Microbiota de los hormigueros de Atine: visualización de un paisaje microbiano mediante microscopía electrónica de barrido

Resumen

Proponemos un protocolo optimizado de Microscopía Electrónica de Barrido para la visualización de muestras altamente heterogéneas y delicadas que contienen biomasa vegetal y fúngica, junto con microbiota y biofilm. Este protocolo permite describir las dimensiones espaciales de la organización de la microbiota.

Resumen

En los ecosistemas a macroescala, como las selvas tropicales o los arrecifes de coral, la localización espacial de los organismos es la base de nuestra comprensión de la ecología de comunidades. En el mundo microbiano, asimismo, los ecosistemas a microescala están lejos de ser una mezcla aleatoria y homogénea de organismos y hábitats. Acceder a la distribución espacial de los microbios es fundamental para comprender el funcionamiento y la ecología de la microbiota, ya que las especies que cohabitan tienen más probabilidades de interactuar e influir en la fisiología de las demás.

Un ecosistema microbiano entre reinos es el núcleo de las colonias de hormigas productoras de hongos, que cultivan hongos basidiomicetos como recurso nutricional. Las hormigas attine buscan diversos sustratos (en su mayoría de origen vegetal), metabolizados por el hongo cultivado mientras forman una estructura esponjosa, un "jardín microbiano" que actúa como un intestino externo. El jardín es una malla entrelazada de hifas fúngicas que crecen metabolizando el sustrato, abriendo nichos para que se establezca una microbiota característica y adaptada. Se cree que la microbiota contribuye a la degradación del sustrato y al crecimiento de hongos, aunque su organización espacial aún no se ha determinado.

Aquí, describimos cómo empleamos la microscopía electrónica de barrido (SEM) para investigar, con un detalle sin precedentes, la organización espacial de la microbiota y la biopelícula en diferentes sistemas de cultivo de hongos de hormigas cultivadoras. Las imágenes SEM han proporcionado una descripción de la estructura y organización espacial de la microbiota. El SEM reveló que la microbiota suele agruparse en biopelículas, una estructura muy extendida de los paisajes microbianos de la fungicultura. Presentamos los protocolos empleados para fijar, deshidratar, secar, pulverizar el recubrimiento y obtener imágenes de una comunidad tan compleja. Estos protocolos se optimizaron para tratar muestras delicadas y heterogéneas, que comprenden biomasa vegetal y fúngica, así como la microbiota y el biofilm.

Introducción

Los ecosistemas están compuestos por organismos interconectados por procesos en una ubicación geográfica específica (es decir, el medio ambiente). Los organismos interactúan con su entorno a lo largo del tiempo, a partir del cual emergen patrones espaciales complejos y heterogéneos. Los patrones espaciales determinan la diversidad ecológica y la estabilidad y, en última instancia, el funcionamiento de los ecosistemas 1,2,3,4. En los ecosistemas a macroescala, como los humedales, las sabanas, los arrecifes de coral y los ecosistemas áridos, ....

Protocolo

1. Muestreo de colonias de campo

NOTA: Al recolectar colonias de hormigas, certifique que se obtienen todos los permisos requeridos por la legislación local antes de recolectar. En nuestro caso, el permiso de recolección #74585 fue emitido por el Instituto Chico Mendes de Conservação e Biodiversidade (ICMBio). Cuando las muestras provengan de una colonia de laboratorio, vaya a la sección 2.

1. Localiza y marca la colonia. Excave una zanja que rodee el área del nido hasta que la cámara del jardín quede expuesta (Figura 2A).
   NOTA: Algunas especies de áttina pueden construir sus coloni....

Resultados

Aquí, presentamos un protocolo simplificado para visualizar los componentes de las muestras de jardín y desechos, como hifas fúngicas, sustrato, microbiota y biopelículas. El SEM ha mejorado nuestra comprensión de cómo el jardín y los residuos moldean los patrones estructurales de la microbiota (Figura 3). En los jardines de ática, las hifas fúngicas son estructuras en forma de rama que cubren partes de la superficie del sustrato. Dado que las hifas fúngicas tienden a ser muy sensibles a la .......

Discusión

SEM utiliza un haz de electrones para escanear la muestra, generando una imagen ampliada de la misma de modo que se pueden visualizar microestructuras tridimensionales en alta resolución. Dado que el SEM funciona en alto vacío, es necesario eliminar hasta más del 99% del agua de las muestras. Dentro de la cámara de vacío SEM, las muestras parcialmente hidratadas pueden deshidratarse y colapsar, además de dispersar electrones. Para la obtención de imágenes de alta resolución en SEM, la pr.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de 2 mL	Axygen	MCT-200-C-BRA	Para fijar y deshidratar muestras
Cloruro de calcio anhidro	Merck	C4901	CaCl2 anhidro para preparar Karnovsky' Fijador s
Secador de punto crítico	Leica	EM CPD 300	Para el secado de punto crítico
Cinta conductora de carbono de doble cara, 12 mm (ancho) x 5 m (largo)	Microscopía electrónica Sciences	77819-12	Para el montaje de muestras
Pinzas entomológicas	Ningún proveedor		Para manipular muestras de jardín
Alcohol etílico (=etanol), puro (≥ 99.5%)	Sigma-Aldrich	459836	Para la deshidratación
Pinzas	Ningún proveedor		Para manipular muestras de jardín
Vaso de vidrio Sin	proveedor		Para la deshidratación
Placa de Petri de vidrio	Sin proveedor		Para manipular muestras de jardín
Pipeta de vidrio	Sin proveedor		Para fijar y deshidratar muestras
Glutaraldehído (Glutaraldehído acuoso grado EM 25%)	Ciencias de la microscopía electrónica	16220	Para preparar Karnovsky' s fijador Objetivo
de oro	Ted Pella, Inc.	8071	Para pulverizar catódicamente con oro
Ácido clorhídrico	Sigma-Aldrich	320331	Para ajustar soluciones
pH Editor de imágenes	Photoshop	cualquier versión	Para ajustar imágenes
Paraformaldehído (Paraformaldehído 20% Solución acuosa EM Grade)	Microscopía electrónica Ciencias	15713	Para preparar Karnovsky' s fijador Receptor de
propileno	Ningún proveedor		Para mantener vivas las colonias de hormigas
Microscopio electrónico de barrido	JEOL	IT300 SEM	para imágenes de muestras
Cacodilato de sodio trihidrato	Sigma-Aldrich	C0250	Para la preparación de tampón de cacodilato de sodio
Espátula	Ningún proveedor		Para manipular muestras de jardín
Recipientes de muestras de 15 mm de diámetro x 10 mm de alto	Ted Pella, Inc.	4591	Para el secado de puntos críticos
Barniz de recubrimiento por pulverización catódica	Baltec	SCD 050	Para recubrir con oro
Stub (Montaje de aluminio, pasador de extremo plano) 12,7 mm x 8 mm	Ciencias de la microscopía electrónica	75520	Para el montaje de muestras

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