Method Article

Análisis de Malformaciones Craneomaxilofaciales en Ratones mediante Tomografía Microcomputarizada Tridimensional

DOI:

10.3791/67340

⸱

January 17th, 2025

 ,  ,  , 
1The 2nd Dental Center, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Stomatology, Zhang Zhiyuan Academician Work Station, Hainan, Western Central Hospital, 3Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Science, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 4College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, describimos en profundidad un método, que se basa en la tomografía microcomputarizada, para segmentar y medir modelos 3D de huesos craneomaxilofaciales en ratones, para una mejor evaluación del desarrollo óseo craneomaxilofacial en ratones que lo que es posible con los métodos actuales.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para modelar las malformaciones craneofaciales causadas por la deficiencia de vitamina A (VAD), expresamos una mutación del receptor de retinoides dominante-negativo en osteoblastos para inhibir específicamente la actividad transcripcional de RAR en ratones. Este enfoque nos permitió investigar los efectos de la VAD sobre la hipomineralización craneal, la deformidad mandibular y la hipoplasia clavicular en casos clínicos. En este estudio, la tomografía microcomputarizada (microTC) de la región craneomaxilofacial de ratones representó una herramienta valiosa para estudiar el crecimiento y desarrollo de este modelo animal. La estimación manual de las imágenes requiere mucho tiempo y es inexacta. Por lo tanto, aquí presentamos un enfoque sencillo, eficiente y preciso para segmentar y cuantificar las imágenes de microTC de cada hueso craneomaxilofacial. Se utilizó el software MicroCT para cortar la mandíbula, el hueso frontal, el hueso parietal, el hueso nasal, el premaxilar, el maxilar, el hueso interparietal y el hueso occipital de ratones y medir sus longitudes y anchuras correspondientes. Este método de segmentación se puede aplicar para estudiar el crecimiento y el desarrollo en biología del desarrollo, biomedicina y otras ciencias relacionadas y permite a los investigadores analizar los efectos de las mutaciones genéticas en los huesos craneofaciales individuales.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El intrincado desarrollo del cráneo y la cara humana abarca un sofisticado proceso morfogenético en 3D, intrincadamente orquestado por numerosos genes. Estos genes desempeñan un papel fundamental en la regulación de los intrincados patrones, la proliferación y la diferenciación de los tejidos derivados de diversas fuentes embrionarias. Este proceso altamente coordinado subraya la complejidad del crecimiento y desarrollo craneofacial humano. Las malformaciones craneofaciales (incluyendo labio leporino y paladar hendido, cierre de suturas craneales e hipoplasia facial) que ocurren como resultado de anomalías del desarrollo representan más de un tercio de todos los defectos congénitos de nacimiento. Como animal modelo comúnmente utilizado en la investigación biomédica, el ratón tiene una estructura ósea craneomaxilofacial compleja y delicada que es muy similar al hueso craneomaxilofacial humano en términos de anatomía y fisiología. El estudio de la biología del desarrollo craneomaxilofacial ha recorrido un largo camino en los últimos años con el advenimiento de nuevas técnicas en genética de ratones, especialmente en malformaciones1.

El ácido retinoico (AR) es el metabolito in vivo de la vitamina A2. La deficiencia de vitamina A (VAD) se asocia con una serie de trastornos multisistémicos graves, como un mal remodelado óseo, fracturas, así como malformaciones craneofaciales y malformaciones esqueléticas caracterizadas por enanismo 3,4 . Los receptores de retinoides (RARA) son factores de transcripción cruciales en la señalización de retinoides5. Se diseñó un mutante dominante-negativo RARα403 (dnRARα)6 y se estableció un modelo de ratón en el que los osteoblastos expresaban dnRARα. Esto dio lugar a que los ratones exhibieran enanismo, deformidades craneofaciales, formación incompleta de hueso cortical y hueso trabecular aumentado pero mal remodelado.

