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Modelo de curación de heridas por quemaduras similar a un tablero de ajedrez de ratones basado en un dispositivo de calentamiento digital

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DOI:

10.3791/67375

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27 de diciembre de 2024

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1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

En este artículo

Resumen

Se presenta un protocolo simplificado para establecer un modelo de cicatrización de heridas por quemaduras en ratones utilizando un dispositivo de calentamiento digital. Los sitios experimentales en forma de tablero de ajedrez creados en la piel facilitan un análisis funcional adicional para el ensayo de cicatrización de heridas.

Resumen

Las lesiones por quemaduras graves se encuentran entre las afecciones más traumáticas y físicamente debilitantes, ya que afectan a casi todos los sistemas de órganos y provocan una morbilidad y mortalidad considerables. Dada su complejidad y la afectación de múltiples órganos, se han creado varios modelos animales para replicar diferentes facetas de las lesiones por quemaduras. Los métodos utilizados para producir superficies quemadas varían entre los modelos animales experimentales. Este estudio describe un modelo de quemaduras de ratón simple, rentable y fácil de usar para crear quemaduras consistentes de espesor completo utilizando un dispositivo de calentamiento digital. La punta de este dispositivo se aplicó al dorso de ratones durante 10 s a 97 °C para establecer una quemadura similar a un tablero de ajedrez y examinar la cicatrización de la herida bajo el tratamiento de un apósito experimental. Se recogieron muestras de piel para su análisis histológico, incluyendo la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y la tinción de Masson. La cicatrización de la herida se evaluó mediante el análisis del área de la herida y el examen microscópico de la infiltración inflamatoria, la reepitelización y la formación de tejido de granulación. El modelo de lesión por quemadura en ratón puede servir como una herramienta fundamental en el estudio de la fisiopatología de las lesiones térmicas y en la evaluación de intervenciones terapéuticas.

Introducción

Las quemaduras se consideran una de las lesiones críticas de la piel, causadas por la exposición al calor, la electricidad, los materiales químicos y la exposición a la radiación 1,2. Se puede clasificar en cuatro grados dependiendo de la profundidad de la lesión, que van desde la epidermis hasta todo el grosor de la piel, e incluso los músculos y huesos. Las quemaduras pequeñas pueden provocar la formación de cicatrices y aumentar el riesgo de infección. Una gran área de lesión por quemadura no solo causa daño local, sino que también estimula trastornos del corazón, los riñones y otros órganos o sistemas del cuerpo a través de inflamaciones y respuestas inmunitarias graves y a largo plazo, lo que conduce a graves consecuencias sistémicas y una alta morbilidad3. La mayoría de los sobrevivientes de lesiones por quemaduras están acompañados de discapacidades físicas duraderas, angustia emocional y disminución de la calidad de vida 4,5. Por lo tanto, es importante estudiar el proceso patológico de las quemaduras y los mecanismos de regeneración del tejido quemado.

Implicados en las respuestas inmunitarias, la regeneración de tejidos y la homeostasis sistemática, los estudios in vitro no pudieron investigar exhaustivamente el proceso patológico de la cicatrización de las heridas por quemaduras. Así, en las últimas dos décadas, con el fin de explorar posibles intervenciones terapéuticas, se desarrollaron diferentes modelos animales de curación de heridas por quemaduras para replicar las diversas características de las lesiones por quemaduras 6,7. Las heridas por quemaduras generalmente se producen en la superficie del dorso de cerdos, ratas, ratones, conejos y otros animales después de la depilación. El tiempo de combustión puede durar de 3 s a 30 s para formar daño térmico de espesor parcial a completo con un rango de 5% a 30% de área total del cuerpo (TBSA)8. Actualmente no existen modelos estandarizados de estos métodos en la investigación con animales quemados debido a la alta variabilidad de las técnicas utilizadas. Los métodos utilizados para producir superficies quemadas varían entre los modelos animales experimentales, incluyendo la llama de gas9, el baño de etanolquemado 10, la placa/barra de metal simple precalentada11,12, el agua hirviendo o caliente13,14. Sin embargo, la técnica de infligir quemaduras y la profundidad de la quemadura producida a menudo son inconsistentes y están mal descritas en estudios anteriores, lo cual es crucial para determinar la gravedad de la quemadura y el método de tratamiento de la quemadura.

