Presentación de Proteoformas de Histonas mediante electroforesis en gel 2D-TAU

Resumen

Este método describe una estrategia simple y rápida para la caracterización e investigación de proteoformes de histonas.

Resumen

Las histonas experimentan varias modificaciones postraduccionales (PTM) como la metilación, la acetilación, la fosforilación, la acilación y la ubiquitinación, que controlan la dinámica de los nucleosomas y determinan el destino celular. El nucleosoma, que es la unidad funcional de la cromatina, comprende el ADN, cuatro pares de histonas (H3, H4, H2A y H2B) que forman el núcleo globular y la histona enlazadora H1, que estabiliza la estructura de la cromatina. Las colas amino (N)-terminales de las histonas sobresalen de los dominios del núcleo globular y experimentan distintos PTM que influyen en el paisaje de la cromatina. Algunas evidencias sugieren que la homeostasis de las histonas PTM es crucial para preservar todas las actividades fisiológicas. La desregulación de las histonas PTM es la causa principal de la proliferación celular anormal, la invasión y la metástasis. Por lo tanto, el desarrollo de métodos para caracterizar las histonas PTM es crucial. En este trabajo describimos una técnica eficaz para aislar y analizar las isoformas de histonas. El método, basado en la combinación de dos separaciones ortogonales, permite el enriquecimiento de isoformas de histonas y la posterior identificación por espectrometría de masas. La técnica, descrita originalmente por Shechter et al., combina geles de poliacrilamida ácido-urea (TAU-GEL), que pueden separar proteínas histonas básicas en función del tamaño y la carga, y geles de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE), que pueden separar proteínas por peso molecular. El resultado es un mapa bidimensional de isoformas de histonas, adecuado para la digestión en gel, seguido de la identificación por espectrometría de masas y el análisis de Western blot. El resultado es un mapa bidimensional de isoformas de histonas, adecuado tanto para la digestión en gel como para la identificación por espectrometría de masas y el análisis de Western blot. Este enfoque proteómico es un método robusto que permite el enriquecimiento de una sola isoforma de histona y la caracterización de nuevos PTM de histonas.

Introducción

La aparición, la progresión y la quimiorresistencia del cáncer están relacionadas con eventos genéticos y epigenéticos, incluidas las histonas PTM. Las histonas experimentan una variedad de PTM que regulan la dinámica de la cromatina y dictan^{el destino de} las células.

El nucleosoma es la unidad funcional de la cromatina y es un complejo molecular de ADN y proteínas que permite que el ADN se empaquete en el núcleo. Consta de cuatro pares de histonas (H3, H4, H2A y H2B) que constituyen el núcleo del nucleosoma, así como la histona enlazadora H1, que ayuda a estabilizar la estructura de la cromatina. Las colas amino (N)-terminales de las histonas sobresalen de sus dominios centrales globulares y sufren modificaciones postraduccionales específicas que afectan al paisaje de la cromatina².

Hasta ahora, se conocen al menos 23 clases de histonas PTM. Estos PTM son modificaciones covalentes que consisten principalmente en metilación, acetilación, fosforilación, glicosilación, ubiquitilación, SUMOilación y ADP-ribosilación³. Además, recientemente se ha propuesto una estrecha correlación entre la homeostasis del epigenoma y el recableado metabólico, lo que explica el crecimiento exponencial del posible número de histonas PTMs 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Las histonas PTM, depositadas, borradas y transducidas por enzimas modificadoras, se denominan respectivamente escritores, borradores y lectores. Afectan las propiedades físicas y químicas de la estructura de la cromatina, afectando el perfil de expresión génica, incluida la expresión de genes supresores de tumores y oncogenes 14,15,16.

El número de histonas proteoformas aumenta cuando se incorporan al nucleosoma como variantes de histonas. Estas variantes son isoformas no alélicas de histonas canónicas y añaden complejidad al alterar las propiedades químicas y físicas de la cromatina. En comparación con las histonas canónicas, las variantes de histonas tienen dominios funcionales que sufren modificaciones postraduccionales únicas o interactúan con componentes específicos de la cromatina, lo que afecta la dinámica y la estabilidad del nucleosoma¹⁷.

