El laboratorio flotante: procedimiento operativo estándar para recolectar y filtrar muestras de agua de mar de transbordadores operativos para análisis de ADN ambiental

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo novedoso para recuperar eDNA marino a través de la recolección y filtración de muestras de agua de mar de transbordadores operativos y otros buques comerciales.

Resumen

Las herramientas genéticas para recuperar información de los rastros de ADN ambiental están bien establecidas para la caracterización de la biodiversidad tanto específica como taxonómicamente amplia. Sin embargo, en el contexto marino, la recolección de muestras de eDNA de áreas de difícil acceso, como aguas abisales o en alta mar, aún puede ser una limitación. El uso de transbordadores regulares o barcos comerciales que cruzan grandes extensiones de mar abierto puede constituir valiosas plataformas oportunistas para la recolección de muestras ambientales. Las ventajas son innumerables, desde la posibilidad de recopilar datos en cualquier condición meteorológica y en cualquier momento del día hasta la repetibilidad en el tiempo, siendo las rutas constantes, y con una reducción total de costes y emisiones de combustible. Trabajos anteriores han demostrado que el enfoque es posible y exitoso. Sin embargo, el proceso de adquisición de muestras de los vientres de estos grandes buques marinos puede no ser inmediato. Este trabajo ilustra con todo detalle cómo se puede preparar, organizar y llevar a cabo la recolección y el filtrado de agua de mar de grandes barcos.

Introducción

En las últimas décadas, el análisis del ADN ambiental (eDNA), es decir, la detección de material genético dejado por organismos en el medio ambiente, se ha convertido rápidamente en una herramienta prometedora de monitoreo para las comunidades de animales marinos y de agua dulce. Esta técnica molecular ofrece la posibilidad de identificar simultáneamente múltiples taxones dentro de una sola muestra (enfoque de metabarcode), permitiendo la detección de las comunidades biológicas que habitan o atraviesan el área muestreada 1,2,3,4,5.

Actualmente, el verdadero desafío es llegar a los lugares de muestreo, ya que a menudo es económica y/o logísticamente inviable recolectar muestras a grandes escalas geográficas, lo que hace que las áreas pelágicas generalmente estén submuestreadas en comparación con las áreas costeras más accesibles⁶. El uso de transbordadores u otros buques comerciales permite transectos de muestreo altamente replicables, ya que siguen rutas de envío específicas que suelen ser constantes durante la temporada y cubren grandes áreas ^7,8. Además, el uso de rutas de ferry como medio de muestreo permite la recolección de muestras en cualquier momento del día y durante todas las estaciones, independientemente del clima y las condiciones del mar, además de presentar muchas otras ventajas (Figura complementaria 1). Los estudios preliminares han demostrado tanto su viabilidad como su precisión para evaluar los índices de biodiversidad ^9,10. Las muestras de agua se pueden recolectar de la sala de máquinas del ferry a través de una tubería de derivación que intercepta el agua de enfriamiento marina aguas arriba de los motores. LIFE-CONCEPTU MARIS (Conservación de los Tejidos Submarinos y Pelágicos en el Mediterráneo: Gestión de Acciones para su Recuperación en Sostenibilidad) es el primer proyecto en el que esta prueba de concepto se ha puesto en práctica a gran escala: tiene como objetivo la recogida de 500 muestras (a lo largo de dos años), y supone la participación no de una, sino de varias compañías de transbordadores y varios transportistas. permitiendo resaltar cualquier problema crítico y refinar las estrategias de muestreo para adaptarse mejor a los contextos más diversos que se pueden encontrar a bordo. A continuación describimos las características del proyecto para su componente relacionado con la recolección a gran escala de muestras de ADN ambiental marino (para la descripción del proyecto, visite https://webgate.ec.europa.eu/life/publicWebsite/project/details/5707).

La decisión de realizar una campaña de muestreo utilizando un ferry programado implica algunas acciones que deben tomarse antes del muestreo propiamente dicho, que es el aspecto que se aborda directamente en este trabajo. Aquí, mencionamos brevemente las acciones que deben preceder al muestreo a bordo de cualquier buque comercial.

