Artículo de método

Una plataforma de apoyo a la toma de decisiones médicas para identificar la trombospondina 1 en la enfermedad del hígado graso no alcohólico mediante análisis de inmunoinfiltración

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DOI:

10.3791/67328

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30 de agosto de 2024

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1Department of Geriatric Cardiology, General Hospital of Southern Theater Command, 2Guangzhou Key Laboratory of Cardiac Rehabilitation, 3Branch of National Clinical Research Center for Geriatric Diseases, Chinese PLA General Hospital, 4The First School of Clinical Medicine, Southern Medical University, 5Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Cardiovascular Department/The Second School of Clinical Medicine, Southern Medical University, 6Department of Electronics & Communication Engineering, Mepco Schlenk Engineering College, 7Department of Teleinformatics Engineering, Federal University of Ceará

En este artículo

Resumen

Este estudio investigó las relaciones entre la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) y el infarto de miocardio (IM) a través de genes coexpresados, identificando la trombospondina 1 (THBS1) como biomarcador. El análisis de inmunoinfiltración reveló que las células T CD8+ y los neutrófilos eran factores clave, y que THBS1 mostraba potencial como herramienta diagnóstica para la EHGNA y el infarto de miocardio.

Resumen

La enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) y el infarto de miocardio (IM) son dos de las principales cargas para la salud con una prevalencia y mortalidad significativas. Este estudio tuvo como objetivo explorar los genes coexpresados para comprender la relación entre la EHGNA y el IM e identificar posibles biomarcadores cruciales de IM relacionados con la EHGNA mediante bioinformática y aprendizaje automático. Se llevó a cabo un análisis de enriquecimiento funcional, se construyó un diagrama de red de interacción coproteína-proteína (PPI) y se emplearon técnicas de eliminación de características recursivas de máquina de vectores de soporte (SVM-RFE) y operador de selección y contracción mínima absoluta (LASSO) para identificar un gen expresado diferencialmente (DEG), la trombospondina 1 (THBS1). THBS1 demostró un fuerte rendimiento en la distinción de pacientes con EHGNA (AUC = 0,981) y pacientes con IM (AUC = 0,900). El análisis de inmunoinfiltración reveló linfocitos T CD8+ significativamente más bajos y niveles más altos de neutrófilos en pacientes con EHGNA e IM. Los linfocitos T CD8+ y neutrófilos fueron efectivos para distinguir la EHGNA/IM de los controles sanos. El análisis de correlación mostró que THBS1 se correlacionó positivamente con CCR (receptor de quimiocinas), clase MHC (clase de complejo mayor de histocompatibilidad), neutrófilos, parainflamación y Tfh (células T auxiliares foliculares), y se correlacionó negativamente con células T CD8+, actividad citolítica y TIL (linfocitos infiltrantes de tumores) en pacientes con EHGNA e IM. THBS1 surgió como un nuevo biomarcador para el diagnóstico de NAFLD/MI en comparación con controles sanos. Los resultados indican que las células T CD8+ y los neutrófilos podrían servir como características inmunitarias inflamatorias para diferenciar a los pacientes con EHGNA/IM de los individuos sanos.

Introducción

La enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) es un importante problema de salud pública, con una prevalencia del 25%-30%1. Se ha reportado que la prevalencia de EHGNA es alta entre los pacientes con diabetes2. Sin embargo, la importancia de la EHGNA en pacientes no diabéticos aún no está clara. Los estudios han sugerido que la EHGNA desempeña un papel independiente en la patogénesis de la aterosclerosis 3,4. Además, un metaanálisis ha demostrado que la EHGNA está estrechamente asociada con la calcificación de las arterias coronarias, la disfunción endotelial y la aterosclerosis, y ha surgido como un factor de riesgo cardiovascular independiente5. La conexión entre la EHGNA y las enfermedades cardiovasculares aún requiere más investigación.

El infarto de miocardio (IM) es una enfermedad catastrófica que amenaza la salud e impone una importante carga económica a los pacientes y sus familias en todo el mundo6. El infarto de miocardio también es una causa importante de muerte en pacientes con EHGNA. Un estudio clínico publicado en el British Medical Journal ha demostrado que el riesgo de infarto de miocardio en pacientes con EHGNA es 1,17 veces mayor que en pacientes sin EHGNA7,8. Algunos estudios han identificado vías moleculares, como la inflamación, el estrés oxidativo y el metabolismo de los lípidos, que contribuyen al infarto de miocardio relacionado con la EHGNA 9,10,11. Sin embargo, los mecanismos subyacentes que vinculan la EHGNA y el IM siguen sin estar claros. Es crucial identificar nuevos biomarcadores relacionados con el pronóstico de la EHGNA y el IM.

