Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Cribado y aislamiento de bacterias intestinales escindidoras de glucósidos C

944 visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/67346

⸱

28 de febrero de 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este estudio establece un conjunto de procedimientos operativos estándar (SOP, por sus siglas en inglés) para detectar y aislar de manera eficiente las bacterias intestinales capaces de escindir los glucósidos C.

Resumen

Los glucósidos C se encuentran comúnmente en las plantas medicinales y exhiben una amplia diversidad estructural junto con diversas bioactividades, que incluyen actividades antibacterianas, antiinflamatorias, antivirales, antioxidantes y antineoplásicas. En los glucósidos C, el carbono anomérico de la fracción de azúcar está directamente conectado a una aglicona a través de un enlace carbono-carbono. En comparación con los O-glucósidos, los C-glucósidos son estructuralmente estables y resistentes a los ácidos y enzimas. En consecuencia, suelen ser irrompibles, lo que da lugar a una mala absorbibilidad y una baja biodisponibilidad. Curiosamente, algunas bacterias intestinales pueden escindir los enlaces glucosídicos C-C, proporcionando un enfoque biológico específico y respetuoso con el medio ambiente para degradar los glucósidos C. En este estudio, se desarrolló un conjunto de procedimientos operativos estándar (SOP) para el cribado de bacterias intestinales capaces de escindir enlaces glucosídicos C-C basados en el modelo de biotransformación de compuestos naturales. Los POE incluyen la preparación y el enriquecimiento de bacterias intestinales, el cribado orientado a la actividad y la validación de la actividad en un medio fuente de carbono bajo. Esta metodología proporciona una referencia fundamental para los investigadores que buscan aislar y estudiar estas bacterias funcionales especializadas.

Introducción

Los glucósidos C son un grupo de compuestos caracterizados por la unión directa de los grupos glicosilo a las agliconas a través de enlacesC-C 1. En la naturaleza, la orientina, la vitexina, la puerarina y sus derivados se identifican comúnmente como C-glucósidos2. Estos compuestos se encuentran frecuentemente en plantas medicinales como Trollius chinensis3 y en animales como Styela plicata4. Los estudios han demostrado que estos compuestos brindan beneficios para la salud y exhiben diversas bioactividades, que incluyen antibacteriano 5,6,7, antiinflamatorio 8,9,10,11,12, antiviral 3,12,13, antioxidante 14,15,16 y Actividades antineoplásicas17.

Debido a la unión de los grupos glicosil al esqueleto a través de enlaces C-C, estos compuestos exhiben una alta estabilidad y resistencia a la hidrólisis ácida y enzimática18, lo que conduce a una mala absorbibilidad y baja biodisponibilidad19. Esta limitación afecta el desarrollo y la utilización de los glucósidos C. Sin embargo, los fármacos que contienen glucósidos C, a menudo administrados por vía oral, son desglicosilados por enzimas específicas, produciendo agliconas bioactivas más potentes 20,21,22,23. Si bien las propias enzimas del huésped no pueden desglicosilar los glucósidos C, se ha informado que las bacterias intestinales metabolizan ciertos tipos. Por ejemplo, algunas bacterias intestinales convierten la mangiferina en norathyriol, que exhibe mayor potencia como agente antidiabético o antineoplásico24. A pesar de estos hallazgos, solo se ha caracterizado un número limitado de bacterias capaces de escindir los glucósidos C, y los mecanismos subyacentes siguen siendo poco conocidos. El cribado eficiente y estandarizado de estas bacterias mejorará la comprensión de sus funciones y acelerará el desarrollo de los glucósidos C.

