El presente protocolo describe un método para inducir la dispersión de juveniles de tercera etapa (juveniles pre-dauer, JIII.) de Bursaphelenchus xylophilus en criptobiosis a través de la regulación osmótica de los iones de cloruro de potasio (KCl). Este método puede proporcionar apoyo técnico para la investigación sobre los mecanismos de resistencia al estrés de B. xylophilus.
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Artículo de método
Inducción de la entrada de juveniles de dispersión de tercera etapa de Bursaphelenchus xylophilus en criptobiosis a través de la regulación osmótica
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Resumen
Resumen
La criptobiosis es un estado en el que los organismos pierden casi toda su agua interna y entran en anhidrobiosis bajo un estrés ambiental extremo. La dispersión de los juveniles de la tercera etapa (juveniles pre-dauer, 
) de Bursaphelenchus xylophilus puede entrar en criptobiosis a través de la deshidratación y revivir tras la rehidratación cuando las condiciones ambientales mejoran. La regulación osmótica es crucial para su supervivencia en este proceso. En este estudio, se recolectaron especímenes de B. xylophilus de Pinus massoniana muerto debido a la enfermedad del marchitamiento del pino en Ningbo, provincia de Zhejiang, China. Después de la inmersión en una solución de cloruro de potasio (KCl) al 8%, B. xylophilus entró en un estado criptobiótico después de una deshidratación gradual debido al aumento de la presión osmótica externa por evaporación natural del agua. B. xylophilus pudo resistir el estrés a baja temperatura a -20 °C. B. xylophilus pudo revivir después de la rehidratación, con una tasa de supervivencia del 92,1%. Este proceso puede regular la entrada de B. xylophilus en la criptobiosis, lo que les permite resistir entornos extremos. Este método descrito en nuestro estudio es sencillo y fiable, proporcionando soporte técnico para el estudio de los mecanismos de resistencia al estrés de B. xylophilus.
Introducción
La enfermedad del marchitamiento del pino es una de las enfermedades forestales más graves de China1. El nematodo de la madera de pino Bursaphelenchus xylophilus (B. xylophilus) representa una amenaza significativa para las especies de pino como Pinus massoniana (P. massoniana) al reproducirse dentro del huésped, lo que provoca un rápido marchitamiento y muerte. Bajo condiciones ambientales desfavorables después de la muerte del huésped, los juveniles reproductivos de B. xylophilus pueden entrar en juveniles pre-dauer (). Estos juveniles buscan insectos vectores para continuar su transferencia y propagación, causando extensas mortandades de pinares2.
La criptobiosis es un estado en el que los organismos pierden casi toda su agua interna y entran en anhidrobiosis bajo un estrés ambiental extremo. En este proceso, los organismos se deshidratan gradualmente, lo que resulta en un movimiento detenido, un metabolismo reducido yun ciclo de vida suspendido. En condiciones adecuadas, pueden recuperarse tras la rehidratación. La criptobiosis permite a los organismos resistir ambientes extremos, como las bajas temperaturas, y prolongar su vida útil5. Los nematodos que sobrevivieron en criptobiosis durante 30.000 años se encontraron en el permafrost antártico6.
Estudios previos han demostrado que los nematodos pueden adaptarse a varios factores de estrés abiótico, como la baja temperatura, la sequía y la alta presión osmótica, durante la deshidratación ajustando su permeabilidad superficial. Además, los nematodos pueden enroscar sus cuerpos para disminuir el área de superficie y minimizar la tasa de pérdida de agua. Por ejemplo, Caenorhabditis elegans regula el equilibrio osmótico, permitiendo que los iones y las moléculas pequeñas pasen libremente a través de su cutícula, mientras que las moléculas más grandes nopueden. B. xylophilus también exhibe criptobiosis. Durante las etapas de deshidratación y rehidratación de la criptobiosis, la regulación osmótica es esencial para controlar el intercambio de sustancias a través de la cutícula, por lo que es fundamental para ingresar o recuperarse de la criptobiosis9.
El presente estudio presenta un método para inducir criptobiosis en B. xylophilus a través de la regulación osmótica. Este método es simple, eficiente y altamente confiable, y proporciona soporte técnico para investigar los mecanismos de resistencia al estrés de B. xylophilus.
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Protocolo
1. Colección de 
B. xylophilus
- Colección de discos infectados de P. massoniana
NOTA: Todos los procedimientos cumplieron con las Medidas Administrativas para el Área Epidémica de la Enfermedad del Marchitamiento del Pino y la Madera Infectada y otras regulaciones aplicables. Se seleccionó como sitio de muestreo un bosque de P. massoniana infectado por B. xylophilus en el condado de Xiangshan, ciudad de Ningbo, provincia de Zhejiang. P. massoniana, que murió de la enfermedad del marchitamiento del pino, fue talada dentro del sitio de muestreo.- Recoja troncos redondos (de 5 cm de grosor) de las secciones superior, media e inferior del tronco principal de los árboles talados.