La creciente prevalencia de la EHGNA, que afecta a un amplio segmento de la población, pone de relieve un importante problema de salud pública, en particular dada su asociación con la diabetes. Sin embargo, el impacto de la EHGNA en los pacientes no diabéticos sigue siendo poco conocido. La EHGNA se ha implicado en la patogénesis de la aterosclerosis y se reconoce como un factor de riesgo cardiovascular independiente, estando estrechamente relacionado con la calcificación de las arterias coronarias, la disfunción endotelial y la aterosclerosis. A pesar de estas asociaciones, los mecanismos precisos que unen la EHGNA y las enfermedades cardiovasculares como el infarto de miocardio (IM) requieren una mayor elucidación. El infarto de miocardio es una de las principales causas de mortalidad en todo el mundo e impone una importante carga económica. El riesgo de infarto de miocardio en los pacientes con EHGNA es notablemente mayor que en aquellos sin EHGNA, lo que pone de relieve la necesidad de una comprensión más profunda de las vías moleculares que conectan estas afecciones. Si bien se ha sugerido que la inflamación, el estrés oxidativo y el metabolismo de los lípidos son factores contribuyentes, los mecanismos exactos siguen sin estar claros. Existe una necesidad urgente de identificar nuevos biomarcadores que puedan proporcionar información sobre el pronóstico y el tratamiento del infarto de miocardio relacionado con la EHGNA.

En consecuencia, en este estudio, se descargaron conjuntos de datos de microarrays de ARN para NAFLD y MI del Centro Nacional de Información Biotecnológica-Ómnibus de Expresión Génica (NCBI-GEO, ver Tabla de Materiales) para identificar y analizar la interacción de genes expresados diferencialmente (DEG) entre NAFLD y MI. Análisis de enriquecimiento, construcción de diagramas de red de interacción proteína-proteína (PPI), eliminación de características recursivas de máquina de vectores de soporte (SVM-RFE), y se utilizaron algoritmos de operador de selección y contracción mínima absoluta (LASSO) para identificar los genes hub 12,13,14,15,16,17,18,19. Se realizó un análisis de inmunoinfiltración para examinar las células inmunitarias en pacientes con EHGNA y IM. En última instancia, estos métodos se integraron para dilucidar la relación entre la EHGNA y el IM. La Figura 1 ilustra la secuencia de diseño seguida en este estudio. Mediante la combinación de la bioinformática, el aprendizaje automático y el análisis de inmunoinfiltración, este estudio pretende contribuir al desarrollo de una nueva plataforma de apoyo a la toma de decisiones médicas.

Las contribuciones clave de este artículo son: (1) Identificación de genes co-expresados: El estudio destaca la relación entre NAFLD y MI mediante la identificación de genes co-expresados, ofreciendo una comprensión más profunda de los vínculos moleculares entre estas dos condiciones. (2) Aplicación de la bioinformática y el aprendizaje automático: Utilizando técnicas de bioinformática y aprendizaje automático, incluida la eliminación de características recursivas de máquina de vectores de soporte (SVM-RFE)17 y el operador de selección y contracción mínima absoluta (LASSO)19, el estudio identifica THBS1 como un gen expresado diferencialmente. THBS1 demuestra un alto rendimiento en la distinción de los pacientes con EHGNA e IM de los controles sanos. (3) Análisis de inmunoinfiltración: El estudio realiza un análisis de inmunoinfiltración, revelando niveles significativamente más bajos de células T CD8+ y niveles más altos de neutrófilos en pacientes con NAFLD e IM. (4) Análisis de correlación: La investigación demuestra que THBS1 se correlaciona positivamente con varios factores inmunológicos, incluidos CCR (receptor de quimiocinas), MHC clase I (complejo mayor de histocompatibilidad clase I), neutrófilos, parainflamación, y células Tfh (T auxiliares foliculares). Se correlaciona negativamente con las células T CD8+, la actividad citolítica y los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL).

Protocolo

Los detalles de las bases de datos, los enlaces web y el software/paquetes utilizados se enumeran en la Tabla de materiales. Los parámetros de simulación utilizados se proporcionan en la Tabla 1.

