Análisis de citometría de flujo de la expresión de factores tisulares en plaquetas humanas

Resumen

Este artículo describe el protocolo para cuantificar el porcentaje de plaquetas positivas para el factor tisular (TF) utilizando citometría de flujo sanguíneo total, evaluando la proteína: (1) intracelularmente en condiciones de reposo, y (2) en la superficie celular, tanto en reposo como en condiciones activadas. También se proporciona orientación para evaluar plaquetas TF-positivas en plasma rico en plaquetas.

Resumen

Un subconjunto de plaquetas humanas circulantes almacena intracelularmente el Factor Tisular (TF), el principal activador de la cascada de coagulación sanguínea y la formación de trombos. Al activarse las plaquetas, la TF queda expuesta en la membrana celular, donde se une a la FVII, lo que finalmente conduce a la generación de trombina. Teniendo en cuenta que (1) los niveles de plaquetas TF-positivas aumentan en diversos entornos clínicos, contribuyendo al fenotipo protrombótico del paciente, y (2) diferentes fármacos pueden modular la expresión de la TF asociada a plaquetas, es valioso un método estandarizado para evaluar plaquetas TF-positivas, ya que su evaluación ha sido controvertida en el pasado. Aquí, describimos un protocolo para medir el porcentaje de plaquetas TF-positivas utilizando citometría de flujo en sangre entera y plasma rico en plaquetas (PRP)/plaquetas lavadas. Este protocolo tiene como objetivo proporcionar instrucciones detalladas para cuantificar el porcentaje de plaquetas TF-positivas evaluando la proteína (1) intracelularmente en condiciones de reposo, y (2) en la superficie celular, tanto en reposo como en condiciones activadas. La primera sección proporciona información esencial para realizar correctamente la extracción de sangre y así asegurar que los procedimientos preanalíticos no afecten a los resultados. A continuación, el protocolo se centra en la preparación de muestras y procedimientos de marcado para el análisis de citometría de flujo. Se detallan los pasos detallados para la estimulación, marcado, fijación y permeabilización celular —cuando sea necesario—. Finalmente, se describen instrucciones para la configuración de la citometría de flujo para identificar correctamente la población plaquetaria y analizar eventos TF-positivos. Por último, el método incluye el procedimiento para preparar PRP si se van a medir plaquetas TF-positivas en plaquetas aisladas. Dado que solo un subconjunto de plaquetas contiene TF, es importante asegurarse de que estas plaquetas no se pierdan durante los pasos de centrifugación necesarios para obtener PRP.

Introducción

El factor tisular (TF), una glicoproteína transmembrana y activador clave de la cascada de coagulación sanguínea, se expresa por un subconjunto, ~20%-30%, de las plaquetas humanas^{circulantes 1}, especialmente aquellas de tamaño² mayor. Al activarse por agonistas plaquetarios clásicos como el difosfato de adenosina (ADP) y la trombina, las plaquetas exponen TF funcionalmente activa en su superficie de forma dependiente de la concentración, permitiendo que se una a los factores VII/VIIa, lo que finalmente conduce a la generación^{de trombina} 1,3,4,5,6. Cabe destacar que, en condiciones patológicas como la enfermedad coronaria (CAD⁾⁷, infección por síndrome respiratorio agudo grave-coronavirus-2 (SARS-CoV-2^{) 8}, migraña con aura asociada al foramen oval patentado (MHA-PFO⁾⁹, cáncer¹⁰ y sepsis¹¹, el número de plaquetas TF-positivas aumenta significativamente, contribuyendo al mayor riesgo trombótico observado en estos entornos clínicos.

A pesar de esta evidencia contundente, la detección de plaquetas TF-positivas sigue siendo un tema de debate dentro de la comunidad^{científica 6,12,13}. Se han sugerido desafíos metodológicos, incluyendo variables preanalíticas, preparación de muestras y especificidad de anticuerpos, como posibles razones para los resultados contradictorios reportados en la literatura 2,4,12,14. Por ello, es crucial establecer un ensayo estandarizado basado en un protocolo bien definido para medir la TF en plaquetas humanas.

En este contexto, la citometría del flujo sanguíneo total es la única tecnología que permite el análisis de plaquetas TF-positivas con un manejo mínimo de muestras, lo cual es crucial para evitar la pérdida de este subconjunto plaquetario.

En este artículo, proponemos un protocolo para medir la TF asociada a plaquetas utilizando citometría de flujo sanguíneo total, evaluando la proteína (1) intracelularmente en condiciones de reposo y (2) en la superficie celular tanto en reposo como en condiciones activadas. También se proporcionan instrucciones si se requiere la evaluación de plaquetas TF-positivas en plasma rico en plaquetas (PRP).