En las células cancerosas, la desregulación de las histonas PTM y sus variantes afecta el perfil de expresión génica, lo que conduce a una proliferación celular anormal, invasión, metástasis y la activación de vías de resistencia a los fármacos 3,18,19,20. Las mutaciones dentro de las histonas o los complejos de remodelación de la cromatina pueden alterar el fenotipo celular, contribuyendo a la transformación neoplásica. La acumulación de alteraciones epigenéticas, como la metilación de histonas, es un factor clave en la activación de las vías de resistencia a fármacos 21,22,23. Las mutaciones dentro del complejo SWI/SNF, que consta de 15 subunidades codificadas por 29 genes, afectan a más del 20% de los cánceres humanos en muchos tipos de tumores. En la última década, se han desarrollado estrategias farmacológicas de base epigenética (epifármacos), y muchos fármacos dirigidos al cáncer con patrones anormales de modificación de histonas han sido aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA)²³.

El análisis de las proteínas histonas es bastante desafiante, lo que lo convierte en un área de estudio exigente. Recientemente, los métodos de espectrometría de masas se han convertido en la forma preferida para caracterizar y estudiar las proteoformas de histonas. Sin embargo, las drásticas condiciones de extracción, en combinación con la escasa solubilidad de algunas variantes y la alta homología de secuencia, dificultan su análisis.

En la última década, se han desarrollado varios métodos basados en espectrometría de masas para el perfil y la investigación de histonas 24,25,26,27. En este estudio, presentamos un método rentable y fiable para crear un mapa bidimensional de proteoformas de histonas, que puede aumentar las posibilidades de descubrir nuevas modificaciones postraduccionales.

La electroforesis 2D TAU combina la separación en condiciones ácidas con SDS PAGE. En la primera dimensión, la condición ácida del medio da una carga neta positiva a las proteínas básicas. Dado que las histonas son proteínas muy básicas y tienen un punto isoeléctrico (pH) más alto en comparación con el medio, se cargan positivamente y migran bajo un campo eléctrico. En la segunda dimensión, las histonas son desnaturalizadas por SDS y separadas en función de su peso molecular. El mapa 2D resultante se puede utilizar como herramienta para enriquecer proteoformas específicas con una resolución de un solo punto para el análisis de espectrometría de masas y estudios inmunológicos^28,29. Después de la electroforesis, las manchas 2D de TAU se pueden decolorar, digerir con tripsina y analizar mediante espectrometría de masas. Alternativamente, el mapa 2D de TAU puede secarse en un filtro de nitrocelulosa/PVDF e investigarse mediante inmunotinción²⁷.

En este contexto, los métodos podrían ser estratégicos para mejorar la identificación y el análisis de nuevas modificaciones postraduccionales correlacionadas con el recableado metabólico^30,31.

Hemos mejorado aún más el método original incorporando un paso de sonicación, que es útil para la degradación del ADN y mejora la solubilidad de las proteínas. Además, hemos prolongado la etapa de incubación para la extracción de histonas, con el fin de obtener una muestra de proteína de alta pureza. Además, en nuestro protocolo, ejecutamos la primera dimensión a baja tensión durante más tiempo para lograr una mejor resolución. El gel resultante se utilizó para investigar histonas canónicas PTM y caracterizar modificaciones novedosas como la glicación^10,32.

En general, hemos desarrollado un método para extraer y purificar histonas, seguido de la resolución de las proteoformas de histonas utilizando un mapa bidimensional. El trabajo también incluye un procedimiento para la digestión en gel para el análisis de espectrometría de masas y los pasos para el análisis bidimensional de Western blot.

