Medición de la actividad enzimática de las enzimas desubiquitilantes asociadas a trastornos del neurodesarrollo mediante un ensayo de escisión de la cadena de ubiquitina in vitro

Resumen

Este protocolo explica cómo medir el efecto de la variación genética asociada con los trastornos del neurodesarrollo sobre la actividad de la enzima desubiquitilante mediante la combinación de la purificación de proteínas recombinantes con ensayos de escisión de la cadena de ubiquitina.

Resumen

Los trastornos del neurodesarrollo (NDD, por sus siglas en inglés) se asocian con alteraciones en la función del sistema nervioso, pero a menudo siguen siendo poco conocidos a nivel molecular. Los trastornos discretos causados por genes individuales proporcionan modelos para investigar los mecanismos que impulsan el neurodesarrollo atípico. Las variantes de los genes que codifican proteínas de la familia de la enzima desubiquitilante (DUB) se asocian con varios NDD, pero es necesario determinar los mecanismos patogénicos de los trastornos impulsados por estas variantes genéticas. El impacto de las variantes genéticas en la actividad de DUB puede determinarse experimentalmente mediante un ensayo de escisión de ubiquitina in vitro independiente del sustrato. Este ensayo no requiere conocimiento de los sustratos aguas abajo para medir directamente la actividad catalítica. Aquí, el protocolo para determinar el impacto de las variantes genéticas en la actividad enzimática se modela utilizando la proteasa específica de ubiquitina DUB 27, ligada al cromosoma X (USP27X), que está mutada en la discapacidad intelectual ligada al cromosoma X 105 (XLID105). Esta línea experimental se puede utilizar para aclarar los mecanismos subyacentes a los trastornos del neurodesarrollo impulsados por variantes en los genes DUB.

Introducción

Los trastornos del neurodesarrollo (TND) surgen de diversas etiologías con determinantes ambientales o genéticos que impulsan el desarrollo atípico del sistema nervioso¹. Las pruebas genéticas de secuenciación de próxima generación han relacionado un número cada vez mayor de variantes en genes relacionados con el sistema de ubiquitina con NDD genéticos². El sistema de ubiquitina cataliza la ligadura del pequeño modificador de proteínas ubiquitina a residuos de lisina principalmente en sustratos de proteínas para impulsar cambios en el comportamiento celular, incluida la localización, la estabilidad, las interacciones proteína-proteína o la actividad³. La ubiquitilación está mediada por las enzimas E1 activadoras, E2 conjugadoras y E3 ligasas⁴ y es reversible por la actividad de las enzimas desubiquitilantes (DUB) que catalizan la escisión y la eliminación de la ubiquitina de los sustratos proteicos⁵. La ubiquitina se puede ligar al sustrato como un monómero (monoubiquitilación) o cadenas poliméricas (poliubiquitilación) que se forman en cualquiera de los siete residuos de lisina (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) o el residuo M1 de la ubiquitina. Estas diferentes topologías de cadena de ubiquitina y sus combinaciones crean un código celular que es clave para la transducción de señales⁶.

Los DUB como USP27X, USP7, USP9X, USP48, STAMBP, OTUD4, OTUD6B y OTUD5 se han asociado con los NDD 2,7,8,9,10,11. Para la mayoría de los NDD, los mecanismos moleculares que impulsan la patogénesis siguen sin definirse experimentalmente. Algunos de los DUB que impulsan los trastornos recientemente descritos son poco conocidos y carecen de lecturas celulares conocidas que puedan usarse para evaluar el impacto de la variación genética en la función de las proteínas. In vitro, los ensayos de escisión de la cadena de ubiquitina superan esta limitación como lecturas de actividad DUB independientes del sustrato que pueden medir el impacto de las variantes genéticas en la actividad enzimática¹².