Protocolo

El protocolo fue aprobado por el Comité Ético de la Institución (n.º 70/24, CE 18.06.24), y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los donantes de sangre. El protocolo guiará al usuario a través de siete pasos principales (Figura 1). El primer paso aborda el procedimiento para realizar la toma de muestras de sangre. Los pasos 2 y 3 describen el protocolo de titulación de anticuerpos y la preparación de la muestra para el análisis de la expresión intracelular de TF utilizando un anticuerpo monoclonal (mAb) marcado con ficoeritrina (PE) con αCD142/HTF1. El paso 4 describe el protocolo para evaluar la proteína expuesta en la superficie plaquetaria utilizando un método de tinción indirecta con αCD142/HTF1 mAb. Debido a la obstrucción estérica del fluorocromo, el mAb marcado con PE utilizado para la tinción intracelular no se une al dominio catalítico de la proteína expuesta a la superficie. Por ello, se propone un protocolo para la tinción indirecta con un mAb secundario marcado con Alexa Fluor 633. Los pasos 5 y 6 detallan las fases del análisis de citometría de flujo. El paso final describe el procedimiento para preparar plasma rico en plaquetas (PRP) para evitar la pérdida de la subpoblación de plaquetas de gran tamaño. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Abstinencia de sangre

NOTA: La extracción de sangre humana debe realizarse solo después de obtener la aprobación del Comité Ético.

1. Recoger muestras de sangre mediante muestras venosas periféricas o de canula con agujas de un brazo no afectado por infusiones venosas periféricas, preferiblemente de la vena antecubital.
   1. Para el muestreo venoso periférico, aplicar el torniquete y, tras insertar una aguja mariposa G19 en la vena, retirarla para evitar la activación plaquetaria (Figura 2).
      NOTA: No utilice una aguja mariposa más pequeña que G21 para evitar la activación plaquetaria.
   2. Para muestreo venoso con una cánula-aguja, no aplique el torniquete en ningún momento durante la muestra. Si es necesario, lava la muestra con solución salina al 0,9% antes de tomarla. Siempre descarta los primeros 5 mL de sangre antes de empezar a llenar los tubos.
2. Extrae 2 mL de sangre en un aspirador EDTA (para usar en el recuento de células sanguíneas). Mezcla suavemente el tubo tres veces para asegurar una mezcla completa de sangre y anticoagulante.
3. Extraer sangre en un vacutainer de citrato de sodio de 0,129 M para el análisis de la expresión de TF asociada a plaquetas. Llena cuidadosamente el vacío hasta el nivel indicado para mantener la proporción correcta de sangre/anticoagulante. Invierte suavemente los tubos cinco veces para asegurar una mezcla adecuada de la sangre con el anticoagulante, evitando la formación de coágulos y la hemólisis de las muestras.
   NOTA: Se recomienda el uso de anticoagulante citrato de 0,129 M para optimizar la detección de TF asociada a plaquetas con el clon HTF1 del αCD142 mAb. Si es necesario aislar plaquetas de sangre entera, extraiga un segundo vacutainer de citrato de sodio de 0,129 M para la preparación de plasma rico en plaquetas (PRP).
4. Mantén los aspiradores en posición vertical en un soporte para tubo. No los agites en placas giratorias o inclinables, y evita los sistemas de transporte neumáticos. No refrigeres las muestras de sangre para evitar la activación de las plaquetas.
   NOTA: Las muestras de sangre deben procesarse preferiblemente en un plazo de 15 minutos tras la retirada si se desea medir otro marcador de activación plaquetaria asociado a los gránulos junto con TF. En caso contrario, las muestras deben procesarse a más tardar 3 horas desde la recogida (Figura 3).

2. Titulación del anticuerpo anti-TF (para evaluación intracelular de TF)

NOTA: La determinación de la TF almacenada intracelularmente se realiza utilizando el mab PE-αCD142/HTF1.

