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Tomografía preclínica por emisión de positrones con moldes animales conformes al cuerpo para el análisis de imágenes automatizado basado en la nube en ratones

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DOI:

10.3791/67370

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25 de octubre de 2024

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1Drug Safety R&D, Discovery & Early Development, Pfizer, Inc., 2Comparative Medicine, Discovery & Early Development, Pfizer, Inc.

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el procedimiento para realizar imágenes PET in vivo en ratones utilizando moldes animales conformes al cuerpo (BCAM) en el escáner PET/CT G8. Se proporcionan detalles técnicos sobre la preparación del ratón, incluida la implantación adecuada del tumor, el posicionamiento óptimo, la adquisición de imágenes PET/CT asistida por BCAM y el análisis de datos.

Resumen

La tomografía por emisión de positrones (PET) es una modalidad de imagen molecular que se puede utilizar para investigar una multitud de cuestiones farmacológicas, como la modulación de biomarcadores, la ocupación de receptores y la biodistribución de compuestos de interés. En los estudios de biodistribución, los sujetos experimentales a menudo se visualizan longitudinalmente después de recibir el artículo de prueba. A continuación, se analizan las imágenes para derivar el perfil de distribución del compuesto en varios órganos en diferentes puntos temporales. Esto constituye un paso crucial en el desarrollo de fármacos para comprender la distribución y el perfil potencialmente vinculante de un compuesto en investigación. Sin embargo, los métodos estándar/manuales de análisis de biodistribución basados en imágenes PET requieren mucha mano de obra y tiempo, y a menudo se asocian con una alta variabilidad entre operadores. Además, es un desafío mantener las posiciones de los animales consistentes en diferentes puntos de tiempo. Para abordar estas deficiencias, se utilizaron una serie de moldes de animales conformes al cuerpo del ratón (BCAM) para permitir el posicionamiento rígido y consistente de los animales durante la adquisición de imágenes PET/CT. Además, se empleó una plataforma de software como servicio (SaaS) que consta de un mapa de probabilidad de órganos (OPM) basado en la nube y una herramienta de segmentación impulsada por inteligencia artificial para permitir la cuantificación fiable y automatizada de los datos de imágenes PET in vivo. El flujo de trabajo presentado aquí incluye (1) la preparación de ratones para la obtención de imágenes con los BCAM, incluida la implantación adecuada de tumores subcutáneos para que sean compatibles con los moldes, (2) la adquisición de imágenes PET/CT con BCAM utilizando el escáner G8, y 3) la realización de segmentación automatizada de órganos y análisis de biodistribución utilizando el SaaS basado en la nube. [18F]En este caso, se utilizó FDG como trazador ejemplar, pero otros biomarcadores y/o compuestos marcados con radio pueden adaptarse fácilmente al flujo de trabajo. Este procedimiento se puede ejecutar de manera precisa y efectiva con una capacitación mínima, y el análisis automatizado de datos de PET arrojó resultados satisfactorios consistentes con el método manual.

Introducción

Las tecnologías de imagen molecular in vivo son herramientas importantes en el desarrollo de fármacos para facilitar la evaluación de los tres pilares de la farmacología: biodistribución, compromiso con el objetivo y modulación de la farmacodinámica 1,2,3. La tomografía por emisión de positrones (PET), con su traducibilidad clínica y alta sensibilidad, se encuentra entre las modalidades de imagen molecular más utilizadas tanto en la clínica como en el espacio de investigación y desarrollo preclínico. El floreciente campo de las imágenes preclínicas de PET y radioteranóstica es valioso para el desarrollo de terapias intrínsecas a tumores, terapias dirigidas, así como nuevas terapias de inmunooncología (IO). La continua aparición y desarrollo de nuevos radiotrazadores Immuno-PET tiene el potencial de influir en los regímenes específicos de fármacos IO personalizados e identificar a los respondedores frente a los no respondedores 4,5,6. Mientras tanto, los radiotrazadores metabólicos específicos, como [18F]FDG y [18F]FLT, pueden monitorear la respuesta de un tumor a la terapia y pueden arrojar luz sobre si un tumor está proliferando activamente o consumiendo glucosa7, o si las células tumorales están experimentando una detención del ciclo celular por vías de inhibición 8,9.

