Artículo de método

Análisis comparativo del cariotipo de las poblaciones de hierbas de Lycoris aurea utilizando bandas de fluorocromo y 45S y 5S rDNA-FISH

DOI:

10.3791/67363

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29 de noviembre de 2024

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1Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province, Huaihua University, 2College of Biological and Food Engineering, Hunan University

En este artículo

Resumen

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Este protocolo investiga la distribución de heterocromatina en ocho poblaciones de hierba Lycoris aurea (L'Her), utilizando tinción combinada de cromosomas PI y DAPI, hibridación fluorescente in situ (FISH) con regiones del gen 18S-5.8-26S rRNA (regiones 45S rDNA) y sondas de ADN ribosómico 5S.

Resumen

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Para comprender la variación del cariotipo en ocho poblaciones, se establecieron meticulosamente cariotipos detallados utilizando mediciones cromosómicas, bandas de fluorescencia y señales FISH de ADNr. El número de sitios de ADNr 45S varía de uno a cinco pares por población, siendo el número más común por cariotipo cuatro pares. El locus de ADNr 45S se localiza predominantemente en los brazos cortos y las regiones terminales de los cromosomas, mientras que el locus de ADNr 5S se encuentra principalmente en el brazo corto y en las regiones terminales o proximales. Las poblaciones HBWF, HNXN, HBBD y HNZX mostraron una distribución similar de sitios de ADNr 45S, al igual que GXTL, HBFC y SCLS, lo que indica una estrecha relación entre poblaciones con distribuciones similares de sitios de ADNr 45S. Los cariotipos de todas las poblaciones estudiadas son simétricos, comprendiendo centrómeros estables y metaestables o centrómeros exclusivamente estables. Los diagramas de dispersión de MCA y CVCL distinguen eficazmente sus estructuras cariotípicas. El análisis incluye seis parámetros cuantitativos (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI). Además, los resultados indican que el PCoA basado en estos seis parámetros es un método robusto para determinar las relaciones del cariotipo biológico entre las ocho poblaciones. El número de cromosomas en las poblaciones de Lycoris es x = 6-8. Con base en el estudio y la literatura actuales, la diferenciación genómica de estas poblaciones se discute en términos de tamaño del genoma, heterocromatina, sitios de ADNr 45S y 5S y asimetría del cariotipo.

Introducción

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Lycoris es una familia que incluye varias plantas hortícolas importantes1. Lycoris aurea (L'Hér.) Hierba. es una planta medicinal tradicional china con una larga historia. El análisis fitoquímico ha demostrado que Lycoris aurea (L'Her.) La hierba contiene galantamina y otros alcaloides, que pueden mejorar la sensibilidad a la acetilcolina y tienen el potencial de tratar la enfermedad de Alzheimer comoinhibidores de la colinesterasa.

En las plantas superiores, el análisis del cariotipo es crucial para integrar los mapas genéticos y físicos, con importantes implicaciones prácticas para la biología de las plantas. Este análisis permite la caracterización del genoma a nivel cromosómico, la clarificación de las relaciones taxonómicas celulares entre poblaciones, la identificación de aberraciones genéticas y la comprensión de las tendencias de la evolución cromosómica 3,4,5. Por lo general, la descripción de un cariotipo incluye el número de cromosomas, las longitudes absolutas y relativas de los cromosomas, las ubicaciones de constricción primaria y secundaria, la distribución de fragmentos heterocromáticos, los números y ubicaciones de los sitios de ADNr y otras características de la secuencia de ADN, así como la asimetría del cariotipo 6,7,8. Entre los parámetros del cariotipo, la asimetría está determinada por variaciones en la longitud del cromosoma (asimetría intercromosómica) y la posición del centrómero (asimetría intracromosómica). La asimetría del cariotipo es una característica importante que refleja la morfología cromosómica y es ampliamente utilizada en la taxonomía de células vegetales 9,10,11,12.

A menudo, la ausencia de marcadores cromosómicos limita el análisis del cariotipo e impide la identificación de los cromosomas individuales. En los últimos años, la tinción de Giemsa, las bandas de fluorescencia y la hibridación fluorescente in situ (FISH) se han vuelto populares en el análisis de cromosomas de plantas. Los métodos de tinción fluorescente dual, como la tinción CMA (cromomicina A3) / DAPI (4, 6-diamino-2-fenilindol) y la tinción PI (yoduro de propilo) / DAPI (conocida como tinción CPD), revelan regiones heterocromáticas ricas en GC y AT en los cromosomas 4,13. Durante la metafase o paquiteno de la mitosis de la planta, secuencias repetidas de ADN o segmentos largos de ADN pueden generar señales específicas en las poblaciones de plantas a través de la hibridación FISH 14,15,16.

Las bandas fluorescentes y las señales FISH proporcionan marcadores útiles para la identificación de cromosomas. Mediante la medición de la longitud de los cromosomas, el análisis de las características de las bandas de fluorescencia y la comparación de las diferencias de señal FISH, se pueden construir cariotipos citogenéticos moleculares detallados de diferentes germoplasmas o poblaciones de plantas. Estos cariotipos muestran efectivamente la morfología cromosómica en varios germoplasmas o poblaciones, lo que permite comparaciones de la distribución de la heterocromatina y la localización de la secuencia de ADN y fomenta futuras investigaciones 4,8,17. Las comparaciones de cariotipos citogenéticos moleculares pueden ofrecer información valiosa sobre las relaciones filogenéticas y la evolución cromosómica de poblaciones relacionadas 8,14,18,19.

