Artículo de método

Microbiota de los hormigueros de Atine: visualización de un paisaje microbiano mediante microscopía electrónica de barrido

DOI:

10.3791/67334

⸱

4 de octubre de 2024

 ,  ,  , 
1Institute of Biosciences, Rio Claro, Department of General and Applied Biology, São Paulo State University (UNESP), 2Plant Pathology and Nematology Department, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, University of São Paulo (USP)

En este artículo

Resumen

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Proponemos un protocolo optimizado de Microscopía Electrónica de Barrido para la visualización de muestras altamente heterogéneas y delicadas que contienen biomasa vegetal y fúngica, junto con microbiota y biofilm. Este protocolo permite describir las dimensiones espaciales de la organización de la microbiota.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En los ecosistemas a macroescala, como las selvas tropicales o los arrecifes de coral, la localización espacial de los organismos es la base de nuestra comprensión de la ecología de comunidades. En el mundo microbiano, asimismo, los ecosistemas a microescala están lejos de ser una mezcla aleatoria y homogénea de organismos y hábitats. Acceder a la distribución espacial de los microbios es fundamental para comprender el funcionamiento y la ecología de la microbiota, ya que las especies que cohabitan tienen más probabilidades de interactuar e influir en la fisiología de las demás.

Un ecosistema microbiano entre reinos es el núcleo de las colonias de hormigas productoras de hongos, que cultivan hongos basidiomicetos como recurso nutricional. Las hormigas attine buscan diversos sustratos (en su mayoría de origen vegetal), metabolizados por el hongo cultivado mientras forman una estructura esponjosa, un "jardín microbiano" que actúa como un intestino externo. El jardín es una malla entrelazada de hifas fúngicas que crecen metabolizando el sustrato, abriendo nichos para que se establezca una microbiota característica y adaptada. Se cree que la microbiota contribuye a la degradación del sustrato y al crecimiento de hongos, aunque su organización espacial aún no se ha determinado.

Aquí, describimos cómo empleamos la microscopía electrónica de barrido (SEM) para investigar, con un detalle sin precedentes, la organización espacial de la microbiota y la biopelícula en diferentes sistemas de cultivo de hongos de hormigas cultivadoras. Las imágenes SEM han proporcionado una descripción de la estructura y organización espacial de la microbiota. El SEM reveló que la microbiota suele agruparse en biopelículas, una estructura muy extendida de los paisajes microbianos de la fungicultura. Presentamos los protocolos empleados para fijar, deshidratar, secar, pulverizar el recubrimiento y obtener imágenes de una comunidad tan compleja. Estos protocolos se optimizaron para tratar muestras delicadas y heterogéneas, que comprenden biomasa vegetal y fúngica, así como la microbiota y el biofilm.

Introducción

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Los ecosistemas están compuestos por organismos interconectados por procesos en una ubicación geográfica específica (es decir, el medio ambiente). Los organismos interactúan con su entorno a lo largo del tiempo, a partir del cual emergen patrones espaciales complejos y heterogéneos. Los patrones espaciales determinan la diversidad ecológica y la estabilidad y, en última instancia, el funcionamiento de los ecosistemas 1,2,3,4. En los ecosistemas a macroescala, como los humedales, las sabanas, los arrecifes de coral y los ecosistemas áridos, los patrones espaciales están correlacionados con el flujo y la concentración de recursos. Al permitir la optimización de los recursos, la heterogeneidad espacial y el modelado dan como resultado ecosistemas más resilientes que homogéneos2. La localización espacial de los organismos, que está en la base de la ecología de las comunidades, también se traslada al mundo microbiano.

Los ecosistemas microbianos, lejos de los organismos mezclados aleatoria y homogéneamente a través de los microhábitats, exhiben patrones espaciales que definen gran parte de su funcionamiento 5,6,7. Desde las columnas de Winogradsky hasta la microbiota asociada al medio ambiente y al huésped, estos ecosistemas están organizados de forma heterogénea en el espacio, con disposiciones espaciales que provocan diferentes respuestas fenotípicas. Las especies que cohabitan son más propensas a interactuar e influir en la fisiología de las demás. Así, la organización espacial comunitaria, más que su composición per se, delimita propiedades ecosistémicas y nichos ecológicos 5,7,8. Para ilustrar estos conceptos, los cambios en el patrón espacial parecen estar correlacionados con la progresión patológica de las placas dentales, caries, enfermedades de las encías 9,10, enfermedad inflamatoria intestinal11, fibrosis quística, infecciones pulmonares, infecciones crónicas de heridas12,13, cáncer colorrectal y adenomas14.

Bajo el alcance de la biogeografía microbiana (el estudio de la distribución y el patrón de la biodiversidad a través del espacio y el tiempo a microescala), el conocimiento de los ecosistemas microbianos se beneficia enormemente al comprender sus patrones espaciales 6,13,15,16,17. Hemos analizado los patrones espaciales de un ecosistema microbiano construido por insectos, que se encuentra en el núcleo de las carismáticas colonias de hormigas attina (Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae: Attini: Attina). Allí reside un "jardín microbiano", centrado en torno a un hongo basidiomiceto de la tribu Leucocoprinae (Basidiomycota: Agaricaceae) o de la familia Pterulaceae (Basidiomycota: Agaricales)18,19,20,21,22. El jardín es una estructura esponjosa que emerge de una malla entrelazada de hifas que crece metabolizando el sustrato mayoritariamente vegetal incorporado por las hormigas (Figura 1). Estos pueden incluir, de acuerdo con los géneros de átines: partes secas de plantas, excrementos y cadáveres de insectos, hojas recién cortadas, semillas y partes florales 23,24. Análogo a un intestino herbívoro externo, el jardín convierte enzimática y químicamente los polímeros recalcitrantes en recursos nutricionales lábiles, proporcionando a las hormigas aminoácidos esenciales, lípidos y azúcares solubles 21,25,26,27,28.