La microtomografía computarizada (microTC) tiene un gran potencial para el estudio de las malformaciones craneomaxilofaciales. Posee la capacidad de detectar y rastrear la evolución de las anomalías esqueléticas innatas y adquiridas en modelos de roedores. El análisis de imágenes MicroCT ofrece una exploración en profundidad de las alteraciones del crecimiento craneofacial en modelos de ratón modificados genéticamente 7,8 . Además, las imágenes 3D emergen como una herramienta vital para delinear rasgos morfológicos, lo que facilita enfoques personalizados de análisis y visualización9. La micro-TC se ha utilizado en varios estudios para analizar fenotipos craneofaciales, incluyendo la definición de puntos de referencia anatómicos en humanos y ratones y el análisis volumétrico de cada hueso craneofacial 10,11,12. Aquí, describimos en detalle un método basado en la tecnología microCT para separar y medir modelos 3D de huesos craneomaxilofaciales de ratón para permitir una mejor evaluación y análisis del desarrollo esquelético craneomaxilofacial de ratón que lo que es posible con los métodos actuales.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemos cumplido con todas las normas éticas pertinentes para la experimentación e investigación con animales. Todos los procedimientos con animales de experimentación fueron aprobados por el Comité Asesor Institucional de Investigación y Cuidado de Animales del Noveno Hospital Popular de Shanghai, Facultad de Medicina de la Universidad Jiaotong de Shanghai.

Tanto la cepa de ratones Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 (R26dn/dn) como la cepa de ratones Osterix-Cre (OsxCre) (No.006361) utilizadas aquí se mantuvieron en el fondo C57BL/6. Los ratones R26dn/dn se cruzaron con ratones OsxCre para generar OSXCre; RatonesR26 dn/dn . Todos los ratones fueron criados y mantenidos en condiciones específicas libres de patógenos (SPF).

1. Cría de ratones

NOTA: F significa el número de generaciones de ratones; N significa el número de generaciones de apareamiento entre ratones cigóticos y ratones de fondo. Por lo tanto, F2 + N representa la segunda generación, así como cualquier programa de cría de ratones posterior. F0 significa ratones primarios.

  1. Empareja un ratón macho sexualmente maduro con un par de ratones hembra de una edad comparable. Comience las inspecciones diarias para los cachorros recién nacidos después de un período inicial de 18 días. Al identificar a las hembras preñadas, aíslelas si es necesario para garantizar un cuidado materno óptimo. En el caso de que no se observen embarazos dentro de un mes después del emparejamiento inicial, considere alternar el ratón macho entre diferentes configuraciones de reproducción para promover la fertilización.
  2. Cruce ratones R26dn/dncon ratonesCre OSX (F0). Corta las colas para el genotipado y conserva el macho OSXCre; R26dn/+ratones en jaulas hasta la madurez sexual, que es ~6 semanas de edad (F1).
  3. Cruce de OSXCre macho de seis semanas de edad; ratones R26dn/+ con ratones hembra R26dn/dn(F2). Cortar las colas para el genotipado y reemplazar los ratones reproductores viejos con ratones más jóvenes a tiempo (F2 + N).

2. Preparación

  1. Prepare cuatro pares de Osx Cre de 4 semanas de edad, OSXCre; R26dn/+, y OSXCre; RatonesR26 dn/dn. Eutanasia individual de los ratones mediante la administración de asfixia con dióxido de carbono.
    NOTA: Para garantizar una eutanasia eficiente, el caudal deCO2 debe ajustarse para desplazar aproximadamente el 30% del volumen de la jaula cada minuto. Por ejemplo, en una jaula de 45 cm x 30 cm x 30 cm, se recomienda un caudal de 40 L/min.
  2. Corta el cuello del ratón con unas tijeras mientras sostienes su cuerpo, dejando el cráneo intacto.
    NOTA: Para obtener un cráneo completo, abra la boca del ratón, corte a lo largo de la comisura de la boca con unas tijeras oftálmicas, tire de ambas manos hacia ambos lados y gírela para pelar la piel de la cabeza del ratón.
  3. Sumerja los cráneos de ratón en paraformaldehído al 4% durante 48 h, luego guárdelos en etanol al 70%.
    PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es tóxico; Use la protección adecuada.
  4. Escanee los cráneos recolectados con un escáner microCT: resolución: 4,5 μm; voltaje: 70 kV; corriente: 114 μA; filtro: 0,5 mm Al; paso de rotación: 0,5 °.
  5. Guarde las imágenes de las tomografías computarizadas. Las imágenes en formato DICOM se seleccionan para importarlas al software y se analizan.