1. Obtención de conjuntos de datos de microarrays de ARN

  1. Descargue el conjunto de datos de infarto de miocardio (IM), GSE66360, de la base de datos NCBI-GEO .
  2. Descargue el conjunto de datos de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD, por sus siglas en inglés), GSE89632, de la base de datos NCBI-GEO .
  3. Asegúrese de que los conjuntos de datos descargados incluyan 49 muestras de IM, 50 controles en buen estado para GSE66360, 39 muestras de NAFLD y 24 controles en buen estado para GSE89632.

2. Identificación de los DEG

  1. Preprocesamiento de datos e identificación DEG
    1. Cargue los conjuntos de datos en RStudio mediante las funciones de R adecuadas.
    2. Utilice el paquete R limma para identificar los DEG12 con los siguientes umbrales: P < 0.05P y | log FC | > 1.5.
    3. Utilice los paquetes de R pheatmap, ggplot2 y Venn para generar mapas de calor y diagramas de Venn para visualizar DEG.
  2. Crear visualizaciones
    1. Utilice pheatmap para generar mapas de calor de DEGs.
    2. Utilice ggplot2 para crear diagramas de Venn que muestren la superposición de DEG entre NAFLD y MI.

3. Análisis de enriquecimiento

  1. Realizar análisis de enriquecimiento de GO, KEGG y OD
    1. Cargue DEG en el paquete de R clusterProfiler13.
    2. Realizar análisis de enriquecimiento de ontología génica (GO) para categorizar los DEG en funciones moleculares, procesos biológicos y componentes celulares.
    3. Realice análisis de vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) para mapear DEG en vías bioquímicas.
    4. Utilice el análisis de enriquecimiento de la ontología de la enfermedad (DO) para vincular los DEG a estados clínicos específicos.

4. Análisis de PPI mediante la construcción de redes de PPI

  1. Utilice la plataforma en línea STRING 14 para construir diagramas de red de interacción proteína-proteína (PPI) de co-DEG con una puntuación de confianza de 0,4.
  2. Visualice las redes PPI utilizando Cytoscape15.

5. Cribado de DEGs de centros candidatos mediante la aplicación de algoritmos de aprendizaje automático

  1. Utilice los algoritmos de regresión SVM-RFE (Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination) y LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) en RStudio para seleccionar los DEG 16,17,18 más relevantes.
  2. Asegúrese de que SVM-RFE clasifique y elimine entidades de forma iterativa, mientras que la regresión19 de LASSO aplica la regularización para identificar un conjunto disperso de DEG.

6. Construcción de la curva ROC para evaluar el rendimiento diagnóstico

  1. Utilice RStudio para realizar el análisis de la curva ROC (característica operativa del receptor)20.
  2. Calcule el área bajo la curva (AUC) para los co-DEG cruciales.

7. Análisis de inmunoinfiltración para explorar la infiltración inmunitaria

  1. Realice un análisis de enriquecimiento de conjuntos genéticos de una sola muestra (ssGSEA) utilizando los paquetes R GSVA y GSEABase para analizar la infiltración inmunitaria en NAFLD y MI21.
  2. Comparar la abundancia relativa de tipos de células inmunitarias entre muestras de NAFLD y MI y controles sanos.

8. Análisis estadístico

  1. Realice todos los análisis estadísticos en RStudio.
  2. Aplicar el análisis de correlación de Pearson para examinar los patrones de coexpresión génica.
  3. Asegure la significación estadística con P < 0,05.
    NOTA: Asegúrese de que todo el software y los paquetes de R estén instalados correctamente y actualizados a sus versiones más recientes antes de iniciar el protocolo.

Resultados

A continuación se presentan los principales hallazgos del estudio propuesto, que abarca varios análisis realizados para dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a la EHGNA y el IM.

Identificación de DEGs
En el conjunto de datos de GSE89632, se identificaron 76 genes regulados al alza y 20 regulados a la baja como NAFLD-DEG (Figura 2B,D), mientras que el conjunto de datos GSE66360 reveló 118 genes regulados al alza y 8 a la baja como MI-DEG (Figura 2C,E). Posteriormente, los co-DEG se derivaron de la superposición entre los NAFLD-DEG y los MI-DEGs, identificando 13 DEGs regulados al alza y 1 DEG regulados a la baja entre los co-DEG (Figura 2A).

La identificación de los DEG exclusivos de la EHGNA y el IM, así como los comunes a ambos trastornos, proporciona información valiosa sobre los procesos moleculares que subyacen a estas enfermedades. La comprensión de los patrones de expresión génica distintos y compartidos relacionados con ambas afecciones ayuda a aclarar la fisiopatología de la EHGNA y el infarto de miocardio y puede identificar posibles objetivos moleculares para la intervención terapéutica. Una investigación más profunda sobre los co-DEG podría revelar reguladores críticos o vías esenciales para la interacción entre estos dos trastornos, lo que facilitaría el desarrollo de terapias dirigidas destinadas a mitigar los resultados negativos para la salud asociados con la EHGNA y el IM.