La obtención de imágenes in vivo no invasivas presenta múltiples ventajas en comparación con los experimentos farmacológicos tradicionales sin imágenes. Por ejemplo, las imágenes permiten una evaluación sistémica y holística de la distribución y/o el efecto farmacológico de un fármaco en todo el sujeto, lo que permite no solo el seguimiento de la eficacia en el sitio objetivo, sino también la detección de actividades inesperadas fuera del sitio. Debido a su naturaleza no invasiva, el mismo conjunto de animales puede evaluarse longitudinalmente en diferentes puntos temporales y/o con diferentes biomarcadores para abordar cuestiones biológicas distintas10. Esto no solo reduce significativamente el número de animales necesarios para el estudio, sino que también proporciona un control ortogonal en todos los puntos temporales y, por lo tanto, ayuda a mejorar las correlaciones y reducir las variabilidades individuales. A pesar de este prometedor desarrollo de biomarcadores de imagen, la necesidad de evaluar compuestos de investigación in vivo con estudios de biodistribución basados en imágenes PET, sin embargo, se encuentra con una falta de procesos automatizados eficientes para el análisis. Los estudios de biodistribución de PET generan información valiosa sobre la cinética, la acumulación de tejidos, la unión y el metabolismo de un compuesto. La obtención de datos cuantitativos altamente reproducibles es fundamental para el desarrollo de terapias farmacéuticas.

Para abordar estas necesidades insatisfechas en el análisis automatizado de imágenes PET, InVivo Analytics ha diseñado un conjunto de moldes animales conformes al cuerpo del ratón (BCAM)11. Se trata de moldes de plástico impresos en 3D que sujetan la cabeza, el torso (y los órganos internos), la cola y las extremidades de un ratón en posiciones rígidas y predefinidas. Se pueden seleccionar moldes de diferentes tamaños en función del peso corporal del animal, y se pueden crear recortes en regiones específicas, como el hombro o el flanco inferior, para permitir que los tumores subcutáneos sobresalgan. Las imágenes PET/CT adquiridas con estos BCAM son muy uniformes y pueden ser analizadas en lotes por la plataforma de segmentación automatizada basada en la nube de la empresa11. Este artículo presenta un flujo de trabajo automatizado de análisis de biodistribución in vivo que funciona mediante la adquisición física de imágenes con BCAM y la realización de segmentación y análisis de imágenes mediante el SaaS.

Protocolo

Todos los procedimientos realizados en animales siguieron las regulaciones y las pautas establecidas, y fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Pfizer o a través de un proceso de revisión ética. El estudio imagenológico PET se realizó siguiendo todos los protocolos institucionales de seguridad radiológica. En este estudio se utilizaron ratones hembra C57BL/6, de 10 a 12 semanas de edad, con pesos corporales que oscilaron entre 18 y 26 g. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación y puesta en escena de los animales

NOTA: Este paso implica la estadificación de los animales para la obtención de imágenes por TEP con implante tumoral guiado por plantillas BCAM.