Este es un aspecto que no debe pasarse por alto y que determina el éxito de la campaña de recaudación. Las compañías navieras son entidades comerciales y no de investigación y, por lo tanto, no están ni están obligadas a estar familiarizadas con los fines y objetivos de la investigación científica que se pretende llevar a cabo a bordo. Esto implica una fase inicial importante y delicada en la que los objetivos del proyecto científico propuesto, que pueden ser multidisciplinares, deben ser transmitidos y motivados por la alta dirección de la propia naviera. En el caso específico del proyecto CONCEPTU MARIS, esto fue posible gracias a una relación de décadas en la que las compañías navieras ya habían estado involucradas en proyectos de monitoreo visual (por ejemplo, Transectos de línea fija [FLT]⁷), lo que determinó una relación de estima mutua necesaria para poder obtener la luz verde para el acceso a las salas de máquinas indispensable para el enfoque de muestreo cubierto por este trabajo.

El tipo de régimen de muestreo adoptado en el proyecto CONCEPTU MARIS es doble: las muestras se toman tanto en estaciones de muestreo fijas (FSS, ver más abajo) como con motivo de los avistamientos de cetáceos "raros". Estas representan las especies que menos se ven durante los transectos FTL¹¹, a saber: delfín común (Delphinus delphis), zifio de Cuvier (Ziphius cavirostris), calderón tropical (Globicephala melas), delfín gris (Grampus griseus), cachalote (Physeter macrocephalus) y rorcual común (Balaenoptera physalus). Se recolecta una muestra de agua adicional solo cuando el avistamiento de las especies raras reportadas por el equipo del censo visual (equipo FLT) ocurre más de media hora antes o después de uno de los FSS. Los muestreos realizados junto con los avistamientos serán necesariamente diurnos.

Las estaciones fijas de muestreo (FSS), cuya posición geográfica permanece invariable en los cruceros, se identifican de antemano y se acuerdan con todo el equipo de trabajo. Las posiciones geográficas de los SFS se seleccionan de acuerdo con 1) la presencia de un sitio de interés biológico basado en datos observacionales/bibliográficos previos; 2) prioridad dada a los puntos que indican cambios de hábitat en los mapas batimétricos (por ejemplo, borde de la plataforma continental); 3) cobertura homogénea de las rutas marítimas designadas, seleccionando así lugares de muestreo aproximadamente equidistantes (a unas 35-45 millas náuticas de distancia), con el fin de cubrir todo el recorrido y prever también la recogida de muestras nocturnas.

Con el fin de garantizar que las muestras adyacentes se tomen en diferentes momentos del día y que haya suficiente tiempo entre dos muestras consecutivas para completar el procesamiento de la muestra, es aconsejable tomar muestras de los SFS adyacentes, una en el viaje de ida y otra en el viaje de regreso. Esto significa que si los SFS se numeran según el orden cronológico en el que se muestrean, no aparecerán en orden consecutivo en el mapa. Por ejemplo, si se seleccionan 6 SFS, se muestrearán 3 en el viaje de ida y 3 en el viaje de vuelta. "Su orden a lo largo de la ruta en el mapa será PortAFSS1-FSS6-FSS2-FSS5-FSS3-FSS4-PortB, con las tres estaciones de muestreo en cursiva (FSS4, FSS5 y FSS6) que se estudiarán en el viaje de regreso (ver Figura 1).

Cada SFS tiene un número de identificación único (es decir, ninguno de los SFS identificados en diferentes rutas comparte el mismo número de identificación). La numeración se asigna la primera vez que se muestrea un SFS y se realizará una numeración consecutiva. Por lo tanto, al final del proyecto, los SFS de bajo número serán aquellos que hayan sido probados durante varios años o para los que se disponga de los datos más antiguos.

Cada muestra consta de aproximadamente 13 L de agua de mar recolectada en cada estación de muestreo. El agua de mar se decanta directamente desde la tubería de derivación del ferry a contenedores "Bag-in-the-Box" (BiB), es decir, bolsas de plástico laminadas con papel de aluminio estéril, hasta el procesamiento de la muestra (ver más abajo). Las características y ventajas del sistema de muestreo Bag-in-Box (BiBSS) son ilustradas en detalle por Valsecchi et al. (2021)⁹ y también se informan aquí en la Figura 2 para mayor comodidad.

