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Artículo de método

Estudio de la exposición crónica de ratones a la radiación ultravioleta B

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DOI:

10.3791/67368

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19 de agosto de 2025

 ,  ,  , 
1Department of Human Genetics and Biochemistry, Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2The Ragon Institute of Mass General, MIT, and Harvard Main Street

En este artículo

Resumen

El protocolo describe un estudio de los efectos sistémicos y locales en la piel de la exposición a los rayos ultravioleta B en ratones.

Resumen

La radiación ultravioleta B (UVB) (280-320 nm) ha sido reconocida como carcinógena desde 1928, lo que lleva a minimizar la exposición al sol. Sin embargo, los estudios epidemiológicos sugieren que la exposición al sol se correlaciona con una mayor esperanza de vida y una menor incidencia de enfermedades cardiovasculares y ciertos cánceres como el cáncer de colon y endometrio. La exposición a los rayos UVB también influye en el metabolismo hepático, protege contra la lipotoxicidad hepatocelular y afecta la salud metabólica. Estos efectos se deben en parte a la síntesis de vitamina D, aunque algunos son independientes de la vitamina D. Además, la fototerapia con UVB tiene propiedades inmunomoduladoras y se usa para tratar afecciones de la piel como el vitíligo y la psoriasis, al mismo tiempo que afecta el sistema inmunológico sistémico. Dados los amplios efectos fisiológicos de los UVB, existen lagunas en la comprensión del mecanismo detrás de la mayoría de estos efectos. Demostramos que la exposición diaria a UVB de bajo nivel mejora el comportamiento de búsqueda de alimentos en ratones machos pero no en hembras debido al aumento de la secreción de grelina de los adipocitos de la piel. En las mujeres, el estrógeno inhibe la actividad p53 de los adipocitos, bloqueando la elevación de la grelina y demostrando una respuesta dependiente del sexo a la radiación UVB. Además, la activación de p53 inducida por UVB en queratinocitos epidérmicos activa el eje hipotálamo-hipófisis-gonadal, induciendo el comportamiento sexual y la profertilidad ovárica. Este artículo describe un protocolo para estudiar los efectos locales y sistémicos de la radiación UVB baja utilizando un modelo de ratón C57BL / 6J. Los elementos clave incluyen la calibración precisa de las dosis de UVB, las condiciones de la carcasa y la depilación cuidadosa para garantizar una exposición constante. Los ratones se someten a un régimen de exposición UVB graduado durante varias semanas, con monitoreo de cambios de salud y comportamiento. También se detallan los métodos para la validación de la eficiencia de la radiación a través de mediciones de pigmentación. Al enfatizar la calibración de las dosis de UVB, el cuidado riguroso de los animales y los controles metodológicos, este protocolo facilitará el estudio de los efectos integrales de la exposición a los rayos UVB, contribuyendo a una comprensión matizada de sus beneficios y riesgos terapéuticos.

Introducción

Las frecuencias de radiación solar que llegan a la superficie terrestre incluyen radiación ultravioleta (UV), radiación UVA (320-400 nm) y radiación UVB (280-320 nm). Los rayos UVB son un inductor de mutaciones. Los rayos UV fueron reconocidos como carcinógenos en 19281, y desde mediados de 1900, se recomendó reducir la exposición al sol como medida de precaución para evitar el cáncer de piel2. Aunque los rayos UVB son claramente un desencadenante ambiental para el cáncer de piel, la investigación en la última década3 con estudios recientes de nuestro grupo 4,5,6 ha demostrado que los rayos UVB tienen amplios efectos en los sistemas fisiológicos. Un estudio de una cohorte de mujeres seguidas durante 20 años reveló que la esperanza de vida era mayor en 2 años en las mujeres que no evitaban el sol en comparación con las mujeres que sí lo hacían7. Estudios adicionales demostraron que la exposición al sol se correlacionó con una disminución de las enfermedades cardiovasculares y la mortalidad general 8,9,10. También se han descrito correlaciones inversas entre la luz solar y el cáncer de colon y el cáncer de endometrio8. La exposición a los rayos UVB también induce el metabolismo hepático11, protege contra la lipotoxicidad hepatocelular y las enfermedades metabólicas, y tiene efectos positivos sobre las endorfinas y los comportamientos relacionados con el sexo 3,6. Estas líneas de evidencia indican los efectos perjudiciales de evitar la exposición al sol en la salud humana. Los efectos beneficiosos de la exposición al sol se han atribuido principalmente a la inducción de la producción de vitamina D, sin embargo, al menos algunos de los beneficios para la salud de la luz solar son independientes de los niveles de vitamina D 4,6,12

