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Artículo de método

Una plataforma de apoyo a la toma de decisiones médicas para identificar la trombospondina 1 en la enfermedad del hígado graso no alcohólico mediante análisis de inmunoinfiltración

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DOI:

10.3791/67328

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30 de agosto de 2024

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1Department of Geriatric Cardiology, General Hospital of Southern Theater Command, 2Guangzhou Key Laboratory of Cardiac Rehabilitation, 3Branch of National Clinical Research Center for Geriatric Diseases, Chinese PLA General Hospital, 4The First School of Clinical Medicine, Southern Medical University, 5Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Cardiovascular Department/The Second School of Clinical Medicine, Southern Medical University, 6Department of Electronics & Communication Engineering, Mepco Schlenk Engineering College, 7Department of Teleinformatics Engineering, Federal University of Ceará

En este artículo

Resumen

Este estudio investigó las relaciones entre la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) y el infarto de miocardio (IM) a través de genes coexpresados, identificando la trombospondina 1 (THBS1) como biomarcador. El análisis de inmunoinfiltración reveló que las células T CD8+ y los neutrófilos eran factores clave, y que THBS1 mostraba potencial como herramienta diagnóstica para la EHGNA y el infarto de miocardio.

Resumen

La enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) y el infarto de miocardio (IM) son dos de las principales cargas para la salud con una prevalencia y mortalidad significativas. Este estudio tuvo como objetivo explorar los genes coexpresados para comprender la relación entre la EHGNA y el IM e identificar posibles biomarcadores cruciales de IM relacionados con la EHGNA mediante bioinformática y aprendizaje automático. Se llevó a cabo un análisis de enriquecimiento funcional, se construyó un diagrama de red de interacción coproteína-proteína (PPI) y se emplearon técnicas de eliminación de características recursivas de máquina de vectores de soporte (SVM-RFE) y operador de selección y contracción mínima absoluta (LASSO) para identificar un gen expresado diferencialmente (DEG), la trombospondina 1 (THBS1). THBS1 demostró un fuerte rendimiento en la distinción de pacientes con EHGNA (AUC = 0,981) y pacientes con IM (AUC = 0,900). El análisis de inmunoinfiltración reveló linfocitos T CD8+ significativamente más bajos y niveles más altos de neutrófilos en pacientes con EHGNA e IM. Los linfocitos T CD8+ y neutrófilos fueron efectivos para distinguir la EHGNA/IM de los controles sanos. El análisis de correlación mostró que THBS1 se correlacionó positivamente con CCR (receptor de quimiocinas), clase MHC (clase de complejo mayor de histocompatibilidad), neutrófilos, parainflamación y Tfh (células T auxiliares foliculares), y se correlacionó negativamente con células T CD8+, actividad citolítica y TIL (linfocitos infiltrantes de tumores) en pacientes con EHGNA e IM. THBS1 surgió como un nuevo biomarcador para el diagnóstico de NAFLD/MI en comparación con controles sanos. Los resultados indican que las células T CD8+ y los neutrófilos podrían servir como características inmunitarias inflamatorias para diferenciar a los pacientes con EHGNA/IM de los individuos sanos.

Introducción

La enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) es un importante problema de salud pública, con una prevalencia del 25%-30%1. Se ha reportado que la prevalencia de EHGNA es alta entre los pacientes con diabetes2. Sin embargo, la importancia de la EHGNA en pacientes no diabéticos aún no está clara. Los estudios han sugerido que la EHGNA desempeña un papel independiente en la patogénesis de la aterosclerosis 3,4. Además, un metaanálisis ha demostrado que la EHGNA está estrechamente asociada con la calcificación de las arterias coronarias, la disfunción endotelial y la aterosclerosis, y ha surgido como un factor de riesgo cardiovascular independiente5. La conexión entre la EHGNA y las enfermedades cardiovasculares aún requiere más investigación.

El infarto de miocardio (IM) es una enfermedad catastrófica que amenaza la salud e impone una importante carga económica a los pacientes y sus familias en todo el mundo6. El infarto de miocardio también es una causa importante de muerte en pacientes con EHGNA. Un estudio clínico publicado en el British Medical Journal ha demostrado que el riesgo de infarto de miocardio en pacientes con EHGNA es 1,17 veces mayor que en pacientes sin EHGNA7,8. Algunos estudios han identificado vías moleculares, como la inflamación, el estrés oxidativo y el metabolismo de los lípidos, que contribuyen al infarto de miocardio relacionado con la EHGNA 9,10,11. Sin embargo, los mecanismos subyacentes que vinculan la EHGNA y el IM siguen sin estar claros. Es crucial identificar nuevos biomarcadores relacionados con el pronóstico de la EHGNA y el IM.

