Síntesis verde de líquido iónico a base de quinolina

Resumen

En el presente trabajo, dilucidamos la síntesis verde de líquido iónico (IL) a base de quinoleína, a saber, bromuro de 1-hexadecilquinolina-1-io {[C₁₆quin]Br} mediante la mezcla de quinolina con un exceso de 1-bromohexadecano, junto con su caracterización detallada mediante resonancia magnética nuclear y mediciones espectroscópicas infrarrojas.

Resumen

La amenaza cada vez mayor de la resistencia a los antimicrobianos (RAM) pone en peligro la potencia de los antibióticos predominantes contra las infecciones que brotan incesantemente y que son generadas por bacterias, virus, parásitos y hongos, lo que representa una gran amenaza para la salud y el bienestar humanos. En este sentido, varias moléculas novedosas han demostrado su valía, siendo los líquidos iónicos (IL) una de las alternativas más ecológicas, no volátiles y térmicamente estables a los antimicrobianos existentes, con un alto potencial de solvatación y una baja presión de vapor. Además, la utilización de estas entidades tanto para estabilizar como para desestabilizar las estructuras de proteínas y mejorar la actividad enzimática ha aumentado aún más su potencial en la industria biomédica. Con esto en mente, presentamos la síntesis y caracterización verde de IL a base de quinoleína, debido a su inmensa potencia antimicrobiana, con baja citotoxicidad y gran actividad de chaperonas artificiales. En este caso, la maniobra del enfoque de síntesis de un solo recipiente en condiciones de reacción más ecológicas y sin disolventes no solo mejoró la eficiencia de la reacción, sino que también aumentó el rendimiento químico. La pureza de la IL sintetizada se corroboró mediante resonancia magnética nuclear (RMN) 1H, RMN 13C y espectroscopía infrarroja (IR). El potencial biológico del compuesto sintetizado se valida aún más mediante el análisis de sus propiedades de absorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicidad (ADMET) y se autentifica mediante un ensayo de difusión en disco.

Introducción

El crecimiento monumental de la población mundial explica un tremendo incremento en el consumo de una amplia gama de productos básicos en los últimos años, incluidos alimentos, medicamentos y otros productos cruciales para el sustento de los organismos mortales. Esto ha vigorizado la búsqueda de nuevos compuestos químicos con propiedades excepcionalmente especializadas, ecológicamente racionales y beneficiosas en todo el mundo. Los líquidos iónicos (IL) han demostrado ser felices en este sentido. La implicación de estos compuestos en el ámbito científico ha impulsado nuevas iniciativas en la investigación de tecnologías químicas contemporáneas¹. A diferencia de los enfoques convencionales, la utilización de IL no solo facilita condiciones de reacción progresivas, sino que también promueve una estrategia personalizada para abordar diversos desafíos bioquímicos relacionados con la investigación y el desarrollo experimentales².

Típicamente, las IL son sales estables constituidas por cationes (orgánicos) y aniones (inorgánicos), que poseen un punto de fusión inferior a 100 °C³. Siguiendo los 12 principios de la química verde, empíricamente, estos son sustitutos convincentes de los disolventes orgánicos habituales⁴. Las asombrosas propiedades asociadas con la utilización de estos compuestos abarcan una gran conductividad intrínseca, polaridad, tendencia a la solvatación, estabilidad térmica, no volatilidad, acidez/basicidad, hidrofilicidad/hidrofobicidad y sintonización, lo que hace que los IL sean los más adecuados para la investigación experimental⁵.