Protocolo

1. Extracción de histonas

1. Realice la extracción de histonas de al menos 1 x 10⁶ células, que son 80% confluentes. Para este experimento, utilizamos líneas celulares MCF-10A de ATCC. Después de la siembra, lave las celdas tres veces con 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1 vez. Realiza todos los pasos sobre hielo.
2. Prepare un tampón de lisis celular que contenga 10 mM de Tris-HCl pH 8,0, 1 mM de KCl y 1,5 mM de MgCl₂. Agregue 1 mM de ditioeritritol e inhibidores de la proteasa y la fosfatasa justo antes de usar.
3. Añada 800 μL de tampón de lisis celular a la placa de Petri que contiene células, raspe y recoja las células en un tubo de 1,5 mL, luego incube en un rotador a 300 rpm, 4 °C durante 1 h.
4. Centrifugar a 10.000 x g, 4 °C, durante 10 min en una microcentrífuga preenfriada con un rotador para tubos de 1,5 mL.
5. Lavar el pellet con 400 μL de tampón de lisis celular y centrifugar a 10.000 x g, 4 °C, durante 10 min. Deseche el sobrenadante. Repita el paso de lavado 3 veces.
   NOTA: Utilice una microcentrífuga preenfriada (4 °C) con un rotador para tubos de 1,5 ml para todos los pasos. Manipule el pellet con cuidado para evitar la pérdida de material.
6. Vuelva a suspender el pellet en 640 μL de 0,2 M H₂SO₄ e incube en un rotador a 300 rpm, a 4 °C, durante 16 h.
   PRECAUCIÓN: El ácido sulfúrico es un producto químico peligroso; Úselo debajo de una campana de gases químicos.
7. Centrifugar a 16.000 x g, 4 °C, durante 10 min. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y guárdelo hasta los siguientes pasos. Deseche los desechos nucleares.
8. Precipitar histonas añadiendo 212 μL de ácido tricloroacético, gota a gota (la concentración final de TCA es del 33%). Mezcle la solución invirtiendo el tubo 10x. Incubar en hielo, en la oscuridad, durante 16 h.
   PRECAUCIÓN: El TCA es un producto químico peligroso; Úselo debajo de una campana de gases químicos.
9. Histonas de pellets girando en una centrífuga preenfriada a 16.000 x g durante 10 min a 4 °C. Retire con cuidado el sobrenadante y lave el pellet 3 veces con 200 μL de acetona fría.
10. Vuelva a suspender el pellet con acetona fría, luego sonique la alta potencia 2x con 3 ciclos de encendido/apagado de 30 s, alternando con una pausa de 10 minutos en hielo.
    NOTA: El procedimiento se realizó con un ultrasonido. Este paso es esencial para eliminar el ADN envuelto en histonas.
11. Centrifugar a 16.000 x g durante 10 min, desechar la acetona y volver a suspender la muestra en 100 μL de agua bidestilada. Determine la concentración de proteínas utilizando el método de ensayo de Bradford, de acuerdo con las instrucciones del fabricante³³.
    NOTA: Después de la centrifugación, el pellet a veces aparece blanco o translúcido. Un precipitado blanco y opaco podría indicar la presencia de contaminantes salinos que podrían perjudicar la separación 2D. Si es así, repita los pasos de lavado con acetona hasta que el pellet se vuelva translúcido.
12. Liofilizar 70 μg de histonas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ajuste el liofilizador a 30 °C durante 60 min. Compruebe el volumen del tubo y repita el paso a 30 °C hasta que la muestra esté completamente liofilizada (generalmente, se necesitan 90 min para liofilizar completamente la muestra). Después de 60 minutos, verifique el volumen cada 10 minutos, ya que el proceso depende de la muestra.
    NOTA: Si la cantidad de proteínas histonas es baja, comience con 2 x 10⁶ celdas. En este caso, utilice el mismo volumen de reactivos utilizado para 1 x 10⁶ células. Comprobar la pureza de todos los productos químicos utilizados durante el procedimiento; todos los reactivos deben ser de grado HPLC.