La creciente prevalencia de la EHGNA, que afecta a un amplio segmento de la población, pone de relieve un importante problema de salud pública, en particular dada su asociación con la diabetes. Sin embargo, el impacto de la EHGNA en los pacientes no diabéticos sigue siendo poco conocido. La EHGNA se ha implicado en la patogénesis de la aterosclerosis y se reconoce como un factor de riesgo cardiovascular independiente, estando estrechamente relacionado con la calcificación de las arterias coronarias, la disfunción endotelial y la aterosclerosis. A pesar de estas asociaciones, los mecanismos precisos que unen la EHGNA y las enfermedades cardiovasculares como el infarto de miocardio (IM) requieren una mayor elucidación. El infarto de miocardio es una de las principales causas de mortalidad en todo el mundo e impone una importante carga económica. El riesgo de infarto de miocardio en los pacientes con EHGNA es notablemente mayor que en aquellos sin EHGNA, lo que pone de relieve la necesidad de una comprensión más profunda de las vías moleculares que conectan estas afecciones. Si bien se ha sugerido que la inflamación, el estrés oxidativo y el metabolismo de los lípidos son factores contribuyentes, los mecanismos exactos siguen sin estar claros. Existe una necesidad urgente de identificar nuevos biomarcadores que puedan proporcionar información sobre el pronóstico y el tratamiento del infarto de miocardio relacionado con la EHGNA.

En consecuencia, en este estudio, se descargaron conjuntos de datos de microarrays de ARN para NAFLD y MI del Centro Nacional de Información Biotecnológica-Ómnibus de Expresión Génica (NCBI-GEO, ver Tabla de Materiales) para identificar y analizar la interacción de genes expresados diferencialmente (DEG) entre NAFLD y MI. Análisis de enriquecimiento, construcción de diagramas de red de interacción proteína-proteína (PPI), eliminación de características recursivas de máquina de vectores de soporte (SVM-RFE), y se utilizaron algoritmos de operador de selección y contracción mínima absoluta (LASSO) para identificar los genes hub 12,13,14,15,16,17,18,19. Se realizó un análisis de inmunoinfiltración para examinar las células inmunitarias en pacientes con EHGNA y IM. En última instancia, estos métodos se integraron para dilucidar la relación entre la EHGNA y el IM. La Figura 1 ilustra la secuencia de diseño seguida en este estudio. Mediante la combinación de la bioinformática, el aprendizaje automático y el análisis de inmunoinfiltración, este estudio pretende contribuir al desarrollo de una nueva plataforma de apoyo a la toma de decisiones médicas.

Las contribuciones clave de este artículo son: (1) Identificación de genes co-expresados: El estudio destaca la relación entre NAFLD y MI mediante la identificación de genes co-expresados, ofreciendo una comprensión más profunda de los vínculos moleculares entre estas dos condiciones. (2) Aplicación de la bioinformática y el aprendizaje automático: Utilizando técnicas de bioinformática y aprendizaje automático, incluida la eliminación de características recursivas de máquina de vectores de soporte (SVM-RFE)17 y el operador de selección y contracción mínima absoluta (LASSO)19, el estudio identifica THBS1 como un gen expresado diferencialmente. THBS1 demuestra un alto rendimiento en la distinción de los pacientes con EHGNA e IM de los controles sanos. (3) Análisis de inmunoinfiltración: El estudio realiza un análisis de inmunoinfiltración, revelando niveles significativamente más bajos de células T CD8+ y niveles más altos de neutrófilos en pacientes con NAFLD e IM. (4) Análisis de correlación: La investigación demuestra que THBS1 se correlaciona positivamente con varios factores inmunológicos, incluidos CCR (receptor de quimiocinas), MHC clase I (complejo mayor de histocompatibilidad clase I), neutrófilos, parainflamación, y células Tfh (T auxiliares foliculares). Se correlaciona negativamente con las células T CD8+, la actividad citolítica y los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL).

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Protocolo

Los detalles de las bases de datos, los enlaces web y el software/paquetes utilizados se enumeran en la Tabla de materiales. Los parámetros de simulación utilizados se proporcionan en la Tabla 1.

1. Obtención de conjuntos de datos de microarrays de ARN

  1. Descargue el conjunto de datos de infarto de miocardio (IM), GSE66360, de la base de datos NCBI-GEO .
  2. Descargue el conjunto de datos de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD, por sus siglas en inglés), GSE89632, de la base de datos NCBI-GEO .
  3. Asegúrese de que los conjuntos de datos descargados incluyan 49 muestras de IM, 50 controles en buen estado para GSE66360, 39 muestras de NAFLD y 24 controles en buen estado para GSE89632.

2. Identificación de los DEG

  1. Preprocesamiento de datos e identificación DEG
    1. Cargue los conjuntos de datos en RStudio mediante las funciones de R adecuadas.
    2. Utilice el paquete R limma para identificar los DEG12 con los siguientes umbrales: P < 0.05P y | log FC | > 1.5.
    3. Utilice los paquetes de R pheatmap, ggplot2 y Venn para generar mapas de calor y diagramas de Venn para visualizar DEG.
  2. Crear visualizaciones
    1. Utilice pheatmap para generar mapas de calor de DEGs.
    2. Utilice ggplot2 para crear diagramas de Venn que muestren la superposición de DEG entre NAFLD y MI.