Los análisis ultraestructurales, enzimáticos y transcriptómicos realizados para jardines de los géneros Atta y Acromyrmex sugieren que estos ambientes estructuran un continuo de degradación del sustrato y parches nutricionales 26,29,30,31,32. Las partes jóvenes del jardín tienden a ser más oscuras debido al sustrato recién incorporado después de ser fragmentado. Estos sustratos recién añadidos a menudo se colonizan desde los bordes, que fueron cortados por hormigas obreras e inoculados con grupos miceliales. Irradiando desde los bordes cortados, las hifas fúngicas se extienden sobre el sustrato 29,32,33. La abundancia de hifos aumenta a medida que avanza la degradación del sustrato, dando lugar a regiones blanquecinas y metabólicamente activas 30,31,32. Las regiones más antiguas, con sustrato más degradado y una microbiota abundante29,32, tienden a presentar tonos parduzcos y mayor humedad. Los trabajadores retiran fragmentos de esta región, separándolos en pilas de desechos, donde también toman sustratos que dañan al hongosimbionte 34,35,36. Las pilas de residuos, aunque físicamente separadas del jardín, son un punto de degradación continua del sustrato y del ciclo de nutrientes por parte de la abundante microbiota habitante 29,32,37,38,39.

Una microbiota compuesta principalmente por Enterobacter, Klebsiella, Pantoea, Pseudomonas y Serratia, también habita en el jardín, al parecer compartida por diversos sistemas de cultivo de hongos. La microbiota, que codifica vías metabólicas que podrían complementar el metabolismo fúngico, participa potencialmente en las respuestas fisiológicas del jardín 40,41,42,43,44. Los datos metagenómicos no solo indicaron que la microbiota estaba allí41,42, sino que también el análisis de microscopía electrónica de barrido (SEM) del cultivo de hormigas cortadoras de hojas mostró principalmente bacterias en forma de bastoncillos sobre el sustrato de la planta32. A pesar de que las bacterias (incluyendo cepas celulolíticas) fueron aisladas de todo el jardín, se visualizaron solo en las partes más antiguas del jardín y en las pilas de desechos, así como en la pelletización inicial que llevaban las reinas fundadoras29,32. Tampoco estaba claro si la microbiota podía formar biopelículas in vivo (es decir, en el jardín y en los residuos), como sugería su capacidad metabólica42 y se observaba in vitro44.

Aquí, empleamos SEM para comprender mejor la organización espacial de la microbiota en las regiones del jardín, detallando las interacciones físicas microbiota-sustrato y microbiota-hifas. Al proporcionar imágenes con mayor profundidad focal, SEM permite observar estructuras microscópicas tridimensionales en alta resolución, lo que permite un análisis exhaustivo de los patrones espaciales de la microbiota del jardín. Detallamos los pasos para fijar, deshidratar, secar, rociar y obtener imágenes de muestras tan heterogéneas y delicadas a base de hongos. Al eliminar la etapa de postfijación con tetróxido de osmio (OsO4) y reducir el tiempo de deshidratación, simplificamos los protocolos 32,33,45 para la preparación de muestras de jardín y residuos para el análisis SEM. Este protocolo adaptado preserva los patrones estructurales de las hifas, así como la organización espacial de la microbiota y el biofilm, y podría aplicarse a otros ecosistemas microbianos y biofilms delicados.

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Figura 1: Jardines microbianos de Attine. El jardín es una estructura esponjosa resultante de una malla entrelazada de hifas que crece metabolizando el sustrato mayoritariamente vegetal incorporado por las hormigas. También habita en el jardín la microbiota, que codifica vías metabólicas que podrían complementar el metabolismo de los hongos. Los datos metagenómicos y los análisis previos de microscopía electrónica de barrido indicaron su presencia, aunque teníamos escaso conocimiento de su organización espacial e interacciones físicas con el sustrato y las hifas fúngicas. Empleamos SEM para desvelar la organización y el patrón espacial de la microbiota y la biopelícula. Ilustraciones de Mariana Barcoto (jardín y microbiota adaptados de Barcoto y Rodrigues 94), y fotos de Mariana Barcoto y Enzo Sorrentino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

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1. Muestreo de colonias de campo

NOTA: Al recolectar colonias de hormigas, certifique que se obtienen todos los permisos requeridos por la legislación local antes de recolectar. En nuestro caso, el permiso de recolección #74585 fue emitido por el Instituto Chico Mendes de Conservação e Biodiversidade (ICMBio). Cuando las muestras provengan de una colonia de laboratorio, vaya a la sección 2.

  1. Localiza y marca la colonia. Excave una zanja que rodee el área del nido hasta que la cámara del jardín quede expuesta (Figura 2A).
    NOTA: Algunas especies de áttina pueden construir sus colonias debajo de la hojarasca o dentro de troncos podridos. En tales casos, gire con cuidado la cama o rompa con cuidado los troncos para recoger las muestras. Para obtener información detallada sobre la localización, recolección y mantenimiento de colonias vivas de diversas especies de hormigas atinadas, véase Sosa-Calvo et al.46.
  2. Abra la cámara de jardín lateralmente para evitar que la tierra caiga sobre la superficie del jardín. Recoja cuidadosamente las muestras de jardín con pinzas entomológicas, una cuchara o una espumadera de cocina, según el tamaño del jardín.
    NOTA: Asegúrese de esterilizar las herramientas antes de recolectarlas. Cuando recoja los jardines de las hormigas cortadoras de hojas, use guantes de tela gruesa para evitar (o al menos atenuar) las picaduras de las obreras. Para otras especies de atina, los guantes de tela son opcionales.
  3. Transfiera las muestras de jardín a un recipiente de plástico limpio que contenga una capa de yeso para equilibrar la humedad del jardín. Después de transferir el jardín y las hormigas, cierre herméticamente el recipiente para evitar que la muestra se seque. Almacene las muestras de jardín a 23-25 °C hasta su procesamiento.
  4. Cierre la zanja con tierra previamente removida.

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Figura 2: Protocolo de preparación de la muestra. A) Muestreo de las colonias de campo. (B) Procesamiento de muestras. (C) Fundamentos breves y flujo de trabajo para la preparación de muestras: 1. Fijación: para fortalecer y preservar la estructura de la muestra. 2. Deshidratación: el contenido de agua de las muestras se intercambia por etanol. 3. Secado de puntos críticos: el CO2 líquido sustituye al etanol y se evapora. 4. Montaje: muestra mostrada para su análisis. 5. Recubrimiento por pulverización catódica con oro: evite la carga de la muestra. 6. Imagenología. Ilustraciones y fotos de Mariana Barcoto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Reactivos

NOTA: Tenga en cuenta que las siguientes soluciones deben prepararse de antemano.