El método de cribado se ha desarrollado y perfeccionado con el tiempo hasta convertirse en un sistema maduro. Los enfoques principales incluyen el enriquecimiento, el cribado orientado a la actividad y la validación de la actividad en medios de origen bajos en carbono. Este método facilita el aislamiento de cepas objetivo puras, así como la identificación de especies, datos genómicos y rasgos de los microorganismos objetivo. Con este sistema, las bacterias intestinales capaces de escindir los glucósidos C pueden ser examinadas y aisladas de manera efectiva.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Los experimentos realizados se adhirieron a las regulaciones locales, nacionales e internacionales de contención de bioseguridad apropiadas a los peligros específicos de bioseguridad asociados con cada cepa. Se recogieron muestras fecales de voluntarios sanos que no habían tomado ningún fármaco durante al menos una semana. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Construcción de un modelo de transformación bacteriana intestinal humana in vitro

  1. Preparación de Medio Anaeróbico General (GAM)25
    1. Preparación de la solución A
      1. Combine 10,0 g de triptona, 10,0 g de peptona proteosa, 3,0 g de peptona de soja, 13,5 g de suero digestivo en polvo, 1,2 g de extracto de hígado en polvo, 2,2 g de extracto de carne de vacuno y 5,0 g de extracto de levadura en un matraz Erlenmeyer de 500 ml.
      2. Agregue 500 mL de agua destilada y revuelva hasta que las sustancias se disuelvan por completo.
    2. Preparación de la solución B
      1. Prepare la solución B siguiendo el mismo procedimiento que la solución A, excepto que combine 3,0 g de glucosa, 5,0 g de almidón soluble, 2,5 g de hidrogenofosfato dipotásico y 3,0 g de cloruro de sodio en un matraz Erlenmeyer de 250 ml.
    3. Preparación de la solución C
      1. Prepare la solución C siguiendo el mismo procedimiento que las soluciones A y B, excepto que combine 0,3 g de clorhidrato de L-cisteína y 0,3 g de tioglicolato de sodio en un matraz Erlenmeyer de 100 ml.
      2. Mezcle las tres soluciones en un matraz Erlenmeyer de 1000 mL, ajuste el pH a 7.2 usando una solución de hidróxido de sodio al 10% y agregue agua destilada para obtener un volumen final de 1000 mL.
      3. Distribuya el medio en matraces Erlenmeyer de 250 mL y autoclave a 121 °C durante 30 min. Enfriar a temperatura ambiente y almacenar a 4 °C.
    4. Preparación de medio anaeróbico general sólido
      1. Agregue agar al 1%-2% al medio líquido GAM y caliente hasta que se disuelva por completo. Distribuir en matraces Erlenmeyer de 250 mL y autoclave a 121 °C durante 30 min.
    5. Preparación de un medio de origen bajo en carbono
      1. Prepare el medio fuente bajo en carbono utilizando el mismo procedimiento que el GAM, pero omita el extracto de levadura, la glucosa y el almidón soluble.
  2. Preparación de Flora Intestinal Humana Mixta
    1. Recoja 1-2 g de heces humanas frescas en un tubo de recolección de heces estéril desechable lleno de gas nitrógeno. Selle el tubo de inmediato. Añadir 5 mL de medio GAM, sellar y cultivar a 37 °C durante 24 h en una incubadora anaeróbica estéril.
      NOTA: Use un medidor de oxígeno para monitorear los niveles de oxígeno de la incubadora anaeróbica y reemplace el gas nitrógeno según sea necesario para mantener las condiciones anaeróbicas.
  3. Activación de la flora intestinal humana mixta
    1. Después de 24 h, transfiera 0,5 mL de la suspensión bacteriana intestinal humana a un nuevo tubo de microcentrífuga que contenga 4,5 mL de medio GAM fresco.
    2. Sellar e incubar a 37 °C durante 24 h en condiciones anaeróbicas para obtener una flora intestinal humana mixta activa.
  4. Preparación de soluciones de referencia
    1. Pesar 5 mg de orientina y luteolina, y disolverlas por separado en 1 mL de DMSO para preparar soluciones de referencia de orientina y luteolina a una concentración de 5 mg/mL.
  5. Cribado de la flora intestinal activa capaz de escindir los glucósidos C
    1. Mezclar 260 μL de flora intestinal activada con 6 mL de medio fuente fresco bajo en carbono que contenga 40 μL de solución de referencia de orientina, e incubar a 37 °C.
    2. Incluya un grupo de control (6 mL de medio fuente bajo en carbono, 40 μL de solución de referencia de orientina y 260 μL de solución salina normal) y un grupo en blanco (6 mL de medio fuente bajo en carbono, 40 μL de solución salina normal y 260 μL de flora intestinal activada).
      NOTA: Realice todas las pruebas por triplicado en una incubadora anaeróbica.
  6. Pretratamiento de soluciones de transformación
    1. Después de 24 h y 48 h, pipetear 1 mL de las soluciones de reacción en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y centrifugar a 13.400 x g durante 15 min a temperatura ambiente para eliminar las bacterias.
    2. Añadir 200 μL del sobrenadante a 600 μL de metanol, mezclar y centrifugar a 13.400 x g durante 15 min a temperatura ambiente para eliminar las proteínas.
  7. Detección de productos de transformación
    1. Filtre el sobrenadante con una membrana microporosa de 0,22 μm y analice el filtrado mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Realice análisis de HPLC en un instrumento equipado con una columna C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm).
    2. Mantenga la temperatura del horno de columna a 40 °C, con un caudal de 1 mL/min. Utilice acetonitrilo como fase móvil A y ácido fórmico al 0,1% en agua purificada como fase móvil B.
      NOTA: Emplee un sistema de gradiente lineal de la siguiente manera: 5%-55% A a 0-20 min, 55%-95% A a 20-25 min, 95%-5% A a 25-30 min y 5% A a 30-32 min.