Protocolo

1. Preparación en el laboratorio

1. Lista de verificación de equipo
   1. Consulte la lista de verificación para conocer los elementos que se deben tener en cuenta tanto para la recolección como para la filtración de muestras. Se muestra en el Archivo Suplementario 1. Cada artículo y su uso se explicarán en las secciones siguientes.
   2. Imprima una copia del Archivo complementario 1 y complételo antes de la salida para la campaña de muestreo.
2. Preparación del sistema de toma de muestras Bag-in-Box
   1. Prepare las bolsas en caja en el laboratorio, debajo de la campana extractora si es posible, antes de abordar. Selle las tres aberturas (la de la bolsa, parte de la tapa que cierra la bolsa y la salida del grifo) con una película de sellado (Figura 3, Tabla de materiales).
   2. Enrolle las bolsas, con la tapa desprendida y sellada en el interior, herméticamente y ciérrela con una cinta adhesiva para evitar que se vuelva a abrir durante el transporte (Figura 3).
   3. Realice esta operación asegurándose de no dejar entrar aire en la bolsa durante la maniobra de sellado antes mencionada, tanto (i) para evitar la posible contaminación transportada por el aire que ingresa a la bolsa como (ii) para evitar que la bolsa plegada se vuelva más voluminosa (si contiene aire).

2. Preparación a bordo

1. Coordinación con los miembros de la tripulación
   1. Tan pronto como esté a bordo, comparta los puntos de muestreo seleccionados con el capitán y su tripulación para que se indiquen los horarios en que el ferry estará más cerca de cada punto seleccionado como "Estación de muestreo fija" (FSS).
   2. Anote el tiempo de muestreo para cada SFS y la velocidad de crucero actual (o media, si está disponible) del transbordador para esa ruta: esto permite estimar la extensión (km) del tramo de mar muestreado.
   3. Como el ferry nunca pasa exactamente por el mismo punto, corrija las coordenadas de cada toma de muestras de agua de mar después del muestreo real.
      NOTA: El intervalo exacto de muestreo es el dato más importante para una identificación fiel de la zona marítima realmente muestreada; por lo tanto, es útil imprimir un mapa de los puntos aproximados donde se informan las coordenadas de muestreo reales (por ejemplo, en el Archivo Suplementario 2).
   4. Si la compañía otorga acceso a la sala de máquinas, solicite que lo acompañen a la sala.
   5. Use el equipo de protección personal (EPP) antes de ingresar a la sala de máquinas. Aquí, el entorno es inhóspito (ruido ensordecedor y altas temperaturas) y lleno de puntos potencialmente insidiosos (escaleras empinadas, grandes huecos en los pisos). Una vez obtenido el permiso para ingresar a la sala de máquinas, equipe con todo el equipo de seguridad esencial, como zapatos de seguridad, casco y auriculares de protección auditiva.
   6. Si la superficie filtrante es proporcionada por la empresa de transporte (suele ser recomendable tener una mesa plegable propia), verifique que esta área se pueda desinfectar entre muestras con una solución de lejía al 10%.
2. Instalándose en la sala de máquinas
   1. Como hay varias entradas de agua de mar en los barcos, identifíquese con el gerente de la sala de máquinas, lo que permite un camino mínimo para el agua de entrada a través de las tuberías del barco para minimizar la contaminación de la muestra de agua con sustancias y organismos que se pueden encontrar en las tuberías.
   2. Una vez que se haya identificado el punto / entrada más adecuado para recolectar el agua de mar entrante, pregunte al personal si el grifo de recolección de muestras se puede mantener ligeramente abierto durante toda la duración del crucero para enjuagar continuamente la tubería utilizada para la recolección de muestras con agua "local". Deseche el agua de mar que fluye incesantemente del grifo en la sentina.

3. Recogida de muestras de agua (en la sala de máquinas)

NOTA: La Figura 4 muestra las fases de la recolección de muestras de agua de mar.