  1. Prepare tampón de cacodilato de sodio 0,2 M. Para ello, disuelva 42,8 g de cacodilato de sodio en 800 mL de agua destilada, agitando hasta la disolución y la estabilización del pH a 7,2 (si es necesario, ajuste el pH con ácido clorhídrico). Aumente el volumen de la solución a 1 L añadiendo agua destilada. Almacene la solución a 4 °C (durante ~1 mes).
    PRECAUCIÓN: El glutaraldehído y el paraformaldehído son tóxicos y deben manipularse dentro de una campana extractora. Use guantes de nitrilo y gafas protectoras todo el tiempo mientras manipula dichos reactivos.
  2. Preparar el fijador de Karnovsky (modificado de Karnovsky)47. Para ello, añadir 10 mL de solución acuosa de glutaraldehído al 25% y 10 mL de solución acuosa de paraformaldehído al 20% a 25 mL de tampón de cacodilato de sodio 0,2 M y mezclar. Añadir 1 mL de cloruro cálcico 0,1 M (CaCl2) y aumentar el volumen a 100 mL añadiendo agua destilada. Almacene la solución a 4 °C (hasta 1 mes).
    PRECAUCIÓN: El fijador de Karnovsky es dañino cuando se inhala y puede causar irritación de la piel y los ojos. Por lo tanto, evite respirar vapores, usándolo solo al aire libre o en un área bien ventilada. Use guantes de nitrilo y gafas protectoras todo el tiempo cuando manipule la solución.
  3. Usando etanol absoluto (grado analítico), prepare soluciones de etanol al 30%, 50%, 70% y 90% en agua destilada; También se requiere etanol al 100%.

3. Fijación de la muestra

NOTA: Los fijadores endurecen y preservan las muestras, manteniendo las características morfológicas. Los aldehídos (como el paraformaldehído y el glutaraldehído) son fijadores no coagulantes de tipo reticulante, que inducen enlaces cruzados dentro y entre las proteínas y los ácidos nucleicos48.

  1. Retire las obreras, los huevos, las pupas y las larvas de las muestras del jardín con pinzas entomológicas (Figura 2B). Separe los fragmentos de jardín que no superen los 5 mm3. Agregue los fragmentos a un tubo de 2 mL (Figura 2C).
  2. A los tubos que contienen las muestras, utilice una pipeta de vidrio Pasteur para añadir ~1 mL de solución fijadora Karnovsky (asegúrese de que la muestra esté completamente cubierta). Mezclar agitando suavemente para ayudar a que la muestra se remoje e incube a 4 °C durante al menos 24 h antes de continuar con el procesamiento de la muestra (Figura 2C.1).
    NOTA: Cuando los siguientes pasos de deshidratación no se llevarán a cabo inmediatamente después de la fijación, el protocolo puede detenerse en este paso y las muestras pueden almacenarse durante ~ 1 año a 4 °C.
    Sugerimos utilizar una pipeta de vidrio Pasteur, ya que está compuesta por un material inerte y es más fácil de limpiar para su posterior reutilización. El material de jardín es altamente hidrofóbico y tiende a flotar sobre la superficie de la solución fijadora. Por lo general, tarda hasta 5 minutos en empaparse completamente en el fijador. Asegúrese de que el fijador cubra los fragmentos del jardín, ya que su volumen tiende a reducirse a medida que ingresa a los poros de la muestra. Verificamos empíricamente que después de que la muestra se empapó y se humedeció, sus componentes (en particular, el delicado micelio fúngico) se volvieron susceptibles de romperse cuando se mezclaron más. Por lo tanto, recomendamos evitar agitar las muestras tanto como sea posible.

4. Deshidratación de la muestra

NOTA: La serie de lavado de etanol cambia gradualmente el agua de las muestras por etanol. Es importante comenzar con una solución de etanol de baja concentración (ver más abajo) para evitar dañar excesivamente o colapsar muestras tan delicadas49.

  1. Retire completamente la solución fijadora de Karnovsky con una pipeta de vidrio, teniendo cuidado de no alterar la muestra (Figura 2C.1).
    NOTA: Deseche el fijador de Karnovsky en un recipiente debidamente etiquetado para el manejo de residuos químicos tóxicos.
  2. Inmediatamente después de retirar el fijador, añadir 1 mL de etanol al 30%, teniendo cuidado de no alterar la muestra, e incubar durante 10 min a temperatura ambiente (Figura 2C.2).
    NOTA: Las muestras siempre deben estar empapadas en solución. Asegúrese de reemplazar rápidamente las soluciones durante la serie de lavado gradual de etanol. A medida que el jardín pierde su aspecto poroso y se agrega en el fondo del tubo, 1 mL de etanol tiende a ser suficiente para cubrir la muestra (cuando la muestra no supera los 5mm3). Sin embargo, si las muestras no están completamente cubiertas, agregue etanol hasta que la muestra esté completamente cubierta.
  3. Elimine completamente el etanol al 30% con una pipeta de vidrio, teniendo cuidado de no interrumpir la muestra. Deseche el etanol al 30% correctamente.
    NOTA: Para toda la serie de lavado gradual de etanol, deseche el etanol en un recipiente debidamente etiquetado para el manejo de residuos químicos tóxicos.
  4. Añadir 1 mL de etanol al 50% e incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Elimine completamente el etanol al 50% con una pipeta de vidrio, teniendo cuidado de no alterar la muestra. Deseche el etanol al 50% correctamente.
  5. Añadir 1 mL de etanol al 70% e incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Elimine completamente el etanol al 70% con una pipeta de vidrio, teniendo cuidado de no alterar la muestra. Deseche el etanol al 70% correctamente.
    NOTA: En la etapa de lavado con etanol al 70%, el usuario puede pausar el protocolo si es necesario, ya que los tubos de muestra pueden almacenarse durante la noche a 4 °C, cuando el material no se procesará inmediatamente.
  6. Agregue 1 mL de etanol al 90% e incube durante 10 min a temperatura ambiente. Elimine completamente el etanol al 90% con una pipeta de vidrio, teniendo cuidado de no alterar la muestra. Deseche el etanol al 90% correctamente.
  7. Agregue 1 mL de etanol 100% e incube durante 10 min a temperatura ambiente. Retire completamente el etanol 100% con una pipeta de vidrio, teniendo cuidado de no interrumpir la muestra. Deseche el etanol 100% correctamente.
  8. Con una pinza y/o una espátula, transfiera cuidadosamente las muestras a recipientes de muestras para el secador de puntos críticos (CPD), que contengan etiquetas de identificación de la muestra (hechas previamente en papel y lápiz). Para evitar el secado de las muestras, este trasvase se realiza con el recipiente colocado en una placa de Petri cubierta con etanol 100%.
  9. Coloque las tapas en los recipientes y sumérjalos en un vaso de precipitados de vidrio graduado que contenga 100% de etanol suficiente para sumergir los recipientes. Cubra el vaso de precipitados e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente; A continuación, deseche adecuadamente el etanol al 100%.
  10. Transfiera los recipientes de muestras a otro vaso de precipitados de vidrio graduado que contenga suficiente etanol al 100% para sumergir los recipientes. Cubra el vaso de precipitados e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente; A continuación, transfiera los recipientes de muestras al secador de puntos críticos.
    NOTA: Después de la serie de lavado, las pipetas y vasos de precipitados de vidrio deben enjuagarse abundantemente con agua destilada, y esta agua residual debe desecharse en un recipiente debidamente etiquetado para el manejo de residuos químicos tóxicos. Después del enjuague, los artículos de vidrio se pueden lavar con detergente neutro, enjuagar con agua del grifo y secar al aire.

