Method Article

Un enfoque de cribado de alto rendimiento para evaluar la afinidad de unión de los contaminantes ambientales a los receptores nucleares

DOI:

10.3791/67327

⸱

September 20th, 2024

 , 
1School of Public Health, Qingdao University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un sistema de cribado de alto rendimiento que utiliza la polarización de fluorescencia de una sonda fluorescente específica que se une a un receptor nuclear como lectura para el cribado de contaminantes ambientales.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se han detectado niveles crecientes de compuestos en el medio ambiente, lo que causa una contaminación generalizada y plantea riesgos para la salud humana. Sin embargo, a pesar de su alta incidencia ambiental, existe muy poca información sobre sus efectos toxicológicos. Es urgente desarrollar métodos de cribado de alto rendimiento (HTS, por sus siglas en inglés) para guiar los estudios toxicológicos. En este estudio, se desarrolló un ensayo de unión receptor-ligando utilizando un sistema HTS para determinar la potencia de unión de contaminantes ambientales en receptores nucleares. La prueba se lleva a cabo utilizando un lector de microplacas (es decir, una placa de 96 pocillos que contiene varios productos químicos) midiendo la polarización de fluorescencia (FP) de una sonda fluorescente específica. Este ensayo consta de cuatro partes: la construcción y transformación de vectores recombinantes, la expresión y purificación de la proteína receptora (dominio de unión al ligando), la unión receptor-sonda y la unión competitiva de productos químicos con el receptor. Para ilustrar el procedimiento de ensayo, se determinó la potencia de unión de dos contaminantes ambientales, el ácido perfluorooctanosulfónico (PFOS) y el fosfato de trifenilo (TPHP), con el receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas (PPARγ). Finalmente, también se discutieron las ventajas y desventajas de este método y sus posibles aplicaciones.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se ha detectado ampliamente un gran número de sustancias químicas en el medio ambiente y en el cuerpo humano, lo que plantea importantes preocupaciones sobre su impacto en el entorno ecológico y la salud humana 1,2,3. A pesar de su alta incidencia ambiental, la información sobre sus efectos toxicológicos es escasa. Por lo tanto, es urgente desarrollar métodos de cribado de alto rendimiento (HTS) para facilitar la evaluación de la toxicidad química.

Se han descrito varios métodos de cribado de alto rendimiento (HTS) para la evaluación de la toxicidad química, como los bioensayos HTS utilizados en los programas Tox21 y ToxCast 4,5. Estos métodos pueden identificar rápidamente los tóxicos potenciales y proporcionar información valiosa sobre los mecanismos de la toxicidad química. Sin embargo, estos bioensayos HTS se basan principalmente en sistemas basados en células, que pueden ser complejos y costosos. Además, también se han utilizado métodos de secuenciación de alto rendimiento para la evaluación de la toxicidad química, pero lograr una evaluación de alto rendimiento de los productos químicos sigue siendo un desafío6. Estudios previos han desarrollado ensayos de unión competitiva receptor-ligando basados en polarización de fluorescencia (FP) para determinar la potencia de unión de varios contaminantes ambientales, incluidas las sustancias perfluoroalquiladas y polifluoroalquiladas (PFAS)7,8,9, el bisfenol A (BPA)10,11 y el material particulado (PM)12, con receptores nucleares como el receptor activado por proliferador de peroxisomas (PPAR)7, 8,9,10,13, receptor X farnesoide (FXR)11,12 y receptor tiroideo (TR)14,15. Este enfoque es eficiente, rentable y proporciona información mecanicista.