Este estudio tiene como objetivo desarrollar un modelo animal de quemaduras de ratón simple, rentable y fácil de usar para crear quemaduras consistentes de espesor completo en escenarios clínicos simulados. En este protocolo, utilizamos un conveniente dispositivo de calentamiento digital para controlar la profundidad de la quemadura ajustando la temperatura aplicada a la piel. La punta de este dispositivo se puede cambiar a diferentes tamaños para inducir quemaduras térmicas con diferentes rangos de TBSA. Esto permite la creación de una herida por quemadura similar a un tablero de ajedrez en la espalda del ratón, lo que permite la comparación de varios tratamientos experimentales y de control dentro del mismo animal. Observamos y registramos el proceso de cierre de la herida. Se recolectaron muestras de piel para evaluación histológica (tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y tinción con tricrómico de Masson) en diferentes etapas de la cicatrización de la herida. Este enfoque reduce el número de animales utilizados en el experimento y, por lo tanto, reduce los costos económicos al tiempo que es más compatible con la ética animal. Este estudio proporcionará a los investigadores herramientas esenciales para facilitar el desarrollo de nuevos tratamientos para las lesiones por quemaduras y revelará los mecanismos fisiopatológicos de la cicatrización de heridas por quemaduras.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales de este estudio fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética de la Escuela de Estomatología de China Occidental de la Universidad de Sichuan (WCHSIRB-D-2024-499). Para el presente estudio se utilizaron veinticuatro ratones C57BL/6 de ocho semanas de edad (hembras, peso corporal de 25 a 30 g). Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación del equipo y del ratón antes de una lesión por quemadura

  1. Adquiere los animales y alójalos en jaulas durante 7 días a su llegada para que puedan aclimatarse al entorno.
  2. Esterilice el área de trabajo rociando y limpiando con etanol al 70% (v/v). Cubra la mesa de operaciones con almohadillas absorbentes quirúrgicas estériles.
  3. Ajuste la temperatura del dispositivo de calefacción digital a 97 °C. El dispositivo de calentamiento consta de tres partes (Figura 1).
    NOTA: La temperatura de 50-450 °C se puede ajustar a través del controlador de temperatura (Figura 1A). La base del soporte se utiliza para colocar la punta (Figura 1B), que se puede desmontar (Figura 1C) para reemplazar diferentes tamaños de instrumentos. Desinfecte la punta con yodoforo o alcohol.
  4. Anestesiar al ratón con isoflurano al 5% en oxígeno al 100% en una cámara de inducción durante 3 min (caudal: 4 L/min) hasta que la respiración se haya ralentizado. Evalúe la profundidad de la anestesia mediante una prueba de pellizco en los dedos de los pies.
    NOTA: La inhalación de isoflurano puede provocar somnolencia y dañar el sistema cardiovascular. Es esencial usar equipo de protección y manipularlo dentro de una campana extractora en un área bien ventilada.
  5. Una vez que el ratón esté profundamente anestesiado, transfiéralo a una almohadilla térmica en posición prona para mantener el calor y prevenir la hipotermia durante la recuperación de la anestesia. Reducir el isoflurano a 1. 5% de oxígeno para el mantenimiento a través de un cono nasal.
  6. Aplique gel lubricante en ambos ojos del ratón con un bastoncillo de algodón para evitar la sequedad de la córnea.

2. Inducir lesiones por quemaduras de espesor completo

NOTA: El proceso general de inducción y análisis de quemaduras se muestra en la Figura 2.

