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Inducción de la entrada de juveniles de dispersión de tercera etapa de Bursaphelenchus xylophilus en criptobiosis a través de la regulación osmótica

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DOI:

10.3791/67350

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27 de diciembre de 2024

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11State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Institute of Ecological Conservation and Restoration, Chinese Academy of Forestry, 2Comprehensive Experimental Center in Yellow River Delta of Chinese Academy of Forestry, 3Tianjin Institute of Forestry Science, Chinese Academy of Forestry, 4Ningbo Yongsen Biotechnology Co. Ltd, 5Xiangshan Natural Resources and Planning Bureau of Zhejiang

En este artículo

Resumen

El presente protocolo describe un método para inducir la dispersión de juveniles de tercera etapa (juveniles pre-dauer, JIII.) de Bursaphelenchus xylophilus en criptobiosis a través de la regulación osmótica de los iones de cloruro de potasio (KCl). Este método puede proporcionar apoyo técnico para la investigación sobre los mecanismos de resistencia al estrés de B. xylophilus.

Resumen

La criptobiosis es un estado en el que los organismos pierden casi toda su agua interna y entran en anhidrobiosis bajo un estrés ambiental extremo. La dispersión de los juveniles de la tercera etapa (juveniles pre-dauer, figure-abstract-1) de Bursaphelenchus xylophilus puede entrar en criptobiosis a través de la deshidratación y revivir tras la rehidratación cuando las condiciones ambientales mejoran. La regulación osmótica es crucial para su supervivencia en este proceso. En este estudio, se recolectaron especímenes de B. xylophilus de Pinus massoniana muerto debido a la enfermedad del marchitamiento del pino en Ningbo, provincia de figure-abstract-2 Zhejiang, China. Después de la inmersión en una solución figure-abstract-3 de cloruro de potasio (KCl) al 8%, B. xylophilus entró en un estado criptobiótico después de una deshidratación gradual debido al aumento de la presión osmótica externa por evaporación natural del agua. figure-abstract-4 B. xylophilus pudo resistir el estrés a baja temperatura a -20 °C. figure-abstract-5 B. xylophilus pudo revivir después de la rehidratación, con una tasa de supervivencia del 92,1%. Este proceso puede regular la entrada de figure-abstract-6 B. xylophilus en la criptobiosis, lo que les permite resistir entornos extremos. Este método descrito en nuestro estudio es sencillo y fiable, proporcionando soporte técnico para el estudio de los mecanismos de resistencia al estrés de B. xylophilus.

Introducción

La enfermedad del marchitamiento del pino es una de las enfermedades forestales más graves de China1. El nematodo de la madera de pino Bursaphelenchus xylophilus (B. xylophilus) representa una amenaza significativa para las especies de pino como Pinus massoniana (P. massoniana) al reproducirse dentro del huésped, lo que provoca un rápido marchitamiento y muerte. Bajo condiciones ambientales desfavorables después de la muerte del huésped, los juveniles reproductivos de B. xylophilus pueden entrar en juveniles pre-dauer (figure-introduction-1). Estos juveniles buscan insectos vectores para continuar su transferencia y propagación, causando extensas mortandades de pinares2.

La criptobiosis es un estado en el que los organismos pierden casi toda su agua interna y entran en anhidrobiosis bajo un estrés ambiental extremo. En este proceso, los organismos se deshidratan gradualmente, lo que resulta en un movimiento detenido, un metabolismo reducido yun ciclo de vida suspendido. En condiciones adecuadas, pueden recuperarse tras la rehidratación. La criptobiosis permite a los organismos resistir ambientes extremos, como las bajas temperaturas, y prolongar su vida útil5. Los nematodos que sobrevivieron en criptobiosis durante 30.000 años se encontraron en el permafrost antártico6.