Los ensayos de escisión de ubiquitina in vitro se han utilizado desde la década de 1980. Estos ensayos con sustratos radiomarcados permitieron el descubrimiento de los primeros DUBs, incluyendo la isopeptidasa, identificada por su capacidad de deubiquitilado la histona H2A¹³, y la ubiquitina carboxilo hidrolasa terminal (UCH), identificada por su capacidad de hidrolizar ubiquitina a partir de una variedad de conjugados químicos 14,15,16. Además, se utilizaron proteínas o péptidos poliubiquitilados de longitud completa radiomarcados para identificar la isopeptidasa T y varias UCHs y proteasas específicas de ubiquitina (UBPs) de eritrocitos y músculo esquelético, respectivamente 17,18,19,20. Se utilizaron por primera vez cadenas de ubiquitina de una longitud y un tipo de enlace definidos (tetra-ubiquitina ligada a K48) para medir la actividad DUB de la isopeptidasa T²¹. Desde entonces, este ensayo se ha convertido en el estándar de oro para medir la actividad de DUB en análisis mutacionales^22,23. El refinamiento de este ensayo permite actualmente la visualización de la escisión de ubiquitina a través de electroforesis y tinciones de gel convencionales como el azul de Coomassie, el naranja SYPRO, el rubí y la tinción de plata o la detección fluorescente o basada en inmunotransferencia^12,24. Los aspectos moleculares de la actividad de DUB, como la longitud mínima de la cadena y la especificidad del enlace 25,26,27,28, pueden aclararse mediante el uso de cadenas de ubiquitina de diferentes longitudes (por ejemplo, di-, tri-, tetra-ubiquitina) y enlaces (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63, lineales) en ensayos funcionales. Las variantes asociadas a NDD pueden conducir a defectos de actividad DUB que son específicos del tipo de enlace de la cadena de ubiquitina¹¹.

Un ensayo de escisión de diubiquitina utilizando proteínas DUB recombinantes purificadas puede medir directamente el impacto de las variantes de NDD en la actividad de DUB. USP27X, que está mutado en el trastorno de discapacidad intelectual ligado al cromosoma X NDD 105 (XLID105)^7,28 modela el proceso que aquí se presenta. Este enfoque permite determinar cómo la actividad de DUB se ve interrumpida por variantes genéticas en NDD asociados a DUB existentes y desconocidos.

Protocolo

El siguiente protocolo se puede adaptar para proteínas recombinantes utilizando varias etiquetas de afinidad expresadas en diferentes cepas de células competentes. Dependiendo de la proteína que se exprese, las condiciones de cultivo y expresión nocturna pueden requerir la optimización de la OD₆₀₀ en la inducción de la expresión, el tiempo de expresión, la temperatura de expresión y la concentración de IPTG. En la Figura 1 se ilustra una descripción general del protocolo. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Transformación de células competentes de Rosetta 2 E. coli con el plásmido de expresión recombinante GST-USP27X

NOTA: Para mantener la esterilidad del cultivo bacteriano, realice pasos en los que los recipientes de medios estén abiertos bajo una llama de mechero Bunsen. Para permitir una transferencia óptima de oxígeno, realice la agitación del cultivo bacteriano en un agitador de temperatura controlada de sobremesa con una órbita de 19 mm a 50 mm y una velocidad de 200 rpm²⁹.

1. Descongele 20 μL de células de Rosetta 2 E. coli químicamente competentes en hielo inmediatamente antes de usar. Añadir 1-10 ng del plásmido de expresión pGEX6P1-USP27X (que codifica para la glutatión-S-transferasa N-terminal (GST)³⁰ -marcado con USP27X y que contiene resistencia a la ampicilina) e incubar 5 min en hielo.
2. Choque térmico durante 30 s a 42 °C en baño seco. Incubar en hielo durante 2 min.
3. Agregue 80 μL de medio SOC a temperatura ambiente (RT). Incubar durante 60 min a 37 °C con rotación de 200 rpm en un agitador de sobremesa de 19 mm con control de temperatura.
4. Placa de 50 μL de cultivo en una placa de agar LB suplementada con 25 μg/L de cloranfenicol y 50 μg/L de ampicilina. Incubar durante 20 h a 37 °C con la tapa hacia abajo en una incubadora con temperatura controlada.

2. Expresión bacteriana nocturna de proteína recombinante a partir de plásmido de expresión

NOTAS: Para mantener la esterilidad del cultivo bacteriano, realice pasos donde los recipientes de medios estén abiertos bajo una llama de quemador Bunsen. Para permitir una transferencia óptima de oxígeno, realice la agitación del cultivo bacteriano en un agitador de temperatura controlada de sobremesa con una órbita de 19 mm a 50 mm y una velocidad de 200 rpm²⁹. Mida el diámetro exterior del cultivo₆₀₀ con un espectrofotómetro.