  1. Afeitar la piel del ratón con una afeitadora eléctrica en un área de aproximadamente 5 cm de largo y 4 cm de ancho desde el cuello hasta la cola. Trabaje suavemente para evitar lesionar la piel al afeitarse (Figura 3C).
  2. Use un aplicador con punta de algodón para aplicar la crema depilatoria en el área de la piel afeitada durante 3 minutos (Figura 3D).
    NOTA: Evite aplicar la crema depilatoria en otras partes del ratón para evitar quemaduras, que pueden ser difíciles de detectar. La crema causaba erupciones cutáneas si se usaba durante más de 5 minutos. La duración precisa para una eficacia óptima varía según los productos y debe ser determinada por el operador.
  3. Limpie la crema con una gasa húmeda hasta que no se detecte la crema y el cabello. Desinfecte el área quirúrgica con un exfoliante de clorhexidina seguido de etanol al 70% (v/v) tres veces cada uno. Limpie y seque el área con gasa estéril.
  4. Utilice una punta de pipeta esterilizada de 1 ml con un diámetro de 9 mm (Figura 3A) sumergida en tinta esterilizada para identificar con precisión los sitios de herida deseados. La piel dorsal murina se caracteriza por una topografía irregular. Definir el área de la herida aparte de la médula espinal de los ratones es esencial para garantizar la repetibilidad.
  5. Cubrir la piel con un paño estéril previamente recortado, dejando libre la zona quirúrgica (Figura 3). Póngase guantes resistentes al calor y verifique la temperatura del dispositivo de calefacción digital. Antes y después de la inducción de la combustión, desinfecte la punta del dispositivo con etanol (v/v) al 70%.
  6. Aplique la punta del dispositivo de calentamiento en el centro de los sitios de la herida ubicados (97 °C durante 10 s) para crear seis heridas redondas con un diámetro de 4 mm (Figura 3B). El intervalo entre quemaduras adyacentes es de 0,5-1 cm. Determinar el número de quemaduras de acuerdo con el diseño experimental.
    NOTA: La quemadura es causada principalmente por la conducción de calor; Por lo tanto, no es necesario ejercer presión sobre la varilla, es decir, mantenerla en contacto con la piel por gravedad mientras se induce la quemadura. Hubo seis quemaduras para el diseño experimental. Este es el número máximo de heridas por quemaduras que se pueden construir según el dispositivo que hayamos utilizado y la zona del dorso del ratón. Sobre esta base, se pueden lograr múltiples réplicas del mismo grupo experimental.

3. Cuidado y medición después de la quemadura

  1. Aplique hielo a la herida de la quemadura durante 5 minutos para reducir el dolor potencial para el manejo del dolor (Figura 3G).
  2. Apague el isoflurano y retire el cono de la nariz después de la lesión por quemadura. Transfiera el mouse a una almohadilla térmica hasta que el mouse se mueva normalmente (por ejemplo, no esté agachado o temblando).
  3. Coloque cada ratón en una jaula de recuperación para evitar que se rasquen entre sí. Ablande algunos gránulos de comida agregando de 5 a 10 gotas de agua potable a cada gránulos y colóquelos en el piso de la jaula para facilitar la alimentación.
    NOTA: Esterilización de las jaulas mediante pulverización y limpieza con etanol al 70% (vol/vol). La ropa de cama debe reemplazarse regularmente para mantener a los ratones calientes y absorber la orina.
  4. Administrar buprenorfina (0,1 mg/kg) por vía subcutánea en caudal dos veces al día durante un total de 3 días, asegurando al menos 8 h entre inyecciones.
  5. Limpiar todas las heridas con gasa estéril humedecida con suero fisiológico después de 24 h de inducción de la quemadura. Secar la piel con una gasa y aplicar una pequeña cantidad de gel antibacterial (hidrogel TKH) con una jeringa para cubrir la herida de la quemadura12,14. Repita este procedimiento los días 3, 7 y 10 siguientes.
  6. Use un vendaje transparente y transpirable para cubrir las heridas. El tamaño del apósito debe cubrir aproximadamente 1 cm alrededor de la herida y no debe cubrir el área sin depilación.
    NOTA: Cambie el apósito para heridas al menos una vez cada 2 días. El uso prolongado del apósito sin reemplazo puede provocar una infección de la herida con formación de pus, lo que resulta en una cicatrización tardía de la herida.
  7. A lo largo del período de seguimiento, mida el peso cada 2-3 días. En general, los ratones que pierden entre el 15% y el 20% de su peso corporal inicial deben ser sacrificados y retirados del experimento.

4. Colección de heridas

  1. A los 0, 3, 7, 10 y 14 días, marque la herida con la punta de una pipeta estéril de 1 ml y regístrela con una cámara digital.
  2. Eutanasia de los ratones por sobredosis de anestesia y luxación cervical (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente).
    NOTA: Tenga cuidado durante la luxación cervical para evitar tirones excesivos, que pueden dañar las heridas del dorso.
  3. Con unas tijeras, aísle el sitio de la herida y la piel circundante, incluida la musculatura subyacente (1 cm x 1 cm). Prepárese para al menos tres muestras para cada grupo.
  4. Fijar las muestras de piel en paraformaldehído (PFA) al 4% durante 24 h y almacenar a 4 °C. El volumen fijador debe ser 30 veces el volumen del tejido 15,16.
    NOTA: El PFA es peligroso. Asegúrese de trabajar en un área bien ventilada y use el equipo de protección adecuado.