2. Mini electroforesis 2D de tritón-ácido-urea (TAU) en gel

1. Prepare un mini-gel de TAU para un mini sistema de electroforesis vertical de gel de poliacrilamida como se describe a continuación.
   1. Prepare el gel separador: 6 M de urea, 15% acrilamida/bisacrilamida (29:1), 5% ácido glacial acético, 0,25% Triton X-100 (v/v), 0,4% TEMED (v/v), 0,1% APS (p/v). Para preparar la solución, disuelva la urea en acrilamida/bis y 1 ml de agua ultrapura con agitación suave a temperatura ambiente; Agregue los otros componentes y ajuste el volumen. Para un gel mini-TAU, prepare 10 ml de solución. Llene las placas de gel preestablecidas con la solución, evitando la formación de burbujas de aire a solo 1,5 cm de la parte superior. Cubra la solución con 1 ml de isopropanol para nivelar el gel.
   2. Prepare el gel de apilamiento: 6 M de urea, 6% de acrilamida/bisacrilamida (29:1), 5% de ácido glacial acético, 0,25% Triton X-100 (v/v), 0,4% TEMED (v/v), 0,1% APS (p/v). Para preparar la solución, disuelva la urea en acrilamida/bis y 1 mL de agua ultrapura; Agregue los otros componentes y ajuste al volumen. Llene las placas de gel con solución apiladora, coloque un peine de gel de 10 pocillos entre las placas e insértelo hasta que la solución de gel llegue a la mitad de los dientes del peine. Deje que el gel polimerice 16 h a 4 °C.
      NOTA: Inserte con cuidado el peine para asegurar la formación regular de pocillos.
2. Prepare 100 μL de tampón de muestra TAU disolviendo 6 M de urea, ácido glacial acético al 5% y agua bidestilada. Disolver la muestra liofilizada preparada en 30 μL de tampón de muestra TAU.
3. Llene el mini casete con tampón de funcionamiento TAU, concentración final de ácido acético al 5%. Enjuague los pocillos del gel TAU con una jeringa llena de tampón corriente y cargue la muestra en el pocillo con una micropipeta.
4. Conecte la cámara electroforética a la fuente de alimentación, con el electrodo positivo (rojo) colocado en la parte inferior. Preste atención, cuando IP > pH, las proteínas están cargadas positivamente, por lo que la migración es de electrodo positivo a negativo. Primero haga funcionar el gel a 30 V durante 70 minutos, luego a un voltaje constante de 25 V durante 17 h.
   NOTA: Durante este tiempo, apague ocasionalmente la fuente de alimentación y enjuague los pocillos de gel con una jeringa desechable. Preste atención a eliminar las burbujas de la superficie inferior del gel con una jeringa para evitar la pérdida de la muestra y la presencia de manchas en las proteínas resueltas.
5. Retire el gel de las placas de gel y corte la línea de interés con un bisturí limpio. Manipule con cuidado el gel para evitar que se rompa. Dado que la línea de interés es incolora, cargue la muestra en el pocillo número 1 para identificar y cortar exactamente el carril de interés.
   NOTA: Para comprobar la separación en el gel mini-TAU, prepare y pase la muestra por duplicado. Uno de estos geles se puede teñir con Coomassie Brilliant Blue. El patrón de separación se presenta en la Figura 1A.
6. Lavar el carril con 15 mL de Tris-HCl 0,5 M pH 8,8 durante 15 min.
7. Prepare 15 mL de tampón de equilibrio 1 con 6 M de urea, 0,5 M de Tris-HCl, pH 6,8, 30% de glicerol, 20% de SDS y 2% de ditioeritritol. Prepare 15 mL de tampón de equilibrio 2, usando 6 M de urea, 0,5 M de Tris-HCl, pH 6,8, 30% de glicerol, 20% de SDS y 2% de yodoacetamida. Prepare el tampón de equilibrio 1 y 2 justo antes de usarlo; Guarde el tampón de equilibrio 2 en la oscuridad.
8. Incubar el carril de gel, bajo agitación suave, en 10 mL de tampón de equilibrio 1 durante 15 min, luego decantar. Incubar el carril de gel, bajo agitación suave, con 10 mL de tampón de equilibrio 2 durante 15 min en la oscuridad, luego decantar.
9. Prepare un gel de acrilamida SDS al 15% resolutivo siguiendo la Tabla 1. Coloca la placa de gel y llénala con la solución de gel resolutivo. Llene la solución hasta que esté a 1,5 cm del extremo de la placa de gel larga. Ponga 1 mL de isopropanol en la superficie para nivelar el gel y permitir que se polimerice.
10. Después de la polimerización en gel, decantar el isopropanol y secar el pozo con papel de cromatografía de celulosa Chr de 3 mm. Inserte el carril resultante del paso 8 en el pocillo de gel.
11. Selle el carril al gel de resolución con una solución de sellado de agarosa de bajo punto de fusión al 0,5 % en tampón Tris/glicina/SDS y 5 μL de azul de bromofenol al 0,003 %. Permitir la polimerización en gel de agarosa durante 30 min.
    NOTA: Evite la formación de burbujas de aire durante el sellado de agarosa para evitar el manchado del gel.
12. Coloque las placas de gel en el casete y llénelas con 1x tampón Tris/glicina/SDS. Pasa el gel a 120 V hasta que el tinte azul de bromofenol llegue al fondo. Retire suavemente el gel de las placas, deseche el exceso de agarosa y la plata tiña el gel mediante un procedimiento compatible con la espectrometría de masas o la transferencia para el ensayo inmunológico.