  1. Antes de la implantación de la célula, afeitar el pelaje de los ratones en la región deseada de crecimiento tumoral.
  2. Configure la estación de anestesia y coloque un molde BCAM del tamaño adecuado en el preclip con la parte superior volteada 90 grados. Esto servirá como base de implantación del tumor (Figura 1A).
  3. Anestesiar a los animales en una caja de inducción adecuada con 2,0% de isoflurano y 98% de oxígeno a un caudal de 0,5-1,5 L/min.
    NOTA: Todos los sistemas de anestesia son variables.
    1. Utilice un sistema calibrado y pruebe antes de usar. Coloque un ratón anestesiado en la base y extienda sus extremidades (Figura 1B).
  4. Coloque suavemente un molde de plantilla de inyección tumoral BCAM (Figura 1C) en el lado dorsal del ratón (Figura 1D).
  5. Cree cuidadosamente una marca de referencia circular temporal en la ubicación de recorte deseada (por ejemplo, hombro o flanco, izquierda o derecha) con un marcador (Figura 1D). Retira el molde de la plantilla.
  6. Prepare las células para la inyección extrayendo el volumen deseado en una jeringa. Coloque una aguja de 27 G en la jeringa y llene el espacio de volumen muerto. Se recomienda un volumen de 0,1-0,2 mL por inoculación.
  7. Levante la piel con los dedos o fórceps utilizando las marcas temporales del paso 1.5 como referencia para crear una tienda de campaña, inserte lentamente la aguja e inyecte las células por vía subcutánea en el lugar deseado. Deseche la aguja en un recipiente para objetos punzocortantes de riesgo biológico.
  8. Controlar el crecimiento del tumor. El volumen tumoral promedio en el momento de la inscripción en este ejemplo fue de 200-300 mm3.
    NOTA: Evite el uso de componentes metálicos como crotales o microchips para evitar artefactos en las imágenes por TC.

2. Extracción de dosis radiactivas

  1. Siguiendo todos los protocolos institucionales de seguridad radiológica, extraiga cuidadosamente una dosis objetivo de [18F]FDG en el rango de aproximadamente 70-80 μCi en una jeringa estéril adecuada para inyección intravenosa.
    NOTA: El rango de 70-80 μCi es óptimo para adaptarse al rango dinámico del escáner PET Sofie G8. Otros generadores de imágenes pueden tener diferentes rangos dinámicos que requieren una dosis objetivo diferente.
  2. Mida cuidadosamente la dosis radiactiva en un calibrador de dosis colocando la jeringa en la cámara del pocillo y bajando el cazo. Preste atención a seleccionar el isótopo apropiado o el número de calibración antes de la medición.
  3. Toma una lectura estable. Registre la fecha y la hora. Ajuste la dosis si es necesario.
  4. (Opcional) Utilice solución salina estéril para llevar el volumen de la dosis final a 0,1-0,2 mL.
    NOTA: El volumen de inyección deseado puede variar.
  5. La dosis está lista para ser administrada.

3. Administración de dosis intravenosa

  1. Siguiendo los protocolos institucionales de seguridad radiológica y de la IACUC, prepare la cola del ratón para la inyección intravenosa dilatando la vena de la cola. En este estudio, la vena de la cola se dilató colocando la jaula del animal o la cámara de inducción en un calentador deslizante ajustado a 42 °C.
    NOTA: Puede tomar hasta 10 minutos de calentamiento para que la vena de cola se dilate por completo.
  2. Antes de la inyección, registre el peso del ratón. Esto determinará qué BCAM específico del peso se utilizará para las imágenes de PET/CT.
  3. Una vez que esté listo, transfiera el ratón a un sistema de retención adecuado (por ejemplo, se utilizó una plataforma de inyección de vena de cola en el presente estudio) y localice la vena de cola.
  4. Manipule con cuidado la jeringa radiactiva e inyecte la dosis por vía intravenosa en un ratón consciente. Registre el tiempo de inyección.
  5. Coloque con cuidado la jeringa a un lado y limpie el exceso de sangre que caiga de la cola con una gasa. Retire el ratón del protector y vuelva a colocarlo en la carcasa adecuada.
  6. Vuelva a colocar con cuidado la jeringa en la cámara del calibrador de dosis y registre las lecturas residuales para realizar los cálculos de dosis adecuados. Registre la fecha y la hora de la lectura de la actividad residual.
  7. Una vez que se completen las inyecciones, tenga cuidado y coloque cohortes de ratones detrás de recintos de plomo y/o lejos del personal, siguiendo las prácticas de radiación seguras para la institución. Nota: Todos los materiales utilizados están sujetos a una contaminación radiactiva menor. Monitoree todas las áreas con un contador Geiger calibrado y limpie según las pautas de seguridad contra la radiación.