El género Lycoris , un grupo diverso e intrigante dentro de la familia Amarilis, es conocido por sus bulbos perennes. Con aproximadamente 20 especies, 15 de las cuales son endémicas de China, muestra una rica biodiversidad. Este género se encuentra exclusivamente en las regiones templadas cálidas y subtropicales del este de Asia, incluido el suroeste de China, el sur de Corea y Japón, con algunas poblaciones que se extienden hasta el norte de la India y Nepal20. Los primeros estudios citogenéticos se centraron principalmente en el recuento de cromosomas para establecer el número cromosómico básico del género y describir la morfología de los cromosomas en poblaciones específicas, centrándose en gran medida en Lycoris radiata21. El número total de cromosomas observado en este género oscila entre 12 y 33 o 44, lo que representa los niveles diploide, diploide anormal, triploide, tetraploide y aneuploide, respectivamente. Los números básicos de los cromosomas, x, son 6, 7, 8 y 11.

Lycoris aurea (L'Hér.) La hierba, una especie notable dentro del género Lycoris , está ampliamente distribuida en toda China22. Prospera en ambientes relajados y húmedos y se reproduce a través de pequeños bulbos. Estos bulbos, que contienen licorina y galantamina, dos compuestos medicinales clave, se han utilizado en la medicina tradicional china durante siglos. La Lycoris aurea también cautiva a los horticultores con sus llamativas flores rojas en otoño y sus hojas de hoja perenne en invierno. Sin embargo, la similitud morfológica entre todos los Lycoris aurea estudiados (L'Hér.) Las poblaciones de hierbas presentan un desafío significativo para la identificación cromosómica utilizando métodos citológicos convencionales.

La clonación de FISH, fosmid o BAC (cromosomas artificiales bacterianos) con secuencias repetitivas de ADN y sondas de oligonucleótidos en cromosomas metafásicos o paquidermales se ha utilizado para el análisis de cariotipo 23,24,25, el análisis citogenético comparativo 26,27, la construcción de mapas citogenéticos28,29 y ensayos específicos de cromosomas30. Recientemente, la técnica FISH se ha aplicado al análisis cromosómico de poblaciones de Lycoris 31. Aunque el número de cromosomas y el cariotipo varían en las poblaciones de Lycoris, el número total de cromosomas permanece constante, observándose tres tipos básicos: el cromosoma del centrómero central (M-), el cromosoma del centrómero distal (T-) y el cromosoma del centrómero proximal (A-). Además, se observan diversas formas y tamaños de cromosomas en las poblaciones naturales32.

La hibridación in situ con fluorescencia de ARN (FISH) es útil para detectar cambios cromosómicos, como la fusión de centrómeros, la inversión, la amplificación de genes y la deleción de fragmentos. La tecnología de hibridación fluorescente in situ (RNA-FISH) permite el análisis visual de alta resolución de los cromosomas para detectar e identificar múltiples cambios complejos, incluida la fusión de las regiones centrales de los cromosomas, la formación de nuevas estructuras cromosómicas, la inversión de regiones cromosómicas, la amplificación de genes o fragmentos de genes y la pérdida de secuencias de genes en regiones cromosómicas específicas33. Cinco de los 500 clones mostraron fuertes señales FISH en la región del centrómero del cromosoma central (M-), pero no en el cromosoma (T-)34 del centrómero distal. El patrón único de distribución de la señal FISH en cada cromosoma permitió la identificación de cromosomas individuales, lo que anteriormente había sido un desafío en las poblaciones de Lycoris utilizando métodos de tinción tradicionales31. En la actualidad, existen pocos estudios sobre la citogenética molecular de Lycoris aurea (L'Hér.) Herb, haciendo hincapié en la urgente necesidad de más investigación en este campo.

En este estudio, ocho cromosomas metafásicos bien diferenciados de Lycoris aurea (L'Hér.) Las poblaciones de hierbas se prepararon utilizando métodos de inmersión enzimática y secado con llama (EMF). Para la identificación de FISH se utilizó tinción CPD y sondas de ADNr 45S y 5S. Se construyeron cariotipos citogenéticos moleculares detallados de estas poblaciones utilizando datos combinados de mediciones cromosómicas, bandas fluorescentes y señales FISH de ADNr 45S y 5S. Se calcularon seis índices de asimetría cariotípica diferentes para cada población con el fin de identificar las relaciones cariotípicas entre ellas. La evaluación de los datos del cariotipo citogenético molecular proporcionó información significativa sobre la diferenciación genómica y las relaciones evolutivas de las ocho poblaciones, lo que podría remodelar la comprensión de los cromosomas Lycoris .

Protocolo

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Los reactivos y equipos utilizados en este estudio se detallan en la Tabla de Materiales, mientras que las sondas empleadas se proporcionan en el Archivo Suplementario 1.

1. Preparación de los cromosomas apicales

  1. Enraíza por hidroponía. Después de retirar la parte aérea del bulbo, colóquelo en una botella cónica llena de agua, reemplazando el agua cada 3 días, siguiendo el método descrito por Song et al.35.
  2. Extirpar las puntas de las raíces en crecimiento activo cuando alcancen aproximadamente 1,0-2,0 cm de longitud y tratarlas en α-bromonaftaleno saturado a 28 °C durante 1,0 h.
  3. Cortar las puntas de las raíces a aproximadamente 1 cm y colocarlas en una mezcla recién preparada de metanol y ácido acético glacial en una proporción de volumen de 3:1 a temperatura ambiente (aproximadamente 20-25 °C) durante 2-3 h. Luego, almacenarlos en un refrigerador a 4 °C, según lo descrito por She et al.36.
  4. Lave bien las puntas fijas de las raíces (2-3 mm) con agua bidestilada.
  5. Prepare una mezcla de celulasa y pectina hidrolasa en 0,01 mM de tampón de ácido cítrico-citrato de sodio a pH 4,5, con celulasa y pectina hidrolasa al 1% cada una. Coloque las puntas de las raíces pretratadas en la mezcla y digiera a 28 °C durante 1,0-1,5 h.
  6. Lave las puntas de las raíces digeridas con agua destilada dos veces, transfiéralas a un portaobjetos de vidrio y triture bien con el fijador con pinzas de punta fina.
  7. Seque los portaobjetos sobre la llama de una lámpara de alcohol hasta que el agua nebulizada desaparezca. Bajo un microscopio de contraste de fase, seleccione portaobjetos con más de cinco fases divididas y sin cromosomas superpuestos. Guarde los portaobjetos a -20 °C para su uso futuro.

