y se validaron a través del perfilador. Después de la asignación, se obtuvieron lactato e isoleucina como metabolitos significativos, que también han sido reportados en algunos estudios previos sobre el SDRA^30,40. Nos aseguramos de la selección de picos bien resueltos y no superpuestos. Después de la identificación, filtramos la lista de los metabolitos significativos utilizando los criterios mencionados en el protocolo. A continuación, cuantificamos los metabolitos de interés utilizando el módulo de perfilado abriendo los espectros, buscando el metabolito de interés y ajustando el pico del software al pico obtenido en los espectros. Esto proporcionó los valores cuantificados de los metabolitos en mM. Se generó una hoja de cálculo que contenía los nombres de las muestras, los nombres de los metabolitos y las concentraciones como referencia. Después de la cuantificación con el software, se puede realizar la validación a través de otros enfoques, como la proteómica.

Además, los metabolitos identificados se analizan a fondo para determinar su correlación con la gravedad de la enfermedad y para identificar las vías bioquímicas en las que estos metabolitos están activamente involucrados. Dado que solo se identificaron dos metabolitos significativos después de utilizar los criterios mencionados en la sección de material y método, no fue posible el análisis de la vía utilizando el software. Por lo tanto, se realizó una revisión exhaustiva de la literatura para resaltar los ciclos metabólicos desquiciados. Los dos metabolitos identificados en este estudio se correlacionaron con éxito con la gravedad del SDRA. El aumento del lactato denotó inflamación pulmonar y respiración anaeróbica, mientras que el aumento de la isoleucina indicó catabolismo proteico asociado con lesión pulmonar, infección y metabolismo energético⁴⁰. La comprensión de estas vías metabólicas tiene un doble propósito. En primer lugar, revela la complejidad de la enfermedad, proporcionando información sobre sus mecanismos biológicos. En segundo lugar, ayuda a los avances terapéuticos al guiar a los médicos en la adaptación de los tratamientos para los pacientes, mejorando en última instancia los resultados clínicos.

Discussion

La metabolómica identifica y cuantifica eficientemente los metabolitos, centrándose en los ciclos metabólicos que se alteran durante la enfermedad. La calidad de los resultados depende de la ejecución meticulosa de cada paso en el enfoque metabolómico. Cada etapa, desde la selección y recolección de muestras hasta la identificación de la vía, es fundamental para identificar con precisión los factores primarios que contribuyen a la enfermedad. Antes de realizar la metabolómica, es esencial una revisión exhaustiva de la literatura y se debe prestar especial atención en cada etapa.

Al diseñar un estudio metabolómico, la selección de una muestra es crucial para extraer información significativa y garantizar una preparación ideal de la muestra, ya sea para la identificación metabólica dirigida o no dirigida de la condición clínica en consideración. El procesamiento inicial adecuado de la muestra es crucial, y los protocolos deben seguirse de manera consistente para todas las muestras a lo largo del estudio⁴⁹. Es necesario tener especial cuidado cuando se trabaja con muestras clínicas. Las muestras comúnmente utilizadas para la metabolómica basada en RMN incluyen biofluidos, extractos de células y extractos de tejidos^50,51. El líquido cefalorraquídeo (LCR) y la orina a menudo requieren un tratamiento previo mínimo y se estudian con frecuencia en contextos como dolencias relacionadas con los riñones, enfermedades neurodegenerativas y toxicidad de medicamentos. La sangre entera, el plasma y el suero proporcionan información completa para un amplio espectro de enfermedades críticas y se prefieren debido a la facilidad de recolección. Una amplia gama de otros biofluidos, como el líquido seminal, la saliva, la bilis, el líquido de diálisis, el líquido amniótico, el condensado del aliento exhalado, los aspirados pulmonares, el líquido sinovial y el líquido de lavado mini broncoalveolar (mBALF), se han utilizado ampliamente por su especificidad y precisión utilizando RMN 52,53,54. Cada biofluido presenta sus ventajas y desafíos en cuanto a recolección, disponibilidad y contenido informativo, dependiendo del estudio o diseño experimental⁵⁵. Para este estudio, nos hemos centrado en muestras de suero de pacientes con SDRA, ya que las muestras de sangre suelen ofrecer información a nivel de todo el cuerpo y no se ven significativamente influenciadas por las variaciones diarias extremas. Por otro lado, las muestras de orina están sujetas a diversas fluctuaciones y pueden verse afectadas por la dieta, el estilo de vida, los medicamentos y los factores ambientales²⁷. El almacenamiento adecuado de la muestra también es importante para evitar la actividad enzimática o la degradación microbiana. Por lo general, las muestras se criopreservan a -80 °C con ciclos mínimos de congelación y descongelación para evitar la descomposición metabólica y mantener la estabilidad de la muestra. La muestra puede almacenarse a -80 °C durante períodos prolongados, lo que permite realizar cómodamente la experimentación con RMN. Sin embargo, es aconsejable planificar y realizar el experimento lo antes posible para obtener resultados óptimos.