1. Prepare 1 L de medio Terrific Broth (TB) añadiendo 47,6 g de TB Powder a 1 L de agua ultrapura con 0,4% de glicerol en un matraz de cultivo con deflector de 2 L. Medio de autoclave durante 30 min y enfriamiento a RT.
2. Elija una sola colonia de bacterias transformadas y agregue 10 mL de medio LB estéril suplementado con 25 μg/L de cloranfenicol y 50 μg/L de ampicilina. Incubar durante 20 h a 37 °C con rotación de 200 rpm en un agitador de sobremesa de 19 mm con control de temperatura.
3. Añadir 10 mL de cultivo durante la noche a 1 L de medio TB suplementado con 25 μg/L de cloranfenicol y 50 μg/L de ampicilina (proporción 1:100 entre el cultivo inicial y el cultivo de expresión). Incubar a 37 °C con una rotación de 200 rpm en un agitador de sobremesa de 19 mm de órbita con control de temperatura hasta que el diámetro exterior de_{cultivo 600} esté entre 0,5 y 0,6.
4. Añadir 50 μM de IPTG al cultivo para inducir la expresión, enfriar a 16 °C e incubar durante 20 h a 16 °C con una rotación de 200 rpm.
5. Células granuladas de cultivo de expresión por centrifugación durante 20 min a ≥3.000 x g y 4 °C. Almacene el pellet a -80 °C durante al menos 1 h.
   NOTA: En este punto, el experimento se puede pausar y reiniciar más tarde (preferiblemente la misma semana). El pellet se puede almacenar a largo plazo a -80 °C.

3. Purificación de proteínas por columna de afinidad de flujo por gravedad

NOTA: La resina, el aglutinante, el lavado, la elución y los tampones de almacenamiento apropiados para cada purificación dependerán de la proteína recombinante que se purifique. Recoja muestras de las fracciones de pellets de celda, sobrenadante, flujo, lavado y elución en tampón SDS-PAGE. Realice la tinción SDS-PAGE y Coomassie de las muestras para evaluar el éxito de la purificación. Realizar la purificación a 4 °C y manipular fracciones en hielo. La escisión de las etiquetas de proteínas se puede realizar dentro o fuera de la columna utilizando la proteasa adecuada para dirigirse al sitio de escisión específico de la proteasa relevante.

1. Asegure la columna de flujo por gravedad vacía en el soporte de retorta y llénela con resina de glutatión agarosa. Utilice 2-3 mL de resina para purificar un pellet celular recogido de 1 L de cultivo de expresión.
2. Lave la columna con un volumen de lecho de resina de etanol al 20%. Lave la columna 3 veces con un volumen de lecho de resina de tampón MS500 (20 mM de Tris pH 7,5, 500 mM de NaCl, 0,5 mM de TCEP). Detenga la columna para que la resina permanezca cubierta con tampón para evitar que se seque mientras prepara el pellet de celda.
3. Descongele el pellet de celda a 4 °C. Añada 30 mL de tampón MS500 (20 mM de Tris pH 7,5, 500 mM de NaCl, 0,5 mM de TCEP, 60 mg de lisozima y un comprimido de inhibidor de la proteasa) al pellet descongelado. Lisar durante 30 min a 4 °C con una rotación suave de extremo a extremo.
4. Sonicar células lisadas en un tubo de centrífuga de 50 ml o en un vaso de precipitados metálico sobre hielo hasta que el lisado fluya libremente cuando se dispense desde la punta de una pipeta. Centrifugar durante 30 min a 4 °C y ≥20.000 x g para eliminar el sobrenadante.
   NOTA: Determine empíricamente los ajustes del sonicador. Configure el sonicador de manera que 120 s de tiempo total sean suficientes para reducir el lisado viscoso a un líquido transparente y de flujo libre.
5. Decantar el sobrenadante en un vaso de precipitados y cargar el lisado aclarado en la columna. Pase el lisado a través de la columna por flujo por gravedad mientras recoge el flujo a través. Cargue la columna con el flujo recopilado y pásela por la columna.
6. Lave la columna con al menos dos volúmenes de lecho de resina de tampón de lavado MS500 (20 mM de Tris pH 7,5, 500 mM de NaCl, 0,5 mM de TCEP) 5 veces. Recoja el flujo de lavado en fracciones de 5 mL. Añada 1 μL de cada fracción a 100 μL de reactivo Bradford para comprobar visualmente la presencia de proteínas. Lavar hasta que la proteína no unida ya no esté presente en el último lavado, agregando pasos de lavado adicionales si es necesario.
7. Recupere la proteína haciendo pasar el tampón de elución MS500 (tampón MS500 suplementado con 10 mM de glutatión y 10 mM de NaOH) a través de la columna, recogiendo fracciones de elución de 5 mL. Compruebe la presencia de proteínas añadiendo 1 μL de eluido a 100 μL de reactivo Bradford. Deje de recolectar fracciones cuando el reactivo de Bradford ya no indique que hay proteínas presentes.
8. Realizar el intercambio de tampones por precipitación y centrifugación. Precipitar la proteína añadiendo 2 volúmenes de 4 M de sulfato de amonio al eluido, invirtiendo suavemente hasta que esté turbio, y luego centrifugando durante 30 min a 4 °C y ≥20.000 x g y de nuevo durante otros 5 min. Retire el sobrenadante después de cada centrifugación sin alterar la pastilla de proteína.
9. Vuelva a disolver y almacenar proteínas en MS500 suplementado con 25% de glicerol. Almacene los gránulos de proteína o la proteína en un tampón de almacenamiento a -80 °C.