La piel es el órgano más grande del cuerpo y es la primera línea de defensa contra los factores estresantes ambientales. Las capas epidérmica y dérmica de la piel están separadas por una capa epidérmica basal compuesta por queratinocitos y melanocitos indiferenciados que se renuevan a sí mismos10. Los queratinocitos en etapas crecientes de diferenciación terminal se encuentran en la capa epidérmica superior. La dermis incluye fibroblastos y vasos sanguíneos, y la hipodermis está formada principalmente por adipocitos. La piel es un órgano dermatoendocrino ya que múltiples receptores de hormonas, como el receptor de andrógenos y el receptor de la hormona liberadora de corticotropina, se expresan en la piel, lo que sugiere que las hormonas influyen en los procesos de la piel por vías paracrinas y autocrinas 13,14,15. La piel también es productora de hormonas. Sin embargo, con algunas excepciones, no se ha documentado la producción de hormonas en la piel y su liberación en la sangre, ni se conocen los desencadenantes de la expresión (revisión en16).

Se ha demostrado que los UVB tienen potencial terapéutico en enfermedades de la piel. La fototerapia, que incluye psoraleno-UVA y UVB de banda estrecha, es la principal modalidad de tratamiento para el vitíligo generalizado17. La respuesta a la fototerapia ocurrió en el 74% de los pacientes a los 6 meses y en el 75% de los pacientes a los 12 meses después del inicio del tratamiento18. El mecanismo de acción de la fototerapia en el vitíligo no se comprende bien. Su acción terapéutica implica una combinación de efectos sobre la cinética del ciclo celular, alteraciones en la expresión de citoquinas, efectos sobre los melanocitos e inmunomodulación. Numerosos estudios han examinado los efectos de la fototerapia sobre la inmunidad de la piel 19,20,21; sin embargo, los efectos sistémicos son poco conocidos, especialmente en el contexto del vitíligo. A diferencia de la psoriasis, donde un estudio mostró una disminución de las citoquinas proinflamatorias y un aumento de las células T reguladoras después del tratamiento de fototerapia, en el vitíligo, el número de células T reguladoras disminuyó con la fototerapia UV21.

Aunque la UVB tiene efectos sobre el cerebro14,15, las glándulas suprarrenales22, los ovarios 5,6, los testículos6, el hígado11 y los ganglios linfáticos23, los mecanismos por los cuales la UVB modula los sistemas sistémicos en su mayoría no se conocen. Este protocolo de investigación describe un modelo de ratón para estudiar los efectos sistémicos y locales (de la piel) de la exposición a los rayos UVB que facilitará el estudio de los efectos integrales de la exposición a los rayos UVB. El modelo de ratón UVB es de amplio interés en fisiología de la piel, dermatología y cáncer de piel, especialmente melanoma. El objetivo general de este método es proporcionar un protocolo simple pero robusto y efectivo para desarrollar el modelo de ratón UVB para preguntas de investigación científica relacionadas con la piel. El protocolo describe cómo superar los desafíos del eritema cutáneo asociado con la depilación y la exposición a los rayos UVB en condiciones fisiológicas y es eficaz para estudiar los efectos locales y sistémicos de los rayos UVB en la piel.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales descritos se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Tel Aviv (permiso IACUC: 01-20-043).

1. Habituación de los ratones para el experimento

  1. Obtenga ratones C57BL / 6J de 7 a 8 semanas de edad comprándolos a un proveedor comercial o criándolos internamente, según el protocolo IACUC del experimentador. Este protocolo prueba los ratones de 15 semanas de edad en el fondo C57BL / 6J, pero el protocolo debe calibrarse en otras cepas de ratones y para edades más jóvenes (< 7 semanas de edad).
    NOTA: El protocolo para utilizar los diferentes ratones agrupados por edad debe ser aprobado por el IACUC de la institución donde se llevará a cabo el experimento. Se proporcionan detalles sobre el estado de salud de los animales (Tabla complementaria 1).
  2. Habitúe a los ratones durante al menos 7 días antes del inicio del experimento. La habituación es fundamental para los ratones después del transporte y la logística.