2. Tinción de CPD

  1. Prepare una solución de CPD agregando PI y DAPI a un atenuador antifluorescente al 30% (v/v), donde la concentración de PI es de 0,6 μg·mL-1 y la concentración de DAPI es de 3 μg·mL-1.
  2. Secar el portaobjetos cromosómico a 65 °C durante 30 min.
  3. Añadir 100 μL de diluyente de RNasa A (la solución de almacenamiento de RNasa A diluida 100 veces con 2x SSC (citrato de sodio salino), lo que da como resultado una concentración final de 100 μg/mL) por portaobjetos de cromosoma. Cubra el portaobjetos y caliéntelo en una cámara húmeda a 37 °C durante 30-60 min.
  4. Lave el portaobjetos cromosómico con 2x SSC a temperatura ambiente durante tres intervalos de 5 minutos cada uno.
  5. Lave el portaobjetos cromosómico a temperatura ambiente durante 1-2 minutos.
  6. Añadir 200 μL de diluyente de pepsina (la solución de almacenamiento de pepsina se diluye 100 veces con 0,01 N HCl para lograr una concentración final de 5 μg/mL) por portaobjetos de cromosoma. Cubra el portaobjetos e incube en una cámara húmeda a 37 °C durante 5-20 min.
  7. Lave las secciones de los cromosomas con agua ultrapura a temperatura ambiente durante 2 minutos, seguido de un lavado con 2 xSSC a temperatura ambiente durante dos intervalos de 5 minutos cada uno.
  8. Fije los portaobjetos con una solución de metanol: ácido acético glacial (3:1) durante 10 min.
  9. Lavar con 2x SSC a temperatura ambiente durante tres intervalos de 5 min cada uno.
  10. Tratar con etanol al 70%, 95% y 100% a -20 °C durante 5 minutos cada uno, luego secar a temperatura ambiente.
  11. Tome los portaobjetos cromosómicos tratados y secos, agregue 30 μL de solución de tinción CPD a cada portaobjetos, cúbralos con un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm y tiña en la oscuridad durante más de 30 minutos. El material cromosómico extenso debe teñirse durante la noche.
  12. Observe los portaobjetos cromosómicos bajo un microscopio de fluorescencia, utilizando un filtro de excitación verde (WG) para la tinción PI y un filtro ultravioleta (UV) para la tinción DAPI. Captura imágenes con el software compatible.
    1. Ajuste el tiempo de exposición a través de los dos filtros para lograr intensidades de fluorescencia roja y azul similares durante la captura de imágenes. La imagen CPD se obtiene a partir de las imágenes en escala de grises teñidas con PI y DAPI. Las mediciones cromosómicas y el procesamiento de imágenes se realizaron con el software Adobe Photoshop.

3. Hibridación fluorescente in situ

  1. Prepare la solución híbrida: FAD (10 μL), ssDNA (2 μL), 20× SSC (2 μL), 5S rDNA (1 μL), 45S rDNA (1 μL) y 50% sulfato de glucano (4 μL). Después de la preparación, centrifugar la solución híbrida (2500 x g, 5-10 min, a temperatura ambiente) y colocarla en hielo.
  2. Coloque las diapositivas escaneadas en el horno a 65 °C durante 30-60 min.
  3. Retire los portaobjetos horneados, agregue 100 μL de solución de desnaturalización de FAD al 70%, cubra con un cubreobjetos y desnaturalice en un horno de hibridación molecular a 85 °C durante 2,5 min.
  4. Retire el cubreobjetos e inmediatamente sumerja los portaobjetos en etanol frío al 70%, 90% y 100%, deshidratando sucesivamente durante 5 minutos cada uno.
  5. Retire los portaobjetos y déjelos secar a temperatura ambiente durante más de 30 minutos.
  6. Agregue 20 μL de solución híbrida al portaobjetos, coloque suavemente el cubreobjetos encima hasta que el líquido se difunda por completo y déjelo a temperatura ambiente durante 10 minutos para humedecer el área cubierta del portaobjetos.
  7. Coloque los portaobjetos en una placa híbrida empapada con 2× SSC (la placa híbrida debe ser una placa de Petri grande con una tapa envuelta en papel de aluminio para facilitar la operación lejos de la luz) e incube a 37 °C durante la noche (durante al menos 6 h).
  8. Contratiñir los cromosomas montándolos con 3 μg·mL-1 DAPI en una solución al 30% (v/v) de Vectashield H-100. Capture la imagen utilizando software compatible, con la fluorescencia azul de DAPI excitada por la luz púrpura del filtro y la fluorescencia roja de PI excitada por la luz verde, respectivamente.
    NOTA: La hibridación de FISH se realizó utilizando sondas de ADNr 45S y 5S en portaobjetos previamente teñidos con CPD, siguiendo el método descrito por She et al.36.