Estudios previos han demostrado que los nematodos pueden adaptarse a varios factores de estrés abiótico, como la baja temperatura, la sequía y la alta presión osmótica, durante la deshidratación ajustando su permeabilidad superficial. Además, los nematodos pueden enroscar sus cuerpos para disminuir el área de superficie y minimizar la tasa de pérdida de agua. Por ejemplo, Caenorhabditis elegans regula el equilibrio osmótico, permitiendo que los iones y las moléculas pequeñas pasen libremente a través de su cutícula, mientras que las moléculas más grandes nopueden. figure-introduction-2 B. xylophilus también exhibe criptobiosis. Durante las etapas de deshidratación y rehidratación de la criptobiosis, la regulación osmótica es esencial para controlar el intercambio de sustancias a través de la cutícula, por lo que es fundamental para ingresar o recuperarse de la criptobiosis9.

El presente estudio presenta un método para inducir criptobiosis en figure-introduction-3 B. xylophilus a través de la regulación osmótica. Este método es simple, eficiente y altamente confiable, y proporciona soporte técnico para investigar los mecanismos de resistencia al estrés de figure-introduction-4 B. xylophilus.

Protocolo

1. Colección de figure-protocol-1 B. xylophilus

  1. Colección de discos infectados de P. massoniana
    NOTA: Todos los procedimientos cumplieron con las Medidas Administrativas para el Área Epidémica de la Enfermedad del Marchitamiento del Pino y la Madera Infectada y otras regulaciones aplicables. Se seleccionó como sitio de muestreo un bosque de P. massoniana infectado por B. xylophilus en el condado de Xiangshan, ciudad de Ningbo, provincia de Zhejiang. P. massoniana, que murió de la enfermedad del marchitamiento del pino, fue talada dentro del sitio de muestreo.
    1. Recoja troncos redondos (de 5 cm de grosor) de las secciones superior, media e inferior del tronco principal de los árboles talados.
    2. Cortar los troncos redondos recolectados de P. massoniana en rodajas de 0,5-1 cm de grosor, luego recórtelos en tiras pequeñas de 2-3 cm de largo.
    3. Coloque las pequeñas tiras de madera en bolsas selladas y guárdelas en un laboratorio para su uso posterior.
  2. Extracción de figure-protocol-2 B. xylophilus
    1. Conecte un tubo de goma al extremo estrecho de un embudo de vidrio de cuello largo con un diámetro aproximado de 15 cm. Asegure el tubo de goma con una llave de presión. Coloque el embudo ensamblado en un soporte de embudo.
    2. Envuelva las pequeñas tiras de madera completamente en una sola capa de papel de seda y luego colóquelas en el embudo. Agregue agua destilada al embudo hasta que todas las tiras de madera estén sumergidas.
      NOTA: Después de reposar durante 12-24 h, los nematodos migraron fuera de las tiras de madera y se asentaron en el fondo del embudo10. El papel de seda evitaba que los restos de madera se asentaran y permitía el paso de los nematodos.
    3. Suelte lentamente la llave de presión en la parte inferior del embudo y deje que 2000-5000 μL de la mezcla se filtren en una placa de Petri (5 cm de diámetro) para el examen microscópico y la identificación morfológica.
    4. Identifique figure-protocol-3 B. xylophilus mediante la observación de características como estiletes, bulbos esofágicos medianos, gotas de lípidos y formas de cola "en forma de dedo"11.
    5. Bajo un microscopio, transfiera B. xylophilus individual figure-protocol-4 a un portaobjetos aspirando 10 μL de líquido junto con un nematodo usando una pipeta de 10 μL cada vez. Repita este proceso 30 veces para recolectar aproximadamente 300 μL de la mezcla que contiene nematodos.
    6. Después de la extracción de B. xylophilus, esterilice las tiras de figure-protocol-5 madera restantes y los materiales de madera infectados para evitar una mayor contaminación.