3. Tinción de plata ³²

1. Prepare los siguientes reactivos - Fijador: 50% metanol, 5% ácido acético, 45% agua desionizada; Solución de lavado: 50% metanol, 50% agua desionizada; Sensibilizante: 0,02% Na₂S₂O₃ 5H₂O en agua desionizada; Reactivo de plata: 0,1% de nitrato de plata en agua desionizada fría (4 °C); Revelador: 0,04% Formalina y 2%_Na2CO₃, Formaldehído (37%) (añadir justo antes de usar) 0,4 mL de agua desionizada y llenar hasta 1000 mL; Reactivo de parada: 5% de ácido acético; Solución de almacenamiento en gel: ácido acético al 1%.
   NOTA: Dado que los productos químicos utilizados para manchar son peligrosos, realice todos los pasos bajo una campana de gases químicos.
2. Siga el procedimiento de la Tabla 2 con la siguiente consideración. Realice todas las incubaciones con agitación suave. Prepare el reactivo de parada antes de comenzar el paso de revelado; Esto asegurará el desarrollo del gel con la intensidad oportuna. Durante el paso de desarrollo, las manchas aparecerán como señales amarillas que se volverán marrón claro al final de la incubación. La intensidad de las diferentes manchas dependerá de la cantidad de proteoformas de histonas. El gel está listo para la escisión puntual y la digestión en gel (Figura 1B)

4. Digestión en gel

1. Prepare las siguientes soluciones: 50 mM de bicarbonato de amonio (NH₄HCO3)/50% (v/v) de acetonitrilo; 10 mM de ditiotreitol (DTT) en 50 mM de NH₄HCO₃; 55 mM de yodoacetamida (IAA) en 50 mM de NH₄HCO₃; 0,1 por ciento de AFC; 50 mM NH₄HCO₃, pH 8; Acetonitrilo de grado HPLC; Tubos de silicona de 1 mL.
   NOTA: Para evitar la contaminación de queratina humana, del cabello o la piel, use guantes limpios y trabaje en un área limpia.
2. Extraiga las manchas de histonas de interés del gel teñido con un bisturí limpio y colóquelas en un tubo de silicona fresco (1,5 ml). Tenga cuidado de extirpar una sola mancha y ponerla en un solo tubo para evitar la contaminación cruzada de isoformas.
3. Añadir a cada punto de gel 250 μL de 50 mM de acetonitrilo NH₄HCO₃/50% e incubar bajo agitación suave en un termomezclador a temperatura ambiente. Decanta la solución y repite este paso 3 veces. Las piezas de gel aparecerán transparentes.
4. Deshidrata las manchas de gel añadiendo acetonitrilo (200 μL). En esta etapa, las piezas de gel tomarán un color blanco opaco.
5. Decantar el acetonitrilo y dejar secar al aire durante 10 min. La pieza de gel aparecerá seca en el tubo. La reducción y la alquilación no son esenciales, ya que las proteínas histonas se han reducido y alquilado durante la etapa de equilibrio.
6. Rehidratar las manchas de gel en 20 μL de solución de tripsina (0,1 mM HCl) o un volumen suficiente para cubrir las piezas de gel. Coloque los tubos en la termobatidora e incube, bajo agitación suave, a 37 °C durante un mínimo de 4 h hasta 16 h.
7. Transfiera el sobrenadante que contiene los péptidos trípticos a un tubo nuevo. Añadir 50 μL de solución de extracción (60% de acetonitrilo, 1% de TFA) a las piezas de gel y sonicar 2x en un baño de agua ultrasónico durante 10 min a 4 °C.
8. Transfiera el sobrenadante, que contiene péptidos trípticos adicionales, al tubo fresco. Utilice un liofilizante para secar los péptidos extraídos agrupados. Ajuste el liofilizador a 30 °C y seque la solución; Aparecerá un pellet liofilizado en el tubo.
   NOTA: Este paso depende del volumen; Generalmente, 1 h es suficiente, pero verifique el volumen cada 10 min hasta que la muestra esté completamente seca.
9. Añadir 15 μL de AGT al 0,1 % a cada tubo e incubar suavemente en una termobatidora a 25 °C. Transfiera el sobrenadante al vial para el análisis LC-MS/MS.

5. Mancha occidental 2DTAU

1. Prepare el tampón de transferencia, 250 mM de base Tris, 92 mM de glicina y 10% de metanol con agua bidestilada.
2. Corta la membrana de nitrocelulosa y el papel de filtro a las dimensiones del gel.
3. Equilibre el gel y remoje la membrana, el papel de filtro y los papeles de filtro en el tampón de transferencia durante 15 minutos. Utilice membranas de nitrocelulosa o PVDF. Si utiliza membranas de PVDF (difluoruro de polivinilideno), actívelas sumergiéndolas en MetOH al 100%.
4. Prepare el sándwich de gel en el casete para una transferencia semiseca de la siguiente manera: Electrodo negativo/Papel de filtro/Gel/Membrana de nitrocelulosa/Papel de filtro/Electrodo positivo. Elimine las burbujas de aire entre el gel y la membrana para garantizar buenos resultados.
5. Coloque el casete en la unidad semiseca y ejecute la mancha a 25 V durante 30 min. Al final, desmonte el sándwich secante y guarde la membrana para el ensayo inmunológico. Compruebe la eficiencia de la transferencia con la tinción de Ponceau. Marque la membrana con un signo en la parte superior derecha para conservar la orientación correcta del filtro.
6. Incubar con anticuerpos primarios y secundarios dependiendo del experimento (Figura 2).