4. Anestesia y posicionamiento de los animales para la toma de imágenes por emisión de positrones

  1. En un momento adecuado (p. ej., 10-15 minutos antes del final del período de absorción del marcador), encienda todo el equipo de anestesia y los instrumentos de calentamiento animal necesarios para la inducción de la anestesia y las imágenes por TEP. La anestesia se puede ajustar al 2,0%-2,5% de isoflurano en oxígeno al 98% (los ajustes pueden variar según la cepa de ratón y el modelo de enfermedad).
  2. Confirme que todos los adaptadores y válvulas estén encendidos y que el caudal de gas sea de 0,5-1,0 L/min. Los caudales específicos pueden variar entre los sistemas de anestesia y los sistemas de diagnóstico por imágenes.
  3. Coloque los animales apropiados en una caja de inducción y espere hasta que el sujeto alcance la profundidad correcta de anestesia.
  4. Aplique un ungüento lubricante para los ojos en cada ojo.
  5. Transfiera el mouse a un BCAM del tamaño adecuado en función del peso corporal.
  6. Levante suavemente el mouse por la nuca, inserte la cola en la ranura de la cola y envuélvala debajo del BCAM. Coloque la cola en la plataforma de la cola y péguela con cinta adhesiva para asegurar la posición. Comprueba que el lomo esté recto. Cierre suavemente el BCAM (Figura 2A,B).
  7. Coloque con cuidado las cuatro extremidades para que descansen en cada una de las plataformas de patas BCAM. Use cinta adhesiva según sea necesario para asegurar las patas a cada plataforma (Figura 2B).
  8. Encaje suavemente el BCAM en la lanzadera de la cama de imágenes insertando primero el extremo delantero (Figura 2C). La lanzadera ya debe estar conectada al muelle de carga G8 con el flujo de anestesia (Figura 2D). Empuje hacia abajo la parte posterior del BCAM y un clic indicará que está asegurado a la lanzadera G8.
    NOTA: Mantenga el suministro de anestésico para que el animal permanezca en el plano anestésico deseado durante la toma de imágenes.

5. Adquisición de imágenes

  1. Abra el software de adquisición de PET G8. Las carpetas de estudio, los parámetros de escaneo y los ID de sujeto se pueden crear de antemano.
    1. Introduzca los detalles del estudio en el software: peso del ratón, fecha/hora y cantidad de la dosis inicial extraída, fecha/hora de la inyección y fecha/hora y cantidad de lectura de actividad residual.
  2. Inserte la lanzadera con el ratón en la abertura del escáner. Una luz indicadora azul indicará el acoplamiento adecuado al sistema.
  3. Seleccione los parámetros PET/CT adecuados. Adquisición de datos de imágenes.
    NOTA: En este estudio, se realizó una PET estática de 18F de 7 minutos, seguida de una tomografía computarizada predeterminada de 70 segundos, y se aplicó un algoritmo de reconstrucción 3D de máxima probabilidad de expectativa y maximización (opción predeterminada y única en el escáner G8) para reconstruir los datos12.
  4. Una vez completada la adquisición, la lanzadera volverá a su posición inicial inicial. Retire la lanzadera con el ratón e insértela en la base. Presione la parte posterior de la pestaña vertical BCAM para quitarla de la lanzadera G8 y, suavemente, tire hacia arriba y retire el BCAM con el mouse.
  5. Presione las dos pestañas de retención para voltear hacia arriba y abrir la parte superior del BCAM.
  6. Retire suavemente el ratón. Asegúrese de que el ratón se haya recuperado completamente de la anestesia y esté brillante, alerta y receptivo (BAR) antes de regresar a su jaula de origen.
  7. Continúe el procedimiento a intervalos de tiempo establecidos para escanear toda la cohorte/grupo de ratones.