1. Titulación por anticuerpos usando perlas
   NOTA: El uso de perlas permite definir la cantidad correcta de anticuerpo a emplear (es decir, la concentración de anticuerpos que produce la mayor separación de picos de fluorescencia entre muestras positivas y negativas). Este análisis se realiza utilizando dos muestras, una verdaderamente positiva y otra verdaderamente negativa. La concentración de anticuerpos no es informada por el fabricante (véase la Tabla de Materiales), por lo que la titulación de anticuerpos se realiza utilizando cinco puntos de dilución.
   1. Centrifuga el anticuerpo a 17.000 x g durante 5 minutos a 4 °C. Para preparar los cinco puntos de dilución de anticuerpos, se pipetan 40 μL de anticuerpo en el tubo 1 y 20 μL de PBS en los tubos 2 a 5. Realizar cuatro diluciones seriadas consecutivas de 1:2 transfiriendo 20 μL del tubo 1 al tubo 2 y luego sucesivamente.
   2. Prepara un tubo de ensayo para cada volumen de anticuerpos a analizar. Añade una gota de perlas negativas y una gota de perlas positivas a cada tubo de ensayo. Añadir 20 μL de cada dilución de anticuerpos al tubo de ensayo y al vórtice inmediatamente. Incuba en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 minutos.
   3. Añade 1 mL de PBS 1x sin Ca⁺⁺ y Mg⁺⁺, pH 7,4, a cada tubo y vórtice.
   4. Adquiere las muestras en el citómetro de flujo según las instrucciones del fabricante y registra un archivo de datos de 10.000 eventos en la compuerta de "perlas". La concentración óptima de anticuerpos es la que proporciona la mayor separación entre picos positivos y negativos.
2. Titulación de anticuerpos en plaquetas
   NOTA: Por norma general, la concentración óptima de anticuerpos identificada con las perlas debe verificarse en las células a teñir, en este caso, plaquetas en sangre entera.
   1. Fijación
      1. Invierte suavemente el vacutainer de citrato de sodio cinco veces para mezclar bien la sangre y el anticoagulante. Transfiere 50 μL de sangre a un tubo de 1,5 mL, añade 950 μL de paraformaldehído (PFA) al 1%, mezcla suavemente e incuba la muestra durante 90 minutos a temperatura ambiente.
      2. Centrifuga la muestra a 1.500 x g durante 5 minutos, con freno, a temperatura ambiente.
      3. Retira el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet pipeteando suavemente 1 mL de 1x PBS sin Ca⁺⁺ y Mg^{++, pH} 7,4.
   2. Permeabilización
      1. Prepara un tubo para cada volumen de anticuerpos a analizar (prueba el volumen identificado con la titulación de las perlas junto con una dilución mayor y una menor, por ejemplo, 10 μL, 5 μL, 2,5 μL si el volumen identificado es 5 μL) y un tubo para el control de Fluorescencia Menos Uno (FMO).
      2. Dispensa 100 μL de sangre fija en cada tubo y centrifuga a 1.500 g durante 5 minutos, con freno, a temperatura ambiente.
      3. Retirar el sobrenadante, volver a suspender el pellet en 100 μL de Tritón-PBS al 0,1% para permeabilizar las muestras e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
   3. Tinción
      1. Centrifugar el anticuerpo a 17.000 x g durante 5 minutos a 4 °C. Añadir los volúmenes de anticuerpos necesarios a cada tubo de ensayo según lo determinado en 2.2.2.1 y mezclar.
      2. Incuba las muestras durante 15 minutos a oscuridad a temperatura ambiente.
      3. Añade 300 μL de 1x PBS sin Ca⁺⁺ y Mg⁺⁺, pH 7,4, a cada tubo y mezcla. Obtén las muestras en el citómetro de flujo (véase el paso 5).
      4. Calcula el índice de tinción según la siguiente fórmula¹⁵:
                                
         donde,_{MFI pos} es la intensidad media de fluorescencia de los eventos positivos, MFI_negativo es la de los eventos negativos, y SD es la desviación estándar de la población negativa.
      5. Elige la concentración de anticuerpos más baja que proporcione el índice de tinción más alto.
         NOTA: En las condiciones experimentales actuales, el índice de tinción más alto para el mAb PE-αCD142/HTF1 se obtiene utilizando 5 μL de anticuerpo.

3. Preparación de muestras para el análisis de citometría de flujo de la expresión intracelular de TF

1. Fijación de sangre total y permeabilización
   1. Para el análisis de TF intracelular, fijar y permeabilizar la sangre total según el procedimiento descrito en el paso 2.
2. Procedimiento de tinción
   NOTA: En el siguiente protocolo, la población plaquetaria se identifica mediante tinción αCD61-PerCP. Se pueden usar otros marcadores de población a discreción del operador.
   1. Prepara un tubo para el control de Fluorescencia Menos Uno (FMO) y otro para la tinción TF. Añade 100 μL de sangre total fija y permeabilizada a cada tubo junto con los anticuerpos listados en la Tabla 1.
   2. Incuba las muestras durante 15 minutos a oscuridad a temperatura ambiente.
   3. Añade 300 μL de 1x PBS sin Ca⁺⁺ y Mg⁺⁺, pH 7,4, a cada tubo y mezcla. Guarda las muestras teñidas en la oscuridad hasta el análisis de citometría de flujo (véase el paso 5).
      NOTA: Para calcular la matriz de compensación, prepare las muestras tal como se describe en la Tabla 2.

4. Preparación de muestras para el análisis de citometría de flujo de la expresión de TF asociada a la superficie celular en plaquetas en reposo y activadas

NOTA: Para la detección de TF asociada a la superficie celular, utilice αCD142/HTF1 mAb (1 mg/mL) sin marcar y IgG anti-ratón Alexa Fluor 633 para ratones (2 mg/ml) como anticuerpo secundario para la detección de señales. El adenosina 5'-difosfato (ADP) se utiliza como agonista plaquetario para inducir la exposición de TF en la superficie celular. Se utiliza un anticuerpo marcado con PE como marcador de población plaquetaria para minimizar el desbordamiento, que se comprobará mediante la compensación de señales.