Análisis de enriquecimiento
El análisis de GO reveló que los DEG de NAFLD se enriquecieron principalmente en los siguientes procesos biológicos (BP): diferenciación de células grasas, respuesta a lipopolisacáridos y procesos de organismos multicelulares (p < 0.05, Figura 3A). Para los componentes celulares (CC), los DEG de NAFLD se asociaron principalmente con el complejo fosfatidilinositol 3-cinasa, la luz del gránulo secretor y la luz de la vesícula citoplasmática (p < 0,05, Figura 3A). En términos de función molecular (MF), las actividades clave incluyeron la actividad reguladora de la fosfatidilinositol-3-quinasa, la actividad activadora de la transcripción de unión al ADN (específica de la ARN polimerasa) y la actividad general del activador de la transcripción de la unión al ADN (p < 0,05, Figura 3A).

Para los MI-DEGs, el análisis de PA mostró enriquecimiento en la quimiotaxis de leucocitos, activación de leucocitos mieloides y quimiotaxis celular (p < 0,05, Figura 3B). El análisis de CC destacó el enriquecimiento en gránulos terciarios, gránulos ricos en ficolina-1 y lumen de gránulos secretores (p < 0,05, Figura 3B). El análisis MF reveló un enriquecimiento en la actividad del receptor de reconocimiento de patrones, la unión al receptor RAGE y la actividad del receptor inmune (p < 0,05, Figura 3B).

El análisis de enriquecimiento de KEGG indicó que las NAFLD-DEG se enriquecieron significativamente en las siguientes vías: IL-17, AGE-RAGE, TNF, diferenciación de osteoclastos, malaria, artritis reumatoide, enfermedad de Chagas y vías de señalización JAK-STAT (p < 0,05, Figura 3C). Los MI-DEGs se enriquecieron en IL-17, TNF, metabolismo lipídico y aterosclerosis, señalización de receptores tipo Toll, señalización de receptores de lectina tipo C, legionelosis, artritis reumatoide y vías de señalización de NF-κB (p < 0,05, Figura 3D). El análisis de enriquecimiento de la ontología de la enfermedad (OD) demostró que los tres DEG principales tanto para la EHGNA como para el IM se asociaron significativamente con la aterosclerosis, la enfermedad cardiovascular arteriosclerótica y la arteriosclerosis (p < 0,05, Figura 3E-F).

Análisis de diagramas de red PPI
En el diagrama de red PPI para NAFLD, se identificaron 92 nodos y 250 bordes, lo que refleja una red compleja de interacciones entre proteínas asociadas con esta condición. De manera similar, el diagrama de red PPI para el infarto de miocardio reveló 117 ganglios y 587 bordes, lo que indica una red más intrincada característica del paisaje molecular del infarto de miocardio. Además, los diagramas de red PPI para co-DEG identificaron 14 nodos y 21 bordes, lo que destaca las posibles interacciones clave entre las proteínas compartidas entre NAFLD y MI (Figura 4A-F).

Las redes PPI son valiosas para construir y analizar dianas terapéuticas y proporcionan información importante sobre las conexiones moleculares que subyacen a la EHGNA y la IM. Las topologías de red únicas observadas en la EHGNA y el IM enfatizan los distintos mecanismos fisiopatológicos involucrados en estas enfermedades. Por otra parte, el descubrimiento de conexiones compartidas entre co-DEG sugiere posibles vías compartidas o redes reguladoras que median la interacción entre la IM y la EHGNA. Investigaciones adicionales sobre estas conexiones podrían revelar nuevos objetivos moleculares para la intervención y el desarrollo de terapias, lo que podría ofrecer nuevas opciones de tratamiento para estas enfermedades complejas.

Cribado de DEGs del centro de candidatos
Se empleó el algoritmo SVM-RFE17 para detectar posibles DEG cruciales, lo que resultó en la identificación de 6 genes en GSE89632 y 4 genes en GSE66360 (Figura 5A,B). De manera similar, se utilizó el algoritmo LASSO19 para identificar DEG cruciales candidatos, produciendo 4 genes en GSE89632 y 5 genes en GSE66360 (Figura 5C,D). En particular, un diagrama de Venn representó la intersección del centro DEG (THBS1) identificado por los análisis de redes SVM-RFE, LASSO y co-PPI, lo que subraya su importancia en la patogénesis de la NAFLD y la IM (Figura 5F).