6. Subir imágenes al SaaS

  1. Inicie sesión para app.invivo.ax y crear un proyecto.
  2. Haga clic en la pestaña roja de carga en la parte superior derecha de la ventana. Seleccione un sistema de diagnóstico por imágenes y un indicador utilizados en el estudio por imágenes (es decir, [18F]FDG). Seleccione la carpeta con los datos de imagen.
  3. Vaya a la pestaña de anotaciones dentro de la carpeta del proyecto. Haga clic en Anotar para agregar información relevante de escaneo (nombre del sujeto, sexo, tamaño de BCAM, peso del sujeto, nombre de la cohorte, punto de tiempo y valor de la dosis inyectada). La mayoría de los metadatos se rellenarán automáticamente.

7. Análisis automatizado de datos

  1. Dentro de la carpeta del proyecto, se deben rellenar todos los análisis. Haga clic en los escaneos para navegar desde los niveles de proyecto, grupo y materia individual. Seleccione Analizar en la esquina superior derecha.
  2. En la parte superior derecha de la ventana de la cinta de opciones de análisis, en Proyecto, seleccione el símbolo más y seleccione ROI del mapa de probabilidad de órganos. El Mapa de Probabilidad de Órganos (OPM) es un atlas estadístico de órganos de ratón que abarca múltiples órganos y tejidos predefinidos. Seleccionar órganos individuales de interés en función de las necesidades de investigación.
    NOTA: En este ejemplo, la segmentación y el análisis manuales se realizaron utilizando VivoQuant, utilizando la herramienta spline, seguidos de la interpolación dentro del operador de ROI 3D. Los resultados del análisis automatizado se compararon con los resultados de la segmentación manual como punto de referencia.

Resultados

Una vez cargados, los datos de PET se pueden ver en el sitio web de SaaS como un panel de imágenes coronales, sagitales y transversales superpuestas con los ROI de los órganos seleccionados que son dictados por la OPM (Figura 3A). El software no solo puede cargar imágenes individuales, sino que varios ratones de un grupo o de un estudio completo se pueden ver a la vez como una sola imagen colapsada. Dentro de esta ventana de análisis, hay opciones para personalizar los colores del ROI, la intensidad de la barra de escala y otros parámetros comunes. Una vez seleccionadas las métricas analíticas ideales, el SaaS genera un gráfico de barras de biodistribución descargable de los órganos seleccionados (Figura 3B).

Para evaluar el rendimiento de la plataforma SaaS basada en OPM, los resultados del análisis automatizado se compararon con los que obtuvo un analista de imágenes experimentado como estándar de oro. Se realizó una regresión lineal de ajuste en los valores de captación de [18F]FDG del cerebro, el corazón, el riñón (derecha) y el bazo. Cabe destacar que la plataforma ofrece una lista completa de órganos para que los usuarios elijan, incluidos el esqueleto, el cerebro, la vejiga, el corazón, los riñones (derecho e izquierdo), el hígado, el bazo, los pulmones y los músculos cuádriceps (derecho e izquierdo). Los cuatro órganos mencionados anteriormente se seleccionaron en este estudio solo con fines ilustrativos. Además, debido a la variación del tamaño, la forma y la profundidad/ubicación de los tumores implantados, el tumor no se incluye como un órgano en la OPM y, por lo tanto, se excluye de este análisis comparativo. Como se muestra en la Figura 4, el análisis automatizado y el análisis manual arrojaron resultados generales consistentes, con el cerebro mostrando la correlación más alta (r2 = 0,8466). Esto se espera debido al gran tamaño del órgano y a la posición altamente constante del cerebro dentro del cráneo. El riñón derecho y el corazón también mostraron valores razonables de r2 de 0,6874 y 0,4849, respectivamente. Por el contrario, el análisis de correlación para el bazo generó un valor r2 de 0,3922, que es el más bajo entre los órganos evaluados. Esto no es sorprendente, ya que el bazo está anidado en el páncreas y los tejidos adiposos carecen de morfología definida y presumen la misma densidad de tejidos blandos en la TC. Por lo tanto, el bazo es difícil de segmentar manualmente, y la OPM puede presentar un medio más preciso para demarcar este órgano (es decir, superar el estándar de oro). La pendiente y la intersección con el eje Y de estos análisis de correlación también se muestran en la Figura 4. De acuerdo con los valores de r2 , el cerebro tenía una pendiente más cercana a 1 (es decir, una correlación perfecta entre la OPM y los resultados manuales) y la intersección Y más pequeña (es decir, un sesgo sistémico mínimo), mientras que los otros órganos mostraron una desviación mayor y variable de una correlación perfecta.