En este estudio, empleamos un espectrómetro de RMN de 800 MHz para la adquisición de datos, que proporciona datos espectrales de alta resolución. Para este experimento, nos adherimos a los mismos parámetros de adquisición mencionados anteriormente. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los mismos parámetros de adquisición descritos en este protocolo se pueden aplicar utilizando espectrómetros de RMN que operan a otras intensidades de campo magnético. El número de escaneos se puede aumentar cuando se opera a un campo magnético más bajo para mejorar la resolución. Si bien las intensidades de campo más altas pueden ofrecer una resolución mejorada, los aspectos centrales del proceso de adquisición, como las secuencias de pulsos, los retrasos de relajación y el control de la temperatura, permanecen consistentes en los diferentes instrumentos, lo que garantiza la reproducibilidad y confiabilidad de los resultados.

Seguir un procedimiento estandarizado es esencial para mantener la reproducibilidad y la imparcialidad, ya que las desviaciones pueden dificultar el análisis y la evaluación posteriores de los datos. Cada paso de la experimentación de RMN debe realizarse meticulosamente, ya que la calidad de los espectros depende de ellos. Se debe prestar especial atención a la calza, ya que define la forma del pico, y los parámetros de adquisición deben optimizarse de acuerdo con la muestra y el diseño del estudio. En el caso de muestras con baja concentración metabólica en la muestra, se puede aumentar el número de exploraciones. La adquisición de datos en RMN implica la optimización estándar de experimentos 1D y 2D adaptados a la elección de la muestra y a la información específica requerida. Se han optimizado varios experimentos de RMN para obtener espectros de alta calidad a partir de biofluidos, minimizando el impacto de macromoléculas no deseadas. La secuencia de pulso CPMG⁵⁶ es la preferida para muestras como suero, plasma o líquido cefalorraquídeo. Esta técnica suprime las señales amplias de macromoléculas como lípidos y proteínas, que tienen largos tiempos de relajación transversal y pueden oscurecer las resonancias de los metabolitos de bajo peso molecular.

El preprocesamiento de datos abarca los métodos intermedios utilizados para garantizar un análisis de datos uniforme y homogéneo y su interpretación. Este proceso incluye evitar señales indeseables o regiones espectrales propensas a inconsistencias y corregir los cambios de pico. En los biofluidos, excluir regiones no deseadas a menudo significa eliminar señales, como las del agua, que dominan el rango de 4,6 ppm a 5 ppm. Los cambios máximos, causados por variaciones en el pH, la temperatura, la concentración de sal, los factores de dilución y la composición iónica, se pueden minimizar mediante el uso de tampones a un pH homeostático. Además, el uso de compuestos de referencia estándar, la alineación de picos y la agrupación pueden ayudar a reducir los cambios de picos. La alineación de picos es crucial para correlacionar patrones a través de diferentes espectros adquiridos en condiciones idénticas.

El procesamiento de espectros debe realizarse correctamente para garantizar una agrupación precisa más adelante en el análisis. Todos los espectros deben calibrarse y alinearse uniformemente, y las correcciones de base y fase se pueden realizar de forma manual o automática. La corrección adecuada de la fase y la base, así como la calibración, son fundamentales. Realizar la corrección de la línea de base es esencial para evitar distorsiones que puedan afectar la identificación y cuantificación de los metabolitos⁵⁷. La corrección de fase es necesaria para garantizar que no haya picos distorsionados o invertidos que puedan afectar a la interpretación de los resultados. Decida cuidadosamente los criterios para seleccionar los metabolitos significativos y filtre los resultados en consecuencia. Dado que el agrupamiento proporciona resultados en forma de valores de ppm, identifique con precisión el nombre del metabolito utilizando varias fuentes mencionadas en el protocolo. Si hay varios metabolitos presentes en los mismos valores de ppm, identifíquelos a través de la forma del pico.

Antes de realizar el análisis estadístico, se realiza la normalización para reducir las variaciones en el conjunto de datos, ya sean inducidas o no, debido a diferencias en la magnitud y fluctuaciones en las concentraciones de metabolitos. Este proceso implica varios métodos de centrado, escalado y transformación, elegidos en función de la distribución y variabilidad de los datos. El objetivo es minimizar los sesgos sistemáticos no deseados al tiempo que se preservan los factores biológicos de interés. Se utilizan métodos multivariantes, incluidos PCA, PLS-DA y OPLS-DA, para establecer metabolitos diferenciales con valores de VIP mayores que 1. La previsibilidad del modelo y la validación cruzada se determinan utilizando los valores R2 (bondad de ajuste) y Q2 (bondad de predicción), mientras que las estadísticas de prueba de permutación validan el modelo. Un mapa de calor basado en la correlación de Pearson evalúa la robustez del modelo mediante la enumeración de los metabolitos regulados al alza y a la baja en los subfenotipos y los endotipos resultantes.