3. Análisis de enriquecimiento

  1. Realizar análisis de enriquecimiento de GO, KEGG y OD
    1. Cargue DEG en el paquete de R clusterProfiler13.
    2. Realizar análisis de enriquecimiento de ontología génica (GO) para categorizar los DEG en funciones moleculares, procesos biológicos y componentes celulares.
    3. Realice análisis de vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) para mapear DEG en vías bioquímicas.
    4. Utilice el análisis de enriquecimiento de la ontología de la enfermedad (DO) para vincular los DEG a estados clínicos específicos.

4. Análisis de PPI mediante la construcción de redes de PPI

  1. Utilice la plataforma en línea STRING 14 para construir diagramas de red de interacción proteína-proteína (PPI) de co-DEG con una puntuación de confianza de 0,4.
  2. Visualice las redes PPI utilizando Cytoscape15.

5. Cribado de DEGs de centros candidatos mediante la aplicación de algoritmos de aprendizaje automático

  1. Utilice los algoritmos de regresión SVM-RFE (Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination) y LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) en RStudio para seleccionar los DEG 16,17,18 más relevantes.
  2. Asegúrese de que SVM-RFE clasifique y elimine entidades de forma iterativa, mientras que la regresión19 de LASSO aplica la regularización para identificar un conjunto disperso de DEG.

6. Construcción de la curva ROC para evaluar el rendimiento diagnóstico

  1. Utilice RStudio para realizar el análisis de la curva ROC (característica operativa del receptor)20.
  2. Calcule el área bajo la curva (AUC) para los co-DEG cruciales.

7. Análisis de inmunoinfiltración para explorar la infiltración inmunitaria

  1. Realice un análisis de enriquecimiento de conjuntos genéticos de una sola muestra (ssGSEA) utilizando los paquetes R GSVA y GSEABase para analizar la infiltración inmunitaria en NAFLD y MI21.
  2. Comparar la abundancia relativa de tipos de células inmunitarias entre muestras de NAFLD y MI y controles sanos.

8. Análisis estadístico

  1. Realice todos los análisis estadísticos en RStudio.
  2. Aplicar el análisis de correlación de Pearson para examinar los patrones de coexpresión génica.
  3. Asegure la significación estadística con P < 0,05.
    NOTA: Asegúrese de que todo el software y los paquetes de R estén instalados correctamente y actualizados a sus versiones más recientes antes de iniciar el protocolo.

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Resultados

A continuación se presentan los principales hallazgos del estudio propuesto, que abarca varios análisis realizados para dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a la EHGNA y el IM.

Identificación de DEGs
En el conjunto de datos de GSE89632, se identificaron 76 genes regulados al alza y 20 regulados a la baja como NAFLD-DEG (Figura 2B,D), mientras que el conjunto de datos GSE66360 reveló 118 genes regulados al alza y 8 ...

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Discusión

El método descrito en este estudio tiene implicaciones significativas para la investigación de los mecanismos moleculares que subyacen a la EHGNA y el IM. Al identificar biomarcadores clave como THBS1, el protocolo propuesto ofrece objetivos potenciales para intervenciones diagnósticas y terapéuticas. Este enfoque puede extenderse a otras enfermedades complejas que implican múltiples vías y respuestas inmunitarias, lo que facilita el descubrimiento de nuevos biomarcadores y dianas terapé...

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Agradecimientos

Este estudio contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 62271511, U21A200949), la Fundación Yucai del Hospital General del Comando del Teatro del Sur (2022NZC011), el Proyecto del Programa de Ciencia y Tecnología de Guangzhou (2023A03J0170), el Centro Nacional de Investigación Clínica de Geriatría (NCRCG-PLAGH-2023006) y la Fundación de Investigación Básica y Básica Aplicada de Guangdong (No.2020A1515010288, No.2021A1515220101).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CytoscapeCytoscape ConsortiumVersión 3.6.1Se utiliza para visualizar redes de interacción proteína-proteína (PPI)
GSE66360 del conjunto de datos MI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).Base de datos NCBI-GEO -Para recopilar conjuntos de datos de microarrays de ARN para análisis
Paquete R clusterProfilerBioconductor -Utilizado para análisis de enriquecimiento GO, KEGG y DO
Paquete R ggplot2CRAN -Utilizado para crear diagramas de Venn y otras visualizaciones
Paquete R GSEABaseBioconductor -Utilizado junto con GSVA para el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes
Paquete R GSVABioconductor -Utilizado para el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes de una sola muestra (ssGSEA)
Paquete R limmaBioconductor -Utilizado para identificar genes expresados diferencialmente (DEGs)
Paquete R pheatmapCRAN -Utilizado para generar mapas
de calor Paquete R vennCRAN -Utilizado para crear diagramas de Venn
Conjuntos de datos de microarrays de ARN (GSE66360, GSE89632)NCBI-GEO -Conjuntos de datos de microarrays de ARN disponibles públicamente utilizados para el análisis
RStudioRStudio, PBCVersión 1.4.1717Entorno de desarrollo integrado para
la base de datos R StringSTRING (www.string-db.org/) -Herramienta en línea para la construcción de redes PPI

Referencias

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