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Figura 1: BCAM e implante tumoral guiado por plantilla. (A) El pre-clip (1) se une a la pieza inferior de un molde BCAM (2) con una línea de anestesia conectada (3). Esto sirve como base de implantación del tumor. (B) Un ratón con el sitio objetivo del implante afeitado (en este caso, el hombro derecho) se coloca en la base bajo anestesia antes de la inyección de células. (C) Plantilla de implantación tumoral (4) con recortes predefinidos para guiar la colocación de la inoculación de células tumorales. (D) Hacer una marca de referencia temporal antes de la inyección de la célula con el molde de plantilla colocado en el lado dorsal del ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Colocación de un ratón en un BCAM. (A) Vista superior: coloque un ratón cómodamente en un BCAM del tamaño adecuado (5). (B) Vista lateral: se usa cinta adhesiva para asegurar las patas traseras a las plataformas (6). La cola está asegurada con cinta adhesiva a la plataforma de la cola (7) directamente debajo del ratón. (C) El ratón, en el BCAM, se inserta en la lanzadera de imágenes (8). (D) El mouse, el BCAM y la lanzadera están conectados a una estación de acoplamiento que funciona con anestesia (9). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Imágenes representativas y salida de datos vistos y analizados por la herramienta SaaS, respectivamente. (A) Imágenes representativas tal y como se ven en el sitio web de SaaS. Vistas coronales, sagitales y transversales de la imagen PET/CT superpuestas con ROI de órganos seleccionados del Mapa de Probabilidad de Órganos (OPM). Rosa: cerebro; rojo: corazón; azul oscuro: pulmón; salmón: hígado; Naranja: riñón (derecha). El tumor no está definido por la OPM. (B) Un gráfico representativo descargable generado a partir del análisis automatizado. En el panel superior izquierdo se puede ver una lista de los órganos seleccionados. Los datos aquí se informan en %ID/mL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Análisis de regresión lineal que compara los valores de absorción de [18F]FDG del órgano derivados del análisis manual y el flujo de trabajo de automatización basado en OPM. Se utilizaron diez tomografías por emisión de positrones y tomografías computarizadas de ratones hembra C57BL/6. Los valores r2 , las líneas de confianza del 95%, la pendiente y las intersecciones Y se muestran en el gráfico para cada órgano indicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El presente informe describe el procedimiento de realización de imágenes PET in vivo de ratón con los moldes BCAM y el análisis de datos con la herramienta SaaS automatizada. Se proporcionan instrucciones paso a paso sobre la preparación del mouse, la adquisición de imágenes y el procesamiento de datos. Este flujo de trabajo de automatización también produjo datos que eran coherentes con el análisis manual. A continuación se destacan algunas consideraciones técnicas clave.

Aunque un tumor no es uno de los órganos definidos por la OPM, un paso crítico en este protocolo es la implantación adecuada de tumores subcutáneos para, en última instancia, garantizar la alineación óptima de todos los órganos del ratón dentro de la cavidad corporal y el BCAM. El OPM solo puede producir datos precisos cuando la columna vertebral de un ratón está relativamente recta y los órganos internos están colocados de manera neutral. Los tumores excesivamente grandes o mal colocados podrían afectar la postura del ratón y presionar su cavidad corporal, desplazando así los órganos internos. Este cambio, a su vez, sesgará el análisis cuantitativo resultante del algoritmo OPM. Otros han reportado el impacto de una columna vertebral no recta en la alineación de los órganos internos utilizando diversas modalidades de imagen y algoritmos de segmentación 13,14. Por lo tanto, es crucial utilizar la plantilla para guiar la implantación del tumor y controlar de cerca el crecimiento tumoral para garantizar que los tumores estén correctamente posicionados y en el rango de tamaño ideal.