En este estudio, se describe el protocolo para el ensayo de unión receptor-ligando basado en la detección de la polarización de fluorescencia (FP) de una pequeña sonda fluorescente. El principio del ensayo de unión receptor-ligando basado en FP se ilustra en la Figura 1. Cuando una pequeña molécula fluorescente es excitada por luz polarizada plana, la luz emitida se vuelve altamente despolarizada debido a la rápida rotación molecular. Sin embargo, cuando el marcador se une a un receptor más grande, su rotación se ralentiza. Un valor alto de FP se detecta cuando el trazador está unido al receptor grande, mientras que un valor bajo de FP se observa cuando el trazador está libre. El receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas (PPARγ) se purificó para la unión de la sonda al receptor. Se utilizaron rosiglitazona (Rosi), ácido perfluorooctanosulfónico (PFOS) y fosfato de trifenilo (TPHP) para competir por la unión de la sonda con el receptor. Rosi, un agonista específico de PPARγ, se utilizó como control positivo en los ensayos de unión competitiva al receptor. Además, el PFOS y el TPHP han sido identificados previamente como agonistas débiles de PPARγ en estudios anteriores 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Además, pertenecen a diferentes categorías estructurales de compuestos conocidos por su exposición ambiental y son notables por sus tasas de detección relativamente altas en las poblaciones humanas. Estos compuestos se utilizaron para validar aún más la amplia aplicabilidad del ensayo de unión de competencia. El procedimiento consta de cuatro etapas: construcción y transformación de vectores recombinantes, expresión y purificación de la proteína receptora (dominio de unión al ligando), unión receptor-sonda y unión competitiva de productos químicos con el receptor.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los detalles de los reactivos y el equipo se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Construcción y transformación de vectores recombinantes

NOTA: PPARγ es un factor de transcripción dependiente de ligando con una estructura de receptor nuclear clásica, que comprende un dominio de unión al ADN que regula los genes diana y un dominio de unión al ligando activado por los ligandos. Tras la activación del ligando, PPARγ forma un heterodímero con otro receptor nuclear, el receptor X retinoide (RXR), y se une a los elementos de respuesta de PPARγ, regulando así la transcripción de los genes diana posteriores 9,16.

  1. Diseñe cebadores para el PPARγ-LBD (ver Tabla 1) y amplifique el segmento de ADN PPARγ-LBD (ver Tabla 2 y Tabla 3).
  2. Linealizar el vector pET28a marcado con His×6 digiriéndolo con endonucleasas de restricción XhoI y BamHI18.
  3. Clonar el segmento de ADN PPARγ-LBD en el vector pET28a marcado con His×6 utilizando el kit de clonación disponible comercialmente, lo que da como resultado el plásmido recombinante pET28a-PPARγ-LBD-6×His18.
  4. Transfectar el plásmido de expresión recombinante pET28a-PPARγ-LBD-6×His en células de Escherichia coli BL21 (DE3) para la expresión de proteínas18.
  5. Añadir 5 μL del vector recombinante a las células BL21(DE3) competentes, incubar en hielo durante 30 min, realizar un choque térmico a 42 °C durante 45 s y, a continuación, volver inmediatamente al hielo.
  6. Agregue 900 μL de medio LB, agite a 37 °C durante 1 h (160-200 rpm), luego centrifugue a ~ 3000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  7. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet bacteriano en 100 μL de medio LB y extiéndalo sobre un medio sólido. Invertir las placas y el cultivo a 37 °C durante 12-16 h.
  8. Seleccionar colonias individuales para la secuenciación, identificación y posterior expresión y purificación de proteínas.