Estos algoritmos avanzados de aprendizaje automático proporcionaron un marco sólido para identificar los DEG clave asociados con el IM y la EHGNA y ofrecieron información valiosa sobre su potencial como objetivos terapéuticos o de diagnóstico. La identificación de THBS1 como un gen hub a través de múltiples técnicas analíticas pone de manifiesto su importancia en las vías moleculares que subyacen a ambas enfermedades. Investigaciones adicionales sobre la importancia funcional de THBS1 y sus interacciones dentro de la red co-PPI podrían dilucidar nuevos mecanismos que vinculan la NAFLD y el IM, lo que podría allanar el camino para terapias dirigidas y estrategias de medicina de precisión.

Valor de diagnóstico de los DEG de un concentrador
Se llevó a cabo un análisis ROC para evaluar la eficiencia diagnóstica de los DEG de hub identificados en los conjuntos de datos de NAFLD y MI. Como se muestra en la Figura 6A,B, THBS1 demostró un alto poder discriminatorio, con un AUC de 0,981 (IC del 95%: 0,949-1,000) en pacientes con EHGNA y de 0,900 (IC del 95%: 0,834-0,956) en pacientes con IM. El sólido rendimiento de THBS1 como biomarcador de diagnóstico pone de manifiesto su utilidad potencial para diferenciar entre NAFLD, IM y controles sanos.

Estos resultados sugieren que THBS1 podría servir como un marcador valioso para el estado de la enfermedad, ofreciendo a los médicos una herramienta útil para la evaluación de riesgos y la identificación temprana. Para facilitar la integración de THBS1 en la práctica clínica y mejorar la atención y el tratamiento de los pacientes, se necesitan más estudios de validación para confirmar su precisión diagnóstica en diversas poblaciones de pacientes y entornos clínicos.

Análisis de infiltración inmunitaria
Se llevó a cabo ssGSEA para analizar 29 genes relacionados con el sistema inmunológico entre NAFLD/MI y el grupo de control (CON). En comparación con el grupo CON, la infiltración de células inmunitarias aumentó significativamente en los grupos de NAFLD y MI, particularmente para CCR, MHC clase I, neutrófilos, parainflamación y células Tfh (p < 0,05, Figura 7A,B). Por el contrario, la infiltración de células inmunitarias disminuyó notablemente en los grupos de EHGNA e IM en relación con el grupo CON, especialmente para las células T CD8+, la actividad citolítica y los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) (p < 0,05, Figura 7C,D).

Estos resultados sugieren una desregulación de la infiltración de células inmunitarias tanto en la EHGNA como en el IM, lo que pone de manifiesto el complejo panorama inmunológico asociado a estas afecciones. Los cambios observados en la composición de las células inmunitarias proporcionan información valiosa sobre los procesos inmunológicos que subyacen al desarrollo y la fisiopatología de estas enfermedades. Una mayor comprensión de estas características inmunitarias podría revelar nuevos objetivos terapéuticos para la intervención y apoyar el desarrollo de planes de tratamiento individualizados basados en los perfiles inmunológicos de los pacientes con EHGNA e IM.