Otra área de posible desviación es la selección de un BCAM del tamaño adecuado. Los BCAM se crean en integrales de 2 g, con un rango de 18-26 g. Sin embargo, dado que los ratones con diferentes composiciones corporales (por ejemplo, más músculo frente a más grasa) pueden tener el mismo peso corporal pero diferentes tamaños físicos, es importante elegir el BCAM más adecuado utilizando su peso corporal como referencia general. Sube o baja el nivel por ensayo y error, y ten en cuenta que la alineación adecuada es fundamental. La elección de un BCAM demasiado grande hará que los órganos internos del ratón se "hundan" más cerca de la parte inferior de la cama, lo que afectará especialmente a la precisión del análisis de los órganos dorsales, como los riñones y la columna vertebral. Por el contrario, colocar un ratón en BCAM que es demasiado pequeño podría presionar sus cavidades corporales, sesgar la posición de los órganos y potencialmente causar dificultad en su respiración. El uso de cinta adhesiva para asegurarse de que las extremidades estén aseguradas en las plataformas de las patas ayudará con la configuración y el posicionamiento.

Aunque este flujo de trabajo reportado permite el análisis estandarizado y automatizado de imágenes PET, vale la pena señalar que el OPM actual se construye sobre la base de la cepa de ratón inmunocompetente C57BL/6 y ratones sanos. Otras cepas y condiciones de salud de los ratones pueden presentar diferentes características anatómicas que requieren ajuste, optimización y validación adicionales del algoritmo. Por ejemplo, las cepas inmunodeficientes, como la NSG o la NCG, tienen bazos más pequeños. De manera similar, los ratones que portan implantes tumorales ortotópicos pueden tener diferentes tamaños, formas y ubicaciones de órganos internos según el estado de su enfermedad. Otra limitación de este flujo de trabajo es el rendimiento general durante la fase de adquisición de un experimento. Esto se debe principalmente al tiempo adicional necesario para configurar un ratón correctamente en el BCAM. La capacitación y la práctica podrían aumentar la eficiencia del operador en la colocación adecuada. La adición de una segunda estación de acoplamiento también puede aumentar el rendimiento general, donde un acoplamiento puede servir para la configuración de BCAM y el otro puede servir para quitar un mouse a una jaula de recuperación. No obstante, incluso con el mayor tiempo que se requiere para la configuración de BCAM antes del escaneo, la inversión en tiempo se amortiza al ahorrar tiempo en el análisis de datos. Por ejemplo, en el presente estudio, la OPM tardó menos de 10 minutos en analizar diez imágenes (con 4 ROI), mientras que un analista con mucha experiencia tardó entre 3 y 4 horas en segmentar y analizar manualmente el mismo conjunto de imágenes y ROI. Un analista sin experiencia necesitaría aún más tiempo para el análisis manual. La plataforma SaaS permite el análisis de escaneos PET en grandes lotes, donde el análisis completo de biodistribución in vivo se puede completar en cuestión de minutos después de la carga de datos. Esta es una característica extremadamente útil cuando se manejan grandes cantidades de datos de múltiples grupos y/o en varios puntos de tiempo, como se explica a continuación.

La segmentación manual de órganos para un solo sujeto puede llevar mucho tiempo y, por lo general, requiere una capacitación inicial significativa del operador. Incluso con una formación adecuada, los análisis manuales se enfrentan inevitablemente a variabilidades entre operadores, que pueden sesgar los resultados cuantitativos15,16. Por el contrario, la segmentación automatizada y el análisis de datos pueden determinar de manera precisa y eficiente la biodistribución general de un radiotrazador y eliminar las variabilidades que tienen su origen en las operaciones humanas. Estos beneficios de la automatización se han visto tanto en el análisis de imágenes clínicas como en el espacio preclínico. Por ejemplo, Sluis et al. demostraron que un solo escaneo requería 4 h para segmentar los órganos de interés, en comparación con los 30 min de los métodos basados en la nube de IA17. Otro estudio de Nazari et al. también informó que el análisis basado en algoritmos del hígado y los riñones demostró resultados precisos dentro del 7,0% en comparación con dos físicos médicos humanos18. Los datos de la Figura 4 también mostraron claramente la fiabilidad del flujo de trabajo de análisis de imágenes PET basado en SaaS, y que el análisis automatizado produjo resultados consistentes en comparación con el análisis manual.