2. Expresión y purificación de la proteína receptora

  1. Incubar las células BL21 (DE3) transformadas en 200 mL de medio LB suplementado con 100 μg/mL de ampicilina en un agitador orbital (230 rpm) durante 1-2 h a 37 °C.
  2. Inducir las células cuando el OD600 alcance 0,4-0,6 unidades de absorbancia añadiendo 10 μM de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) e incubar a 16 °C durante 16 h.
  3. Recoja la suspensión bacteriana y centrifugue a 8000 × g, 4 °C, durante 10 min.
  4. Lisar las células en 20 mL de tampón de lisis soluble (50 mM de NaH2PO4, 300 mM de NaCl, 10 mM de imidazol, pH 8,0), añadiendo 200 μL de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y 200 μL de lisozima. Vuelva a suspender el pellet bacteriano con una pipeta de 5 mL, y luego proceda con la sonicación al 30% de potencia durante 20 min.
  5. Agregue un tampón de lisis igual a 5 veces el volumen de la columna para equilibrar la columna de níquel. Repite este proceso dos veces y reserva.
  6. Centrifugar la suspensión bacteriana sonicada a 8000 × g durante 15 min a 4 °C para obtener el lisado de sobrenadante bacteriano (CL).
  7. Cargue el CL en la columna de níquel (para la adsorción de proteínas) para obtener el flujo continuo (FT).
  8. Lavar la columna con 5 veces el volumen de la columna de tampón de lavado (50 mM de NaH2PO4, 300 mM de NaCl, 20 mM de imidazol, pH 8,0) para obtener el eluido de lavado (W1-W6).
  9. Lavar la columna con 1 mL de tampón de elución (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8,0) para eluir la proteína objetivo y obtener las fracciones proteicas (E1-E5).
  10. Tome una alícuota de 20 μL de cada fracción (CL, FT, W1-W6 y E1-E5) y analice usando SDS-PAGE18 con tinción Coomassie Brilliant Blue. PPARγ-LBD funciona como una proteína de 34,9 kDa en un gel desnaturalizante.

3. Ensayo de unión al receptor

NOTA: En este ensayo, C1-BODIPY-C12 se utilizó como sonda fluorescente de sitio específico para establecer el sistema de unión receptor-ligando. C1-BODIPY-C12, un ligando específico para PPARγ, es un análogo fluorescente del ácido graso con el grupo fluorescente BODIPY incorporado en el ácido graso en la posición C1.

  1. Diluir el PPARγ-LBD humano purificado en tampón Tris-HCl (20 mM de Tris, 100 mM de NaCl, pH 8,0) hasta un rango de concentración de 1 nM a 6400 nM. Además, diluya la sonda C1-BODIPY-C12 en tampón Tris-HCl a una concentración de 50 nM.
  2. Mezcle la solución diluida de PPARγ-LBD (55 μL por pocillo) y la solución de sonda C1-BODIPY-C12 (55 μL por pocillo) en una placa negra de 96 pocillos. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
  3. Mida la polarización de fluorescencia (FP) con el lector de microplacas.
  4. Grafique los valores de FP frente a la concentración del receptor, ajuste la curva utilizando la unión específica con la ecuación de la pendiente de Hill utilizando software estadístico y gráfico, y calcule el valor de Kd .

4. Ensayo de unión competitivo

NOTA: En este ensayo, se utilizaron 800 nM de PPARγ-LBD humano y 50 nM de sonda C1-BODIPY-C12 para la unión al receptor. Se utilizaron rosiglitazona (Rosi), fosfato de trifenilo (TPHP) y ácido perfluorooctanosulfónico (PFOS) para competir con la unión de la sonda a PPARγ.

  1. Diluir los tres compuestos en tampón Tris-HCl dentro de un rango de concentración de 0 a 200 μM.
  2. Prepare la solución de unión receptor-sonda con una concentración final de 800 nM de PPARγ-LBD humano y 50 nM de sonda C1-BODIPY-C12.
  3. Mezcle la solución de unión receptor-sonda (55 μL por pocillo) y la solución compuesta (55 μL por pocillo) en una placa negra de 96 pocillos. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
  4. Mida la polarización de fluorescencia (FP) con el lector de microplacas.
  5. Represente los valores de FP en función de la concentración del ligando. Obtener la concentración inhibitoria semimáxima (IC50) de cada ligando a partir de la curva de competencia utilizando el modelo sigmoidal procesado por un software de gráfica y análisis.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Expresión proteica y purificación de PPARγ-LBD
PPARγ-LBD se expresó heterólogamente en BL21 (DE3) como una proteína marcada con histidina. La proteína se detectó en las fracciones solubles, y el PPARγ-LBD purificado mostró una sola banda en SDS-PAGE con un peso molecular aparente de aproximadamente 34,9 kDa (Figura 2), consistente con el peso molecular predicho de la proteína.