5. Secado de puntos críticos

NOTA: Un secador de punto crítico intercambia el etanol en las muestras por dióxido de carbono líquido (CO2), que se evapora de la muestra a mayor temperatura y presión. Siga las instrucciones del fabricante para dichos procedimientos.

  1. Encienda el equipo.
  2. Abra la cámara, coloque los recipientes de muestra dentro y agregue etanol 100% hasta que cubra los contenedores. Cierre la cámara.
  3. Active la opción Frío y espere hasta que la temperatura alcance los 10 °C.
  4. Abra la válvula del cilindro deCO2 y active la opción Agitador .
  5. Activa la opción de CO2 in, siempre revisando la cámara para verificar cuánto CO2 ya la ha llenado. Cuando la cámara esté casi llena, desactive la opción de entrada de CO2 y active la opción de intercambio, manteniéndola activada hasta que haya suficiente CO2 solo para cubrir los recipientes. Asegúrese de que los recipientes estén siempre cubiertos con CO2 (es decir, desactive la opción de intercambio antes de que todo el CO2 haya salido de la cámara). Repita el paso 5.5 6x.
  6. Active el CO2 por última vez y llene la cámara hasta que los recipientes estén cubiertos.
  7. Active la opción Calor y desactive la opción Agitador . Cierre la válvula del cilindro deCO2.
  8. Espere hasta que la temperatura suba a 35 °C; luego, active la opción Salida de gas .
    NOTA: A unos 30 °C, la cámara alcanza presiones de 70-80 bar, alcanzando el punto crítico, donde desaparece el líquido.
  9. Cuando la presión de la cámara alcanza 1 bar, se ha eliminado todo el contenido de gas. Abra la cámara y retire los recipientes.
  10. Apague el equipo.

6. Montaje

  1. Prepare portamuestras SEM (es decir, talones de aluminio; Figura 2C.4).
    1. Envuelva los talones con un trozo de papel de aluminio, cubriendo solo la parte superior, para facilitar la limpieza de los talones después del análisis.
    2. Identifique los talones escribiendo el código/número de muestra en la parte inferior del soporte, garantizando la identificación de lo que se coloca en la parte superior.
    3. Cubre la parte superior con cinta de carbono de doble cara. Coloque los talones en un portamuestras.
  2. Abra la tapa del recipiente de muestras y transfiera con cuidado la muestra seca a una placa de Petri de vidrio con pinzas y espátula.
    NOTA: Los jardines de punto crítico de secado tienden a aglomerarse formando muestras muy compactas que deben separarse cuidadosamente como fragmentos de no más de 1 mm3de tamaño.
  3. Coloque con cuidado los fragmentos en la superficie pegajosa del trozo cubierto con cinta adhesiva. Una vez que el fragmento de jardín toca la cinta, es muy difícil (re)moverlo, así que tenga cuidado de no colocarlo en lugares o posiciones no deseadas. Agregue hasta nueve fragmentos por stub.
  4. Repita los pasos 6.2 y 6.3 para cada muestra.

7. Recubrimiento por pulverización catódica con oro

NOTA: Es necesario recubrir la muestra para evitar que se cargue. Siga las instrucciones del fabricante para ajustar configuraciones como la presión del gas de operación (0,5 × 10-1 mm Hg de presión de gas en este protocolo), el tiempo de pulverización catódica (220 s), el grosor de la capa de oro (~120 Å), la corriente (50 mA) y el suministro de voltaje. La pulverización catódica tiende a seguir un flujo de trabajo común, aunque los equipos de diferentes fabricantes pueden funcionar de manera ligeramente diferente.

  1. Abra el brazo objetivo con bisagras y coloque los talones en la mesa de muestras.
  2. Cierre el brazo de destino con bisagras y compruebe si el escudo contra astillas de la cámara de vacío de vidrio está incrustado correctamente.
  3. Abra la válvula del cilindro de argón y encienda el interruptor de alimentación principal.
  4. Siga el aumento del vacío en la pantalla del equipo hasta que alcance la marca de 0,5 × 10-1 mm Hg en la pantalla; a continuación, active el enjuague. Repita la operación 5 veces.
  5. Encienda el sistema de circulación de agua, active la opción HV On y abra la tapa de la película de oro. Confirme que el color del plasma es rosado. Para seguir este protocolo, configure 220 s de pulverización catódica con un voltaje de 50 mA, que depositará una capa de oro de ~ 120 Å (12 nm).
  6. HV On se apaga automáticamente. Apague el sistema de circulación de agua y cierre la tapa de la película de oro.
  7. Apague el interruptor de alimentación principal, permitiendo que el aire ingrese a la cámara de vacío. Para muestras de jardín y desechos, repita los pasos 7.1-7.7 3 veces.
    NOTA: Si las imágenes no se realizan inmediatamente después de la preparación de la muestra, guarde los talones en un recipiente hermético lleno de una capa de sílice para evitar rehidratar las muestras.