5. Evaluación de la cicatrización de heridas

  1. Lave el tejido de la herida dos veces con PBS y extiéndalo con papel de filtro, que debe recortarse a un tamaño adecuado (Figura 2H). Debido a la presencia de cierto contenido de moco dentro de la capa de tejido subcutáneo, se adhiere a la superficie del papel de filtro sin movimiento ni enroscamiento del tejido.
    1. Coloque el papel de filtro y la muestra en un casete de tejido para la deshidratación de parafina para obtener muestras de tejido relativamente suaves y luego incruste el tejido15,16. Almacene las muestras a 4 °C.
      NOTA: Estire el tejido tanto como sea posible y evite cualquier pliegue, ya que estos pliegues se volverán permanentes después de la fijación.
  2. Corte las muestras incluidas en parafina en secciones de 5 μm de espesor y tiña los portaobjetos mediante H&E y tricrómico de Masson para evaluar el grado de tejido de granulación, la formación de angiogénesis y la deposición de colágeno, proporcionando evidencia para evaluar las diferentes etapas y la progresión de la cicatrización de la herida17,18.
  3. Capture imágenes de todas las muestras utilizando un microscopio con un objetivo de 40x.
  4. Utilice un software compatible para analizar la sección de piel manchada, incluida la epidermis, la dermis, el tejido subcutáneo y el estado muscular.

Resultados

En este protocolo, se crearon heridas por quemaduras similares a un tablero de ajedrez con una duración de quemadura de 10 s a 97 °C mediante el dispositivo de calentamiento digital (Figura 1). La punta del dispositivo está hecha de cobre puro, que es conocido por su excelente conducción de calor y sus capacidades de calentamiento rápido. La empuñadura sostenida por el experimentador está hecha de material de policarbonato, que proporciona resistencia al calor y no inflamabilidad. En comparación con los métodos de placa/barra de metal precalentado o de agua hirviendo o caliente, este dispositivo demuestra un rendimiento de seguridad superior y reduce el tiempo de anestesia en ratones, acortando en consecuencia la duración total del experimento.

El proceso general de inducción y análisis de quemaduras se muestra en la Figura 2. Cada animal tenía seis heridas por quemaduras en el dorso, dispuestas como se muestra en la Figura 2E. Se evaluó el tamaño de la herida en estos animales y se recolectaron muestras de piel para su análisis histológico, incluida la tinción con tricrómico H&E y Masson en los días 1, 3, 7, 10 y 14 posteriores a la quemadura, respectivamente.

Cada herida por quemadura tenía forma circular con un área igual, así como una profundidad uniforme después de la inducción de la quemadura. El color del borde de la lesión por quemadura cambió de blanco ceroso a rojo, acompañado de una zona hiperémica debido a la respuesta inflamatoria inmediata a la lesión. Además, el tamaño de la herida por quemadura aumentó ligeramente durante las 72 horas posteriores a la quemadura (Figura 4A).

El análisis microscópico de las secciones de las heridas teñidas con tricrómico H&E y Masson (Figura 4B) reveló la destrucción completa de la capa epidérmica y daños en todo el espesor de la dermis, afectando tanto a la grasa subcutánea como al músculo. El examen histológico indicó que el proceso de cicatrización de la herida se encontraba en la etapa inflamatoria en el día 3, caracterizado por vasodilatación y una infiltración sustancial de células inflamatorias. Se observó una reducción notable en el área de la herida el día 7 posterior a la quemadura en comparación con el día 3, como se observa en las imágenes microscópicas de las muestras. El tejido de granulación y cardiovascular se forma, y las fibras de colágeno se depositan densamente el día 14, lo que significa que la cicatrización de heridas entra en la etapa de remodelación. Las heridas se recuperaron sin infección evidente durante todo el proceso de curación.