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Figura 1: Secuencia de diseño del sistema de apoyo a la toma de decisiones médicas para identificar la THBS1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Diagramas de Venn, diagramas de volcanes y mapas de calor. (A) Diagrama de Venn para GSE89632 y GSE66360. (B) Un diagrama volcánico de genes expresados diferencialmente (DEGs) en GSE89632. (C) Un diagrama volcánico de DEGs en GSE66360. (D) Un diagrama de mapa de calor de los DEG en GSE89632. (E) Un diagrama de mapa de calor de los DEG en GSE66360. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Análisis de enriquecimiento de genes expresados diferencialmente (DEGs). (A) Los cinco principales NALFD-DEGs enriquecieron la ontología génica (GO) en el proceso biológico (BP), el componente celular (CC) y la función molecular (MF). (B) Los cinco principales MI-DEG enriquecieron GO en BP, CC y MF. (C) Los ocho principales NALFD-DEG enriquecieron las vías de señalización de la enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG). (D) Los ocho MI-DEG principales enriquecieron las vías de señalización KEGG. (E) Los cinco principales NALFD-DEG enriquecieron la ontología de la enfermedad (DO). (F) Los cinco principales MI-DEG enriquecidos con OD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Diagramas de red de interacción proteína-proteína (PPI). (A) Un diagrama de red de PPI de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) obtenido de la plataforma en línea String. (B) Un diagrama de red PPI de NAFLD obtenido de Cytoscape. (C) Un diagrama de red de IBP de infarto de miocardio (IM) obtenido de la plataforma en línea String. (D) Un diagrama de red PPI de MI obtenido Cytoscape. (E) Un diagrama de red PPI de interacciones de proteínas. (F) Un diagrama de red PPI de IL1B y FOS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Cribado de DEGs del centro candidato. (A) Seis DEG cruciales obtenidos por SVM-RFE en NAFLD. (B) Cuatro DEGs cruciales obtenidos por SVM-RFE en el infarto de miocardio (IM). (C) Cuatro DEG cruciales obtenidos por LASSO en NAFLD. (D) Cinco DEG cruciales obtenidos por LASSO en MI. (E) Solo un DEG adquirido a partir de los resultados anteriores en el diagrama de Venn. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Valor diagnóstico de un gen expresado diferencialmente (DEGs) central. (A) Curvas ROC en NAFLD. (B) Curvas ROC en MI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Distribución de las células inmunitarias infiltrantes y correlación entre THBS1 y las células inmunitarias infiltrantes en la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) y el infarto de miocardio (IM). (A) Distribución de las células inmunitarias infiltrantes en la EHGNA. (B) Distribución de las células inmunitarias infiltrantes en el MI. (C) Correlación entre THBS1 y las células inmunitarias infiltrantes en la EHGNA. (D) Correlación entre THBS1 y las células inmunitarias infiltrantes en el infarto de miocardio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

AbreviaturaNomenclatura
AUCÁrea bajo curva
BPProceso biológico
CCComponente celular
CONTRAMandos
GRADOSGenes expresados diferencialmente
HACEROntología de la enfermedad
IROntología genética
KEGGEnciclopedia de Genes y Genomas de Kioto
LAZOOperador de selección y contracción absoluta mínima
MFFunción molecular
MIInfarto de miocardio
HÍGADO NAFLDEnfermedad del hígado graso no alcohólico
PPIInteracción proteína-proteína
ROCCurvas características del operador receptor
ssGSEAAnálisis de enriquecimiento de conjuntos genéticos de una sola muestra
SVM-RFEAdmite la eliminación de características recursivas de máquina vectorial
THBS1Trombospondina 1

Tabla 1: Parámetros de simulación utilizados en la experimentación.

Discusión

El método descrito en este estudio tiene implicaciones significativas para la investigación de los mecanismos moleculares que subyacen a la EHGNA y el IM. Al identificar biomarcadores clave como THBS1, el protocolo propuesto ofrece objetivos potenciales para intervenciones diagnósticas y terapéuticas. Este enfoque puede extenderse a otras enfermedades complejas que implican múltiples vías y respuestas inmunitarias, lo que facilita el descubrimiento de nuevos biomarcadores y dianas terapéuticas. Además, la integración de técnicas de bioinformática y aprendizaje automático proporciona un marco versátil para la medicina personalizada, lo que permite estrategias de tratamiento personalizadas basadas en perfiles moleculares individuales. Este método también se puede adaptar para su uso en entornos clínicos para mejorar la precisión del diagnóstico y mejorar los resultados de los pacientes a través de intervenciones específicas.

La EHGNA y el infarto de miocardio (IM) son dos de las principales cargas sanitarias con una prevalencia y mortalidad significativas. La EHGNA se caracteriza por la acumulación de lípidos en el hígado1. Cada vez hay más pruebas que sugieren que la EHGNA afecta negativamente no solo a la integridad estructural del corazón, sino también a su función, especialmente en el contexto del IM 22,23,24. Además, existen pruebas convincentes que indican una fuerte correlación entre la EHGNA y la aterosclerosis. Los estudios han encontrado que la prevalencia y la gravedad de la EHGNA en pacientes con infarto de miocardio no diabético están relacionadas con la enfermedad de las arterias coronarias25. Se ha demostrado que la EHGNA de moderada a grave es un factor de riesgo independiente, lo que triplica el riesgo de lesiones múltiples de las arterias coronarias4. Sin embargo, estos estudios se centran principalmente en la EHGNA y el IM, por lo que los mecanismos subyacentes de la asociación entre la EHGNA y la aterosclerosis aún no están claros. Por lo tanto, es crucial explorar estos mecanismos para prevenir el infarto de miocardio relacionado con la EHGNA.