- Cortar los troncos redondos recolectados de P. massoniana en rodajas de 0,5-1 cm de grosor, luego recórtelos en tiras pequeñas de 2-3 cm de largo.
- Coloque las pequeñas tiras de madera en bolsas selladas y guárdelas en un laboratorio para su uso posterior.
- Extracción de B. xylophilus
- Conecte un tubo de goma al extremo estrecho de un embudo de vidrio de cuello largo con un diámetro aproximado de 15 cm. Asegure el tubo de goma con una llave de presión. Coloque el embudo ensamblado en un soporte de embudo.
- Envuelva las pequeñas tiras de madera completamente en una sola capa de papel de seda y luego colóquelas en el embudo. Agregue agua destilada al embudo hasta que todas las tiras de madera estén sumergidas.
NOTA: Después de reposar durante 12-24 h, los nematodos migraron fuera de las tiras de madera y se asentaron en el fondo del embudo10. El papel de seda evitaba que los restos de madera se asentaran y permitía el paso de los nematodos. - Suelte lentamente la llave de presión en la parte inferior del embudo y deje que 2000-5000 μL de la mezcla se filtren en una placa de Petri (5 cm de diámetro) para el examen microscópico y la identificación morfológica.
- Identifique B. xylophilus mediante la observación de características como estiletes, bulbos esofágicos medianos, gotas de lípidos y formas de cola "en forma de dedo"11.
- Bajo un microscopio, transfiera B. xylophilus individual a un portaobjetos aspirando 10 μL de líquido junto con un nematodo usando una pipeta de 10 μL cada vez. Repita este proceso 30 veces para recolectar aproximadamente 300 μL de la mezcla que contiene nematodos.
- Después de la extracción de B. xylophilus, esterilice las tiras de madera restantes y los materiales de madera infectados para evitar una mayor contaminación.
2. Control del proceso de regulación osmótica
- Preparación de la mezcla de regulación osmótica
- Prepare una solución acuosa de KCl al 8%.
- Con una pipeta, agregue 10 μL de la solución acuosa de KCl al 8% al portaobjetos que contiene la mezcla de B. xylophilus, produciendo aproximadamente 310 μL de una mezcla de nematodos y solución de KCl.
- Regulación del aumento de la presión osmótica y la deshidratación de B. xylophilus
- Coloque el portaobjetos en la platina del microscopio, permitiendo que el agua se evapore de forma natural. Aumentaría gradualmente la presión osmótica del entorno circundante, lo que haría que los nematodos se deshidrataran durante aproximadamente 30-60 minutos.
NOTA: El operador solo necesita esperar a que el agua se evapore naturalmente hasta que los cristales de KCL precipiten y observar el estado de los nematodos bajo un microscopio. Se necesitan unos 30-60 minutos para que 310 μL de la mezcla se evaporen naturalmente hasta que precipiten los cristales de KCL. - Observe el proceso de deshidratación (p. ej., enroscamiento del cuerpo, agregación, etc.) de B. xylophilus bajo el microscopio. Cuando el agua se evapora por completo y los cristales de KCl precipitan, B. xylophilus deja de moverse y entra en criptobiosis.
- Coloque el portaobjetos en la platina del microscopio, permitiendo que el agua se evapore de forma natural. Aumentaría gradualmente la presión osmótica del entorno circundante, lo que haría que los nematodos se deshidrataran durante aproximadamente 30-60 minutos.
- Tratamiento del estrés a baja temperatura del criptobiótico B. xylophilus
- Coloque el criptobiótico B. xylophilus en un ambiente de temperatura constante de -20 °C durante 24 h.
- Coloque el criptobiótico
- Regulación de la disminución de la presión osmótica y rehidratación de B. xylophilus
- Añadir aproximadamente 300 μL de agua destilada alrededor de los juveniles que habían sido sometidos a un tratamiento a baja temperatura con pipeta. El proceso de rehidratación, que dura unos 30-60 minutos, disminuye gradualmente la presión osmótica de su entorno circundante.
- Observe el proceso de rehidratación de B. xylophilus (por ejemplo, estiramiento del cuerpo, reanudación del movimiento, etc.) bajo el microscopio. Calcular la tasa de supervivencia a las 24 h.