2. Alojamiento de los ratones

  1. Aloje a los animales en jaulas domésticas con ropa de cama estándar y acceso ad libitum a comida y agua estándar en un ciclo estándar de luz / oscuridad de 12:00 h (horas de luz: 07:00 - 19:00 h y horas oscuras: 19:00-07:00 h) a temperatura estándar de 22 ± 1 ° C y 32% -35% de humedad.
    NOTA: Hemos probado este protocolo en acceso dietético restringido y también funciona bien en esas condiciones experimentales.
  2. Asegúrese de que la cantidad de ratones por jaula esté de acuerdo con su peso corporal, tamaño de camada e hipótesis experimental.

3. Afeitado y depilación

  1. Antes del afeitado, coloque a los ratones en la cámara de isoflurano conectada a un vaporizador de anestesia con isoflurano al 5% y 1 L / min de oxígeno.
    NOTA: Las experimentadoras deben tener cuidado al usar isoflurano, ya que la exposición puede causar graves peligros para la salud, y las mujeres embarazadas deben evitarlo en cualquier forma.
  2. Asegúrese de que los ratones estén inmóviles y respiren constantemente. Use ungüento ocular para los ojos para prevenir la sequedad.
  3. Encienda la máquina de afeitar (dimensiones de la cuchilla LxAxA: 204 x 50 x 41 mm) y sosténgala paralela a la piel del ratón. Mueva suavemente la máquina de afeitar en la máquina de afeitar en la dirección de avance. No empuje la máquina contra la piel del ratón; Un par de rondas de afeitado deberían afeitar suficientemente a los ratones desde el lado dorsal. Afeite a los ratones dorsalmente para que se afeite entre el 50% y el 60% de la región dorsal (Figura 1) antes del inicio de la exposición a la radiación. Vuelva a afeitar a los ratones cada vez que haya parches de rebrote de pelaje, que generalmente es de alrededor de 0,5 cm.
    NOTA: Utilice con cuidado la afeitadora para no lastimar o rasgar la piel de los animales; El experimentador debe mantener la afeitadora lo más paralela posible a la piel. La frecuencia del afeitado del cabello depende de la tensión y del tipo de tratamiento experimental administrado a los ratones.
  4. Anestesiar a los ratones de una jaula a la vez y luego afeitarlos. Después del afeitado, aplique crema depilatoria (suficiente para cubrir el aplicador de algodón) en el área afeitada con almohadillas de algodón. Tenga cuidado de no exponer la crema depilatoria más cerca de los ojos de los animales. Hacer lo contrario puede causar complicaciones graves y picazón.
  5. Después de 1-2 minutos, lave el área suavemente con pañuelos humedecidos en solución salina estéril de tampón de fosfato (PBS) para eliminar los restos de la crema depilatoria del cuerpo del ratón y eliminar los restos del vello atascado.
    NOTA: El tiempo prolongado (> 5 min) con la crema depilatoria podría dañar la piel de los ratones y debe evitarse. Asegúrese de que la temperatura del PBS sea ambiente a temperatura ambiente y no demasiado fría.
  6. Seque el área afeitada con tejidos blandos, luego coloque a los ratones en la jaula de recuperación limpia y seca con ropa de cama de jaula. Observe de cerca a los ratones hasta que recuperen la conciencia.
    NOTA: La lámpara de luz infrarroja puede garantizar que la temperatura corporal de los ratones no baje drásticamente después de los pasos de lavado.
  7. Deje que los ratones descansen en su jaula con comida y agua ab libitum y recupérese del procedimiento de afeitado durante al menos 10 días antes de la primera exposición a los rayos UVB.
    NOTA: Si los ratones se exponen a los rayos UVB antes de 10 días después del afeitado, podría provocar eritema cutáneo.