La unión de la sonda C 1-BODIPY-C12 a PPARγ-LBD
En el ensayo de unión al receptor, se utilizó C1-BODIPY-C12, un ácido graso marcado con BODIPY que puede unirse a PPARγ-LBD, como sonda de fluorescencia para estudiar la potencia de unión de contaminantes ambientales con hPPARγ-LBD. Como se muestra en la Figura 3A, los valores de polarización de fluorescencia (FP) aumentaron de 20 a 250 tras la adición de PPARγ-LBD, lo que indica la unión de C1-BODIPY-C12 al receptor. La curva de unión alcanzó la saturación a 800 nM PPARγ-LBD, con una constante de disociación (Kd) de 253,5 nM ± 10,05 nM. Por lo tanto, se eligió PPARγ-LBD de 800 nM para los posteriores ensayos de unión competitivos.

La unión competitiva de los contaminantes ambientales a PPARγ-LBD
La rosiglitazona (Rosi), un agonista específico de PPARγ, se utilizó como control positivo para desplazar la sonda fluorescente en los ensayos competitivos de unión al ligando. Como se muestra en la Figura 3B, Rosi inhibió la unión de la sonda C1-BODIPY-C12 a PPARγ-LBD de manera dependiente de la dosis, con un IC50 de 6,89 μM, lo que demuestra la viabilidad del ensayo. A continuación, se determinaron las afinidades de unión de TPHP y PFOS a PPARγ-LBD. Como se muestra en la Figura 3C,D, el TPHP y el PFOS también inhibieron la unión de la sonda C1-BODIPY-C12 a PPARγ-LBD de manera dependiente de la dosis, con valores de IC50 de 60,45 μM y 37,27 μM, respectivamente.

figure-results-1
Figura 1: Ilustración esquemática de los ensayos de unión competitiva a receptores basados en polarización de fluorescencia (FP). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Análisis SDS-PAGE del PPARγ-LBD purificado. M es el marcador de peso molecular de la proteína. Cl es el lisado celular, FT es la fracción de flujo, W1-W6 son las soluciones de lavado, E1 es el eluido y E2-E4 son las proteínas PPARγ-LBD purificadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Curva de unión al receptor basada en polarización de fluorescencia (FP) y curvas de unión competitivas. (A) Curva de unión basada en FP de C 1-BODIPY-C12 a PPARγ-LBD humano. (B-D) Curvas de unión competitivas basadas en FP de Rosi, PHPP y PFOS a PPARγ-LBD humano. Las barras de error denotan la desviación estándar (DE) de tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

IDENTIFICACIÓNSeq
pET28a-PPARG-P1 humanoCAAATGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCC
pET28a-PPARG-P2 humanoGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGTACAAGTCCTTGTAGATCTC
Secuencia de nucleótidos PPARγ-LBDAGACGACATTCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGAT
ATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTG
GTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAA
TGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCCGCTGAC
CTCCGGGCCCTGGCAAAACATTTGTATGACTCATAAAGTCCTTCC
CGCTGACCAAAGCAAAGGCGAGGGCGATCTTGACAGGAAAGACAACA
GACAAATCACCATTCGTTATCTATGACATGAATTCCTTAATGATGGGAGA
AGATAAAATCAAGTTCAAACACATCACCCCCCTGCAGGAGCAGAGCAA
AGAGGTGGCCATCCGCATCTTTCAGGGCTGCCAGTTTCGCTCCGTGG
AGGCTGTGCAGGAGATCACAGAGTATGCCAAAAGCATTCCTGGTTTTG
TAAATCTTGACTTGAACGACCAAGTAACTCTCCTCAAATATGGAGTCCA
CGAGATCATTTACACAATGCTGGCCTCCTTGATGAATAAAGATGGGTT
TCTCATATCCGAGGGCCAAGGCTTCATGACAAGGGAGTTTCTAAAG
AGCCTGCGAAAGCCTTTTGTGACTTTATGGAGCCCAAGTTTGAGT
TTGCTGTGAAGTTCAATGCACTGGAATTAGATGACAGCGACTTGGCAA
TATTTATTGCTGTCATTATTCTCAGTGGAGACCGCCCAGGTTTGCTGAA
TGTGAAGCCCATTGAAGACATTCAAGACAACCTGCTACAAGCCCTGG
AGCTCCAGCTGAAGCTGAACCACCCTGAGTCCTCACAGCTGTTTG
CCAAGCTGCTCCAGAAAATGACAGACCTCAGACAGATTGTCACGGA
ACACGTGCAGCTACTGCAGGTGATCAAGAAGACGGAAACCGACATG
AGTCTTCACCCGCTCCTGCAGGAGATCTACAAGGACTTGGACTGGGG
CTCGAGGCCACCCACCC