2. Aislamiento de cepas individuales de la flora bacteriana intestinal humana

  1. Activación de la flora bacteriana intestinal humana mixta
    1. Activar la flora bacteriana intestinal humana mixta capaz de escindir la orientina, como se describe en el paso 1.3, para obtener la solución de flora bacteriana intestinal humana activada.
  2. Preparación de placas GAM sólidas
    1. Disuelva el medio GAM sólido preparado calentándolo y viértalo en placas de Petri estériles desechables en una incubadora anaeróbica. Deje que el medio se solidifique para preparar placas GAM sólidas.
  3. Cribado preliminar de cepas individuales de la flora bacteriana intestinal humana
    1. Pipetear 100 μL de la solución bacteriana activada en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contenga 1 mL de solución salina normal.
    2. Inocular un volumen adecuado de la solución bacteriana en una placa de Petri utilizando un anillo de inoculación desechable. Selle la placa e incubela en una incubadora anaeróbica.
  4. Observación de la morfología de las colonias
    1. Después de 48 h de incubación a 37 °C, observe el tamaño, la morfología y el color de las colonias en la placa.
  5. Selección de colonias individuales para obtener cepas individuales
    1. Seleccione colonias bacterianas individuales distintas y cultívelas en tubos de microcentrífuga de 10 mL que contengan 4,5 mL de medio GAM fresco. Incubar en condiciones anaeróbicas a 37 °C durante 24 h para obtener cepas individuales.
  6. Verificación de la actividad de una sola deformación
    1. Verifique la actividad de las cepas individuales como se describe en los pasos 1.5, 1.6 y 1.7. Realizar la verificación de la actividad mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y marcado de placas25.
  7. Purificación de cepas individuales de la flora bacteriana intestinal humana
    1. Purifique la cepa individual activa como se describe en el paso 2.1. Verifique su actividad a través de experimentos de transformación con orientina, siguiendo los procedimientos descritos en los pasos 1.5, 1.6 y 1.7.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Las muestras fecales de diez voluntarios sanos se examinaron mediante experimentos de transformación, lo que dio como resultado una muestra que demostró actividad en la desglicosilación de la orientina. Este hallazgo confirmó la viabilidad del cribado de muestras activas. La muestra activa se aisló mediante el método de marcado en placa. Con base en la morfología y las características de las colonias, se seleccionaron aproximadamente 18 colonias bacterianas individuales con coloración amarilla o blanca, formas variadas y...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Se estableció un procedimiento operativo estándar (SOP) para el cribado de bacterias intestinales humanas capaces de escindir los glucósidos C. Utilizando estos procedimientos, se obtuvo con éxito una cepa activa pura, y su propiedad de desglicosilación se confirmó mediante pruebas de transformación. El POE consiste en la preparación y el enriquecimiento de las bacterias intestinales, el cribado orientado a la actividad y la validación de la actividad en un medio fuente de carbono bajo.<...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

El trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China 82374134.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AcetonitriloThermo Fisher ScientificF2408R205 HPLC
Incubadora anaeróbicaShanghai CIMO Medical Instrument Manufacturing Co., Ltd YQX- II
Extracto de carne de vacunoBeijing Abxing Biotechnology Co., Ltd01-009BR
Suero digestivo en polvoBeijing Abxing Biotechnology Co., Ltd01-087BR
Dipotásico Fosfato de hidrógenoBeijing Chemical WorksM26298AR
Tubo de recolección de heces estériles desechablesLang Fu Co., Ltd5 mL
agua destiladaDepartamento de Biofarmacéutica, Universidad de Medicina
de Beijing DMSOSigma-Aldrich CorporationWXBD2861VAR
EP TuboBiodee Biotechnology Co., LTD10 mL/1.5 mL
Centrífuga EppendorfEppendorf AG5418
GlucosaBeijing Chemical WorksGC205003AR
Cromatógrafo de líquidos de alto rendimientoShimadzu CorporationLC-20
Esterilizador de vapor de alta presiónSanyo Denki Shanghai Co., LtdMLS-3780
Innoval C18 Columna cromatográficaAgela Technologies Co., LTD4,6 mm y veces; 250 mm, 5 y micro; m
Clorhidrato de L-cisteínaBeijing Abxing Biotechnology Co., LtdBGASY01BR
Polvo de extracto de hígadoBeijing Abxing Biotechnology Co., Ltd01-085BR
LuteolinInstitutos Nacionales para el Control>98%
Agitador magnéticoIka Werke Co., LTDRCT
básico MetanolThermo Fisher Membrana20240901312AR
MilliporeSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.0,22 y micro; L y veces; 50 mm
OrientinYishiming (Pekín) Biotechnology Co., Ltd19120601>98%
PeptonaPekín Abxing Biotechnology Co., Ltd1685787BR
Placa de Petri PekínBiodee Biotechnology Co., Ltd150 mm
Cloruro de sodioPekín Abxing Biotechnology Co., LtdBN20008
AR Tioglicolatode sodioShanghai Jianglai Biotechnology Co., LtdJ031S219019AR
Almidón solubleBeijing Abxing Biotechnology Co., LtdS9765BR
Peptona de sojaBeijing Abxing Biotechnology Co., Ltd2147955BR
TriptonaAgela Technologies Co., Ltd1685787
Limpiador ultrasónicoKun Shan Ultrasonic Instruments Co., LtdKQ-500DE Extracto de
levaduraBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD01-014BR
deTradicional China Beijing de Alimentos y Medicamentos de filtro Scientific BR