1. Preparación para la recolección de agua
   1. Lleve todo el equipo necesario (primera parte de la lista de verificación del Archivo Suplementario 1 ) a la sala de máquinas. Llegue a la sala de máquinas al menos 15 minutos antes de la hora de muestreo planificada para esterilizar el área donde se manipulan los BiB con una solución de lejía al 10%.
   2. Si el grifo dedicado no se ha dejado abierto durante todo el crucero, ábralo para la recolección de muestras de agua de mar y deje correr el agua durante al menos 5 minutos (el agua se elimina en la sentina) antes de la extracción real (Figura 4A).
   3. Prepare la estación de filtrado.
      NOTA: Hay varias medidas en la configuración de la estación de filtrado que pueden mejorar significativamente la eficiencia de la filtración (ver paso 4.3): 1) use matraces de vacío de alta capacidad (matraz de 2 L, 4 L o 5 L, según el volumen a extraer). Esto, además de ahorrar el tiempo necesario para vaciar el matraz entre 1 L y el siguiente, minimiza la manipulación del cilindro de filtración y, por tanto, cualquier contaminación; 2) se pueden utilizar múltiples matraces filtrantes dispuestos en serie, medida que permite la filtración simultánea de múltiples muestras (bolsas). Esta medida se recomienda en regímenes de muestreo estrictos, donde de lo contrario existe el riesgo de no tener el tiempo necesario para procesar los sacos antes de llegar al puerto de atraque.
   4. Utilice un marcador permanente para preparar y etiquetar el BiB escribiendo en él: 1) el código de identificación alfanumérico único de la muestra en ambos lados del BiB (importante especialmente si los BiB no se procesan inmediatamente a bordo y se filtran en tierra) 2) la fecha; 3) el momento exacto de comenzar a llenar el dorsal.
2. Recogida de agua
   1. Retire la película de sellado de la abertura del babero y comience a llenarlo hasta que esté completamente lleno (aproximadamente 13 L) (Figura 4B).
   2. Cuando la bolsa esté casi llena, retire la película de sellado de la tapa, pero no de la abertura del grifo: mantenga la película de sellado alrededor del grifo segura (lengüeta de plástico roja) hasta la filtración (Figura 4C). Selle el babero con la tapa, presionándolo firmemente hasta que esté completamente cerrado.
   3. Tome nota de la hora exacta en que se completa la recolección de muestras: permite calcular la duración total (minutos) de la recolección de muestras.
3. Después de la recolección de agua
   1. Escriba con el marcador permanente en el BiB la hora exacta en que se completa la recolección de muestras e informe todos los datos en el formulario de recolección / filtración de muestras (Archivo complementario 2).
   2. Transfiera el BiB lleno a la sala de almacenamiento o al área de filtración (un espacio dedicado en la propia sala de máquinas o en una cabina).
   3. Transfiera todos los datos en el formulario de recolección/filtración de muestras (Archivo complementario 2).
      NOTA: El archivo complementario 2 muestra la hoja de recolección/filtración de muestras que se completará a bordo en todas sus partes.
      1. Para la parte relativa a la recogida de la muestra (verde), indíquense las horas de inicio y finalización del muestreo de agua de mar de la sala de máquinas.
      2. En segundo lugar, después de consultar con los miembros de la tripulación o los registros GPS, ingrese las coordenadas geográficas relativas al comienzo y al final del muestreo y la velocidad de crucero. Esto le permite calcular posteriormente la longitud del segmento marino muestreado.
         NOTA: En cuanto a la parte relativa al filtrado (azul), se indicará si la filtración se produce a bordo o posteriormente en tierra: se indicarán los tiempos de filtrado para cada uno de los 3 filtros.