3. Imágenes MicroCT y reconstrucción 3D

NOTA: Todos los huesos utilizados en este estudio fueron segmentados manualmente.

  1. Haga clic con el botón derecho del ratón en la página MASCARILLAS y seleccione Nueva máscara; Aparece una nueva capa llamada Verde .
  2. Seleccione el intervalo de umbrales de 671-2.566 en la página Umbrales que aparece. Repita este proceso para todas las capas relacionadas. (Figura 1A).
  3. Utilice la herramienta Borrador en el menú Editar para borrar manualmente los huesos unidos a la mandíbula en cada capa en el plano sagital 2D (Figura 1B).
  4. Seleccione la región de la mandíbula en el plano sagital 2D después de hacer clic en la opción Región creciente (Figura 1C).
    PRECAUCIÓN: Asegúrese de que la región mandibular esté seleccionada completamente en cada capa; de lo contrario, resultará en una mandíbula incompleta después de la reconstrucción.
  5. Haga clic en la capa recién creada Mandíbula en la página MÁSCARAS y seleccione Calcular 3D en el menú desplegable (Figura 1D).
  6. En la interfaz de objetos 3D , haga clic con el botón secundario en Mandíbula y haga clic en Propiedades. Haga clic para cambiar el color. Codifica por colores todos los modelos 3D reconstruidos con diferentes huesos.
  7. Haga clic en Medir en la esquina superior izquierda y seleccione distancia en el menú desplegable que aparece. Calcule la longitud marcando puntos en la imagen 3D (Figura 1E).
    PRECAUCIÓN: La referencia para medir el ancho del hueso es la parte más ancha del hueso.
  8. En la interfaz de objetos 3D , haga clic con el botón secundario en Mandíbula y haga clic en Propiedades. Módulo Properties-Info-Volume para leer los valores de volumen reconstruidos para cada bloque óseo craneomaxilofacial. (Figura 1F).
  9. Mida la mandíbula, el hueso frontal, el hueso parietal, el hueso nasal, el premaxilar, el maxilar, el hueso interparietal y el hueso occipital de la misma manera que arriba y márquelos individualmente con diferentes colores.