4. Ensayo de escisión de la cadena de ubiquitina in vitro

NOTA: Seleccione la longitud de la cadena de ubiquitina y los tipos de enlace en función de la especificidad de DUB descrita en informes anteriores³¹ o determinada empíricamente. Si fuera necesario, este protocolo podría utilizarse para probar la actividad del DUB de tipo salvaje de interés en un panel de cadenas de ubiquitina disponibles comercialmente de longitud y tipo de enlace definidos. Se puede utilizar una cantidad de cadena de diubiquitina de 375-750 ng y una concentración de DUB de 1-2 μM como puntos de partida para el ensayo²⁷.

1. Prepare 10 tampones de activación DUB (500 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM de NaCl y 100 mM de TCEP).
2. Para cada punto de tiempo para cada DUB, prepare 10 μL en total de 2 μM de GST-USP27X purificado en 1x tampón de activación DUB (mezcla DUB). Prepara mezclas maestras y divídelas en puntos de tiempo.
3. Incuba la mezcla DUB durante 10 minutos en RT.
4. Añada 7 μL de tampón de carga SDS-PAGE al tiempo 0 antes de añadir las cadenas de ubiquitina para evitar que se inicie la reacción de deubiquitilación.
5. A cada punto de tiempo para cada DUB, agregue 375 ng de cadenas de di-ubiquitina K-63 diluidas en 10 μL 1x tampón de activación DUB. El volumen total es de 20 μL por reacción.
6. Incubar los tubos a 30 °C, deteniéndose en cada punto de tiempo con 7 μL de tampón de carga SDS-PAGE.
7. Realice SDS-PAGE con un gel de gradiente de 4%-12% e inmunoblot ^7,32 para ubiquitina y USP27X para analizar el cambio en la presencia de mono-ubiquitina en puntos de tiempo seleccionados.

Figura 1: Esquema del diseño del estudio. (A) Transformación de células competentes de E. coli con plásmido de expresión de proteínas recombinantes. (B) Expresión bacteriana durante la noche de la proteína deubiquitilasa recombinante. (C) Purificación de proteínas de desubiquitilasa recombinante utilizando una columna de afinidad de flujo por gravedad. (D) Ensayo de escisión de la cadena de ubiquitina in vitro para evaluar la actividad desubiquitilante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

Para determinar el impacto de las variantes asociadas a la XLID105 en la actividad catalítica de USP27X, se purificaron a partir de bacterias las proteínas USP27X de tipo salvaje marcadas con GST y las variantes asociadas a XLID105 F313V, Y381H y S404N USP27X. Estas variantes se encuentran dentro del dominio catalítico USP de USP27X (Figura 2A). Debido a que se informó previamente que USP27X escinde las cadenas de ubiquitina^{K63 31}, las proteínas USP27X de tipo salvaje y las variantes asociadas a la XLID105 F313V, Y381H y S404N USP27X se incubaron con cadenas de di-ubiquitina unidas a K63 durante 1 h. Estas muestras se separaron mediante SDS-PAGE³², y las proteínas ubiquitina y USP27X se analizaron mediante inmunotransferencia. El USP27X de tipo salvaje induce la escisión de la di-ubiquitina, generando monoubiquitina (Figura 2B y Figura 1 complementaria). Las proteínas variantes F313V, Y381H y S404N USP27X asociadas a XLID105 no escindieron estas cadenas. Debido a que las variantes F313V, Y381H y S404N interrumpen la actividad catalítica de USP27X, la interrupción funcional de USP27X parece ser el principal mecanismo subyacente XLID105⁷. Anteriormente se habían reportado cuantificaciones adicionales y experimentos complementarios⁷.