2. Control del proceso de regulación osmótica

  1. Preparación de la mezcla de regulación osmótica
    1. Prepare una solución acuosa de KCl al 8%.
    2. Con una pipeta, agregue 10 μL de la solución acuosa de KCl al 8% al portaobjetos que contiene la mezcla de figure-protocol-6 B. xylophilus, produciendo aproximadamente 310 μL de una mezcla de nematodos y solución de KCl.
  2. Regulación del aumento de la presión osmótica y la deshidratación de figure-protocol-7 B. xylophilus
    1. Coloque el portaobjetos en la platina del microscopio, permitiendo que el agua se evapore de forma natural. Aumentaría gradualmente la presión osmótica del entorno circundante, lo que haría que los nematodos se deshidrataran durante aproximadamente 30-60 minutos.
      NOTA: El operador solo necesita esperar a que el agua se evapore naturalmente hasta que los cristales de KCL precipiten y observar el estado de los nematodos bajo un microscopio. Se necesitan unos 30-60 minutos para que 310 μL de la mezcla se evaporen naturalmente hasta que precipiten los cristales de KCL.
    2. Observe el proceso de deshidratación (p. ej., enroscamiento del cuerpo, agregación, etc.) de figure-protocol-8 B. xylophilus bajo el microscopio. Cuando el agua se evapora por completo y los cristales de KCl precipitan, figure-protocol-9 B. xylophilus deja de moverse y entra en criptobiosis.
  3. Tratamiento del estrés a baja temperatura del criptobiótico figure-protocol-10 B. xylophilus
    1. Coloque el criptobiótico figure-protocol-11 B. xylophilus en un ambiente de temperatura constante de -20 °C durante 24 h.
  4. Regulación de la disminución de la presión osmótica y rehidratación de figure-protocol-12 B. xylophilus
    1. Añadir aproximadamente 300 μL de agua destilada alrededor de los juveniles que habían sido sometidos a un tratamiento a baja temperatura con pipeta. El proceso de rehidratación, que dura unos 30-60 minutos, disminuye gradualmente la presión osmótica de su entorno circundante.
    2. Observe el proceso de rehidratación de figure-protocol-13 B. xylophilus (por ejemplo, estiramiento del cuerpo, reanudación del movimiento, etc.) bajo el microscopio. Calcular la tasa de supervivencia a las 24 h.

Resultados

En la solución de KCl al 8%, a medida que el agua se evaporaba, figure-results-1 B. xylophilus inicialmente exhibió un notable "enroscamiento" mientras permanecía móvil (Figura 1A). Una vez que el agua se evaporó por completo, los nematodos cesaron su movimiento y se enroscaron, con superficies deprimidas y gotas lipídicas acumuladas (Figura 1B), lo que indica su entrada en el estado criptobiótico. Tras la adición de agua destilada a su entorno circundante, los nematodos se rehidrataron y revivieron (Figura 1C). Después de que el agua se evapore, aparecerán cristales de KCL (Figura 1D). La Figura 1E muestra las características morfológicas de figure-results-2 B. xylophilus.

Un experimento de deshidratación demostró que en una solución inicial de KCl al 8%, la evaporación del agua hizo figure-results-3 que B. xylophilus perdiera agua. Después de la deshidratación, figure-results-4 B. xylophilus fue sometido a estrés a baja temperatura a -20 °C durante 24 h; la tasa promedio de supervivencia fue de 92,1%11. En comparación con una tasa de supervivencia del 0% en el grupo de control que no había entrado en un estado criptobiótico, los datos anteriores sugirieron que la deshidratación podría mejorar significativamente la tasa de supervivencia de B. xylophilus en condiciones de figure-results-5 baja temperatura.

Durante la fase de rehidratación posterior a la criptobiosis de figure-results-6 B. xylophilus, observamos que el 100% de los nematodos exhibieron "burbujas" in vivo al ser transferidos de una solución de KCl al 40% a agua destilada (Figura 2).

figure-results-7
Figura 1: Proceso de deshidratación-criptobiosis-rehidratación de figure-results-8 B. xylophilus. Esta imagen ilustra el proceso de criptobiosis en figure-results-9 B. xylophilus, incluyendo la (A) etapa de deshidratación, (B) etapa de criptobiosis, (C) etapa de rehidratación, (D) etapa de cristalización de KCL y (E) figure-results-10 B. xylophilus. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-11
Figura 2: Acumulación de gránulos de grasa en B. xylophilus no revividofigure-results-12. Esta imagen muestra el estado de B. xylophilus después de figure-results-13 la rehidratación, caracterizado por la presencia de gránulos de grasa en forma de burbuja in vivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

En este estudio, figure-discussion-1 se colectó B. xylophilus de P. massoniana muerta en Ningbo, provincia de Zhejiang. Cabe destacar que figure-discussion-2 B. xylophilus fue seleccionado de una población mixta con diferentes estadios. Específicamente, se eligieron troncos redondos con una alta densidad de B. xylophilus, seguidos del tamizaje de figure-discussion-3 B. xylophilus. Durante el invierno, cuando la temperatura mínima diaria en la provincia de Liaoning es de alrededor de -20 °C, se puede obtener una gran cantidad de B. xylophilus de un solo estadio figure-discussion-4 a partir de Pinus tabuliformis muerto, lo que simplificó el proceso de selección en este experimento12.