8. Imágenes

NOTA: Siga las instrucciones del fabricante para ajustar la configuración de SEM, como el diámetro de apertura del objetivo, el voltaje de funcionamiento, la alineación del sistema de haz de electrones, la alineación axial y los estigmas.

  1. Coloque los talones en el portamuestras, tomando notas sobre la posición de cada muestra.
    NOTA: Use guantes cuando inserte o retire el soporte de muestras y mantenga el soporte lo más limpio posible.
  2. Inicie el software de operación desde el escritorio.
  3. Seleccione la configuración del instrumento. Visualice muestras de jardín con un diámetro de apertura objetivo de 30 μm (es decir, en la segunda etapa), operando en alto vacío, detectando señales de electrones secundarios (SED), voltaje de aceleración de 20 kV, distancia de trabajo de 15 a 20 mm, corriente de sonda de 40.0 (en modo de alta corriente) y variando el aumento de acuerdo con la muestra.
  4. Siguiendo las instrucciones de navegación, presione el icono de ventilación y espere a que se ventile la cámara de muestras. Una barra de progreso indica el estado del vacío.
  5. Cuando se haya alcanzado la presión atmosférica, abra la cámara de muestras e inserte con cuidado el portamuestras.
  6. Cierre suavemente la puerta de la cámara y presione el icono Evac para evacuar el instrumento, siguiendo el estado de vacío a través de la barra de progreso. El sistema de navegación mostrará la posición de la etapa móvil y proporcionará un gráfico de soporte cuando se complete el movimiento. Presione el icono de la cámara para grabar una foto del soporte para obtener una vista superior que ayudará a navegar entre las muestras mientras se toman imágenes.
  7. Presione el icono de observación para encender el cañón de electrones y espere a que se forme la imagen. Utilice la interfaz de usuario manual (control manual) para mover manualmente el eje Z a la altura adecuada (en función de la altura de la muestra y la distancia de trabajo determinada).
    NOTA: Para prolongar la vida útil del filamento de tungsteno, detenga la función de observación siempre que no esté tomando imágenes activamente.
  8. Utilice las opciones que se muestran en la pantalla o el control manual para cambiar la velocidad de ráster y la posición de la imagen. Mueva la platina para obtener una vista completa de la muestra, empleando la función RDC para centrarse en áreas específicas. Al observar una estructura objetivo (o interesante), ajuste la ampliación, el enfoque, el brillo, el contraste y la estigmatización en consecuencia. Corrija la estigmatización mediante el uso de la interfaz de usuario manual para mover el escenario a las direcciones X e Y.
    1. Ajuste la ampliación entre 100x y 700x para visualizar aspectos generales del jardín (como la densidad de hifas, el sustrato y los patrones de colonización).
    2. Ajuste el aumento entre 700x y 1.500x para visualizar los patrones espaciales de la microbiota.
    3. Ajuste el aumento entre 1.500x y 3.000x para observar las interacciones físicas de la microbiota y la biopelícula.
    4. Ajuste el aumento entre 3.000x y 4.000x para centrarse en grupos microbianos específicos.
  9. Para guardar una imagen, utilice la función Congelar , haga clic en el icono de la foto y configure la ruta del archivo. Como estándar, analice al menos tres fragmentos de jardín, tomando imágenes de cada uno en todos los rangos de aumento mencionados en el paso 8.8. Esto da como resultado al menos 12 imágenes por muestra, aunque más imágenes pueden admitir descripciones más detalladas. Sugerimos que de 15 a 25 imágenes por muestra, con todos los aumentos en el paso 8.8, tienden a proporcionar detalles finos para la descripción de la muestra.
    NOTA: Rasterizar y guardar una imagen lleva unos segundos durante los cuales se debe evitar cualquier vibración en la mesa flotante SEM.
  10. Después de terminar la toma de imágenes, presione la opción Vent para ventilar la cámara, siguiendo el estado del vacío a través de la barra de progreso. Retire con cuidado el soporte, cierre suavemente la puerta de la cámara y presione Evac para evacuar la cámara.
  11. Tan pronto como se complete la evacuación, salga del software de operación.
  12. Ajuste el brillo y el contraste para mejorar la visualización con un editor de imágenes.

Resultados

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Aquí, presentamos un protocolo simplificado para visualizar los componentes de las muestras de jardín y desechos, como hifas fúngicas, sustrato, microbiota y biopelículas. El SEM ha mejorado nuestra comprensión de cómo el jardín y los residuos moldean los patrones estructurales de la microbiota (Figura 3). En los jardines de ática, las hifas fúngicas son estructuras en forma de rama que cubren partes de la superficie del sustrato. Dado que las hifas fúngicas tienden a ser muy sensibles a la deshidratación y la ruptura, el usuario puede guiarse por el aspecto de las hifas para evaluar los resultados de la preparación de la muestra. Como también se observó en trabajos previos 32,33,45, las hifas presentan un aspecto tubular; Las hifas intactas en forma de tubo indican una preparación eficaz de la muestra (Figura 3A y Figura 4C). Cuando las hifas tienen forma de cinta, tal aplanamiento es posiblemente un artefacto de la técnica (Figura 4C).

Las superficies del sustrato de las plantas pueden reconocerse por la cutícula y las capas epidérmicas, así como por los estomas y los tricomas. Estas estructuras son más reconocibles cuando los sustratos aún no están colonizados por las hifas fúngicas y la microbiota (Figura 3A y Figura 4C). Cuando el sustrato es colonizado, la microbiota y/o las hifas fúngicas cubren su superficie de tal manera que las estructuras específicas de la planta no son fácilmente discernibles (Figura 3A). La microbiota puede colonizar las hifas fúngicas o el sustrato, cada uno de ellos en una organización espacial aparentemente distinta. En la Figura 3, dichos patrones espaciales se ilustraron esquemáticamente y se encuadraron en las respectivas imágenes SEM donde se identificaron; esto puede facilitar el vínculo entre los resultados del SEM y su interpretación.