Se utilizan métodos univariados, como la prueba t de Student y el ANOVA, como la corrección de Bonferroni o la minimización de FDR (tasa de falsos descubrimientos) y Benjamini-Hochberg, para reducir la probabilidad de falsos positivos. Estos métodos proporcionan una medida aproximada de las características potencialmente importantes, independientemente de su correlación dentro o entre las moléculas y otros factores de confusión. Los metabolitos significativos se identifican a partir de un valor p inferior a 0,05, que luego se utilizan para corroborar los endotipos metabólicos en los subgrupos de resultados⁴⁵.

Se emplean diagramas de bigotes de caja individuales y AUROC para evaluar la especificidad y sensibilidad de los endotipos en los subgrupos de resultados. La puntuación clínica se combina con el modelo en AUROC para validar la precisión del modelo. El valor de AUC > 0,8 se considera significativo⁴⁶. Hay otras pruebas disponibles en línea para probar la precisión de la discriminación y la eficacia de los metabolitos identificados. Algunos de ellos son la clasificación aleatoria de bosques, mapa de calor, correlación, ^etc.45.

Se utilizan varios enfoques para cuantificar metabolitos significativos, incluida la integración máxima, que puede ser un desafío para los principiantes debido a su naturaleza avanzada. Identifique los picos característicos de los metabolitos refiriéndose a los cambios químicos individuales para una identificación precisa. Determine el área de estos picos característicos en relación con el área del pico de referencia, TSP. Para calcular la concentración absoluta de un metabolito (Cm), utilice la siguiente ecuación:

Cm = Im.nr.Cr/Ir.nm

Donde Cr es la concentración del compuesto de referencia (TSP) en la solución, Im e Ir son las áreas de pico integradas (que se pueden obtener utilizando la herramienta de procesamiento y análisis de RMN) del metabolito y de referencia (TSP), respectivamente, y nm y nr son el número de protones que representan el metabolito y los picos de referencia, respectivamente²⁴.

Alternativamente, se utiliza el software automatizado de cuantificación de metabolitos por RMN para obtener concentraciones de metabolitos para espectros únicos o múltiples basados en la concentración del estándar de referencia, TSP. La cuantificación mediante software simplifica el proceso y reduce la probabilidad de errores en comparación con otros métodos. Si bien este trabajo de investigación destaca el uso de software para la cuantificación de metabolitos, puede haber problemas si el metabolito de interés no está presente en la biblioteca de software. Además, el software es de pago, por lo que solo los investigadores con una licencia autorizada pueden utilizarlo.

La metabolómica ha demostrado ser fundamental para desentrañar las complejidades de diversas enfermedades mediante la identificación de ciclos metabólicos desregulados que contribuyen a la gravedad de la enfermedad. Sin embargo, trasladar estos hallazgos a la práctica clínica ha sido un reto. La comunidad médica ahora está enfatizando un enfoque de medicina personalizada para mejorar los resultados de la enfermedad. Si bien la identificación de metabolitos desregulados anteriormente era suficiente, los esfuerzos actuales se centran en la cuantificación precisa para definir rangos específicos de la enfermedad. Esta información es muy valiosa para los médicos a la hora de personalizar las estrategias de tratamiento. Los avances en las técnicas de cuantificación han facilitado los esfuerzos de investigación, con numerosos grupos de investigación en todo el mundo que emplean con éxito estos enfoques utilizando software especializado.

Este progreso subraya el potencial de la metabolómica para tener un impacto significativo en la medicina personalizada y mejorar los resultados clínicos. Además, la integración de los datos metabolómicos con otros datos ómicos, como la genómica y la proteómica, promete proporcionar una comprensión más completa de los mecanismos de la enfermedad y perfeccionar aún más las intervenciones terapéuticas. A medida que la tecnología continúa evolucionando, se espera que la precisión y la utilidad de la metabolómica en entornos clínicos aumenten, allanando el camino para soluciones de atención médica más efectivas y personalizadas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centirfuge	Sigma aldrich	3-18KS
Chenomx NMR suite	Suite de resonancia magnética, v9, Chenomx Inc., Edmonton, Canadá		Software de cuantificación de metabolitos de RMN
Inserto coaxial	Sigma aldrich	Z278513
Óxido de Deuterim	Sigma aldrich 151882
Eppendorf	Tarsons	500020
Metaboanalista	Grupo		Software de análisis estadístico de metabolómica
Tubo de RMN	Wilmad	Z412007	5 mm de diámetro
Pipeta Eppendorf research plus	3123000039		0-100 μ l
Viales de recogida de muestras	Viales de enfriamiento criogénico Tarsons	523194
Azida de sodio	Sigma aldrich	S2002
Cristal de cloruro de sodio	Sigma aldrich	S9625
Fosfato de sodio dibásico	Sigma aldrich	567550
Fosfato de sodio monobásico	Sigma aldrich	S0751
Topspin 3.6.4	Herramienta de procesamiento y análisis de RMN	Bruker
Tsp salt	Sigma aldrich	269913