1. Tinción TF
   1. Diluir αCD142/HTF1 mAb 1:100 en 1x PBS sin Ca⁺⁺ y Mg⁺⁺, pH 7,4, para obtener una concentración de trabajo de 10 μg/mL. Diluir Alexa Fluor 633 anti-ratón IgG 1:10 en 1x PBS sin Ca⁺⁺ y Mg⁺⁺, pH 7,4, para obtener una concentración de trabajo de 200 μg/mL.
   2. Preparar los tres tubos de muestra y dispensar 1 PBS sin Ca⁺⁺ ni Mg⁺⁺, pH 7,4, como se indica en la Tabla 3.
   3. Dispensar 7,5 μL de αCD142/HTF1 mAb diluido y añadir 5 μL de ADP (200 μM) para obtener una concentración final de 10 μM de ADP. Invierte suavemente el vacaneure de citrato 5 veces para mezclar bien la sangre y el anticoagulante, y luego dispensa 5 μL de sangre entera en cada tubo. Mezcla suavemente las muestras.
   4. Incuba las muestras durante 20 minutos a temperatura ambiente.
2. Fijación de ejemplos
   1. Fija cada muestra añadiendo 300 μL de paraformaldehído al 1% (PFA) e incuba las muestras durante 1 hora a temperatura ambiente.
      NOTA: Las muestras marcadas, fijadas con PFA al 1% y almacenadas a 4 °C, permanecen estables hasta 4 días.
   2. Añade 300 μL de 1x PBS sin Ca⁺⁺ y Mg⁺⁺, pH 7,4, a cada tubo y centrifuga a 1500 x g durante 5 minutos con freno a temperatura ambiente.
   3. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 95 μL de 1x PBS sin Ca⁺⁺ y Mg⁺⁺, pH 7,4, pipeteando suavemente.
3. Tinción con el anticuerpo secundario
   1. Dispensa 5 μL de Alexa Fluor 633 IgG diluido e incuba las muestras durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
   2. Añade 300 μL de 1x PBS sin Ca⁺⁺ y Mg⁺⁺, pH 7,4, a cada tubo y centrifuga a 1500 x g durante 5 minutos con freno a temperatura ambiente. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 95 μL de 1x PBS sin Ca⁺⁺ y Mg⁺⁺, pH 7,4.
   3. Dispensar 5 μL de αCD41-PE en cada tubo (véase la Tabla 4). Incuba las muestras durante 15 minutos a oscuridad a temperatura ambiente.
   4. Añade 300 μL de 1x PBS sin Ca⁺⁺ y Mg⁺⁺, pH 7,4, a cada tubo y mezcla.
   5. Guarda las muestras teñidas en la oscuridad hasta el análisis de citometría de flujo (véase el paso 6).
      NOTA: Para calcular la matriz de compensación, prepare las muestras según los pasos 4.1-4.3 y según se describa en las Tablas 5 y 6.

5. Análisis de citometría de flujo de la expresión intracelular de TF

NOTA: El siguiente procedimiento se refiere a adquisiciones en un citómetro de flujo de referencia; por tanto, los escenarios y gráficos reportados deben considerarse representativos. El protocolo puede aplicarse a cualquier citómetro de flujo de nueva generación y alta sensibilidad. Encienda el citómetro de flujo mucho antes de la adquisición de la muestra para asegurar la estabilidad del láser. Lava a fondo la fluidica y la celda de flujo, ya que las plaquetas son pequeñas y cualquier residuo celular puede interferir con la visualización de la población de plaquetas en el gráfico de puntos del área de dispersión frontal/lateral (FSC-A/SSC-A). Realiza el control de calidad con las perlas de control de calidad según las instrucciones del fabricante y lava de nuevo los fluidos para eliminar cualquier perla residual.

1. Configuración de adquisición
   1. Crear un gráfico de puntos FSC-A/SSC-A en escala logarítmica mostrando Todos los Eventos (Figura 4A). Crea un gráfico de puntos CD61-A/SSC-A en una escala logarítmica que muestre Todos los Eventos (Figura 4B).
   2. Ajusta la ganancia de PE (Y-585) y PerCP (B690) según el control de calidad diario. Establece el umbral aproximadamente a 2000 en SSC-H y a 1000 en PerCP (B690-H) para visualizar la población plaquetaria. Pon el caudal en BAJO.
   3. Dibuja una región entre 10³ y 10⁵ llamada "CD61⁺" para identificar la población plaquetaria.
   4. Adquirir controles de tinción única para calcular la matriz de compensación y luego obtener las muestras. Registrar un archivo de datos de 10.000 eventos dentro de la puerta "CD61⁺" (Figura 4D,E). Empieza a grabar 5-10 segundos después de empezar la adquisición de la muestra.

6. Análisis de citometría de flujo de la expresión superficial de TF

1. Haz un gráfico de puntos FSC-A/SSC-A en una escala logarítmica mostrando Todos los Eventos (Figura 5A), y un diagrama de puntos CD41-A/SSC-A en una escala logarítmica mostrando Todos los Eventos (Figura 5B).
2. Ajusta la ganancia de Alexa Fluor 633 y la ganancia de PE (Y-585) según el control de calidad diario, y establece el umbral aproximadamente a 1000 en SSC-H y a 2500 en PE (Y585-H) para visualizar la población plaquetaria como se muestra en la Figura 5B. Pon el caudal en BAJO.
3. Dibuja una región entre 10⁴ y 10⁵ llamada "CD41⁺" para identificar la población de plaquetas.
4. Adquirir controles de tinción única para calcular la matriz de compensación y luego obtener las muestras. Registrar un archivo de datos de 10.000 eventos dentro de la puerta "CD41⁺" (Figura 5D,E). Empieza a grabar 5-10 segundos después de empezar la adquisición de la muestra.