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Resultados
En la solución de KCl al 8%, a medida que el agua se evaporaba, B. xylophilus inicialmente exhibió un notable "enroscamiento" mientras permanecía móvil (Figura 1A). Una vez que el agua se evaporó por completo, los nematodos cesaron su movimiento y se enroscaron, con superficies deprimidas y gotas lipídicas acumuladas (Figura 1B), lo que indica su entrada en el estad...
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Discusión
En este estudio, se colectó B. xylophilus de P. massoniana muerta en Ningbo, provincia de Zhejiang. Cabe destacar que B. xylophilus fue seleccionado de una población mixta con diferentes estadios. Específicamente, se eligieron troncos redondos con una alta densidad de B. xylophilus, seguidos del tamizaje de
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada por el Fondo de Investigación Basal de la Institución Científica Central de Interés Público del Laboratorio Estatal Clave de Genética y Mejoramiento de Árboles (subvención número CAFYBB2020ZY001-2), proyectos de investigación empresarial (202404016-4320) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC 32271896).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Portaobjetos de cristal | Bioland | GS7101-7525 | 75 mm &tiempos; 25 mm &tiempos; 1 milímetro |
| Embudo de vidrio de cuello largo | Tecnología experimental Nanjing Kangluoda | N/A | 150 milímetros |
| Microscopio | Phenix | XSP-35-1600X | PH100-2B41L-IPL |
| Placa de Petri | Tecnología experimental Nanjing Kangluoda | TB-624935792745 | 50 mm &tiempos; 50 milímetros |
| Pinchcock | Tecnología experimental Nanjing Kangluoda | TB-624973311743 | 36 mm &tiempos; 11 mm &tiempos; 55 milímetros |
| Pipeta | Eppendorf | 3123000012 | 10– 100 µ L |
| Cloruro de potasio (KCL) | Solarbio Ciencias de la Vida | P9921 | 500 gramos |
| Tubo de goma | Tecnología experimental Nanjing Kangluoda | TB-624923457094 | 7 mm &tiempos; 5 milímetros |
| Esterilizador | BinJiang | https://detail.1688.com/offer/644766597053.html?_t=1730892390541&spm= a2615.7691456.co_0_0_wangpu _score_0_0_0_0_1_0_0000_0.0 | 75L |
| Papel tisú | Huella de corazón a corazón | M3 | 22,5 cm &tiempos; 21,5 cm |
Referencias
- Li, Y., Zhang, X. Analysis on the trend of invasion and expansion of Bursaphelenchus xylophilus. Forest Pest and Disease. 37 (5), 1-4 (2018).
- Futai, K. Pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Annu Rev Phytopathol. 51 (51), ?61(2013).
- Crowe, J. H., Cooper, A. F. Cryptobiosis. Sci Am. 225, 30-36 (1971).
- Wharton, D. A. Anhydrobiosis. Curr Biol. 25, 1107-1125 (2015).
- Browne, J., Tunnacliffe, A., Burnell, A. Anhydrobiosis: plant desiccation gene found in a nematode. Nature. 416 (6876), 38(2002).
- Shatilovich, A. V., et al. Viable nematodes from late Pleistocene permafrost of the Kolyma river lowland. Dokl Biol Sci. 480 (1), 100-102 (2018).
- Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Osmotic regulation of seamless tube growth. Nat Cell Biol. 15 (2), 137-139 (2013).
- Erkut, C., et al. Trehalose renders the dauer larva of Caenorhabditis elegans resistant to extreme desiccation. Curr Biol. 21 (1), 1331-1336 (2012).
- Pan, L., et al. Third-stage dispersal juveniles of Bursaphelenchus xylophilus can resist low-temperature stress by entering cryptobiosis. Biology. 10 (8), 785(2021).
- Mao, X. F., Li, H. X., Chen, X. Y., Hu, F. Extraction efficiency of soil nematodes by different methods. Chinese J Ecol. 23 (3), 149-151 (2004).
- Pan, L., et al. Isolation and identification of pine wood nematode in Pinus koraiensis in Fengcheng, Liaoning province. Forest Pest and Disease. 38 (1), 4(2019).
- Pan, L., Cui, R., Li, Y., Feng, Y., Zhang, X. Investigation of pinewood nematodes in Pinus tabuliformis Carr. under low-temperature conditions in Fushun, China. Forests. 11 (9), 993(2020).
- Madin, K. A. C., Crowe, J. H. Anhydrobiosis in nematodes: Carbohydrate and lipid metabolism during dehydration. J Exp Zool. 3, 193(2010).
- Wharton, D. A. Anhydrobiosis: The model worm as a model. Curr Biol. 21 (15), 578-579 (2011).
- Li, Y., Zhang, X. High risk of invasion and expansion of pine wood nematode in the middle temperate zone of China. J Temperate Res. 1 (1), 4(2018).
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Reimpresiones y permisos