4. Filtración de muestras de agua de mar

1. Prepárese para la filtración
   NOTA: A partir de este momento, el proceso de filtración se puede gestionar de acuerdo con diferentes protocolos en función de los objetivos específicos del proyecto de investigación. El protocolo descrito aquí permite la filtración eficiente de una gran cantidad de agua de mar (más de 10 litros) directamente a bordo, evitando las limitaciones de volumen inherentes a otros kits o protocolos comerciales de uso común. Cuando sea posible, filtre las muestras de agua a bordo: la filtración puede realizarse en la propia sala de máquinas o en una cabina, preferiblemente ubicada cerca de la sala de máquinas. Siempre es deseable filtrar las muestras de agua de mar inmediatamente después de la recolección, tanto para limitar la degradación del eDNA como por conveniencia, evitando así desembarcar con grandes volúmenes de agua de mar para ser procesada. Si no es posible, las muestras pueden almacenarse en los contenedores Bag-in-Box y transportarse para ser filtradas posteriormente.
   1. En el espacio previsto dedicado a la filtración a bordo (en la sala de máquinas o en una cabina dedicada), prepárese con todo lo que figura en la segunda parte de la lista de comprobación en el Archivo complementario 1 y monte el sistema de filtrado como se muestra en la Figura 5.
   2. Prepare el cilindro de filtración (Tabla de materiales) como se muestra en la Figura 6 y la Figura 7. Use un cilindro nuevo para cada estación, un nuevo par de pinzas de un solo uso o un par de esterilizadas.
      NOTA: Un solo cilindro se puede usar varias veces para filtrar muestras de la misma ubicación. Sin embargo, debe esterilizarse con lejía al 10%, seguido de enjuague con agua dulce, antes de dejarlo secar al aire en el laboratorio y luego empaquetarlo individualmente para almacenarlo hasta la próxima campaña.
   3. Antes de iniciar la filtración, rellene el registro de datos de recogida/filtración de muestras (Archivo complementario 2). Esto es necesario tanto para realizar un seguimiento del número de litros procesados como para medir el tiempo de filtrado (indicativo de la cantidad de partículas en la muestra). Tan pronto como se active la bomba de vacío, inicie el temporizador para medir el tiempo de filtrado.
2. Filtración a bordo
   1. Para minimizar el riesgo de contaminación (especialmente cuando se procesan varias bolsas simultáneamente, ver más abajo), aísle el flujo de agua que se filtrará del entorno circundante colocando una manga aislante (bolsa de plástico) entre el grifo y el cilindro filtrante (ver Figura 7).
      NOTA: Esta es una precaución importante ya que la sensibilidad de las tecnologías utilizadas para el análisis del ADN ambiental hace que el enfoque sea particularmente susceptible a la contaminación ambiental (del operador o la contaminación cruzada entre muestras).
   2. Active la bomba de vacío y filtre hasta 4 L de agua por cada filtro. Mantenga el cilindro siempre lleno durante la filtración para evitar que entre aire en el sistema y ralentice el proceso de filtración.
      NOTA: En cuanto a la elección de la porosidad de la membrana, esta depende del propósito de la investigación, los grupos taxonómicos objetivo y la cantidad de agua que se pretende procesar. Este tema ha sido tratado en trabajos anteriores ^9,12.  en el que se compararon filtros de diferente porosidad. Para el estudio de vertebrados y la elección de procesar 4 litros de agua por filtro, una membrana con una porosidad de 0,45 μm resultó ser la mejor solución, permitiendo procesar grandes volúmenes de agua sin causar desorden en el filtro debido a la saturación de los poros.
   3. Cuando el nivel del agua filtrada dentro del matraz alcance la marca de nivel de 4 L, apague la bomba de vacío y detenga el temporizador, informando el valor del tiempo de filtrado en el registro de datos.
      NOTA: De cada BiB de 12/13 L, se obtendrán 3 réplicas técnicas, de 4 L cada una (denominadas A, B y C).
   4. En este punto, utilizando las pinzas (y, si es necesario, un palillo estéril para ayudar a levantar el borde del filtro), recupere el primer filtro (filtro A) del cilindro, como se muestra en la Figura 8, evitando cualquier posible daño al filtro.
   5. Dobla el filtro por la mitad (con el lado que retenía el material biológico doblado sobre sí mismo) y envuélvelo en papel de aluminio, escribiendo inmediatamente el número de muestra y la identificación de la réplica del filtro (por ejemplo, 15A) en la envoltura. Guárdelo en el congelador de a bordo hasta el desembarco.
   6. Monte un nuevo filtro (filtro B) dentro del cilindro de filtración para procesar otra muestra de 4 L (Figura 9). Vacíe el matraz y comience de nuevo filtrando la segunda réplica hasta que 4 L estén completamente filtrados. Recupere el filtro B como se explica y repita los mismos pasos para el filtro C.
3. Buenas prácticas
   1. Para acortar los tiempos de filtrado, utilice un matraz de vacío grande capaz de acomodar toda el agua filtrada procesada a través de un solo filtro (por lo tanto, en este caso, al menos 4 L de capacidad).
   2. Reduzca considerablemente los tiempos de filtrado filtrando varias bolsas simultáneamente disponiendo el aparato de filtrado en paralelo (es decir, múltiples matraces de vacío atendidos por una sola bomba).
      NOTA: En la campaña CONCEPTU MARIS se adoptaron ambas estrategias (Figura 10). Tenga en cuenta que maximizar la eficiencia del filtrado es muy importante ya que la cantidad de muestras recolectadas a lo largo de una ruta puede ser grande. Por lo tanto, es necesario procesar los sacos en poco tiempo para evitar acumular muestras con el riesgo de tener que desembarcar los sacos si no hay tiempo suficiente para procesarlos a bordo.
   3. Con el fin de controlar la incidencia de falsos positivos (contaminación), incluir en el procedimiento de filtrado, al menos una vez por crucero, una "bolsa en blanco", filtrando en paralelo con las muestras una bolsa llena de agua potable extraída de botellas selladas. Esta muestra de control no requiere réplicas y la trata como el resto de las muestras y la incluye en la ejecución de NGS.
4. Almacenamiento y transporte de filtros
   1. Después de la filtración, almacene todos los filtros entre -4 °C y -20 °C hasta su posterior procesamiento en laboratorio.
   2. Recoja las muestras del congelador a bordo justo antes del desembarque y prepárelas para el transporte a bajas temperaturas utilizando refrigeradores transportables, como se muestra en la Figura 11.
      NOTA: Si las muestras no se filtran a bordo, las bolsas de agua de mar se transportan de manera más segura si se mantienen verticalmente con la tapa sostenida en la parte superior, sostenidas en pares dentro de bolsas de compras dentro de cajas de plástico para facilitar el transporte (Figura 12).