7. Análisis de plaquetas TF-positivas en plasma rico en plaquetas

1. Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP)
   NOTA: El aislamiento de plaquetas debe realizarse a temperatura ambiente para evitar la activación celular. Asegúrese de que la temperatura de los reactivos y los instrumentos esté entre 18 °C y 22 °C. Evite pipeteo rápido y agitaciones vigorosas durante todo el procedimiento.
   1. Mezcla suavemente el vacutainer de citrato de sodio 0,129 M 5 veces y mide el recuento de plaquetas dos veces en un contador de células sanguíneas para calcular el porcentaje de plaquetas recuperadas.
      NOTA: Utilice el valor medio de las dos determinaciones como concentración plaquetaria.
   2. Centrifugar el vacío de citrato de sodio 0,129 M a 100 x g durante 10 minutos, sin freno, a temperatura ambiente (Figura 6). Recoge el PRP obtenido, transfiere a un tubo de polipropileno de 10 mL y registra el volumen recogido.
      NOTA: No uses tubos de poliestireno para evitar la activación plaquetaria.
   3. Recuentar plaquetas dos veces en PRP usando un contador de glóbulos sanguíneos y calcular el porcentaje de recuperación plaquetaria de la siguiente manera:
      
      NOTA: Si la recuperación es inferior al 65%, la población de plaquetas no representa completamente la de la sangre entera. Considera descartar la preparación.
2. Preparación de muestras para el análisis de citometría de flujo de expresión intracelular y de la TF asociada a superficies en PRP
   1. Para analizar la expresión intracelular y la expresión de TF asociada a la superficie en PRP, utilice el mismo protocolo descrito para el análisis de sangre total (véanse los pasos 3-6).

Resultados

Un resumen del análisis de expresión TF asociada a plaquetas se describe en el diagrama de flujo mostrado en la Figura 1. Los pasos incluyen: (1) Recogida de sangre: Recoger sangre de la vena periférica humana, preferiblemente de la vena antecubital, utilizando una aguja de mariposa G19 o una cánula de aguja sin torniquete y con vacuadores que contienen anticoagulantes. (2) Procesamiento de muestras: Procesar las muestras según el tipo de evaluación de la TF que se vaya a realizar. (3) Marcado de muestras: Etiquetar las muestras con anticuerpos específicos. (4) Análisis de citometría de flujo: Analizar las muestras para detectar TF de superficie e intracelular.

Durante la extracción de sangre, se debe prestar especial atención para evitar la activación plaquetaria. Para ello, se observan dos precauciones: retirar el torniquete poco después de insertar la aguja en la vena y desechar la sangre en el primer vacutainer extraído. Sin el uso del torniquete, la población plaquetaria, mostrada en un gráfico de puntos FSC-A/SSC-A, tiene una forma típica, como se muestra en la Figura 2A. Por el contrario, con el uso del torniquete, las propiedades físicas de la población plaquetaria dan lugar a una forma alargada que se asemeja a la morfología observada tras la estimulación con un agonista plaquetario clásico, como ADP (Figura 2B,C).

Los experimentos realizados para evaluar la estabilidad de la expresión de TF asociada a plaquetas a lo largo del tiempo mostraron que era estable durante 3 horas desde la extracción de sangre (Figura 3). Al combinar la medición de la expresión de TF con la de un marcador de activación plaquetaria, como la P-selectina, se recomienda procesar la muestra de sangre lo antes posible para evitar la desgranulación plaquetaria.

Para el análisis de la TF almacenada intracelularmente, la sangre entera se fija en un 1% de PFA, se permeabiliza con PBS-Triton y luego se tiñe con un anticuerpo marcado con PE. La población de plaquetas se identifica en un gráfico logarítmic FSC-A/SSC-A (Figura 4 A,D) y mediante tinción αCD61 mAb (Figura 4 B,E). Los resultados del análisis de la TF intracelular en sujetos sanos (n = 377) indicaron que la TF está presente en el 26,8% ± el 4,8% de las plaquetas circulantes (Figura 4F).

El análisis de citometría de flujo de la expresión de TF asociada a superficies se ha realizado en condiciones de reposo y después de la estimulación celular con ADP 10 μM. La población total de plaquetas hematobacterias, marcada con αCD41 mAb, ha sido identificada en un gráfico logarítmico FSC-A/SSC-A (Figura 5A,B). Los resultados mostraron que en sujetos sanos (n = 377), la TF se expresa entre el 2,8% ± el 1,4% de las plaquetas en reposo (Figura 5D-F) y aumenta hasta un 24,5% ± 5,8% al activarse (Figura 5G-I). TF se expresa por el subconjunto de plaquetas con mayor tamaño (Figura 5D,G, puntos verdes). Además, el análisis mediante citometría de flujo por imagen destaca que la señal TF solo se asocia con eventos positivos αCD61 y no con eventos positivos en αCD45 (Figura 7).