4. Análisis estadístico

  1. Realice análisis estadísticos utilizando el software de su elección. Realizar pruebas t de Student de dos colas (n = 4/grupo).
  2. Para todos los gráficos, utilice barras de error para representar las desviaciones estándar. Considere que los valores P < 0,05 son estadísticamente significativos.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una amplia investigación subraya el impacto multifacético de las mutaciones genéticas en el crecimiento, el desarrollo y los sistemas de órganos de los ratones. Una evaluación exhaustiva de los huesos craneofaciales en ratones mutantes requiere métodos más allá del análisis de imágenes en 2D o de un solo tejido debido a sus limitaciones. Por lo tanto, dilucidar el desarrollo óseo craneofacial es de suma importancia para la investigación de los trastornos craneofaciales humanos.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroCT es una potente herramienta para obtener información 3D realista e isotrópica a partir de muestras biológicas densas y opacas con resolución micrométrica. Los datos obtenidos de la microCT están calibrados por geometría e intensidad, lo que la hace especialmente útil para estudios cuantitativos 13,14,15,16,17. Se utiliz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones de la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Hainan de China (824MS152).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Software GraphPad Prism 6.01GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE. UU./
Micro-CTQuantum GX micro CT, PerkinElmer,
Waltham, MA, EE. UU.		/
Mimics Medical 19.0 Materialise, Lovaina, Bélgica/
Osterix-Cre (OsxCre) //del Laboratorio Jackson
Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα Cepa 403//de la Universidad de Columbia, EE.UU.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chai, Y., Maxson, R. E. Jr Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev Dyn. 235 (9), 2353-2375 (2006).
  2. Mason, J. B., et al. Should universal distribution of high dose vitamin A to children cease. BMJ. 360, k927(2018).
  3. Roulier, S., Rochette-Egly, C., Rebut-Bonneton, C., Porquet, D., Evain-Brion, D. Nuclear retinoic acid receptor characterization in cultured human trophoblast cells: Effect of retinoic acid on epidermal growth factor receptor expression. Mol Cell Endocrinol. 105 (2), 165-173 (1994).
  4. Hayes, K. C., Cousins, R. J. Vitamin A deficiency and bone growth. I. Altered drift patterns. Calcif Tissue Res. 6 (2), 120-132 (1970).
  5. Ghyselinck, N. B., Duester, G. Retinoic acid signaling pathways. Development. 146 (13), dev167502(2019).
  6. Damm, K., Heyman, R. A., Umesono, K., Evans, R. M. Functional inhibition of retinoic acid response by dominant negative retinoic acid receptor mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (7), 2989-2993 (1993).
  7. Ford-Hutchinson, A. F., Cooper, D. M., Hallgrímsson, B., Jirik, F. R. Imaging skeletal pathology in mutant mice by microcomputed tomography. J Rheumatol. 30 (12), 2659-2665 (2003).
  8. Brewer, S., Feng, W., Huang, J., Sullivan, S., Williams, T. Wnt1-cre-mediated deletion of ap-2alpha causes multiple neural crest-related defects. Dev Biol. 267 (1), 135-152 (2004).
  9. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3d mouse embryo atlas based on micro-ct. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
  10. Motch Perrine, S. M., et al. Craniofacial divergence by distinct prenatal growth patterns in fgfr2 mutant mice. BMC Dev Biol. 14, 8(2014).
  11. Percival, C. J., Huang, Y., Jabs, E. W., Li, R., Richtsmeier, J. T. Embryonic craniofacial bone volume and bone mineral density in fgfr2(+/p253r) and nonmutant mice. Dev Dyn. 243 (4), 541-551 (2014).
  12. Titiz, I., Laubinger, M., Keller, T., Hertrich, K., Hirschfelder, U. Repeatability and reproducibility of landmarks--a three-dimensional computed tomography study. Eur J Orthod. 34 (3), 276-286 (2012).
  13. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43 (2-3), 104-115 (2012).
  14. Salomé, M., et al. A synchrotron radiation microtomography system for the analysis of trabecular bone samples. Med Phys. 26 (10), 2194-2204 (1999).
  15. Mizutani, R., et al. Three-dimensional microtomographic imaging of human brain cortex. Brain Res. 1199, 53-61 (2008).
  16. De Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. J Neurosci Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
  17. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61(2006).
  18. Zou, W., Hunter, N., Swain, M. V. Application of polychromatic µct for mineral density determination. J Dent Res. 90 (1), 18-30 (2011).
  19. Neues, F., Epple, M. X-ray microcomputer tomography for the study of biomineralized endo- and exoskeletons of animals. Chem Rev. 108 (11), 4734-4741 (2008).
  20. Gabner, S., Böck, P., Fink, D., Glösmann, M., Handschuh, S. The visible skeleton 2.0: Phenotyping of cartilage and bone in fixed vertebrate embryos and foetuses based on x-ray microCT. Development. 147 (11), dev187633(2020).
  21. Ermakova, O., Orsini, T., Gambadoro, A., Chiani, F., Tocchini-Valentini, G. P. Three-dimensional microCT imaging of murine embryonic development from immediate post-implantation to organogenesis: Application for phenotyping analysis of early embryonic lethality in mutant animals. Mamm Genome. 29 (3-4), 245-259 (2018).
  22. Wong, M. D., Maezawa, Y., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. Automated pipeline for anatomical phenotyping of mouse embryos using micro-ct. Development. 141 (12), 2533-2541 (2014).
  23. Rajion, Z. A., et al. A three-dimensional computed tomographic analysis of the cervical spine in unoperated infants with cleft lip and palate. Cleft Palate Craniofac J. 43 (5), 513-518 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Craniomaxillofacial MalformationsMicrocomputed TomographyCraniofacial BonesMouse ModelBone SegmentationMandibular DeformityCranial HypomineralizationRAR MutationOsteoblastsSkeletal Defects

Related Articles