Figura 2: Impacto de las variantes de XLID105 en la actividad desubiquitilante de USP27X. (A) Diagrama de la estructura de la proteína USP27X humana, que muestra el número de residuos y la ubicación de las variantes XLID105 evaluadas en el dominio USP (púrpura). (B) Las variantes USP27X y XLID105 de tipo salvaje marcadas con GST (F313V, Y381H y S404N) se incubaron con cadenas de di-ubiquitina K63 durante los tiempos indicados. El análisis de inmunoblot se realizó con anticuerpos anti-GST (USP27X) y ubiquitina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Manchas sin recortar de la Figura 2B. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este artículo presenta un protocolo para la expresión y purificación de DUBs USP27X recombinantes y un ensayo in vitro de escisión de la cadena de ubiquitina para comparar la actividad desubiquitilante de USP27X de tipo salvaje y proteínas variantes asociadas a NDD. Este ensayo determinó que las variantes asociadas a XLID105 interrumpen la actividad catalítica de USP27X⁷. Este conocimiento mecanicista nos ayudó a definir XLID105 como un trastorno de disrupción funcional USP27X.

Este protocolo se puede adaptar a otros DUBs que están asociados a enfermedades genéticas con mecanismos moleculares poco conocidos. La optimización del protocolo de expresión y purificación para un DUB específico de interés es crucial. Si no se han descrito protocolos específicos para un DUB determinado de interés, el método descrito aquí puede actuar como punto de partida. Al optimizar un protocolo de expresión y purificación de proteínas, los pasos críticos incluyen la selección de los parámetros apropiados para (1) el sistema de expresión (por ejemplo, cepas de bacterias, células de insectos o células de mamíferos), (2) los vectores de expresión, (3) la etiqueta y la resina de afinidad que se utilizará, (4) las condiciones de crecimiento, (5) las cantidades de cultivo y (6) la necesidad de una mayor purificación (por ejemplo, mediante exclusión de tamaño o cromatografía de intercambio iónico). Se han discutido recomendaciones específicas para estos y otros aspectos del método³³.

El ensayo de escisión de la cadena de ubiquitina in vitro es una forma sencilla de medir la actividad desubiquitilante de los DUB de tipo salvaje o mutantes. Un análisis dependiente del tiempo de la escisión de ubiquitina puede proporcionar información sobre los efectos de la variación genética en la cinética enzimática de DUB al permitir la determinación de parámetros como K,_m y V_max. Esto permitiría distinguir entre los defectos en el sitio activo DUB que perjudican la catálisis (reducción de V_máx.) y los que perjudican el reconocimiento del sustrato (aumento de K_m). La versatilidad de este ensayo se deriva de la variedad de cadenas de ubiquitina que se pueden utilizar para proporcionar información mecanicista distinta sobre un DUB de interés. Las cadenas de ubiquitina de diferentes longitudes y topologías de enlace están disponibles comercialmente, lo que hace que este ensayo sea accesible para los no expertos. Los DUB específicos tienen propiedades únicas para la cinética enzimática, el reconocimiento de enlaces y la escisión. Los pasos críticos para este ensayo incluyen (1) definir una concentración de trabajo del DUB, (2) determinar el tiempo de reacción óptimo, (3) elegir el tipo y la longitud del enlace de la cadena de ubiquitina y (4) seleccionar un método de detección.