Las microbiotas colonizadoras de hifas se observan con menos frecuencia y, cuando se encuentran, están compuestas por células de bastones o cocos que se encuentran aisladas o en pequeños grupos adheridas a la superficie de las hifas. Se puede observar una matriz exopolisacárida (EPS) de biopelícula, que parece una estructura de "tela de encaje", alrededor de las hifas en pequeños grupos (Figura 3A). Bastante más común es la microbiota colonizadora del sustrato, que se encuentra en los jardines de diferentes especies de hormigas atinadas. Los patrones de colonización parecen definidos hasta cierto punto por las etapas de deterioro del sustrato. De este modo, la microbiota, que coloniza sustratos aún no degradados, puede presentarse como células individuales o agruparse en pequeños grupos. La microbiota puede estratificar el sustrato cuando presenta signos microscópicos de deterioro (es decir, cuando las capas cuticulares/epidérmicas de las plantas y otras estructuras vegetales no son discernibles, y los surcos y hendiduras son abundantes).

En estas "alfombras microbianas", la morfología de las células es más reconocible cuando la matriz de EPS está ausente. En los casos en que las células microbianas están incrustadas en la matriz de EPS, su morfología no es fácilmente distinguible. De acuerdo con su organización espacial, caracterizamos las biopelículas como "extendidas" o como "tridimensionales". Cuando se extiende la biopelícula, las células microbianas y la matriz de EPS cubren intermitentemente la superficie del sustrato, formando una capa plana de 1 a 3 células de espesor (Figura 3B). Cuando la biopelícula es tridimensional, las células microbianas y la matriz de EPS se acumulan, formando grupos con varios espesores de células. Las regiones ajardinadas constituidas por sustratos deteriorados (como el jardín viejo y los residuos) albergan la microbiota en sus surcos y hendiduras, donde forman comunidades densas (Figura 3C). En particular, los sustratos ampliamente degradados en las muestras de residuos albergan una profusa microbiota, la más diversa morfológicamente de todas las regiones. Las levaduras añaden más complejidad a esta comunidad, interactuando físicamente con los procariotas a través de una biopelícula. En las muestras de residuos de Atta sexdens y Acromyrmex sp., se observó que las matrices de EPS formaban una malla fibrilar conspicua que rodeaba procariotas en forma de bastoncillos y cocoides, así como levaduras fusiformes y esféricas (Figura 3C).

Como resultado de una malla entrelazada de hifas, la estructura esponjosa del jardín requiere pulverización catódica adicional para cubrir la muestra de manera más uniforme. Tales pasos evitan la dispersión de electrones que distorsiona la imagen y dificulta su resolución (Figura 4A). Las etapas de preparación de las muestras preservaron la mayor parte de la estructura del jardín, revelando la distribución espacial y la organización de la microbiota. Vale la pena reiterar, sin embargo, que estructuras como las hifas fúngicas y la matriz de EPS son muy sensibles a la deshidratación y muy difíciles de conservar, especialmente para SEM. La estructura de la hifa estaba relativamente bien conservada, sin embargo, es razonable considerar que la biopelícula visualizada en algunas muestras de jardín podría carecer de algunos componentes estructurales de la matriz de EPS. Aunque en algunas muestras se conservó la capa externa lisa de polisacáridos que encierra la microbiota (Figura 3A, B), algunas de ellas conservaban las características morfológicas de la microbiota, pero no tenían matriz de EPS. Sin embargo, no está claro si la matriz de EPS estaba realmente ausente o si se retiró durante la preparación de la muestra.

Por un lado, la eliminación de la capa lisa de la biopelícula perjudica la comprensión de la estructura precisa de la biopelícula. Por otro lado, revela la morfología, la organización espacial y las interacciones físicas de las células que habitan debajo de la capa, que es nuestro principal foco de investigación. Estudios previos informaron de la preservación tanto de las hifas fúngicas como de la matriz de la biopelícula mediante el empleo de vapor de tetróxido de osmio (OsO4) como fijador primario 44,50,51,52,53,54. A continuación, llevamos a cabo un experimento comparativo fijando muestras frescas de jardín con vapor de OsO4, que aparentemente conservaba el aspecto liso de las biopelículas (Figura 4B). Este método, sin embargo, provocó un extenso aplanamiento de las hifas y la microbiota. Este aplanamiento resultó en la pérdida de los aspectos espaciales generales del jardín descritos anteriormente 29,33,32,45, lo que limitó los estudios posteriores sobre los patrones estructurales del jardín. La fijación con OsO4 dificultó tanto la distinción de la morfología y distribución microbiana como la diferenciación de las estructuras celulares de los artefactos técnicos, lo que complicó la interpretación de los datos.

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Figura 3: Patrones arquitectónicos de la microbiota. La microbiota coloniza las hifas fúngicas y el sustrato en una organización espacial distinta. Dichos patrones espaciales se ilustraron esquemáticamente y se encuadraron en las respectivas imágenes SEM donde se identificaron (delimitados en la figura por cuadrados blancos): (A) La microbiota colonizadora de hifas está compuesta por grupos aislados o pequeños de células, con matriz exopolisacárida de biopelícula detectable en algunas muestras. (B) La microbiota colonizadora del sustrato se extiende por todo el sustrato, con la matriz de EPS cubriendo las células de tal manera que su morfología no es fácilmente distinguible. (C) Microbiota colonizadora del sustrato formando grupos tridimensionales, constituyendo biopelículas mono o multimorfológicas, en algunos casos evidenciando la matriz de EPS. Ilustraciones de Mariana Barcoto. Abreviatura: EPS = matriz exopolisacárida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Imágenes infructuosas. Imágenes de baja calidad que dan resultados ineficaces y/o dificultan la interpretación de los patrones arquitectónicos. (A) La dispersión de electrones distorsiona la imagen, dificultando su resolución y, en consecuencia, la identificación de la morfología. Esto se observó con frecuencia en muestras recubiertas con pulverización catódica solo una vez y se redujo con un recubrimiento adicional. (B) La fijación de muestras frescas de jardín con vapor de tetróxido de osmio (OsO4) como fijador primario 44,50,51,52,53,54 aparentemente preservó el aspecto liso de las biopelículas. Sin embargo, provocó un extenso aplanamiento de hifas y microbiota, dañando los patrones arquitectónicos del jardín. (C) La preparación de muestras con el fijador de Karnovsky produjo imágenes de mayor calidad en comparación con las preparaciones con OsO4, preservando la mayor parte de la estructura de las hifas, la distribución de la microbiota y los patrones espaciales de los jardines. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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SEM utiliza un haz de electrones para escanear la muestra, generando una imagen ampliada de la misma de modo que se pueden visualizar microestructuras tridimensionales en alta resolución. Dado que el SEM funciona en alto vacío, es necesario eliminar hasta más del 99% del agua de las muestras. Dentro de la cámara de vacío SEM, las muestras parcialmente hidratadas pueden deshidratarse y colapsar, además de dispersar electrones. Para la obtención de imágenes de alta resolución en SEM, la preparación de la muestra debe incluir procedimientos para eliminar el agua manteniendo los cambios en el volumen y la morfología al mínimo, así como un recubrimiento para evitar la carga durante la obtención de imágenes 55,56,57.