Aparte de las aplicaciones expansivas de varias clases de IL en la síntesis orgánica moderna⁶, la catálisis⁷ y varios procesos electroquímicos que involucran sensores⁸, actuadores⁹, baterías¹⁰ y celdas de combustible¹¹, en los últimos años, esta clase de compuestos ha recibido un reconocimiento trascendental en el campo de la biomedicina a la luz de la RAM. Las pruebas actuales revelan que las IL a base de imidazolio, piridina, colina y pirrol son extremadamente efectivas como agentes terapéuticos debido a su alta carga e hidrofobicidad¹². Sin embargo, los homólogos a base de quinolina todavía se consideran los más potentes contra los microbios patógenos¹². Las aplicaciones biomédicas adicionales que acompañan a esta clase de IL incluyen la actividad de chaperona artificial¹³, la citotoxicidad contra las células cancerosas¹⁴ , así como una excelente capacidad de transporte de fármacos¹⁵.

Convencionalmente, la fabricación de IL implica la utilización de medios solventes altamente tóxicos como el diclorometano, el benceno, el tetracloruro de carbono, el dicloroetileno, ^etc.16, lo que dificulta la biocompatibilidad y eleva la toxicidad del compuesto, haciéndolos indeseables para el uso biológico. Además, el uso de disolventes nocivos en los medios de reacción no solo ralentiza el tiempo de reacción, sino que también aumenta la producción no intencionada de subproductos de desecho liberados al medio ambiente¹⁷. Además, el disolvente utilizado en los medios de reacción también influye en el pH del producto final; Por lo tanto, su eliminación al final de la reacción es vital, especialmente cuando el compuesto deseado está destinado a ser utilizado para sistemas biológicos relacionados con proteínas. Por lo tanto, mantenerse alejado del uso de dicho solvente es favorable en el ámbito de la química verde.

En este estudio, reportamos la síntesis en un solo recipiente de un¹³ IL biocompatible y no tóxico, a saber, bromuro de 1-hexadecilquinolina-1-io, utilizando una ruta más verde. La estrategia actual omite la utilización de un solvente molecular, aprovechando la capacidad de auto-resolución del IL formado dentro de la mezcla de reacción, promoviendo una alta eficiencia de reacción y rendimiento químico. La reacción de Menschutkin¹⁸constituye la base de la metodología de síntesis actual. La pureza del compuesto sintetizado se sondea mediante RMN y espectroscopía IR. El perfil farmacocinético del compuesto y la toxicidad se investigaron a través de los estudios ADMET. Además, en el estudio también se ha demostrado el potencial antimicrobiano de la IL sintetizada contra la cepa patógena de Candida albicans .

Protocolo

NOTA: El bromuro de 1-hexadecilquinolina-1-io se sintetizócomo lo describieron anteriormente Sharma et ^al.13.

1. Preparación y esterilización de aparatos de vidrio

NOTA: Esto debe hacerse al menos 1 día antes de configurar la reacción para la síntesis del compuesto deseado.

1. Lave a fondo un matraz de fondo redondo (RB) de 250 mL, 24/29, de dos cuellos, junto con otros aparatos de vidrio como cilindros de medición, etc., y enjuague con agua destilada seguida de acetona.
2. Seque el aparato lavado en un horno de aire caliente a 60 °C hasta que el aparato esté completamente seco para su uso posterior.
   NOTA: Por lo general, el aparato lavado debe colocarse durante la noche en un horno de secado para eliminar completamente la película de agua y garantizar que el sistema de reacción esté libre de impurezas.

2. Configuración del aparato

NOTA: El aparato debe sujetarse correctamente para garantizar un calentamiento uniforme de los reactivos. El diagrama esquemático de la configuración de la reacción se muestra en la Figura 1.

1. Coloque un baño de aceite en una placa caliente con un agitador magnético. Precalentar el baño de aceite a 80 °C antes del inicio de la reacción.
2. Deje que el RB permanezca en un baño de aceite usando un soporte de retorta de tubo de tal manera que esté medio sumergido en el baño de aceite colocado sobre una placa caliente con agitador magnético.
3. Selle la boca superior del RB con un corcho que constituya una aguja de purga, conectada a su vez a una jeringa con un globo N₂ adherido a ella.
4. Selle herméticamente el otro cuello del RB con otro corcho de goma para evitar la fuga de N₂ del medio de reacción.
5. Precalentar todo el medio a 80 °C en una atmósfera inerte mantenida a través de la purga N₂ antes de añadir los reactivos al RB.
6. Rellene el globo N₂ repetidamente para garantizar la inercia del sistema de reacción y mantener la temperatura en todo momento (por lo tanto, se prefiere el calentamiento en baño de aceite).