Tabla 1: Secuencia de cebadores y nucleótidos del dominio de unión al ligando PPARγ.

Nombres de los reactivos experimentalesVolumen/Dosis
pET28a-PPARG-P1 humano1 μL
pET28a-PPARG-P2 humano1 μL
2×phanta Max Master Mix12,5 μL
ADNc2 μL
ddH2O8,5 μL

Tabla 2: Sistema experimental de reactivos PCR.

Nombres de experimentosTemperaturaHora
Pre-desnaturalización95 °C3 minutos
Desnaturalización95 °C15 s
Recocido65 °C15 s
Extensión72 °C6 minutos
Tienda12 °C--

Tabla 3: Programa experimental de reacción por PCR.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La polarización de fluorescencia (FP), la resonancia de plasmón de superficie (SPR) y la resonancia magnética nuclear (RMN) son técnicas comunes utilizadas para evaluar las interacciones de unión directa entre proteínas y compuestos19,20. La PF ha sido ampliamente empleada en la investigación de interacciones moleculares para el descubrimiento de fármacos y el cribado químico 21,22,23. En comparación, los ensayos SPR y NMR son caros y requieren mucho tiempo, lo que los hace menos adecuados para aplicaciones de cribado de alto rendimiento (HTS). Este protocolo describe un método de análisis receptor-ligando basado en FP con un sistema de detección de placas multipocillo, que permite el HTS de productos químicos.

La elección de la sonda adecuada para un ensayo de unión a receptores es crucial. La sonda debe constar de dos componentes: un ligando específico para el receptor nuclear y un grupo fluorescente. Por lo general, tales sondas se pueden obtener comercialmente, como lo ejemplifica la sonda C1-BODIPY-C12 utilizada en este estudio. C1-BODIPY-C12 es un análogo fluorescente del ácido graso, con el grupo fluorescente BODIPY incorporado en la posición C1, y es un ligando específico para PPARγ. Si una sonda fluorescente disponible comercialmente no es una opción, debe sintetizarse químicamente uniendo un grupo fluorescente a un ligando específico conocido.

La estructura clásica de un receptor nuclear incluye un dominio de unión al ADN responsable de regular la expresión génica diana y un dominio de unión al ligando (LBD), normalmente situado en el extremo C-terminal24 del receptor. El sitio de unión del corregulador se encuentra generalmente dentro del dominio de la función de activación transcripcional del receptor nuclear, donde interactúa con los factores correguladores nucleares25. Estos correguladores pueden mejorar o suprimir la actividad transcripcional del receptor, modulando así la expresión génica. El LBD, ubicado en una región específica de la proteína receptora, regula los cambios conformacionales del receptor al unirse al ligando, lo que a su vez activa o inhibe su actividad transcripcional. Dado que el LBD es un dominio bien definido y crucial para reconocer y unirse a ligandos específicos de moléculas pequeñas24, solo se utilizó el receptor-LBD en el ensayo de unión competitiva al receptor en este estudio. Este enfoque, que implicó expresar y purificar el dominio de unión al ligando de PPARγ, redujo los costos de los ensayos.