Resultados

En la Figura 1A, es posible observar cómo migran las proteínas histonas en un gel 1D. Este es un paso preliminar importante para comprender el tiempo de ejecución de la primera dimensión. Una vez que se determine el momento correcto de separación, ejecute la segunda dimensión. El mapa 2D de las proteoformas de histonas muestra un patrón topográfico distintivo (Figura 1B). Cada punto de la Figura 1B representa un tipo de histona específico. Observe la región exacta del gel donde se puede encontrar cada proteoforma de histona. La identificación por espectrometría de masas para cada proteoforma de histonas se reporta en Perri et ^al.32. Por lo tanto, cada mancha en esta condición se asocia con un tipo de histona específico. La presencia de manchas adicionales, junto a las canónicas, puede indicar la existencia de modificaciones novedosas. Las imágenes en gel se pueden adquirir mediante densitometría, y la imagen resultante se puede analizar mediante un software de análisis de imágenes.

La fiabilidad del mapa TAU 2D depende de la rotundidad del lugar. Si la carrera se ha realizado correctamente, los puntos aparecerán como señales distintas y no se verán rayas horizontales y verticales. Por el contrario, las impurezas en la muestra, las soluciones y la capa de agarosa pueden causar rayas y/o rayas en el gel. La calidad del gel influirá en la digitalización de la imagen y en el posterior análisis cuantitativo y cualitativo. Además, podría influir en el éxito del análisis de Western Blot y de las investigaciones de EM. Para verificar la fiabilidad del método, sondeamos la membrana de nitrocelulosa de las proteoformas de histonas resueltas con el anticuerpo primario Acetyladed-Lysine (Ac-K2-100) Rabbit mAb³² (Figura 2). Se utilizó un anticuerpo secundario HRP anti-conejo para detectar las señales de histonas. Como era de esperar, utilizando un densitómetro, es posible cuantificar la peculiar modificación postraduccional en cada variante de histonas presente en el blot.

Figura 1: TAUgel 1D y 2D. (A) Imagen representativa del patrón topográfico de histonas obtenida con TAUgel 1D. (B) Imagen representativa del patrón topográfico de histonas obtenida mediante TAUgel 2D. Las identificaciones de los datos son reportadas por Perri et al. ³². Como era de esperar, cada mancha representa una proteoforma de histona específica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Western blot representativo de 2DTAU. En la imagen, es posible observar el nivel de acetilación de lisina en cada proteoforme de histonas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Reactivos	Concentración: 15%
40% Acrilamida/Bis	3.75
1.5 M Tris pH 8.8	2.5 mL
Agua MilliQ	3.6 mL
10% SDS	100 μL
10% APS	50 μL
TEMED	5 μL

Tabla 1: Resolución de la composición de la solución de gel.

Paso	Hora
Fijación 50% metanol / 5% ácido acético	1 h
Lavar 30% etanol	2 x 20 minutos
Lavar el agua desionizada	1 x 20 minutos
Reactivo de tiosulfato sensibilizador	1 minuto
Lavar el agua desionizada	3 x 20 s
Plata Nitrato de plata	30 minutos
Lavar el agua desionizada	3 x 1 min
Desarrollador de Desarrollo	25-30 min Nota: Desarrollar el gel hasta que las manchas sean visibles (marrón claro)
Solución de parada	1 x 10 minutos
Lavar el agua desionizada	2 x 5 minutos
Lavar el agua desionizada	1 h

Tabla 2: Método de tinción de plata.