4. Configuración de la exposición a los rayos UVB

  1. Use una camisa de manga larga, pantalones, una bata de laboratorio, zapatos cerrados, guantes dobles y un protector facial. Realice la irradiación dentro de una campana biológica con la cubierta de plexiglás de 10 mm hacia abajo para evitar la exposición a los rayos UVB del experimentador.
  2. Coloque la lámpara UVB en la cámara de vidrio de plexiglás transparente sin encenderla, como se muestra en la Figura 2.
  3. Encienda la lámpara UVB y déjela funcionar hasta que la intensidad sea constante. Coloque el radiómetro UVX encendiéndolo como se monitorea usando un radiómetro UVX equipado con un cabezal de medición UVB. Asegúrese de encender el radiómetro UVX a 20 mW/cm2 y lea la configuración del radiómetro. Deje que la lámpara UVB se caliente y se estabilice durante al menos 2 minutos. Cuando la lámpara esté lista para su uso, saque el radiómetro UVX.
  4. Use una jaula limpia que no sea la jaula de la casa para la irradiación y colóquela en la campana biológica debajo de la lámpara UV. Transfiera los ratones a la jaula de irradiación antes del tratamiento con la lámpara UV encendida o apagada para las respectivas exposiciones UV o simuladas. Trate solo 2 ratones a la vez para proporcionar suficiente espacio.
    NOTA: La cámara tenía un área de piso de 500 cm2 y una altura interna de 14 cm para permitir que los ratones se movieran libremente sin treparse unos a otros durante la irradiación. La razón para usar la cámara de exposición es evitar que los ratones se superpongan entre sí durante la exposición y garantizar que todos los ratones obtengan la misma cantidad de exposición a los rayos UVB. La introducción de más de dos ratones en la cámara conducirá a un escenario en el que los ratones se suben unos a otros, lo que creará una inconsistencia en la dosis de UVB administrada a cada ratón.
  5. Calcule la cantidad de tiempo requerido para exponer a los ratones a la intensidad UVB deseada usando la calculadora. Por ejemplo, si el radiómetro UVX muestra 2 mW/cm2 en la pantalla de visualización y la exposición deseada es de 50 mJ/cm2 para los ratones, exponga los ratones durante 25 s en la cámara de irradiación UV mientras la lámpara UV está encendida.
    NOTA: Antes de comenzar, asegúrese de colocar el equipo de protección adecuado como se menciona en el paso 4.1. La duración de la exposición a lo largo del tratamiento osciló entre 20 y 120 s. Sin embargo, la duración puede variar según la intensidad de radiación de la lámpara UVB y, por lo tanto, debe calcularse para cada tratamiento. No se espera que los ratones sean retirados del estudio, ya que normalmente no se observan signos de pérdida de peso, señales de dolor, incluidas quemaduras graves en la piel, sangrado, eritema, apatía o dificultad para respirar con este protocolo.
  6. Exponga a los ratones machos y hembras por separado y limpie la cámara con desinfectante entre cada sexo para evitar la contaminación cruzada de olores para los estudios de comportamiento. En caso de exposición de diferentes grupos de ratones que fueron tratados con tratamiento adicional o animales genéticamente transgénicos o de control, limpie la cámara entre la exposición de cada grupo para evitar la contaminación cruzada de factores desconocidos que son diferentes entre los dos grupos.

5. Exposición a los rayos UVB

  1. Encienda la lámpara UVB y configúrela desde el paso 4.1. a 4.5.
  2. Transfiera los ratones de la jaula doméstica a la cámara de exposición durante el tiempo deseado. Exponga a los ratones a los rayos UVB una vez al día durante los días experimentales deseados (aquí, hicimos 5 días a la semana) durante 8 semanas con un soporte XX-15 equipado con bombillas UVB de 15 W y 302 nm.
    NOTA: La duración de la exposición es subjetiva y depende de la pregunta científica. Los animales no deben desarrollar eritema cutáneo. En caso de eritema, detenga inmediatamente la exposición e informe al veterinario. Utilizamos 5 días a la semana de exposición, excluyendo los fines de semana. La frecuencia de la dosis de UVB se puede reducir en condiciones similares a este protocolo, pero la exposición adicional requerirá calibración por parte del experimentador.
  3. Exponga a los ratones a una dosis de UVB de 50 mJ / cm2, una dosis suberitematente en la cepa de ratón C57BL / 6J.
    NOTA: Una dosis UVB de 50 mJ/cm2 es una dosis suberitematente, y hemos utilizado esta dosis durante 8 semanas en los ratones experimentales. En otros experimentos, hemos utilizado una sola exposición a UVB de 200 mJ/cm2 para estudiar el daño del ADN4.
  4. Coloque los ratones afeitados irradiados simuladamente (no expuestos a UVB) en la cámara de radiación durante la misma cantidad de tiempo sin encender la lámpara UVB y utilícelos como control de la exposición a UVB.
    NOTA: Dado que los ratones son neofóbicos, los experimentos con ratones siempre deben tener el grupo de control, que se somete al mismo pseudotratamiento que el experimental.