Referencias

  1. Zhang, Y. Q., Zhang, M., Wang, Z. L., Qiao, X., Ye, M. Advances in plant-derived C-glycosides: phytochemistry, bioactivities, and biotechnological production. Biotechnol Adv. 60, 108030(2022).
  2. Franz, G., Grun, M. Chemistry, occurrence and biosynthesis of C-glycosyl compounds in plants. Planta Med. 47 (3), 131-140 (1983).
  3. Cai, S., et al. Antiviral flavonoid-type C-glycosides from the flowers of Trollius chinensis. Chem Biodivers. 3 (3), 343-348 (2006).
  4. Shi, X., et al. A flavone C-glycoside from Styela plicata. Biochem Syst Ecol. 86, 103924(2019).
  5. Xiao, J., Capanoglu, E., Jassbi, A. R., Miron, A. Advance on the flavonoid C-glycosides and health benefits. Crit Rev Food Sci Nutr. 56 (Suppl 1), S29-S45 (2016).
  6. Ma, R., Cheng, S., Sun, J., Zhu, W., Fu, P. Antibacterial gilvocarcin-type aryl-C-glycosides from a soil-derived Streptomyces species. J Nat Prod. 85 (10), 2282-2289 (2022).
  7. Le Dang, Q., et al. Desmodinosides A-E: New flavonoid C-glycosides from Desmodium heterocarpon var. stigosum with hepatoprotective and antifungal activity. Fitoterapia. 169, 105609(2023).
  8. Choi, J. S., et al. Effects of C-glycosylation on antidiabetic, anti-Alzheimers disease and anti-inflammatory potential of apigenin. Food Chem Toxicol. 64, 27-33 (2014).
  9. Courts, F. L., Williamson, G. The occurrence, fate and biological activities of C-glycosyl flavonoids in the human diet. Crit Rev Food Sci Nutr. 55 (10), 1352-1367 (2015).
  10. Thao, N. P., et al. Anti-inflammatory flavonoid C-glycosides from Piper aduncum leaves. Planta Med. 82 (17), 1475-1481 (2016).
  11. Kim, M. K., Yun, K. J., Lim, D. H., Kim, J., Jang, Y. P. Anti-inflammatory properties of flavone di-C-glycosides as active principles of camellia mistletoe, Korthalsella japonica. Biomol Ther (Seoul). 24 (6), 630-637 (2016).
  12. Chen, Y. L., Chen, C. Y., Lai, K. H., Chang, Y. C., Hwang, T. L. Anti-inflammatory and antiviral activities of flavone C-glycosides of Lophatherum gracile for COVID-19. J Funct Foods. 101, 105407(2023).
  13. Wang, Y., et al. Flavone C-glycosides from the leaves of Lophatherum gracile and their in vitro antiviral activity. Planta Med. 78 (1), 46-51 (2012).
  14. Devkota, H. P., Fukusako, K., Ishiguro, K., Yahara, S. Flavone C-glycosides from Lychnis senno and their antioxidative activity. Nat Prod Commun. 8 (10), 1413-1414 (2013).
  15. Stark, T. D., et al. Isolation and structure elucidation of highly antioxidative 3,8-linked biflavanones and flavanone-C-glycosides from Garcinia buchananii bark. J Agric Food Chem. 60 (8), 2053-2062 (2012).
  16. Stark, T. D., Germann, D., Balemba, O. B., Wakamatsu, J., Hofmann, T. New highly in vitro antioxidative 3,8-linked biflav(an)ones and flavanone-C-glycosides from Garcinia buchananii stem bark. J Agric Food Chem. 61 (51), 12572-12581 (2013).
  17. Xiao, J., Capanoglu, E., Jassbi, A. R., Miron, A. Advance on the flavonoid C-glycosides and health benefits. Crit Rev Food Sci Nutr. 56 (Suppl 1), 29-45 (2016).
  18. Xie, K., Zhang, X., Sui, S., Ye, F., Dai, J. Exploring and applying the substrate promiscuity of a C-glycosyltransferase in the chemo-enzymatic synthesis of bioactive C-glycosides. Nat Commun. 11 (1), 5162(2020).
  19. Liu, L., et al. Characterization of the intestinal absorption of seven flavonoids from the flowers of Trollius chinensis using the Caco-2 cell monolayer model. PLoS One. 10 (3), e0119263(2015).
  20. Xu, M., et al. Mechanism and application of microbial transformation of glycosides in traditional Chinese medicine. World Sci Technol. 2, 24-27 (2006).
  21. Xie, L., et al. Comparison of flavonoid O-glycoside, C-glycoside and their aglycones on antioxidant capacity and metabolism during in vitro digestion and in vivo. Foods. 11 (6), 882(2022).
  22. Hostetler, G. L., Ralston, R. A., Schwartz, S. J. Flavones: Food sources, bioavailability, metabolism, and bioactivity. Adv Nutr. 8 (3), 423-435 (2017).
  23. Xiao, J. Dietary flavonoid aglycones and their glycosides: which show better biological significance. Crit Rev Food Sci Nutr. 57 (9), 1874-1905 (2017).
  24. Hasanah, U., Miki, K., Nitoda, T., Kanzaki, H. Aerobic bioconversion of C-glycoside mangiferin into its aglycone norathyriol by an isolated mouse intestinal bacterium. Biosci Biotechnol Biochem. 85 (4), 989-997 (2021).
  25. Yang, X., Xu, W. Establishment of model and standard operation procedure for biotransformation of chemical constituents of traditional Chinese medicine by human intestinal bacteria. China J Chin Mater Med. 36 (1), 19-26 (2011).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Explorar más artículos

Ruptura de C-glucósidoscribado bacterianoaislamiento bacterianomedio bajo en carbonoincubación anaeróbicacromatografía líquida de alta resoluciónflora intestinal humanamorfología de la coloniaactividad de desglucosilación
Cribado y aislamiento de bacterias intestinales escindidoras de glucósidos C
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.