Discusión

En la última década, la terapia del paciente con cáncer se ha revolucionado al identificar varias alteraciones moleculares que impulsan el desarrollo y la progresión del cáncer. El avance más significativo en la oncología moderna es el desarrollo de una terapia basada en el análisis molecular integral. Los avances tecnológicos en genómica y proteómica han desempeñado un papel crucial en el perfil de biomarcadores específicos para la detección temprana, la vigilancia, el pronóstico y el seguimiento de fármacos. La proteómica se define como el análisis del complemento proteico completo de una célula, tejido u organismo en una condición particular, y también incluye el estudio de las interacciones de proteínas, las modificaciones postraduccionales y la localización³⁴. Un área específica de la proteómica es la epiproteómica, que implica el estudio sistemático de las modificaciones postraduccionales de las histonas. Estos se han relacionado con el desarrollo y la progresión del cáncer³⁵. El artículo describe un método para identificar isoformas de histonas específicas que contribuyen al fenotipo celular.

El paso crítico del método es la extracción de histonas debido a su escasa solubilidad y alta basicidad. Sus principales limitaciones son la complejidad del mapa 2D y el bajo número de variantes, lo que podría dificultar el análisis MS/MS.

En general, el principal beneficio de este enfoque es que se puede llevar a cabo en cualquier laboratorio, y se puede tener un mini aparato de gel con las precauciones adecuadas. En este contexto, estamos seguros de que este método podría ayudar a un gran número de científicos, como aquellos que no pueden beneficiarse de una gran instalación en su institución, a identificar nuevos epimarcadores, con el objetivo de mejorar el conocimiento sobre el epiproteoma. Además, este método se puede combinar con la espectrometría de masas, que se puede externalizar como un servicio, para descubrir nuevas proteoformas. También se puede utilizar con ensayos inmunológicos para confirmar los cambios en una modificación postraduccional específica para la que se dispone de un anticuerpo comercial.

El método se ha utilizado para estudiar los cambios típicos en las modificaciones de las histonas relacionadas con el desarrollo del cáncer de mama²⁸y para examinar las modificaciones de H1 en células madre embrionarias de ratón³⁶. Además, el método se ha empleado con éxito para medir el nivel de carbonilación de histonas³⁷ en fibroblastos de rápido crecimiento y para explorar nuevas modificaciones de histonas, como la glicación de histonas y la marilación de histonas³⁸.