3. Adición de los reactivos al sistema de reacción

1. Vierta 0,1 M de quinolina y 0,105 M de 1-bromohexadecano en el sistema de reacción sin alterar el entorno de reacción preestablecido.
2. Agitar el contenido continuamente a 2500-3000 rpm durante 3 días en un ambiente inerte y temperatura constante.

4. Purificación/Recristalización del compuesto

NOTA: Todo el producto no debe someterse a una recristalización. En su lugar, se debe optar por la recristalización por lotes para evitar la pérdida del producto.

1. Disuelva el sólido obtenido en una mezcla 1:2 de tolueno/etanoato de etilo. Enfriar esta mezcla a -15 °C en un congelador (temperatura ajustada a -15 °C) y filtrar al vacío utilizando un embudo Buchner, conectado a una bomba de vacío y un matraz filtrante a través de un tubo. Coloque una membrana filtrante de polipropileno, que constituya un tamaño de poro de 0,45 μm, en el embudo de Buchner, cubriendo toda la parte inferior del filtro. Vierta una pequeña cantidad de la mezcla de solvente a través del filtro para crear un sello adecuado, evitando cualquier tipo de fuga de aire a través de la configuración.
2. Lavar el producto filtrado con tolueno frío vertiendo el disolvente a través del embudo de forma gradual, seguido de un secado a 70 °C en un horno de vacío. Repita este procedimiento 2 veces para garantizar la alta pureza del compuesto deseado.

5. Validación del compuesto mediante espectroscopía de RMN

1. Antes de someter el compuesto a ¹H de RMN y ¹³C de RMN, disuélvalo en cloroformo deuterado (CDCl₃) midiendo 1-10 mg del compuesto y disolviéndolo en aproximadamente 1 mL de CDCl_3.
2. Inyecte esta mezcla en un tubo de RMN utilizando una jeringa de 1 mL para el análisis de la muestra bajo un espectrómetro de RMN. La preparación de la muestra es idéntica tanto para la RMN ^{de 1}H como para la RMN ^{de 13}C.

6. Caracterización IR del IL sintetizado

1. No se requiere preparación de la muestra para obtener los espectros IR del compuesto.
2. Someta unos pocos mg de la muestra sólida a un espectrómetro IR para obtener una visión de los diferentes grupos funcionales presentes en el compuesto sintetizado. Las lecturas se obtuvieron como se demostró anteriormente¹⁹.

7. Predicción de las propiedades de ADMET

1. Introduzca las SONRISAS canónicas del IL deseado en el software online gratuito ADMETLAB 2.0 y ejecute el programa para obtener diversos parámetros, reivindicando el potencial biológico del mismo.

8. Ensayo de difusión en disco que demuestra la aplicación biomédica de la IL sintetizada

1. Precultivo de la cepa fúngica de Candida albicans (ATCC 90028) en caldo de levadura peptona dextrosa (YPD) durante casi 16 h en una incubadora agitadora de DBO a 37 °C.
2. Prepare los medios de agar YPD mezclando un 1% de extracto de levadura, un 2% de peptona, un 2% de dextrosa y un 1,5% de agar en 1 L de agua bidestilada. Vierta 25 mL de los medios de agar YPD recién formados en una placa de Petri de 90 mm después de esterilizarla en autoclave durante 15 minutos a 121 °C. Deje las placas intactas para permitir una solidificación adecuada de los medios.
3. Una vez que la placa esté completamente solidificada, extienda alrededor de 100 μL del inóculo fúngico recién preparado de manera homogénea sobre la placa que contiene el medio, utilizando un esparcidor de vidrio. Deje las placas intactas durante 5-7 minutos en la campana de flujo laminar.
4. Coloque un disco de papel circular estéril de 5-6 mm de diámetro en el centro de la misma placa, utilizando pinzas.
5. Añadir 50 μL de solución acuosa de 0,1 mM del IL sintetizado en el disco, gradualmente, con la ayuda de una pipeta de 20-200 μL.
6. Refrigere la placa durante unos 30 minutos para asegurar una difusión adecuada del IL en el agar. Coloque la placa en la incubadora de DBO preestablecida a 37 °C durante 24 h.
7. Mida la zona de inhibición (incluido el diámetro del disco) utilizando una escala de medición y calcule el área debajo de esta zona según la ecuación 1.
   Área = πr² (1)