Durante el proceso criptobiótico, la lenta tasa de deshidratación de los nematodos beneficia su supervivencia y evita el daño estructural a sus proteínas13. El tiempo de deshidratación es crítico para determinar la tasa de supervivencia de figure-discussion-5 B. xylophilus. En este estudio, se utilizó una solución de KCl a una concentración inicial del 8%, y su concentración se incrementó gradualmente con la evaporación natural del agua, lo que permitió que figure-discussion-6 B. xylophilus se deshidratara lentamente y entrara en criptobiosis. Si el agua se evapora demasiado rápido o los nematodos se colocan directamente en una solución de KCl de alta concentración, su tasa de supervivencia disminuye significativamente.

El método descrito en este estudio tiene varias ventajas. Los materiales experimentales son fácilmente accesibles, requiriendo solo solución de KCl y agua destilada para regular la deshidratación y rehidratación de figure-discussion-7 B. xylophilus. Los procedimientos son sencillos: la deshidratación se produjo a través de la evaporación natural y la rehidratación se logró mediante la adición de agua destilada. Todo el proceso se puede completar en 2 h. Este método cuenta con altas tasas de éxito y supervivencia, con la mayor parte de B. xylophilus entrando en criptobiosis después de figure-discussion-8 la deshidratación y la mayoría reviviendo después de la rehidratación, respectivamente11.

El método propuesto es aplicable para regular el estado criptobiótico tanto de B. xylophilus como figure-discussion-9 de los juveniles de dispersión de cuarta etapa (figure-discussion-10)14. Sin embargo, puede no ser eficaz para la propagación de B. xylophilus.

En los últimos años, la enfermedad del marchitamiento del pino causada por B. xylophilus se ha expandido desde el sur de China hasta las zonas septentrionales. figure-discussion-11 B. xylophilus, que habita en los pinos de estas regiones más frías del norte, tiende a exhibir una mayor resistencia al frío15. El método propuesto puede inducir criptobiosis en figure-discussion-12 B. xylophilus, mejorando su resistencia al frío y la sequía. En conjunto, este método puede proporcionar apoyo técnico para estudiar los mecanismos de resistencia al estrés de B. xylophilus y el mecanismo de transmisión de la enfermedad del marchitamiento del pino.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por el Fondo de Investigación Basal de la Institución Científica Central de Interés Público del Laboratorio Estatal Clave de Genética y Mejoramiento de Árboles (subvención número CAFYBB2020ZY001-2), proyectos de investigación empresarial (202404016-4320) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC 32271896).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Portaobjetos de cristalBiolandGS7101-752575 mm &tiempos; 25 mm &tiempos; 1 milímetro
Embudo de vidrio de cuello largoTecnología experimental Nanjing KangluodaN/A150 milímetros
MicroscopioPhenixXSP-35-1600XPH100-2B41L-IPL
Placa de PetriTecnología experimental Nanjing Kangluoda  TB-62493579274550 mm &tiempos; 50 milímetros
PinchcockTecnología experimental Nanjing Kangluoda  TB-62497331174336 mm &tiempos; 11 mm  &tiempos; 55 milímetros
PipetaEppendorf312300001210– 100 µ L
Cloruro de potasio (KCL)Solarbio Ciencias de la VidaP9921500 gramos
Tubo de gomaTecnología experimental Nanjing KangluodaTB-6249234570947 mm &tiempos; 5 milímetros
EsterilizadorBinJiang https://detail.1688.com/offer/644766597053.html?_t=1730892390541&spm=
a2615.7691456.co_0_0_wangpu
_score_0_0_0_0_1_0_0000_0.0		75L
Papel tisú Huella de corazón a corazónM322,5 cm &tiempos; 21,5 cm

Referencias

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