En este estudio, se obtuvieron dos conjuntos de datos del NCBI-GEO. El análisis reveló 13 DEG regulados al alza y 1 DEG regulados a la baja entre NAFLD y MI. Se realizó un análisis de enriquecimiento funcional, se construyó un diagrama de red co-PPI y se emplearon dos algoritmos de aprendizaje automático para identificar los DEG centrales. Como resultado, THBS1 se identificó como un nuevo biomarcador con una eficiencia diagnóstica sobresaliente tanto para la EHGNA como para el IM. Support Vector Machine (SVM) es una técnica de aprendizaje automático supervisado ampliamente utilizada para la clasificación y la regresión17. La eliminación recursiva de características (RFE, por sus siglas en inglés) ayuda a seleccionar los genes más significativos de la muestra. El algoritmo de regresión LASSO19 aplica la regularización para mejorar la precisión de la predicción. Al combinar estos algoritmos con co-DEC, pudimos seleccionar los DEG óptimos.

Sobre la base del análisis que utilizó dos algoritmos de aprendizaje automático y co-DEGs, se identificó la trombospondina 1 (THBS1 o TSP1) como un centro de diagnóstico clave DEG. THBS1 es un miembro de las proteínas de la matriz extracelular y se detectó por primera vez en las plaquetas en respuesta a la estimulación de la trombina26. Varias células, incluidas las células endoteliales, las células estrelladas hepáticas y las células del músculo liso, pueden producir y secretar THBS1 en el espacio extracelular 27,28,29. THBS1 interactúa con CD36, un ligando conocido30, y ejerce un efecto antiangiogénico al regular CD3629,31, lo que subraya su importante papel en la enfermedad cardiovascular. Además, THBS1 puede regular la angiogénesis y la agregación plaquetaria a través de sus interacciones con receptores y proteínas como CD47, factor de crecimiento transformante β e integrinas32. Esto sugiere que THBS1 puede desempeñar un papel crucial en la formación de trombos, la ruptura de la placa vulnerable y la posterior remodelación ventricular durante el infarto de miocardio 33,34,35.

Además, el desarrollo de NAFLD está estrechamente asociado con la síntesis de proteínas secretadas en circulación. Un estudio fundamental publicado en EBioMedicine demostró que THBS1, como proteína secretada, podría servir como un nuevo biomarcador para la EHGNA. Este estudio también encontró que la administración exógena de THBS1 mejora la deposición de lípidos hepáticos al inhibir las vías de síntesis de lípidos36. En particular, se identificó a CD36 como un receptor clave para los efectos de THBS1 contra la EHGNA. Además, se ha demostrado que ABT-526, un péptido análogo de THBS1, inhibe la síntesis de lípidos en los hepatocitos. Estos hallazgos proporcionan nuevos conocimientos sobre el diagnóstico y el tratamiento de la EHGNA y sugieren que THBS1 podría ser un nuevo biomarcador tanto para la EHGNA como para el infarto de miocardio, ofreciendo una herramienta de diagnóstico rápida, sencilla y accesible.

La evidencia reciente destaca el papel crítico de las respuestas inmunoinflamatorias en la progresión de la EHGNA y el IM. Las características clave incluyen la expresión de citocinas, la regulación inmunitaria y la activación del sistema neuroendocrino. Wabitsch et al. demostraron que la metformina confiere hepatoprotección al inhibir la expresión de células T CD8+ en ratones NAFLD37. Dolejsi et al. reportaron una disminución en las células T CD8+ y una reducción significativa en la capacidad de reparación miocárdica38. Qin et al. encontraron que los neutrófilos, como parte del índice de inmunoinflamación sistémica, se asocian con la excreción urinaria de albúmina en pacientes con EHGNA39. Zhang et al. indicaron que la infiltración y degranulación de neutrófilos están involucradas tanto en la lesión como en los procesos de recuperación durante el IM27.

En consonancia con estos hallazgos, los resultados actuales revelaron un aumento de la infiltración de CCR, MHC clase I, neutrófilos, parainflamación y células Tfh, mientras que las células T CD8+, la actividad citolítica y el TIL disminuyeron en los pacientes con EHGNA e IM en comparación con los controles sanos. Además, el análisis de correlación mostró que THBS1 se correlacionó positivamente con CCR, MHC clase I, neutrófilos, parainflamación y células Tfh, y negativamente con células T CD8+, actividad citolítica y TIL en pacientes con NAFLD e IM. Estas observaciones sugieren que THBS1 puede contribuir a la modulación de las respuestas inmunitarias mediante el aumento de la CCR, el MHC de clase I, los neutrófilos, la parainflamación y las células Tph, al tiempo que disminuye las células T CD8+, la actividad citolítica y la TIL durante el desarrollo y la progresión de la EHGNA y el IM. Sin embargo, estas especulaciones justifican una investigación más profunda para confirmar el papel preciso de THBS1 en estos procesos.