Los ensayos de escisión de la cadena de ubiquitina miden el impacto de las variantes de NDD en la actividad de DUB ^7,11, lo que ayuda a identificar las variantes que interrumpen la actividad de DUB e impulsan el desarrollo atípico. Este ensayo se puede utilizar en una variedad de situaciones en las que la variación genética impulsa la patología, incluidos el cáncer y la neurodegeneración. Al tratarse de un ensayo independiente del sustrato, no se requiere la identificación previa de un sustrato proteico ubiquitilado específico. Sin embargo, el ensayo se limita a medir los cambios en la actividad de escisión de la cadena de ubiquitina y no puede evaluar los efectos de las variantes sobre las funciones de DUB, como las interacciones proteína-proteína, la localización subcelular y las modificaciones postraduccionales. La identificación de las vías de señalización generales en las que opera un DUB de interés es necesaria para desarrollar ensayos específicos que aborden la forma en que estas variantes impulsan NDD discretas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Amersham Protran 0.45 NC 200 mm × 200 mm 25/PK	Cytiva	10600041
Sulfato de amonio	Fisher Scientific	AC205872500
Ampicilina	Fisher Scientific	BP1760 25
Anti-Ubiquitina (monoclonal de ratón)	Biolegend	Cat# 646302, RRID:AB_1659269	(WB: 1:1000)
Anti-GST (Policlonal de oveja)	MRC-PPU Reactivos y servicios	Cat# S902A Tercera purga	(WB: 1:1000) https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/
Deflector Frascos de cultivo	L Fisher Scientific	10-042-5N
Bradford Reactivo	Millipore Sigma	B6916-500ML
Cloranfenicol	Gold Biotechnology	C-105-25
Completo, Tabletas Inhibidoras de la Proteasa	Millipore Sigma
Econo-Columna 1.5 × 5 cm	Bio-Rad	7371507
Eppendorf ThermoMixer F1.5	Eppendorf	5384000020
Excel	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
Glycerol	Genesee Scientific	18-205
Illustrator	Adobe		https://www.adobe.com/products/illustrator.html
Image Studio	LI-COR Biosciences		https://www.licor.com/bio/image-studio/
Inkscape	Inkscape		https://inkscape.org/
Invitrogen 4-12% NuPAGE 1mm 12 pocillos	gel Thermo Fisher Scientific	NP0322BOX
IPTG (Isopropil-b-D-Tiogalactopiranósido)	Genesee Scientific	20-109
IRDye 800CW Burro anti-Cabra Anticuerpo Secundario IgG	LI-COR Biosciences	Cat# 926-32214	(WB: 1:10000)
IRDye 800CW Burro anti-ratón Anticuerpo secundario IgG	LI-COR Biosciences	Cat# 926-32212	WB: 1:10000)
Isotemp Baño seco digital	Fisher Scientific	88860022
K63 Di-Ubiquitin	South Bay Bio LLC	SBB-UP0072
LB Agar	Genesee Scientific	11-119
LB Caldo	Genesee Scientific	11-118
Lysozyme	Gold Biotechnology	L-040-100
MaxQ 4000 Agitador orbital de sobremesa	Thermo Fisher Scientific	SHKE4000-7
MES-SDS Tampón de funcionamiento	Boston Bioproducts Inc	BP-177
Mini Rotador de tubos	Fisher Scientific	88-861-051
NuPage LDS Tampón de muestras 4x	Thermo Fisher Scientific	NP0007
Odisea  Fc Imager	LI-COR Biosciences	43214
PageRuler Plus Ladder Thermo	Fisher Scientific	26620
pGEX6P1 humano USP27X	MRC-PPU Reactivos y servicios	DU21193	https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/
pGEX6P1 humano USP27X F313V	Addgene	225715	Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
pGEX6P1 humano USP27X S404N	Addgene	225717	Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
pGEX6P1 human USP27X Y381H	Addgene		225716 Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
Pierce Glutathione Agarose	Thermo Fisher Scientific	16100
PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo)	Gold Biotechnology	P-470-10
Polysorbato 20 (Tween 20)	Fisher Scientific	AC233360010
Rosetta 2 Células Competentes	Millipore Sigma	71402-M
SimplyBlue SafeStain	Thermo Fisher Scientific	LC6060
SmartSpec 3000	Bio-Rad	170-2501
SOC medio	Thermo Fisher Scientific	15544034
Cloruro de sodio	Genesee Scientific	18-216
Sonificador 250	Branson	100-132-135
Centrífuga Sorvall RC 6 Plus	Thermo Fisher Scientific	46910
TCEP (Clorhidrato de tris-(carboxietil) fosfina)	Gold Biotechnology	TCEP10
Polvo de caldo fantástico	Genesee Scientific	18-225
Tris Base	Genesee Scientific	18-146
XCell SureLock Mini-Cell y XCell II Blot Module	Thermo Fisher Scientific	EI0002