Como se mencionó anteriormente, TF se almacena en un subconjunto de plaquetas caracterizado por el mayor tamaño dentro de toda la población. Por lo tanto, es importante no perder esta fracción plaquetaria durante la preparación del PRP. Siguiendo las indicaciones proporcionadas en la sección de método (paso 7), es posible aislar una población plaquetaria dentro del PRP que sea representativa de la presente en la sangre total. Como se muestra en la Figura 6, el gráfico de puntos de citometría de flujo de la población plaquetaria obtenida mediante centrifugación de sangre total de 100 x g es muy similar al de la sangre total en términos de distribución de FSC (Figura 6 A,B). En contraste, utilizando una fuerza mayor y un tiempo de centrifugación más largo, como se menciona a menudo en la literatura^{12, 14, 16}, la población de plaquetas recuperadas tiene una FSC más baja en comparación con la de la sangre entera (Figura 6C), lo que sugiere la pérdida de las plaquetas de mayor tamaño, que son aquellas altamente positivas para TF.

Figura 1: Diagrama esquemático para el análisis de expresión TF asociada a plaquetas y el aislamiento de plaquetas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Gráficos de densidad representativos de la población plaquetaria analizados mediante citometría de flujo sanguíneo total. (A) Población plaquetaria analizada en una muestra de sangre extraída sin torniquete o (B) con torniquete. (C) Se informa de la población de plaquetas estimulada con ADP para comparación. Grábulos blancos: glóbulos blancos; RBC: Glóbulos rojos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Estabilidad de la expresión de TF asociada a la superficie celular a lo largo del tiempo. La expresión de TF asociada a plaquetas de plaquetas en reposo se analizó en 4 momentos diferentes tras la extracción sanguínea en el eje x de la siguiente manera: T0 = inmediatamente después de la extracción de sangre; T1 = 1 h después de la extracción de sangre; T2 = 2 h después de la extracción de sangre; T3 = 3 h tras la extracción de sangre. Los datos se informan como media ± DS, n = 3. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Análisis representativo de citometría de flujo de TF almacenada intracelularmente. La población plaquetaria (roja) en sangre total se identifica en el gráfico de puntos FSC/SSC-A (A,D) y mediante tinción αCD61 mAb (B,E). La expresión de TF se analiza utilizando un mAb PE- αCD142/HTF1 (puntos verdes). Se utilizan gráficos histogramáticos para identificar eventos negativos (C) y positivos (F). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Análisis representativo de citometría de flujo de plaquetas TF-positivas asociadas a superficies. La sangre entera fresca se marca con αCD142/HTF1 mAb, luego se fija con PFA al 1% y se marca con el mAb secundario y el αCD41 mAb. La población de plaquetas (roja) en sangre total se identifica en el gráfico de puntos FSC/SSC-A (A, D, G) y mediante la tinción αCD41 mAb (B, E, H). La expresión de TF en estado de reposo (D-F) y tras la estimulación de ADP (G-I) se cuantifica etiquetando con αCD142/HTF1 mAb (puntos verdes). Se reportan gráficos histográficos representativos de muestras negativas (C) y positivas (F,I). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6: Efecto de las diferentes fuerzas de centrifugación sobre la preparación de PRP. (A-C) Análisis de citometría de flujo de la población de plaquetas en sangre total, PRP preparado a 100 x g y a 350 x g. El rango de referencia de la población plaquetaria en FSC-H/SSC-H está indicado con líneas de puntos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 7: Evaluación de la expresión de TF en plaquetas y leucocitos mediante citometría de flujo por imagen. Se muestran imágenes representativas de campo claro (BF, gris), Factor Tissular (TF, verde), αCD61 (rojo), αCD45 (gris), tinción de núcleos con Hoechst (magenta) y la imagen compuesta (fusión), adquirida a 60x de aumento. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

ID de tubo de muestra	Sangre entera (μL) fija/permanente	αCD142-PE (μL)	αCD61-PerCP (μL)
FMO	100	-	15
TF	100	5	15

Tabla 1: Protocolo de tinción para el análisis de citometría de flujo de la expresión intracelular de TF.

ID de tubo de muestra	Sangre entera (μL) fija/permanente	αCD142-PE (μL)	αCD61-PerCP (μL)
Sin manchas	100	-	-
αCD142-PE	95	5	-
αCD61-PerCP	85	-	15

Tabla 2: Control de una sola tinción para la matriz de compensación de la expresión intracelular de TF.

ID de tubo de muestra	PBS 1x (μL)	αCD142 (μL)	ADP (μL)	Sangre entera fresca (μL)	PFA 1% (μL)
FMO	95	-	-	5	300
Descanso	87.5	7.5	-	5	300
ADP activado	82.5	7.5	5	5	300

Tabla 3: Protocolo de tinción para el análisis de citometría de flujo de la expresión superficial de TF.

ID de tubo de muestra	PBS 1x (μL)	Alexa Fluor 633 IgG (μL)	αCD41-PE (μL)
FMO	90	5	5
Descanso	90	5	5
ADP activado	90	5	5

Tabla 4: Protocolo secundario de tinción de anticuerpos para análisis de TF asociada a superficies.

ID de tubo de muestra	PBS 1x (μL)	αCD142 (μL)	ADP (μL)	Sangre entera fresca (μL)	PFA 1% (μL)
Sin manchas	90	-	5	5	300
TF + Alexa Fluor 633 IgG	82.5	7.5	5	5	300
αCD41-PE	90	-	5	5	300

Tabla 5: Preparación de la matriz de compensación para el análisis intracelular de TF.