En primer lugar, la muestra se fija químicamente mediante la reticulación de sus proteínas y ácidos nucleicos, lo que se consigue mediante diversas técnicas. Un método ampliamente utilizado consiste en combinar glutaraldehído y formaldehído (o paraformaldehído) en un tampón, como la piperazina-1,4-bis [ácido 2-etanosulfónico] (PIPES); ácido N-[2-hidroxietil]-piperazina-N'-2-etanosulfónico (HEPES); solución salina tamponada con fosfato (PBS); o cacodilato de sodio. La fijación química fortalece la muestra, preservando su estructura para el secado. Dependiendo de su naturaleza, las muestras pueden necesitar una fijación secundaria (en tetróxido de osmio) e incluso una fijación terciaria (en acetato de uranilo). En segundo lugar, las muestras deben estar deshidratadas. Dado que el secado al aire provoca un colapso extenso de las estructuras finas, una técnica alternativa común es el secado de puntos críticos (CPD). En CPD, la muestra no se somete a tensión superficial, lo que evita que se formen artefactos. Por un lado, el agua alcanza el punto crítico a 228,5 bar y 374 °C, lo que destruiría fácilmente la muestra. Por otro lado, el punto crítico deCO2 es de 73,8 bar y 31 °C, lo que justifica su uso como fluido de transición. Al aumentar la temperatura, el CO2 se convierte en forma gaseosa y se elimina de la muestra 58,59,60,61,62,63. En tercer lugar, las muestras no conductoras deben recubrirse para evitar su carga y aumentar el rendimiento de electrones secundarios, lo que en consecuencia contribuye a la obtención de señales de imagen nítidas64.

El protocolo presentado aquí combina procedimientos para preservar muestras de base fúngica 32,33,45,65,66,67,68 y biofilms 69,70, aunque simplificando el proceso al eliminar los pasos de postfijación y reducir el tiempo de deshidratación. Sin embargo, conservó la delicada estructura del jardín, detallando aún más las interacciones físicas de la microbiota y revelando la estructura espacial de la biopelícula. El ensamblaje espacial de la microbiota es esencial tanto para establecer interacciones como para establecer sus patrones de regulación. La distribución espacial da forma a la dinámica social microbiana, de la que pueden surgir propiedades intrínsecas. Estos son necesarios para hacer frente a la variabilidad y complejidad que enfrentan los ecosistemas microbianos 71,72,73. Nuestros hallazgos refuerzan la microbiota integrando los patrones estructurales del jardín, apoyando su presunta participación en las respuestas fisiológicas 32,42,43,44. Aportamos la evidencia in situ de que las biopelículas son relevantes para las interacciones microbianas en la fungicultura de attina42,44. Las biopelículas son sistemas multicelulares complejos y heterogéneos, donde los microorganismos incrustados en una matriz de EPS autosecretada forman redes sociales. De manera cooperativa y/o antagónica, las interacciones dentro de la biopelícula determinan la apertura, ocupación y modificación de nichos 71,72,73,74. El SEM permitió una mayor comprensión de la organización espacial de la microbiota en las regiones del jardín, detallando las interacciones físicas microbiota-sustrato y microbiota-hifas, al tiempo que simplificó los métodos para futuras investigaciones en este ámbito.

La investigación sobre la microbiota del jardín está recibiendo cada vez más atención, en particular, centrándose en los procesos que podrían dar forma a la composición de estas comunidades únicas75,76, así como a su función e interacciones 42,43,44. Las interacciones entre bacterias y hongos en los cultivos podrían ayudar al hongo a solubilizar el fosfato, producir sideróforos y degradar la celulosa y la quitina. Tales interacciones, que podrían ocurrir como un continuo mutualismo-antagonismo, podrían regular el funcionamiento del jardín44. El enfoque metodológico que aquí presentamos permite echar una ojeada, in situ, a la dimensión estructural en la que podrían tener lugar las interacciones. Destaca que, como la mayoría de los ecosistemas microbianos ya estudiados, los jardines de atine están modelados, organizados heterogéneamente en el espacio5,7,8. El SEM ya proporcionó una perspectiva espacial in situ sobre la dinámica de la microbiota en diversas comunidades asociadas al huésped, como las cianoesponjas77, la piel de ballena jorobada78, los hongos66, los cnidarios79, el intestino humano80, los líquenes81, contribuyendo también a la descripción del plastisfera (un nuevo ecosistema de origen antropogénico)82. Cada uno de estos estudios, sin embargo, empleó un método escalonado ligeramente distinto para la preparación de la muestra.

Las muestras de jardín son muy delicadas y heterogéneas, con hifas fúngicas que se consideran adaptadas para no perder agua26, además de un conjunto diverso de sustratos incorporados24, la microbiota y su biofilm. Sin embargo, el protocolo de preparación de muestras que adaptamos conservó la mayoría de estas estructuras y nos permitió ampliar la caracterización de la estructura espacial de la microbiota. Consideramos que la fijación con la solución de Karnovsky es el paso crítico en el protocolo, ya que el aspecto tridimensional de una muestra tan delicada puede colapsar y/o aplanarse en este punto. Las muestras complejas a base de hongos generalmente se preparan para SEM mediante fijación con glutaraldehído y posfijación con OsO4 65,66,67,68. Sin embargo, se ha informado que la combinación de aldehídos (paraformaldehído y glutaraldehído) mejora la preservación de la biopelícula para SEM69,70. Los métodos para preservar las biopelículas también pueden incluir un 0,15 % de azul alcián o un 0,15 % de rojo rutenio en el fijador inicial de Karnovsky, así como un 1 % de ácido tánico en un 1 % de osmio para la posfijación. La fijación de jardines y residuos de attine con Karnovsky's y la fijación posterior con OsO4 preservaron bacterias en muestras de jardines viejos y desechos, aunque no evidencien la biopelícula32. Dado que nuestras muestras tenían la estructura de jardín, la microbiota y las biopelículas preservadas sin el paso de postfijación de osmio empleado en los protocolos anteriores 32,33,69,70, preferimos simplificar el protocolo eliminando este paso. El OsO4 es un agente oxidante utilizado para la fijación (especialmente) de los componentes celulares lipídicos83. Al ser altamente corrosivo, el OsO4 puede causar quemaduras graves al entrar en contacto con la piel y las mucosas, además de dañar el tracto respiratorio o gastrointestinal cuando se inhala o ingiere84,85. Al eliminar la post-fijación de OsO4, el protocolo reduce el número de regentes tóxicos a manipular.