En resumen, este artículo ilustra el flujo de trabajo del uso de moldes BCAM para facilitar la adquisición de imágenes PET/CT preclínicas estandarizadas, así como el análisis automatizado de datos PET habilitado para SaaS. Está demostrado que esta tecnología de plataforma es relativamente sencilla de emplear, y la calidad de los datos generados por la automatización es coherente con el análisis manual, pero cuenta con importantes beneficios de ahorro de tiempo. Por lo tanto, este flujo de trabajo puede ahorrar a los investigadores cientos de horas en tiempo de análisis de datos y ayudar a estandarizar y reducir la variabilidad entre operadores. Este procedimiento puede ayudar en el desarrollo de una multitud de compuestos farmacológicos en todas las modalidades e indicaciones. En particular, las modalidades de moléculas grandes, como los anticuerpos terapéuticos, los anticuerpos biespecíficos, los captadores de células inmunitarias, los conjugados anticuerpo-fármaco e incluso las nanopartículas, pueden marcarse fácilmente con radiometales (por ejemplo, Zr-89, Cu-64) para permitir la evaluación de la biodistribución mediada por imágenes PET19,20. Del mismo modo, esta tecnología de plataforma puede ayudar a determinar la dosimetría de nuevas radioterapias en ratones21. La aplicación de este procedimiento será un gran valor añadido para el desarrollo de fármacos.

Divulgaciones

Todos los autores son empleados actuales o pasados de Pfizer, Inc.

Agradecimientos

Un agradecimiento especial al personal técnico y de investigación de medicina comparativa de Pfizer La Jolla.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
[18F]FDGPETNet Solutions, Culver City, CANARadiotrazador utilizado para la obtención de imágenes PET
Aguja de 27 G Becton, Dickinson and Company, San Diego, CA 305136utilizado para la inyección de células 
app.invivo.ax/loginInvivo Analytics, Seattle, WANAPágina web de software como servicio
Moldes animales conformes al cuerpoInvivo Analytics, Seattle, WANABCAM con rango de peso de 18 a 26 g
Calibrador de dosis; CRC-55twCapintec, Florham Park, NJCRC-55twMedición de dosis radiactivas
G8 Escáner PET/CTSofie Biosciences/Xodus Imaging, Torrence, CANAEscáner de sobremesa con muelle de carga
G8-Estación de acoplamientoSofie Biosciences/Xodus Imaging, Torrence, CANAEstación de acoplamiento para la puesta en escena
Plantilla de molde de implantaciónInvivo Analytics, Seattle, WANAPlantilla para la implantación óptima de tumores
Pomada ocular lubricanteBAUSCH & LOMB, Ontario, CanadáSoothe NighttimeEye lubricante para ratones
Lanzadera G8 modificadaInvivo Analytics, Seattle, WANALanzadera para alojamiento BCAM
Anestesia para ratones Caja de inducciónPatterson Scientific, Waukesha, WI78933388Se utiliza para anestesiar a un ratón
PRE-ClipInvivo Analytics, Seattle, WAAdaptador NA BCAM para la conexión
de anestesiaPremiere Calentador de portaobjetosLabScientific, Danvers, MAXH-2001Calentador de temperatura ajustable utilizado para la dilatación de las venas de la cola y la inducción de la anestesia
Jeringa (1 mL)Becton, Dickinson and Company, San Diego, CA309659Utilizado para la inyección de células 
Plataforma de inyección de venas de cola Braintree Scientific, Pembroke, MAIL-300Restrainer utilizado para administrar inyecciones intravenosas. 
Vivoqaunt Software Invicro, Needham, MANASoftware utilizado para la segmentación manual

Referencias

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