ID de tubo de muestra	PBS 1x (μL)	Alexa Fluor 633 IgG (μL)	αCD41-PE (μL)
Sin manchas	100	-	-
TF + Alexa Fluor 633 IgG	95	5	-
αCD41-PE	95	-	5

Tabla 6: Preparación de la matriz de compensación para el análisis de TF asociada a la superficie.

Discusión

Este manuscrito informa de protocolos detallados para la evaluación de plaquetas TF-positivas mediante citometría de flujo sanguíneo total, teniendo en cuenta el análisis de la proteína expresada tanto dentro como en la superficie plaquetaria.

Durante los últimos 20 años, la presencia de TF en plaquetas humanas se ha establecido^bien 1,2,3,4,5,17,18. Un subconjunto de plaquetas, que representa entre el 20% y el 30% de la población total de plaquetas^{circulantes 2}, expresa la proteína, reforzando el concepto de heterogeneidad plaquetaria que está cobrando cada vez más relevancia en el^{campo 19,20}. Cabe mencionar que las plaquetas TF-positivas tienen un volumen medio de plaquetas alto, como se mostró anteriormente con la citometría de flujo de imagen^{altamente sensible 2}. Es de suma importancia considerar esta característica, especialmente cuando la expresión de TF debe analizarse en plaquetas aisladas de otros componentes de las células sanguíneas. De hecho, es posible que el paso de centrifugación utilizado para el aislamiento de plaquetas pueda provocar la pérdida de plaquetas^{de gran tamaño 2}. Este problema preanalítico es probablemente uno de los principales factores de la controversia —que duró hasta hace unos años— sobre la presencia de TF en las^{plaquetas 7, 12 y 13}. La citometría de flujo sanguíneo total es un enfoque extremadamente útil en este sentido, ya que permite analizar todos los subconjuntos de plaquetas sin necesidad de aislarlas.

Una segunda razón que fomentó el debate sobre la presencia de TF en plaquetas fue la elección del anticuerpo anti-humano TF utilizado para el análisis. Existen muchos anticuerpos comerciales que se han utilizado para la evaluación de la TF asociada a plaquetas y que reconocen diferentes epítopos de la proteína. Algunos anticuerpos, como los clones TF9-10H10 3,21,22 y ^{VIC7 1,3}, se unen a una región no funcional de TF sin afectar la unión FVII/FVIIa. Otros anticuerpos, incluidos los clones^{VD8 1,2,3} y^{HTF1 18} —estos últimos utilizados en los protocolos actuales— reconocen el sitio catalítico de la proteína, compitiendo con FVII/FVIIa por unirse a TF, bloqueando así su función procoagulante. Es importante señalar que, dependiendo del estado de glicosilación del dominio extracelular y de la conformación del sitio catalítico de TF²³, que podría modificarse en condiciones particulares (como activación celular o enfermedad), algunos de estos anticuerpos podrían ser capaces de reconocer diferencialmente, mediante citometría de flujo, la expresión superficial de TF asociada a plaquetas. Además, también las condiciones de tinción, es decir, si la muestra a analizar es fresca, fija y/o permeabilizada, podrían afectar a la conformación del epítopo y, por tanto, a la unión^{antígeno-anticuerpo 14}.

Otra consideración que merece atención es la elección del fluorocromo unido al anticuerpo. Dado que la TF se expresa solo entre el 20% y el 30% de la población plaquetaria, los fluorocromos de baja emisión, junto con el uso de citómetros de flujo de baja sensibilidad, pueden no ser adecuados para discriminar señales de baja sensibilidad. Por esta razón, se prefieren anticuerpos marcados con fluorocromos brillantes, como PE o APC. Sin embargo, es importante señalar que el gran tamaño de un fluorocromo como el PE puede dificultar la unión del anticuerpo marcado a la proteína²⁴. Para superar este problema, en el protocolo actual, la tinción superficial con TF se realizó como un marcaje indirecto con un αCD142/HTF1 mAb no conjugado, y luego revelado mediante el uso de un anticuerpo secundario. La obstrucción estérica de la PE no afecta la unión de αCD142/HTF1 mAb a la TF almacenada intracelularmente, donde el sitio catalítico es más accesible para la unión de anticuerpos. Está claro que la evaluación de la expresión superficial de la TF asociada a plaquetas mediante marcaje directo, en comparación con la indirecta, sería preferible —si es posible— para acortar el tiempo de procesamiento de la muestra. Sin embargo, este enfoque debe tener en cuenta los problemas críticos mencionados anteriormente y relacionados con la capacidad de unión de los varios anticuerpos comercialmente disponibles contra la TF plaquetaria, debido a la conformación de la propia proteína, o a las condiciones de tinción, así como al obstáculo estérico de los diferentes fluorocromos utilizados. Por lo tanto, para evitar resultados falsos negativos, el marcado directo de la TF asociada a plaquetas expresadas en superficie requiere un proceso de optimización obligatorio y cuidadoso. Estos aspectos son objeto de un estudio en curso destinado a evaluar la eficacia de la tinción directa con los diferentes clones de anticuerpos disponibles comercialmente etiquetados con fluorocromos en uso completo.