Resultados

La figura 2 representa el esquema de reacción de la reacción de Menschutkin involucrada en el proceso de síntesis. El bromuro de 1-hexadecilquinolina-1-io, así sintetizado, se caracterizó mediante RMN y espectroscopia IR. Se espera que el producto aceitoso así adquirido exhiba ^{RMN de 1}H (400 MHz, CDCl₃) a δ 9.34 (d, 1H), 8.21 (d, 1H), 7.80 (t, 1H), 7.30-7.35 (m, 3H), 7.20 (d, 1H), 5.00 (t, 2H), 2.00 (p,2H), 1.30-1.35 (m, 26H), 1 (t, 3H), como se muestra en la Figura 3. El compuesto debe mostrar ^{RMN de 13}C (Figura 4; 100 MHz, CDCl₃) en δ 143, 141, 131, 130.27, 130, 127.5, 126.3, 126, 60, 31, 29, 29, 28.5, 27, 23 y 14. Cada pico está marcado con el número de protón correspondiente mencionado en la estructura del compuesto, responsable de producir esa señal.

CDCl₃ es transparente a la región de RMN (es decir, la región de radiofrecuencia) de los espectros electromagnéticos debido a la ausencia de átomos de H que imparten señales prominentes en esta región y, por lo tanto, se utiliza como solvente para la preparación de muestras en su forma deuterada. No interfiere con el campo magnético aplicado y es completamente inerte por naturaleza. Sin embargo, no es posible eliminar el pico correspondiente a este disolvente (que aparece en torno a las 7,26 ppm para los espectros de RMN de 1H) ya que la deuterización de los disolventes de RMN no puede alcanzar exactamente el 100%. Sin embargo, la aparición de picos generalmente no es significativa y se puede eliminar por completo ejecutando un espectro en blanco de_{CDCl 3} e integrando los picos requeridos en consecuencia. Estos ajustes se pueden realizar directamente dentro del instrumento o mediante la utilización de cierto software (como NMRium, etc.). En caso de que la muestra no esté perfectamente seca, la característica máxima del agua puede aparecer de forma destacada en los espectros. Además, el CDCl₃ y otros disolventes deuterationados también pueden contener cierta cantidad de agua y, por lo tanto, impartir los picos atribuidos a la presencia de agua. Este problema se resolvió aquí secando la muestra correctamente y manteniendo el solvente de RMN a temperatura ambiente, cubierto con una película transparente. En algunos casos, también se utilizan ciertos agentes secantes inertes, como el carbonato de potasio o el sulfato de sodio, para eliminar el contenido de agua presente en la botella de CDCl₃.