4. Análisis del cariotipo

  1. Seleccionar cinco células mitóticas en metafase para cada población en las que los cromosomas estén bien dispersos (sin solapamientos) y moderadamente condensados (los cromosomas no deben estar agregados al máximo, pero los extremos no deben estar agrupados), siguiendo la metodología descrita por She et al.4.
  2. Determine la longitud absoluta de cada cromosoma seleccionando cinco cromosomas con la concentración más alta durante la división celular.
  3. Mida meticulosa y precisamente la longitud del brazo largo (L) y el brazo corto (S) de cada cromosoma, así como el tamaño de cada banda de pigmento fluorescente en el cromosoma.
  4. Calcule los siguientes parámetros: (1) longitud relativa de los cromosomas (RL, porcentaje haploide); (2) relación de brazo (AR = L/S, brazo largo/brazo corto); (3) longitud total del cromosoma haploide (TCL; longitud del cariotipo); (4) longitud promedio de los cromosomas (C); (5) tamaño de la banda de fluorescencia (el porcentaje de la banda de fluorescencia en relación con la longitud del cromosoma); (6) distancia desde el centrómero hasta el sitio de ADNr; (7) índice de centrómero promedio (IC, calculado como la longitud corta del brazo de cada cromosoma dividida por la longitud total de ese cromosoma, y luego promediando estos valores); (8) cuatro indicadores diferentes de asimetría del cariotipo, incluyendo el índice de centrómero (CVCI), el coeficiente de variación (CV), el coeficiente de variación de la longitud del cromosoma (CVCL), el coeficiente de asimetría media del centrómero (MCA) y la categoría de asimetría de Stebbins.
    NOTA: Consulte los métodos de Paszko10 y Peruzzi et al.11 para calcular el índice de asimetría. Clasifique los cromosomas con diferentes proporciones de brazo de acuerdo con los cinco métodos de clasificación de Levan. Organizar los cromosomas de Lycoris aurea (L'Hér.) Hierba en orden descendente de longitud como se describe en el protocolo de Han et al.37.
  5. Asegure la precisión y exactitud de la metodología mediante el dibujo de patrones de cariotipo cromosómico basados en los datos de medición cromosómica combinados con la información de la banda de fluorescencia y la posición y el tamaño del rDNA-FISH.
  6. La visualización de las relaciones asimétricas del cariotipo de las ocho poblaciones es un paso clave que proporciona información clara. Esto se logra a través de diagramas de dispersión bidimensionales, que se utilizan para obtener su MCA y CVCL.
  7. Realizar un análisis de coordenadas principales (PCoA) utilizando el coeficiente de similitud de Gower, un componente crucial, siguiendo los métodos de She et al.38.
  8. Calcular seis parámetros cuantitativos (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI) para determinar los cariotipos citogenéticos de las ocho poblaciones.
  9. Realizar análisis estadísticos utilizando un programa de análisis y visualización de datos para generar el dendrograma basado en UPGMA y el diagrama de dispersión de PCoA.

Resultados

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Mediante el empleo del meticuloso método de inmersión enzimática y secado con llama (EMF), los cromosomas de metafase dispersos y bien diferenciados de Lycoris aurea (L'Hér.) Se obtuvo la hierba y se construyó el cariotipo cromosómico citogenético de Lycoris aurea (Figura 1). Los cromosomas metafásicos con el mayor grado de condensación no son adecuados para el análisis del cariotipo debido a las reducidas diferencias morfológicas. Sin embargo, dado que la longitud total de los cromosomas haploides (TCL) es comparable entre poblaciones, es posible distinguir los cariotipos de diferentes poblaciones de Lycoris aurea comparando las diferencias en los valores de TCL. Las características del cariotipo y el contenido de ADN nuclear de ocho poblaciones de Lycoris aurea se muestran en la Tabla 1. La distribución de las bandas de fluorescencia y las ubicaciones de los sitios de ADNr 45S y 5S se presentan en la Tabla 2. La Figura 2 muestra las mediciones de los cromosomas junto con las características de las bandas de fluorescencia y la ubicación y el tamaño de las señales FISH de ADNr 45S y 5S.

Los números de cromosomas diploides son los siguientes: 2n = 16 = 8m + 8t para GXTL, 2n = 14 = 8m + 6t para HBFC, 2n = 14 = 8m + 6t para GZDS, 2n = 16 = 6m + 10t para HNZX, 2n = 14 = 8m + 6t para HBBD, 2n = 14 = 8m + 6t para HNXN, 2n = 16 = 6m + 10t para HBWF, y 2n + 1 = 15 = 7m + 8t para SCLS (Tabla 1). Tal y como se describe en el protocolo de She et al.4, los cromosomas en metafase de las ocho poblaciones de L. aurea son pequeños, con longitudes medias de los cromosomas que oscilan entre 1,01 μm (HNZX) y 2,08 μm (GZDS) y un TCL que oscila entre 16,14 μm (HNZX) y 29,13 μm (GZDS). Los TCLs de las ocho poblaciones se correlacionan con los contenidos de ADN nuclear reportados (Tabla 1). El rango de longitud relativa (RRL) más pequeño se observa en HNXN (1,52-3,81), mientras que el mayor se observa en GZDS (2,73-5,86). Las poblaciones HNXN y GZDS exhibieron la variación más pequeña y más grande en la longitud de los cromosomas, respectivamente. El índice medio de centrómero (IC) del genoma varió entre 61,02 ± 5,63 (población HBFC) y 70,70 ± 4,63 (población HBWF). La población HBFC mostró el menor cambio en el índice de centrómero, mientras que la población HBWF exhibió los cambios más extensos.

Los cariotipos están compuestos por cromosomas metacéntricos (m) y telocéntricos (t) (Tabla 1; Figura 2), que representan las formas cromosómicas más comunes entre las ocho poblaciones estudiadas. En la Tabla 1 se presentan los ocho índices diferentes de asimetría del cariotipo. Entre estos índices, el coeficiente de variación del índice de centrómero (CVCI) y la asimetría media del centrómero (MCA) caracterizan la asimetría intracromosómica, mientras que el coeficiente de variación de la longitud del cromosoma (CVCL) mide la asimetría intercromosómica. Los rangos para CVCI y MCA son los siguientes: CVCI = 10,97 (HBBD) a 18,25 (HBWF) y MCA = 28,85 (HNZX) a 39,30 (HBWF). Estos valores indican consistentemente que el HBBD tiene la asimetría intracromosómica más baja y el HBWF tiene la más alta. El rango para CVCL es de 14,98 (GZDS) a 23,32 (HBWF), lo que sugiere que GZDS exhibe el cariotipo menos asimétrico, mientras que HBWF muestra el cariotipo más asimétrico entre las ocho poblaciones. De acuerdo con los principios de clasificación de Stebbins9, estos cariotipos pertenecen a la clase 1B, lo que indica que todas las poblaciones estudiadas tienen cariotipos relativamente simétricos.