Varios estudios demostraron que la expresión de TF está elevada en diversas condiciones patológicas caracterizadas por un alto riesgo trombótico 8,9,10,11,17. Recientemente, se ha aportado evidencia de que los niveles de plaquetas TF-positivas, cuantificados con precisión mediante análisis de citometría de flujo, pueden identificar pacientes cardiovasculares que, a pesar de una respuesta óptima al tratamiento farmacológico con aspirina y antagonistas P2Y₁₂, mantienen un alto riesgo^{trombótico 25}. De hecho, la TF asociada a plaquetas es funcionalmente activa y, por tanto, potencialmente capaz de soportar la generación^{de trombina 1,3,4}. En este contexto, la capacidad de realizar análisis de citometría de flujo en unos pocos microlitros de sangre es una ventaja significativa que permite extender el análisis de TF asociado a plaquetas al entorno clínico. Con este fin, cabe mencionar que la validación de la medición de TF asociada a plaquetas mediante citometría de flujo ha sido el objetivo de un proyecto internacional que coordinamos recientemente, con el apoyo de la Sociedad Internacional de Hemostasis y Trombosis, para proporcionar orientación metodológica para su evaluación.

A diferencia de otros marcadores clásicos de activación plaquetaria, como la P-selectina y los agregados plaquetario-leucocitos, que deben analizarse inmediatamente tras la extracción de sangre para evitar artefactos, la expresión de TF es mucho más estable. De hecho, la muestra de sangre puede procesarse en pocas horas tras la extracción sin ningún cambio significativo en la expresión de plaquetas TF; Además, la posibilidad de fijar la muestra y etiquetarla/procesarla posteriormente hace que este análisis sea adecuado para muchos hospitales y laboratorios. Cabe destacar que, aunque el protocolo descrito en este manuscrito es relativamente sencillo de ejecutar, la técnica de citometría de flujo sigue requiriendo formación técnica especializada. Por esta razón, la tecnología avanza hacia el desarrollo de citómetros cada vez más simples destinados a ensayos en el punto de atención.

En conclusión, el protocolo propuesto proporciona métodos para el análisis correcto de la TF asociada a plaquetas, subrayando las ventajas de una técnica basada en el análisis de citometría de flujo para su determinación. Además, destaca las variables preanalíticas que pueden influir en el análisis de esta proteína, enfatizando las medidas a tomar para evitarlas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Adenosina 5'-difosfato (ADP)	Sigma-Aldrich	A-2754	Agonista de plaquetas
Alexa Fluor 633 cabra α-mouse IgG	Invitrogen	A21052	Anticuerpo secundario
Biotubo 10 mL	Biosigma	BSP048	Para la recogida de PRP
Aguja Mariposa G19	Solución PIC	02044019030010	Para la extracción de sangre
CytExpert Software	Beckman Coulter		Análisis de datos de citometría de flujo
Cytoflex S	Beckman Coulter		Citómetro de flujo
Tubos Eppendorf 1,5 mL	Eppendorf	1,20,086	Fijación sanguínea
ImageStreamX Mk II	Cytek Biosciences		Citómetro de flujo de imagen
Kaluza Software	Beckman Coulter		Análisis de datos de citometría de flujo
Paraformaldehído	Antibióticos y ndash; Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	Para reparar sangre y plaquetas
PerCP-y alfa; CD45	BD	345809	Marcador de población leucocitaria
PerCP-y alfa; CD61	BD	347408	Marcador de plásters plaquetarios
PE-& Alpha; CD142	BD	550312	Anticuerpo antifactor tisular humano
PE-& Alpha; CD41	Beckman Coulter	A07781	Marcador de plásters plaquetarios
Suero tampón de fosfato (PBS) 1x sin calcio y magnesio	Gibco	10010-015	Para anticuerpos y dilución de muestras
Puntas de pipeta 10 y micro; L	Gilson y subministración;	F161630	Para preparar muestras
Puntas de pipete 1000 y micro; L	Gilson	F161670	Para preparar muestras
Puntas de pipete 200 y micro; L	Gilson	F161930	Para preparar muestras
Tubo de fondo redondo 5 mL	Corning	352052	Para la adquisición de un citómetro de flujo
Cloruro de sodio 0,9 %	BD	306575	Lavar la cánula de agujas tras la extracción de sangre
Sysmex XN-450	Dasit		Analizador de células sanguíneas
Triton X-100	Carlo Erba Reagenti	9002-93-1	Para permeabilizar la membrana de las células sanguíneas
Tubos de citrato de vacío 0,129M	BD	363079	Para la recogida de sangre
Tubos Vacutainer K2 EDTA	BD	368857	Para la recogida de sangre
Adaptador Luer de Varias Muestras Vacutainer	BD	367300	Para la extracción de sangre
Portavacíos de un solo uso	BD	364815	Para la extracción de sangre
Kit de cuentas de captura de anticuerpos Versacomp	Beckman Coulter	B22804	Titulación por anticuerpos
&alfa; CD142 (clon HTF-1)	Invitrogen	16-1429-82	Anticuerpo antifactor tisular humano