Los reactivos utilizados en este método, incluidos los tampones para la purificación de proteínas, la sonda C1-BODIPY-C12 y Tris-HCl, están disponibles comercialmente y son baratos, lo que supone una ventaja significativa para el ensayo. La detección de polarización de fluorescencia (FP) se realiza en una placa de varios pocillos (ya sea de 96 pocillos o de 384 pocillos), con un tiempo de lectura rápido de 3 a 5 minutos por placa, lo que mejora el rendimiento y la eficiencia de las pruebas. El enfoque de unión receptor-ligando es muy flexible y puede adaptarse fácilmente a varios receptores, siempre que las proteínas receptoras estén disponibles. Esta adaptabilidad amplía el alcance de la investigación que se puede llevar a cabo con este método. En general, la combinación de estas ventajas (facilidad de uso, rentabilidad, capacidad de alto rendimiento, procesamiento rápido y flexibilidad en la adaptación al receptor) hace de este método una opción prometedora para el cribado de contaminantes ambientales tóxicos.

Los resultados actuales demuestran que el PFOS y el TPHP pueden unirse a PPARγ, lo que es consistente con los hallazgos previos de los ensayos de acoplamiento molecular y genes reporteros 9,26. Además, se ha utilizado el método descrito en este manuscrito para evaluar la potencia de unión de varios contaminantes ambientales con receptores nucleares. Por ejemplo, utilizando el ensayo de unión competitiva receptor-ligando basado en FP, la potencia de unión de 19 sustancias perfluoroalquiladas y polifluoroalquiladas (PFAS) y 7 compuestos de bisfenol A (BPA) al receptor activado por proliferador de peroxisomas β/δ (PPARβ/δ)7,10, 12 PFAS a PPARγ 9,13, 7 compuestos BPA y 3 componentes de material particulado (PM2,5) al receptor X farnesoide (FXR)11, Se han determinado 12 y 8 éteres de difenilo polibromados (PBDEs) y 6 bifenilos policlorados (PCBs) al receptor tiroideo (TR)14,15. Estos hallazgos ponen de manifiesto el potencial de este método para detectar las interacciones de unión entre los contaminantes ambientales y los receptores nucleares.

Estudios previos han reportado métodos de ensayo de polarización de fluorescencia (FP) para PPARγ que involucran el uso de filtración en gel para medir la unión, que requiere al menos 1,5 h para detectar la unión de un solo compuesto23. Por el contrario, este método permite la detección de afinidades de unión para al menos 12 compuestos con PPARγ en 10 minutos. Además, algunos kits de ensayo disponibles comercialmente (consulte la Tabla de materiales) tienen un precio de más de $ 3000 para un formato de 800 × 20 μL. Estos métodos son notablemente caros y requieren mucho tiempo. Este estudio presenta mejoras con respecto a estos métodos existentes.

Una limitación potencial de este método es que la sonda de fluorescencia debe ser un ligando para el receptor, y las sondas de fluorescencia no interactúan directamente con los contaminantes ambientales. Por lo tanto, es crucial asegurarse de que la sonda y los contaminantes ambientales se mantengan separados en la solución. Además, este ensayo refleja una situación in vitro y no puede capturar completamente las interacciones in vivo , ya que los receptores son heterodiméricos in vivo27. En consecuencia, si bien este método sirve como una herramienta de detección rápida, es necesario seguir investigando la activación de los receptores y los mecanismos toxicológicos relacionados in vivo .