Las relaciones de asimetría del cariotipo entre los ocho Lycoris aurea (L'Hérit.) Las poblaciones de hierbas se ilustran utilizando diagramas de dispersión bidimensionales de CVCI versus CVCL y MCA versus CVCL (Figura 3). La estructura del cariotipo de estas poblaciones, revelada por los tres pares de parámetros: CVCI, CVCL y MCA, tiene implicaciones significativas. Estos parámetros muestran asimetrías de cariotipo similares. Los hallazgos de los diagramas de dispersión resaltan el impacto potencial de la investigación, mostrando que la población HNXN tiene el cariotipo más simétrico, mientras que las poblaciones HBFC y HBWF exhiben la mayor cantidad de asimetrías intracromosómicas e intercromosómicas, respectivamente (Figura 3).

Este estudio categorizó meticulosamente las ocho poblaciones de Lycoris aurea en tres grupos principales basados en el diagrama de árbol UPGMA con cinco parámetros de cariotipo (Figura 4). El primer grupo, representado por la población SCLS, forma un clado independiente. El segundo grupo está formado por HNXN y HBWF. El tercer conglomerado se divide en dos subgrupos: uno contiene solo HBFC poblacional, mientras que el otro incluye poblaciones HBWF, GZDS y GXTL, con poblacionales HBBD y GZDS agrupados en una rama más pequeña. Las relaciones cariológicas entre las poblaciones estudiadas, reveladas por el análisis de coordenadas principales (PCoA), se ilustran en la Figura 5. El diagrama de dispersión del PCoA indica que las ocho poblaciones se pueden dividir en dos grupos con un nivel de confianza del 68,36%. El primer grupo incluye HBWF, HBBD y GXTL, con las tres primeras poblaciones agrupadas estrechamente. El segundo grupo está formado por HBFC, HNXN, HNZX y SCLS, donde el HBFC ocupa la posición intermedia entre los dos grupos, y el SCLS se sitúa más aislado (Figura 5).

La tinción inversa CPD (combinación de yoduro de propidio y DAPI) y DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) son técnicas estándar utilizadas para observar la estructura nuclear y la distribución de la cromatina. Los resultados de este estudio revelaron fenómenos aparentes de heterocromatina entre ocho poblaciones de Lycoris aurea (L'Hérit.) Hierba (Figura 1 y Figura 2; Tabla 2). Los resultados de la hibridación FISH para cada población indicaron que todas las regiones cromosómicas corresponden a los loci de ADNr 45S y 5S. Las características de las bandas CPD se ilustran en la Figura 1A, C, E, G, I, K, M, O.

En las poblaciones HBFC y HBBD, se observaron bandas de CPD en las regiones centromérica y pericentromérica (Figura 1G,K; Figura 2D,F). Sin embargo, ciertos cromosomas no mostraban bandas CPD: el 3º y 8º cromosoma en SCLS, el 1º cromosoma en HNXN, el 1º cromosoma en HNZX, el 1º cromosoma en HBWF, el 2º cromosoma en GZDS y el 2º cromosoma en GXTL (Figura 1A,C,E,I,J,M,O; Figura 2A-C,E,G,H). En particular, también se encontraron bandas de CPD en los terminales de los brazos cortos de los pares de cromosomas 5, 6 y 7 en SCLS y HNXN, en los pares 4, 5, 6, 7 y 8 en HNZX, y en los pares 5, 6 y 7 en HBFC. Además, las bandas CPD estaban presentes en los extremos cortos del brazo de los cromosomas 4, 5, 6, 7 y 8 en HBWF, en los extremos cortos del brazo de los cromosomas 5, 6 y 7 en HBBD, y en los extremos cortos del brazo de los cromosomas 5, 6, 7 y 8 en GXTL (Figura 1A y Figura 2A).

Después de la hibridación con FISH, la tinción inversa de DAPI formó bandas fluorescentes brillantes alrededor de las partículas centrales de los cromosomas 5, 6 y 7 en GZDS. Estas bandas, denominadas bandas post-FISH DAPI+, indican que estas regiones de heterocromatina contienen un alto número de pares de bases A-T (Figura 2G). El rango de bandas de DPC (peri)centroméricas observadas en las ocho poblaciones fue de 25,00% a 57,14% (Tabla 2), mientras que la cantidad total de bandas de DPC terminales osciló entre 40,00% y 71,43% (Tabla 2). En la población GZDS, las bandas post-FISH DAPI+ se correlacionaron con la longitud del cariotipo, representando el 42,86% del total. Los tamaños de las bandas CPD de ADNr, las bandas CPD no ADNr y las bandas DAPI+ después de FISH difirieron significativamente entre los diversos pares de cromosomas de Lycoris aurea (L'Hérit). Hierba (Figura 2; Tabla 2).

La técnica FISH se utilizó para insertar sondas de ADNr 45S y 5S en cromosomas teñidos con CPD, como se ilustra en la Figura 1. Resumen del número y ubicación de los sitios de ADNr 45S y 5S en las ocho poblaciones de Lycoris aurea (L'Hérit.) La hierba se presenta en la Tabla 2 y se representa en la Figura 2. En particular, las diferencias significativas en el número, el tamaño y la ubicación de los loci de ADNr entre las ocho poblaciones ponen de relieve la importancia de estos hallazgos. En total, había 30 loci de ADNr 45S en las ocho poblaciones. De estos, 4 loci (13,33%) estaban situados en la región del centrómero central, 9 (30,00%) en la región del centrómero casi central y 17 (56,67%) en las regiones terminales de sus respectivos brazos cromosómicos (Figura 2; Tabla 2).