Se espera que los espectros FTIR del IL (Figura 5) demuestren bandas de vibración a 3051 ^cm-1, 2917 ^cm-1 y 2853 ^cm-1, con la máxima intensidad, correspondientes a las vibraciones de estiramiento C-H existentes en el anillo aromático, así como para los carbonos alquilo. Un hombro ancho a 3440 ^cm-1 corresponde a las vibraciones de estiramiento N-H. Otra banda del hombro observada a 1357 ^cm-1 es característica de las vibraciones de estiramiento que surgen debido a la unión C-N. Las bandas notables a 820 ^{cm-1,770 cm-1} y 710 ^cm-1 están asociadas con las vibraciones de flexión C-H fuera del plano. El pico a 1155 ^cm-1es específico para las vibraciones de flexión C-H en el plano. Las vibraciones de estiramiento C-C que prevalecen en el anillo aromático son validadas por los picos visibles a 1468 ^cm-1, 1520 ^cm-1 y 1585 ^cm-1. Los resultados así obtenidos son comparables con los datos reportados previamente por Sharma et ^al.13 y, por lo tanto, confirman la formación del compuesto deseado.

Los resultados obtenidos a través del análisis ADMET se tabulan en la Tabla 1. El potencial biomédico de [C₁₆quin]Br se investigó utilizando un ensayo de difusión de pozos contra la cepa de C. albicans (Figura 6). Esta técnica evalúa la potencia antimicrobiana de la IL midiendo la zona de inhibición del crecimiento alrededor del sitio de aplicación del compuesto. Se observó que [C₁₆quin]Br mostró un efecto antimicrobiano estadísticamente pronunciado (p < 0,05) contra C. albicans, lo que hace que esta clase de IL sea altamente potente y efectiva en el campo de la biomedicina.

Rendimiento porcentual de la reacción
El rendimiento teórico de la reacción se puede calcular de la siguiente manera, según el esquema de reacción adoptado (Figura 2).

A partir del esquema, 1 M de quinolina conduce a la formación de 1 M de bromuro de 1-hexadecilquinolina-1-io, es decir, 129,16 g/mol de quinolina = 434 g/mol [C₁₆quin]Br. Por lo tanto,

12,916 g (0,1 moles) de quinolina ×12,916= 43,4 g

Por lo tanto, el rendimiento teórico de la reacción es de 43,4 g.

Sin embargo

% de rendimiento= ×100

En el presente estudio, se encontró que el rendimiento real de la reacción fue de 37,84 g después del secado completo del producto obtenido.

Por lo tanto

% de rendimiento= ×100=87.188% (87%)

Además, el tiempo de reacción más largo, como se ve en el escenario presente, es pertinente para permitir que el sistema de reacción alcance un equilibrio termodinámico completo, donde la entropía del sistema se maximiza al tiempo que se minimiza la energía libre de Gibbs. Con el tiempo, esto maximiza el rendimiento de la reacción. Sin embargo, las condiciones de reacción son bastante suaves y, por lo tanto, requieren un tiempo de reacción prolongado para garantizar que todo el reactivo se haya convertido con éxito en el producto. El tiempo de reacción, aquí, se optimiza después de un pragmatismo repetido.

Figura 1: Configuración de la reacción. La figura muestra los esquemas generales de la configuración de la reacción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Mecanismo de síntesis. Representación esquemática del esquema de reacción implicado en el proceso de síntesis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: RMN esperada ^{en 1}h. Representación de los espectros de RMN de ¹H de [C₁₆quin]Br. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: ¹³CNMR esperados. Representación de los espectros de RMN de ¹³C de [C₁₆quin]Br. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Espectros IR esperados. Representación de los espectros IR de [C₁₆quin]Br. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Estudio antifúngico. El ensayo de difusión en disco se realizó mediante la adición de 50 μL de 0,1 mM de IL, lo que representa el potencial antifúngico de [C₁₆quin]Br. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Propiedad	Valor	Comentario
Regla de Lipinski	Aceptado	MW ≤ 500; registro P ≤ 5; Aceptor H ≤ 10; ≤ de donantes H 5. Si dos propiedades están fuera de rango, es posible una mala absorción o permeabilidad, una es aceptable.
Absorción gastrointestinal	Alto	Mayor eficacia de la administración oral
Solubilidad en agua	Moderado	Mejora la capacidad de carga de fármacos del compundio
Puntuación de biodisponibilidad	0.55 (55%)	Influye en el potencial terapéutico del compuesto

Tabla 1: Análisis ADMET. Tabla que representa las propiedades importantes a considerar para validar el potencial biológico de la IL sintetizada.