Desde nuestra perspectiva, estamos seguros de que este método se puede aplicar con éxito para perfilar nuevos PTM de histonas, particularmente aquellos asociados con la activación anormal de vías metabólicas específicas, como acetilación, malonilación, metilación, lipidación, lactilación, butilación y otras. En última instancia, el método también podría servir como una herramienta micropreparatoria para aislar proteoformas individuales y puede facilitar el análisis de PTM ligados al metabolismo, mejorando así nuestra comprensión de esta área crucial de investigación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1,4-Ditioeritritol	SIGMA- ALDRICH	D8255	Reactivo para el mantenimiento &menos; grupos SH en el estado reducido; reduce cuantitativamente los disulfuros.
Tampón Tris-HCL de 1,5 M, pH 8,8	BIO-RAD	161-0798	Tampón de gel resolutivo
10x Tris/Glicina/SDS	BIO-RAD	1610772	Utilice este tampón de ejecución premezclado 10x Tris/glycine/SDS para separar muestras de proteínas mediante SDS-PAGE.
2-Propanol	SIGMA-ALDRICH	33539	El 2-Propanol (Isopropanol) es un alcohol secundario. Se ha probado como sustituto del combustible para su uso en diversas pilas de combustible. El polvo de CuO disuelto en 2-propanol se ha utilizado para la síntesis asistida por ablación láser de coloides de Cu. La suspensión de 2-propanol con Zn(NO3)2 se ha empleado para la fabricación de fotoánodo de acero inoxidable (P25-TiO2/SS) recubierto de dióxido de titanio recubierto con una capa uniformemente gruesa de P25-TiO2. Este fotoánodo se utilizó para el proceso de degradación fotocatalítica electroquímica (ECPC).
30% Acrilamida/Solución Bis	BIO-RAD	1610158	reticulante al 2,6%. Reactivo de pureza de electroforesis
Ácido acético Glacial	Carlo Erba Reagennts	401392	El ácido acético es un importante reactivo químico con muchas aplicaciones industriales.
Acetona	Panreac Applichem	211007.1214	Acetona  es un solvente, reconocido por su versatilidad en diversas aplicaciones de laboratorio, fabricación y limpieza.
Acetonitile	VWR	83640320	para HPLC    Agarosa grado LC-MS
	Invitrogen	15510-027	Agarosa  es a  heteropolisacárido  De uso frecuente en biología molecular.
Bicarbonato de amonio	SIGMA-ALDRICH	A6141	mínimo 99,0%
Persulfato de amonio	SIGMA-ALDRICH	A3678	Para biología molecular, para electroforesis, ≥ 98%
Bioruptor plus	Diagenode	B01020001 - B01020002- B01020003	sonicador
Dithiothreitol	SIGMA- ALDRICH	D9163-5G	Agente reductor utilizado para reducir los enlaces disulfuro en proteínas.
Kit de tinte de plata Dodeca	BIO-RAD	161-0480	El kit de tinción de plata Dodeca es fácil de usar para la detección de niveles no agramáticos de proteínas en geles de poliacrilamida.
Glycerol	GE - Healthcare Life Sciences	171325010L	El glicerol es un compuesto triol simple, que participa para ayudar en la fundición de geles de gradiente, estabilizador de proteínas y componente tampón de almacenamiento.
Inhibidor de la fosfatasa Halt	Thermo SCIENTIFIC	78428	Thermo Scientific Halt Phosphatasa Inhibid Cocktail conserva el estado de fosforilación de las proteínas durante y después de la lisis celular o la extracción de proteínas tisulares  Cóctel de un solo uso (100X).
Inhibidor de la proteasa Halt	Thermo SCIENTIFIC	78430	Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail (100X) son soluciones madre concentradas listas para usar de inhibidores de proteasa que se añaden a las muestras para evitar la degradación proteolítica durante la lisis celular y la extracción de proteínas. Cóctel de un solo uso (100X).
Ácido clorhídrico	SIGMA-ALDRICH	H1758	BioReactivo, para biología molecular
Yodoacetamida	SIGMA-ALDRICH	I6125	≥ 99% (RMN), cristalino
KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541	Cloruro de potasio, KCl, is  Generalmente se utiliza en rutinas de laboratorio. Su uso como tampón de almacenamiento para electrodos de pH y como solución de referencia para mediciones de conductividad está bien establecido.
Línea celular MCF10	atcc	CRL-10317	Línea celular epitelial que se aisló en 1984 de la glándula mamaria de una mujer blanca de 36 años con mamas fibroquísticas. Esta línea celular fue depositada por la Fundación del Cáncer de Michigan.
de magnesio MgCl2	SIGMA-ALDRICH	208337	es un sólido cristalino incoloro.
N,N,N',N'-Tetrametiletilene-diamina	SIGMA-ALDRICH	T9281	Para electroforesis, aprox. 99%
Tampón salino de fosfato 1X	Corning	15373631	1 X PBS (solución salina tamponada con fosfato) es  un búfer  solución salina equilibrada   Se utiliza para una variedad de aplicaciones biológicas y de cultivo celular, como el lavado de células antes de la disociación, el transporte de células o tejidos, la dilución de células para el recuento y la preparación de reactivos.
Hexacianoferrato de potasio	SIGMA-ALDRICH	60299	Aceptor de electrones, empleado en sistemas que involucran transporte de electrones,
solución SDS 20% (w/v)	BIO-RAD	161-0418	Dodecil sulfato de sodio. Reactivo de pureza de electroforesis
Tiosulfato de sodio, ReactivoPlus 99%	SIGMA-ALDRICH	21.726-3	Tiosulfato de sodio, ReactivoPlus 99%
Ácido sulfúrico	SIGMA-ALDRICH	339741	Ácido sulfúrico, Reactivo, is  Un ácido extremadamente corrosivo que se presenta en forma de líquido amarillento y ligeramente viscoso. Es soluble en agua y es un ácido diprótico. Tiene propiedades corrosivas, deshidratantes y oxidantes muy fuertes, además de ser higroscópico.
Ácido tricloroacético	SIGMA-ALDRICH	T6399-5G	El ácido tricloroacético (TCA) es  Se utiliza como reactivo para la precipitación de proteínas1,2 y ácidos nucleicos3.
Ácido trifluoroacético	Riedel-de Haë n	34957	Ácido trifluoroacético
Triton X-100	SIGMA- ALDRICH	T9284-1L	Triton X-100 es un tensioactivo de polioxietileno no iónico que se utiliza con mayor frecuencia para extraer y solubilizar proteínas.
Tripsina del páncreas porcino	SIGMA-ALDRICH	T6567	Grado proteómico, biorreactivo, dimetilado
UREA	SIGMA-ALDRICH	33247	La urea es un agente caotrópico y se utiliza para la desnaturalización de proteínas. Altera los enlaces de hidrógeno en la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de las proteínas. También puede alterar los enlaces de hidrógeno presentes en la estructura secundaria del ADN