En la población de GXTL, se encontró una señal de locus de ADNr 45S en la región del centrómero del brazo corto del cromosoma 4, mientras que cuatro señales adicionales se localizaron en la región del centrómero de los brazos largos de los cromosomas 5, 6, 7 y 8 (Figura 1P; Figura 2G). En la población de HBFC, un locus de ADNr 45S se colocó en la región del centrómero en el brazo corto del cromosoma 4, con tres loci encontrados en regiones de heterocromatina pericentroméricas en los brazos cortos de los cromosomas 5, 6 y 8 (Figura 1H; Figura 2D). En la población GZDS, se localizó un locus 45S en la región del centrómero del brazo corto del cromosoma 4 metacéntrico (Figura 1N; Figura 2G). En HNZX, se observaron cinco loci de ADNr 45S en las áreas terminales de los brazos cortos de los pares de cromosomas 4, 5, 6, 7 y 8 (Figura 1H; Figura 2D). La distribución de los sitios 45S en HBBD (Figura 1J; Figura 2E) y HNXN (Figura 1L; Figura 2F) era similar, con un locus en la región del centrómero del brazo corto del cromosoma 4 y tres loci en la región del centrómero de los brazos cortos de los cromosomas 5, 6 y 7.

En HBWF, aparecieron cinco señales de loci de ADNr 45S en las regiones del centrómero del brazo corto de los pares de cromosomas 4, 5, 6, 7 y 8 (Figura 1N; Figura 2G). En el SCLS, se encontró una señal de locus de ADNr 45S en las regiones del centrómero del brazo corto de los pares de cromosomas 1 y 2, así como en las regiones pericentroméricas de los brazos cortos de los pares de cromosomas 5 y 6 (Figura 1P; Figura 2H). Para los loci de ADNr 5S, se identificaron un total de nueve en los ocho taxones, con 3 (33,33%) ubicados en las regiones proximales, 3 (33,33%) en las regiones pericentroméricas y 3 (33,33%) en las regiones terminales de los respectivos brazos cromosómicos (Figura 2; Tabla 2). En GXTL, una señal del locus de ADNr 5S apareció cerca del extremo terminal del brazo largo del par de cromosomas 6 (Figura 1P; Figura 2G). La distribución de los sitios 5S fue similar en HBFC (Figura 1H; Figura 2D) y GZDS (Figura 1N; Figura 2G), ambos conteniendo un locus de ADNr 5S en la región proximal del brazo corto del cromosoma 7. En HNZX, se encontró un locus de ADNr 5S cerca del extremo terminal del brazo largo del cromosoma 8 (Figura 1H; Figura 2D), mientras que en HBBD se identificó un locus de ADNr 5S en el cromosoma 7 (Figura 1J; Figura 2E). En HBWF, dos loci de ADNr 5S aparecieron cerca del extremo terminal de los brazos largos de los cromosomas 4 y 8, dos más en el brazo largo del cromosoma 7, uno en la región del centrómero y uno cerca del extremo (Figura 1N; Figura 2G).

La combinación de las señales FISH de ADNr 45S y 5S, junto con las características terminales del segmento CPD, distinguió eficazmente todos los cromosomas mitóticos de diferentes poblaciones de Lycoris aurea (L'Hérit). Hierba. En las poblaciones de SCLS, HBFC, HBBD, GZDS y GXTL, el cromosoma 1 exhibió fuertes señales de CPD en la región centromérica. El cromosoma 2 mostró fuertes señales de CPD en la región centromérica, con la excepción de GZDS y GXTL. El cromosoma 3 mostró una fuerte señal de CPD en la región centromérica, a excepción del SCLS. El cromosoma 4 exhibió consistentemente fuertes señales de CPD en la región centromérica. Para los cromosomas 5, 6 y 7, se observaron fuertes señales de CPD en los extremos de los brazos cortos. El cromosoma 4 también mostró fuertes señales de ADNr 45S al final del brazo corto, mientras que los cromosomas 5 y 6 tenían fuertes señales 45S en sus regiones terminales, excepto en GZDS. En particular, una fuerte señal de DAPI estaba presente en la población de GZDS. Además, apareció una señal débil de ADNr 5S en la región proximal del cromosoma 7 en las poblaciones HBFC, HBWF, HBBD y GZDS.