También sugerimos la serie de lavado con etanol en lugar de usar acetona, que puede ser demasiado dura para muestras delicadas86. La serie de lavado de etanol con pasos de 10 minutos de duración también simplifica los antiguos protocolos SEM45 sin obstaculizar la resolución de la imagen. Además, verificamos empíricamente que los pasos adicionales de pulverización catódica produjeron imágenes de mayor calidad, lo que fue consistente para muestras de jardín de todas las especies que probamos. Es posible que estos pasos adicionales recubrieran las muestras de manera más uniforme, ya que la dispersión de electrones era mucho más frecuente en las muestras recubiertas solo una vez (Figura 4A). Por lo tanto, alentamos el trabajo futuro probando aditivos y condiciones que podrían dar lugar a un protocolo mejorado para la visualización de biopelículas en muestras de jardín.

El SEM es una potente herramienta para detallar la morfología celular de la microbiota y la disposición espacial de la EPS en las superficies, revelando la topografía y la textura de las muestras de jardín en alta resolución y aumento70,87. Sin embargo, no proporciona discriminación taxonómica para los miembros de la comunidad y, en consecuencia, no tenemos una distinción de quién está dónde. Además, a pesar de la gran profundidad focal de SEM, no informa sobre las características tridimensionales de la muestra. Para una descripción completa del jardín microbiano de atine, incluida la biogeografía taxonómica y la resolución espacial tridimensional, el análisis SEM podría considerarse un primer procedimiento en las técnicas de imagen escalonadas para muestras de jardín. Para la resolución taxonómica, el SEM podría combinarse con la hibridación fluorescente in situ (FISH)88,89 y sus variantes, como el FISH de alta resolución filogenética (HiPR-FISH)90, el marcaje combinatorio y la imagen espectral FISH (CLASI-FISH)9,91 y las proyecciones 3D92. El análisis de la microestructura tridimensional podría detallarse aún más mediante microtomografía de rayos X (μCT de rayos X)93. Hasta ahora, el SEM nos ha permitido observar en detalle la organización espacial de la microbiota alrededor de las hifas y en la superficie del sustrato, surcos y hendiduras. Este tipo de patrones microbianos está ampliando nuestro conocimiento de las interacciones microbianas putativas en los jardines de atiña. Creemos que los pasos de preparación que presentamos podrían aplicarse ampliamente para refinar los estudios sobre la organización espacial microbiana en otros ecosistemas microbianos delicados.

Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean agradecer a la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) por su apoyo financiero (Subvención #2019/03746-0). MOB agradece la beca de doctorado recibida de la FAPESP (proceso 2021/08013-0) y la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Finanzas 001. AR también agradece al Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) por una beca de investigación (#305269/2018). Los autores desean agradecer a Marcia Regina de Moura Aouada y Antonio Teruyoshi Yabuki por ayudar con las pruebas piloto para la preparación de muestras, a Renato Barbosa Salaroli por su asistencia técnica y a Enzo Sorrentino por ayudar en la sesión fotográfica. Este estudio se realizó bajo la autorización de acceso al patrimonio genético #SISGen AA39A6D.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de 2 mLAxygenMCT-200-C-BRAPara fijar y deshidratar muestras
Cloruro de calcio anhidroMerckC4901CaCl2 anhidro para preparar Karnovsky' Fijador s
Secador de punto críticoLeicaEM CPD 300Para el secado de punto crítico
Cinta conductora de carbono de doble cara, 12 mm (ancho) x 5 m (largo)Microscopía electrónica Sciences77819-12Para el montaje de muestras
Pinzas entomológicasNingún proveedorPara manipular muestras de jardín
Alcohol etílico (=etanol), puro (≥ 99.5%)Sigma-Aldrich459836Para la deshidratación
PinzasNingún proveedorPara manipular muestras de jardín
Vaso de vidrio SinproveedorPara la deshidratación
Placa de Petri de vidrioSin proveedorPara manipular muestras de jardín
Pipeta de vidrioSin proveedorPara fijar y deshidratar muestras
Glutaraldehído (Glutaraldehído acuoso grado EM 25%)Ciencias de la microscopía electrónica16220Para preparar Karnovsky' s fijador Objetivo
de oro Ted Pella, Inc.8071Para pulverizar catódicamente con oro
Ácido clorhídricoSigma-Aldrich320331Para ajustar soluciones
pH Editor de imágenesPhotoshopcualquier versiónPara ajustar imágenes
Paraformaldehído (Paraformaldehído 20% Solución acuosa EM Grade)Microscopía electrónica Ciencias15713Para preparar Karnovsky' s fijador Receptor de
propilenoNingún proveedorPara mantener vivas las colonias de hormigas
Microscopio electrónico de barridoJEOL IT300 SEMpara imágenes de muestras 
Cacodilato de sodio trihidratoSigma-AldrichC0250Para la preparación de tampón de cacodilato de sodio
EspátulaNingún proveedorPara manipular muestras de jardín
Recipientes de muestras de 15 mm de diámetro x 10 mm de altoTed Pella, Inc.4591Para el secado de puntos críticos
Barniz de recubrimiento por pulverización catódicaBaltec SCD 050Para recubrir con oro
Stub (Montaje de aluminio, pasador de extremo plano) 12,7 mm x 8 mm Ciencias de la microscopía electrónica75520Para el montaje de muestras
específico específico específico específico específico específico específico

Referencias

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