Otro inconveniente es el fenómeno de "desplazamiento hacia la derecha" observado en los ensayos de polarización de fluorescencia (FP) al evaluar la afinidad de unión, lo que puede llevar a una subestimación sistemática de las afinidades medidas. En estudios anteriores, la afinidad de unión de la rosiglitazona con PPARγ se evaluó utilizando el ensayo de transferencia de energía de resonancia fluorescente resuelto en el tiempo (TR-FRET)28, que es un método altamente sensible para medir la afinidad de unión ligando-receptor. Sin embargo, el ensayo TR-FRET es relativamente lento y engorroso, ya que requiere una incubación de 4 horas de la solución de reacción a temperatura ambiente antes de la detección. Aunque el ensayo FP exhibe una sensibilidad más baja en comparación con el ensayo TR-FRET, es más adecuado para el cribado de alto rendimiento de ligandos ambientales que se unen a receptores nucleares. Sin embargo, el ensayo FP puede pasar por alto algunos ligandos ambientales débiles. Además, en estudios anteriores, la afinidad de unión del PFOS con PPARγ se determinó mediante diálisis de equilibrio (EqD)29, otro método altamente sensible para medir la afinidad de unión ligando-receptor. Sin embargo, la EcD depende de costosos equipos analíticos (LC-MS/MS), lo que limita su aplicación e impide las capacidades de cribado de alto rendimiento.

Aunque este ensayo de polarización de fluorescencia (FP) exhibe un fenómeno de "desplazamiento a la derecha", que puede resultar en valores de IC50 calculados generalmente más altos, no afecta la clasificación de afinidad relativa ni las predicciones posteriores de la evaluación de riesgos. Además, el ensayo FP es rentable, eficiente en el tiempo y capaz de examinar una amplia gama de compuestos por su afinidad hacia múltiples receptores nucleares. En general, el cribado de alto rendimiento de ligandos ambientales basado en FP facilita la identificación rápida de contaminantes ambientales tóxicos.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención Nº 82103875).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
C1-BODIPY-C12 SondaThermo Fisher Scientific, China102209-82-3Se une a PPARγ-LBD y emite fluorescencia.
Coomassie Brilliant Blue R-250Solarbio, China6104-59-2Tiñe las bandas de proteínas.
Prisma GraphPadDotmaticshttps://www.graphpad.com/features
imidazolSolarbio, ChinaI8090Prepare tampones para el proceso de purificación de proteínas.
Isopropil β-D-1-tiogalactopiranósidoSolarbio, China367-93-1Inducir la expresión de PPARγ-LBD
Lector de microplacasBiotek, EE. UU. Sinergia H1 Detección del valor de FP
NaClShanghai Reactivo7647-15-5Prepare tampones para el proceso de purificación de proteínas.
NaH2PO4 · 2H2OReactivo de Shanghái13472-35-0Prepare tampones para el proceso de purificación de proteínas.
Ni NTA Beads 6FFSmart-Lifesciences, ChinaSA005005Purificación de proteínas.
Origen 8.5 OriginLab, Northampton, MA, EE. UU.
Ácido perfluorooctanosulfónico (PFOS)J& K Scientific Ltd, China1763-23-1Los contaminantes ambientales detectados
Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)Solarbio, ChinaP0100Inhibe la degradación de proteínas.
PPARγ-Kit de ensayo de la competenciaThermo Fisher ScientificPV6136https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136
PPARγ-Kit de ensayo de detección de ligandos LBDCaimán 600616https://www.caymanchem.com/product/600616
Rosiglitazona (Rosi)aladdin, China122320-73-4Los agonistas de PPARγ
AgitadorZHICHENG, ChinaZWY-211C Expansión delcultivo bacteriano e inducción de la expresión de proteínas
Fosfato de trifenilo (TPHP)Macklin, ChinaT819317Los contaminantes ambientales detectados
TrisSolarbio, ChinaT8230Prepare tampones para el proceso de purificación de proteínas.
TryptoneOXOID Limited, ChinaLP0042BPrepare caldo de lisogén (LB) medio.
Limpiador ultrasónicoKimberly, ChinaLHO-1Interrumpe las bacterias para lograr una lisis completa
UreaSolarbio, ChinaU8020Prepare tampones para el proceso de purificación de proteínas.
Extracto de levaduraOXOID Limited, ChinaLP0021BPrepare Caldo de Lisogenia (LB) medio.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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