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Figura 1: Cromosomas mitóticos de ocho Lycoris aurea (L' Hér.) Poblaciones de hierbas. Examen de los cromosomas mitóticos de la metafase de ocho Lycoris aurea diferentes (L' Herit.) Se muestran las poblaciones de hierbas, incluyendo la población SCLS (A,B), la población HNXN (C,D), la población HNZX (E,F), la población HBFC (G,H), la población HBWF (I,J) y la población HBBD (K,L). La hibridación de GZDS (M,N) y GXTL (O,P) se realizó utilizando FISH con sondas de ADNr 45S marcadas con biotina y 5S marcadas con digoxina después de la tinción con CPD. Las imágenes resultantes de los cromosomas después de la tinción con CPD muestran señales de ADNr 45S (verde) y 5S (rojo). El ADN total se teñió invertidamente con colorante DAPI, lo que dio como resultado un color azul. Barras de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Diagramas del cariotipo cromosómico de ocho Lycoris aurea (L' Hér.) Poblaciones de hierbas. Diagrama de patrones cromosómicos para ocho poblaciones de Lycoris aurea (L' Herit.) La hierba revela las características de la banda de fluorescencia, junto con la ubicación y el tamaño de las señales FISH de ADNr 45S y 5S. Las poblaciones SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS y GXTL están representadas por (A-H), respectivamente. La escala de ordenadas indica la longitud relativa del cromosoma (el porcentaje de ese cromosoma en el genoma haploide), y el número en la parte superior indica el número de serie del cromosoma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Diagramas de dispersión para ocho Lycoris aurea (L' Hér.) Poblaciones de hierbas basadas en tres parámetros de cariotipo. (A) El índice CVCI se traza contra el índice CVCL. (B) El índice MCA se traza contra el índice CVCL. Se indican las poblaciones SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS y GXTL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Dendrograma UPGMA de ocho Lycoris aurea (L' Hér.) Poblaciones de hierbas. El dendrograma UPGMA se basa en los parámetros x, 2n, TCL, MCA, CVCL y CVCI para los ocho Lycoris aurea (L' Hér.) Poblaciones de hierbas: SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS y GXTL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: PCoA de los ocho Lycoris aurea (L' Hér.) Variedades de hierbas basadas en seis parámetros de cariotipo. El PCoA se basa en los parámetros x, 2n, TCL, MCA, CVCL y CVCI, que representan SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS y GXTL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Nombres de ocho Lycoris aurea (L' Hér.) Poblaciones de hierbas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Distribución de bandas de fluorocromo y sitios de ADNr en los ocho Lycoris aurea (L' Hér.) Poblaciones de hierbas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Ficha complementaria 1: Las sondas empleadas en este estudio. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

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La preparación de Lycoris aurea (L'Hér.) Los cromosomas de las raíces de las hierbas implican varios pasos críticos: (1) cultivar las raíces mediante hidroponía, (2) tratar las puntas de las raíces con α-bromonaftaleno saturado, (3) fijar las raíces con una solución de alcohol-ácido acético, (4) realizar una hidrólisis enzimática en las puntas de las raíces con una solución enzimática y (5) aplastar completamente las raíces digeridas y secar los portaobjetos sobre la llama de una lámpara de alcohol.

La medición precisa de los cromosomas es esencial para el análisis del cariotipo en los estudios citogenéticos. Los cromosomas deben exhibir una condensación notable y límites claramente definidos; De lo contrario, calcular con precisión los parámetros cromosómicos se convierte en un desafío5. Investigaciones citogenéticas previas han demostrado que la diferenciación morfológica de los cromosomas mitóticos depende del grado de condensación 4,36. Cuando la condensación es insuficiente, los extremos de los brazos cromosómicos aún pueden estar desgglutinados, lo que lleva a límites cromosómicos poco claros. Sin embargo, cuando los cromosomas alcanzan la máxima condensación, las diferencias morfológicas entre los cromosomas disminuyen. Por lo tanto, la selección de cromosomas con condensación moderada es crucial para la identificación y medición de cromosomas, especialmente en poblaciones con menos cromosomas.

El marcaje de la sonda es crucial para el éxito de la hibridación in situ de FISH, en particular para la solución de la sonda de ADNr 5S. Debido a la secuencia corta del ADNr 5S, la concentración de secuencias diana marcadas por PCR suele ser baja, lo que provoca señales de hibridación débiles. Sin embargo, la síntesis directa de sondas marcadas con fluoresceína produce señales de hibridación más fuertes y simplifica el proceso. Para la solución de sonda de ADNr 45S, las secuencias parciales de las regiones codificantes de ARNr 5.8S, 18S y 25S de Arabidopsis thaliana se marcaron en los extremos 5' y 3' con 6-carboxil-tetrametilrodamina (TAMRA) y luego se mezclaron. La solución de sonda de ADNr de fluoresceína 5S se obtuvo utilizando secuencias de nucleótidos 1-59 y 60-118 de la región codificante del gen ARNr de Arabidopsis 5S, con cada secuencia marcada en el extremo 5' con fluoresceína 6-carboxilo (6-FAM), y luego se mezcló.

En este estudio, aprovechamos las diferencias entre los tintes DAPI y PI en la unión al ADN y los combinamos para obtener bandas fluorescentes claras. Los colorantes PI (yoduro de propidio) pueden penetrar en las membranas celulares y unirse a las moléculas de ADN dentro de las células. Por el contrario, DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) se une preferentemente a las regiones de ADN ricas en AT, proporcionando una tinción clara y de alto contraste. Debido a estas propiedades complementarias, DAPI y PI a menudo se usan juntos, lo que se conoce como tinción CPD, para recopilar información sobre el núcleo y el citoplasma simultáneamente. Las diferencias en la presencia, ubicación y tamaño de las bandas CPD y DAPI+ revelaron una diferenciación significativa de heterocromatina en las ocho poblaciones de Lycoris aurea. La tinción con CPD mostró regiones de heterocromatina ricas en contenido de GC tanto en las regiones centroméricas y pericentroméricas como dentro de los cromosomas telocéntricos.

El estudio de la asimetría del cariotipo es un enfoque taxonómico citogenético popular, asequible y ampliamente utilizado que incorpora una serie de parámetros e indicadores, incluyendo medidas cualitativas y cuantitativas, parámetros de clasificación de Stebbins y varios índices cuantitativos (por ejemplo, Paszko10; Peruzzi et al.11). Entre estos, la relación R y el CVCL se utilizan para medir la asimetría cromosómica, mientras que el CVCI y el MCA representan indicadores clave de la asimetría cromosómica. En particular, el CVCL se considera un parámetro estadístico robusto para estimar la asimetría intercromosómica10, y la Métrica de Asimetría Cromosómica (MCA) se reconoce como una medida eficaz para evaluar la asimetría intracromosómica11. Para representar mejor las asimetrías de cariotipo entre poblaciones, se recomienda un diagrama de dispersión bidimensional, con dos estimadores de asimetría colocados en los ejes x e y, respectivamente, donde cada muestra se representa como un punto11,12. Los resultados mostraron que los diagramas de dispersión bidimensionales de CVCL vs. CVCI, así como MCA vs. CVCL, ilustran eficazmente las relaciones de asimetría del cariotipo entre las ocho poblaciones distintas de Lycoris aurea (L'Herit.) Herb, apoyando la fiabilidad de estos índices en la evaluación de la asimetría cromosómica.