Discusión

Últimamente, los IL han divulgado varias implementaciones prometedoras en el campo de las ciencias bioquímicas, incluida la actividad de repliegue de proteínas/chaperonas, vehículos de administración de fármacos y/o catalizadores en varias reacciones orgánicas. Sus interesantes propiedades fisicoquímicas, como la sintonización, la biocompatibilidad, la solubilidad, la sostenibilidad, la estabilidad, etc., los han convertido en candidatos potenciales para el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos²⁰. La investigación propuesta visualiza la resistencia a los antimicrobianos como un asunto de grave preocupación y una de las mayores amenazas para la salud mundial, la seguridad alimentaria y el desarrollo en la actualidad, dando prioridad a la búsqueda de la investigación y el desarrollo de nuevos compuestos farmacéuticos en el ámbito de la ciencia biomédica. Al elegir IL a base de quinolina para su aplicación en la industria biomédica, reconocemos su alta potencia en la destrucción de microbios patógenos. Aparte del efecto antimicrobiano de esta clase de compuestos, su actividad de chaperona artificial eleva su mérito en el aspecto biofísico del mundo científico.

En este estudio, sintetizamos con éxito la IL deseada utilizando una ruta de reacción más ecológica. A diferencia de las metodologías convencionales que se basan en la utilización de solventes tóxicos, evolucionando subproductos gaseosos nocivos²¹, aquí reportamos un enfoque más económico, ecológico y libre de solventes para la síntesis de los mismos. El protocolo implica la utilización de una configuración de reacción fácil y un aparato simple, lo que facilita la síntesis robusta en el laboratorio del compuesto deseado. El producto obtenido aquí se puede aislar sin esfuerzo a través de una simple técnica de filtración. La ausencia de subproductos sustanciales a lo largo de la reacción promueve aún más los aspectos más ecológicos de la síntesis. La técnica utilizada en este estudio demostró ser eficiente tanto en términos de rendimiento químico como de pureza del compuesto deseado. La reacción, que de otro modo sería de varios pasos, se llevó a cabo en una sola olla, con la intención de reducir el tiempo y los recursos. Esta técnica se adoptó con el fin de deshacerse de las prolongadas etapas de separación y purificación involucradas en la síntesis orgánica general.

Sin embargo, las limitaciones que acompañan al protocolo mencionado anteriormente implican una gestión exhaustiva de la compatibilidad de las condiciones de reacción (especialmente la temperatura) y la garantía de una purga adecuada del gas N2 para perpetuar manualmente un entorno de trabajo inerte. Es vital controlar y monitorear el entorno de reacción de manera oportuna para la correcta ejecución de cada paso individual. La escalabilidad puede ser otro posible impedimento para el protocolo sugerido, ya que el escalado de una síntesis de un solo recipiente para fines industriales puede ser extremadamente exigente debido a las preocupaciones relacionadas con la mezcla homogénea, así como con el control de cada parámetro de reacción.

En conclusión, la metodología reportada es una estrategia poderosa en química verde, que ofrece varios beneficios, con su propio conjunto de desafíos que deben abordarse y ponderarse meticulosamente mientras se diseñan, ejecutan y optimizan las rutas de reacción.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1-bromohexadecano,	Merck	CAS no.112-82-3	95% de pureza (según lo determinado por análisis de HPLC)
Acetato de etilo	Merck	CAS no.: 205-500-4	95% de pureza (según lo determinado por análisis de HPLC)
Espectrómetro de resonancia magnética nuclear (RMN)	Jeol, modelo: JNM-ECZ 400S	Nil	Nil
Quinolina	Merck	CAS no.91-22-5	95% de pureza (según lo determinado por HPLC análisis)
Tolueno	Merck	CAS n.º 108-88-3	95% puro (según lo determinado por análisis de HPLC)