6. Análisis de exposición a UVB

NOTA: Los ratones fueron sacrificados mediante asfixia por CO2 de acuerdo con las pautas de AVMA.

  1. Para validar la eficiencia de la radiación, mida la pigmentación de la oreja y la cola (Figura 2) utilizando un espectrofotómetro dérmico o un instrumento similar o mediante biopsias de piel inmunoteñidas seguidas de tinción de Fontana Masson, como se describió anteriormente4.
  2. Validación con espectrofotómetro dérmico: Calibre el espectrofotómetro dérmico para establecer la línea de base con papel blanco limpio y normal. Una vez realizada la calibración, coloque el sensor de medición en la oreja o la cola del mouse y anote las lecturas de intensidad de melanina. Los niveles de melanina en los ratones irradiados con UVB y UVB se muestran en la Figura 3.
  3. Validación mediante inmunofluorescencia: Fijar biopsias de piel de ratón (2 cm x 2 cm) en paraformaldehído al 4% e incrustar en bloques de parafina. Tiña cortes de tejido de 10 μm de espesor con anticuerpo anti-CPD (utilizado a una concentración de 1:100)24 durante la noche a 4 °C, seguido de anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia (anticuerpo secundario conjugado Alexa-594 anti-cabra anti-conejo a una concentración de 1:1000)24 durante 1 h a temperatura ambiente. Contratiña los tejidos con DAPI y obtén imágenes mediante microscopía de fluorescencia.
  4. Validación mediante tinción de Fontana Masson: fije biopsias de piel de ratón en paraformaldehído al 4% e insértelas en bloques de parafina. Tiña cortes de tejido de 10 μm para melanina utilizando el protocolo de tinción4 de Fontana Masson con solución de nitrato de plata y cloruro de oro. Contratiña las biopsias de tejido con Nuclear Fast Red Solution y móntalas con un soporte de tejido, seguido de la captura de imágenes de campo claro en el microscopio.

7. Cuidado de los animales

  1. Realizar experimentos con animales de acuerdo con las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
  2. Pese los ratones semanalmente para evaluar su estado de salud básico. Retire los animales con > disminución de peso del 15% entre las mediciones del experimento. Retire los animales que presenten señales de dolor, incluidas quemaduras graves en la piel, sangrado, eritema, apatía o dificultad para respirar debido a la exposición a los rayos UVB, y sacrifíquelos de acuerdo con las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.

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Resultados

Este documento de método menciona el procedimiento detallado paso a paso para generar el modelo de ratón de exposición a UVB. La Figura 1 demuestra claramente el área afeitada del ratón C57BL / 6J representativo en el lado dorsal antes de la exposición a los rayos UVB, lo que demuestra que se afeitó entre el 50% y el 60% del área dorsal. El protocolo de afeitado no muestra signos de eritema cutáneo, lo cual es de suma importancia para los estudios dermatológicos. La Figu...

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Discusión

Los rayos UVB han sido reconocidos durante mucho tiempo como un factor de riesgo ambiental para los cánceres de piel; sin embargo, estudios recientes han iluminado un espectro más amplio de efectos UVB3. Se necesitan estudios que proporcionen una comprensión más profunda de los efectos sistémicos de los rayos UVB. Las diferentes dosis utilizadas en la investigación básica en comparación con los entornos clínicos complican nuestra comprensión de los efectos de los ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

C.L. agradece el apoyo de la subvención del Consejo Europeo de Investigación en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención n.º 726225), el Centro de Regulación Genética I-CORE en Enfermedades Humanas Complejas (n.º 41/11) y la Fundación de Ciencias de Israel (ISF; subvención 129/13).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Desinfectante Amistad internacionalNo aplicable
Cámara de exposiciónHecho en casaNo aplicable
Crema depilatoriaVeetNo aplicable
Afeitadora de cabelloHeiniger707-303 120V US
IsofluranoCuidados críticos de PiramalNo aplicable
Sistema de isofluranoCientífico de KentVetFlo-1210S
PBSSigma AldrichTMS-012
Cámara de plexiglásHecho en casaNo aplicable
Lámpara UVBProductos ultravioletaSerie XX - 15 vatios
Radiómetro UVXProductos ultravioleta97-0015-02

Referencias

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