Este estudio tuvo como objetivo dilucidar las conexiones moleculares entre la EHGNA y la IM utilizando enfoques integrales de bioinformática y aprendizaje automático. Los hallazgos identificaron 96 genes expresados diferencialmente (DEG) en NAFLD y 126 en IM, con 14 DEG superpuestos entre las dos condiciones. El análisis de enriquecimiento funcional reveló que estos DEG están involucrados en procesos y vías biológicas críticas, como la diferenciación de células grasas, la quimiotaxis de leucocitos y varias vías de señalización, incluidas IL-17, TNF y NF-κB. Estos resultados ponen de manifiesto la intrincada interacción de las vías inflamatorias y metabólicas en la EHGNA y el IM. La construcción de diagramas de red de interacción proteína-proteína (PPI), combinada con análisis de aprendizaje automático (SVM-RFE y LASSO), identificó a THBS1 como un gen central clave. THBS1 demostró un excelente rendimiento diagnóstico, con un área bajo la curva (AUC) de 0,981 para NAFLD y 0,900 para IM, lo que sugiere su potencial como un biomarcador robusto para ambas afecciones.

Además, el análisis de inmunoinfiltración reveló distintos perfiles de células inmunitarias en pacientes con NAFLD e IM en comparación con los controles sanos. Específicamente, los pacientes con NAFLD y MI mostraron una mayor infiltración de CCR, MHC clase I, neutrófilos, parainflamación y células Tfh, mientras que mostraron niveles disminuidos de células T CD8+, actividad citolítica y TIL. Estas características inmunitarias subrayan la naturaleza inflamatoria de ambas afecciones y ponen de manifiesto el papel de THBS1 en la modulación de las respuestas inmunitarias.

Este estudio proporciona nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares compartidos que subyacen a la NAFLD y el IM, con THBS1 emergiendo como un nuevo biomarcador para el diagnóstico y un posible objetivo terapéutico. Los hallazgos allanan el camino para futuras investigaciones sobre intervenciones específicas y estrategias de tratamiento personalizadas para pacientes con estas afecciones interconectadas. Mediante la integración de la bioinformática, el aprendizaje automático y el análisis de inmunoinfiltración, la investigación contribuye al desarrollo de una plataforma de apoyo a la toma de decisiones médicas destinada a mejorar el tratamiento clínico de la EHGNA y el infarto de miocardio.

Agradecimientos

Este estudio contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 62271511, U21A200949), la Fundación Yucai del Hospital General del Comando del Teatro del Sur (2022NZC011), el Proyecto del Programa de Ciencia y Tecnología de Guangzhou (2023A03J0170), el Centro Nacional de Investigación Clínica de Geriatría (NCRCG-PLAGH-2023006) y la Fundación de Investigación Básica y Básica Aplicada de Guangdong (No.2020A1515010288, No.2021A1515220101).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CytoscapeCytoscape ConsortiumVersión 3.6.1Se utiliza para visualizar redes de interacción proteína-proteína (PPI)
GSE66360 del conjunto de datos MI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).Base de datos NCBI-GEO -Para recopilar conjuntos de datos de microarrays de ARN para análisis
Paquete R clusterProfilerBioconductor -Utilizado para análisis de enriquecimiento GO, KEGG y DO
Paquete R ggplot2CRAN -Utilizado para crear diagramas de Venn y otras visualizaciones
Paquete R GSEABaseBioconductor -Utilizado junto con GSVA para el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes
Paquete R GSVABioconductor -Utilizado para el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes de una sola muestra (ssGSEA)
Paquete R limmaBioconductor -Utilizado para identificar genes expresados diferencialmente (DEGs)
Paquete R pheatmapCRAN -Utilizado para generar mapas
de calor Paquete R vennCRAN -Utilizado para crear diagramas de Venn
Conjuntos de datos de microarrays de ARN (GSE66360, GSE89632)NCBI-GEO -Conjuntos de datos de microarrays de ARN disponibles públicamente utilizados para el análisis
RStudioRStudio, PBCVersión 1.4.1717Entorno de desarrollo integrado para
la base de datos R StringSTRING (www.string-db.org/) -Herramienta en línea para la construcción de redes PPI

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