Resultados

Al ejecutar el protocolo como se describe, el operador recopilará un número de filtros igual al número de FSS multiplicado por 3 réplicas. Cada filtro conserva trazas biológicas (ADN ambiental) en uno de los dos lados. Los pasos analíticos posteriores a la extracción de eDNA dependen en gran medida de la pregunta de investigación, el objetivo y el objetivo. Por ejemplo, en el estudio piloto de Valsecchi et ^al.9, el protocolo de recolección de eDNA descrito permitió el diseño de un estudio de megaf...

Discusión

Como los pasos del protocolo son simples y directos, hay algunas consideraciones relevantes a considerar cuando se trabaja en transbordadores comerciales. La tubería de derivación de agua de enfriamiento generalmente se encuentra en el área de la sala de máquinas, cuyo acceso puede estar restringido o sujeto a autorización previa. Por lo tanto, asegurarse de contar con dicha autorización, junto con el equipo de protección personal adecuado, es fundamental (Figura 4

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Membranas filtrantes de 4,7 cm de diámetro	Biosigma S.p.A.	https://www.biosigma.com/	Membranas filtrantes de 0,45 μ m porosidad, empaquetado individualmente
Frascos de vacío de 4/5 L	Duran	https://www.duran-bottle-system.com/	5 L Frasco de vidrio con tapón
Almohadillas de papel absorbente	Advantec MFS, Inc.	https://www.advantecmfs.com/category/absorbent-pads-1	Almohadillas absorbentes de papel de filtro, tamaño 47 mm.
Bag-in-Box (BiB)	G.M.V. Agricenter S.r.l.	https://www.gmvagricenter.it/	10 litros bolsas en caja con grifo
Cilindros filtrantes	Sartorius AG	https://shop.sartorius.com/in/industrial-microbiology-filtration-devices/biosart-100-monitors/p/M_Biosart_100_Monitors#	Biostart 100 Cilindros de monitor, con 0.45 μ M Membrana incluida
Película de sellado	Merck	https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/sigma/hs234526a?utm_source=bing&utm_medium= cpc& utm_campaign=Todos+product_ dsa_WW_%28bing+ebizpfs%29& utm_id=626946489& utm_content= 1166583023365595& msclkid= d2b55b82440b1aef56fc3ca803c 6486f& utm_term=%2Fproducto%2F	rollo de 4 pulgadas x 125 pies de película de sellado de laboratorio
Bomba de vacío	portátil KNF Group	https://knf.com/en/us	Laboport N. 96