Para comparar los cariotipos y reconstruir las relaciones cariológicas entre las ocho poblaciones, se aplicó la metodología propuesta por Peruzzi et al.11, utilizando los parámetros x, 2n, TCL, MCA, CVCL y CVCI. Los hallazgos revelaron que las poblaciones de HBWF, GZDS, HBBD y GXTL estaban estrechamente relacionadas, con HBFC posicionado entre estos grupos. En consecuencia, el PCoA basado en estos seis parámetros demostró ser un método altamente efectivo para diferenciar las relaciones entre las ocho poblaciones. Sin embargo, ciertos patrones complejos también emergieron del árbol evolutivo molecular construido. Por ejemplo, mientras que HNZX parecía estar estrechamente relacionado con HBWF en el árbol filogenético molecular, estaba más distantemente relacionado en el diagrama de dispersión PCoA. Esta complejidad pone de manifiesto la importancia de emplear múltiples enfoques cuantitativos para predecir las tendencias en la evolución del cariotipo dentro de Lycoris, complementando las características de clasificación molecular.

Las plantas para este estudio se muestrearon en el centro y oeste de China, incluyendo el condado de Tianlin, provincia de Guangxi (GXTL), el condado de Fang, la provincia de Hubei (HBFC), el condado de Dushan, la provincia de Guizhou (GZDS), el condado de Zixing, la provincia de Hunan (HNZX), el condado de Badong, la provincia de Hubei (HBBD), el condado de Xinning, la provincia de Hunan (HNXN), el condado de Wufeng, la provincia de Hubei (HBWF) y el condado de Lushan, provincia de Sichuan (SCLS). Un ejemplar de vale se ha conservado en el Herbario de la Universidad de Huaihua. Este estudio encontró que la combinación de las señales FISH de ADNr 45S y 5S y las características del segmento CPD terminal distinguieron efectivamente todos los cromosomas mitóticos de diferentes poblaciones de Lycoris aurea (L'Herit). Hierba. El protocolo presentado aquí tiene como objetivo investigar la distribución de heterocromatina entre diferentes poblaciones de Lycoris aurea (L'Herit.) Hierba. La tinción inversa CPD (una combinación de PI y DAPI) y DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) son técnicas establecidas para observar la estructura nuclear y la distribución de la cromatina. El marcaje fluorescente directo de las regiones del gen 18S-5.8-26S rRNA (regiones 45S rDNA) y el ADN ribosómico 5S para la hibridación del cromosoma FISH es sencillo y proporciona señales de hibridación robustas. Esta distinción cualitativa será cada vez más valiosa en el análisis de diversas poblaciones.

Este método es el más adecuado para especies de plantas capaces de un cultivo rápido de la punta de la raíz, ya que el cultivo de la punta de la raíz es necesario durante la mitosis activa. Debido a la secuencia corta 5S, el estudio utilizó la secuencia de nucleótidos 1-118 pb de la región codificante del gen ARNr 5S de Arabidopsis thaliana como sonda de ADNr 5S. Debido a su secuencia corta y señal débil, este método es efectivo solo para identificar especies con bases relativamente conservadas en la región 1-118 pb del gen 5S rRNA. La selección de cromosomas en metafase con condensación moderada es crucial para el éxito del método. La condensación cromosómica está estrechamente relacionada con el momento de la recolección de raíces, la duración del pretratamiento y la cocción de la llama. Por lo tanto, la técnica requiere un control preciso sobre cada paso para garantizar el éxito experimental.

Divulgaciones

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Los autores han declarado que no existen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

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Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación de Ciencias Naturales de China (32070367).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AlcoholSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A500737-0005(70%,  90%,  100%)
1&veces; TNTSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481081&veces;, 10&veces;
2&veces; SSCSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481092&veces;, 20&veces;
45S  ADNrSangon Biotech (Shanghái) Co., Ltd.Se agrega TAMRA en ambos extremos (5 'y 3' extremos)
4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E60730320ml
5S  ADNrSangon Biotech (Shanghái) Co., Ltd.5 'end plus 6-FAM(FITC)
Adobe Photoshop softwareAdobe Systems IncorporatedCS6
Alpha bromo-naphthaleneSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A602718Saturación
Agente anti-agotamientoSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Incubadora bioquímica Vectashield H-100010 mL
Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LtdLRH-70
CelulaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42606810 g
de ácido cítricoSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A50170210 g
Formamida desionizada (FAD)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600211-0500Sulfato de dextrano 0,7
Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42822910 mL
Instrumento de hibridación in situ de fluorescenciaUSA/Abbott ThermoBriteS500-24
Microscopio de fluorescenciaOlympus  China   Co.ltdBX60
Ácido acético glacialSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A501931500 mL
HClReactivo de Aladino Co. Ltd. (Shanghai)H399657500
mL Máquina de hieloDan Ding Shanghai International Trade Co., Ltd.ST-70
Microscopio biológico LeicaAlemania Leica Instrument Co., LTDDM6000B
Alcohol metílicoSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A601617500 mL
MetMorph softwareMolecular DevicesVersión 7.35
HornoThermo Scientific™ Heratherm&comercio;THM#51028152
PectinaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A00429710 g
PepsinSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.1.07185100 g
Yoduro de propidio(PI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A4252591 g
de RNasaASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.R464210 mg
Esperma de salmón ADN(ssDNA)Reactivo de Aladina Co. Ltd. (Shanghái)D1198711 g
Citrato de sodioReactivo de Aladino Co. Ltd. (Shanghái)S18918310 g
Statistica para Windows 10.0 para análisis estadístico

Referencias

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