Además, se evaluaron las capacidades de cicatrización de heridas mediante la cuantificación de los datos de cicatrización de heridas y el análisis de los trazados de heridas (Figura 5). Se observó que la recuperación de la herida mejoró en las heridas tratadas con hidrogel de péptido TKH12,14, lo que se evidenció en áreas de la herida significativamente más pequeñas en los días 7, 10 y 14.

El intervalo entre heridas adyacentes (Figura 6), ya sea transversal o longitudinal, no confirmó diferencias en comparación con la piel no quemada. La epidermis, la dermis y los tejidos subcutáneos estaban intactos, y no había infiltración linfocitaria ni vasodilatación. El proceso de cicatrización de las dos heridas no interfiere entre sí. Por lo tanto, se pueden aplicar diferentes fármacos o apósitos al tratamiento de heridas en base al modelo para evaluar el efecto in vivo.

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Figura 1: Dispositivo de calentamiento digital para la inducción de quemaduras. El dispositivo de calentamiento digital utilizado para inducir lesiones por quemaduras. (a) El controlador de temperatura permite ajustes de temperatura que oscilan entre 50 y 450 °C. (b) La base del soporte se utiliza para sujetar la punta de combustión. (c) La punta del dispositivo se puede cambiar a diferentes tamaños. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Esquema del modelo de herida en forma de tablero de ajedrez. Un esquema paso a paso para reproducir el modelo de herida en forma de tablero de ajedrez descrito en el artículo. (A) Un ratón de 8 semanas de edad se utiliza como modelo para experimentos de curación de heridas. (B) El cabello se retira del área designada para herir. (C) Los seis puntos de herida se marcan con una punta de pipeta de 1 mL. (D) Se utiliza un dispositivo de calentamiento digital para crear seis heridas por quemaduras en el centro de cada sitio marcado (E). (F) Una imagen en primer plano del dorso después de la inducción de la quemadura. (G) Las muestras de piel (aproximadamente 1 cm × 1 cm) se recolectan los días 3, 7, 10 y 14. (H) Las muestras de piel se aplanan con papel filoso y se transfieren a casetes de inclusión. (I) se realiza la deshidratación de la parafina, y (J) las muestras se seccionan a 5 μm de espesor. (K) Las secciones se tiñen con hematoxilina y eosina (H&E), y tricrómico de Masson. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Proceso de inducción de lesiones por quemaduras de espesor completo. (A) El diámetro de una punta de pipeta de 1 mL y (B) la punta del dispositivo de calentamiento digital son de 9 mm y 4 mm, respectivamente. (C) El área dorsal del ratón se afeita con una afeitadora eléctrica. (D) Se aplica crema depilatoria durante 3 min. (E) Se limpia y seca la zona afeitada, y se marcan los puntos de herida con una punta de pipeta esterilizada de 1 ml. (F) El dispositivo de calentamiento digital se aplica a 97 °C durante 10 s para crear seis quemaduras. (G) Se aplica hielo a las heridas de las quemaduras para controlar el dolor. (H) Toda la parte posterior del ratón muestra las seis heridas por quemaduras de espesor completo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Imágenes representativas de las heridas por quemaduras y análisis histológico. (A) Imágenes de las heridas por quemaduras en los días 3, 7, 10 y 14, que muestran la progresión de la cicatrización. (B) Las imágenes histológicas teñidas con H&E y tricrómico de Masson demuestran cicatrización de heridas y regeneración de la piel. Barras de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Variación del tamaño de la herida a lo largo del tiempo. (A) La variación en el tamaño de la herida en animales control y tratados con hidrogel TKH a lo largo del tiempo, analizada con el software ImageJ. (B) Se presentan los datos correspondientes de rastreo de heridas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Heridas por quemaduras adyacentes y análisis histológico. (A) Imágenes representativas de las heridas por quemaduras adyacentes el día 1. (B) Muestras de heridas adyacentes recolectadas para análisis histológico el día 3 (encerradas en un círculo rojo). (C) El papel de filtro se utiliza para aplanar las muestras de tejido antes de la deshidratación de la parafina. (D) H&E y análisis tricrómico de Masson de heridas adyacentes. Barras de escala: 1 mm y 200 μm (ampliadas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Para los estudios de quemaduras, los modelos in vitro suelen centrarse en los efectos inhibitorios de los agentes antimicrobianos locales o antibióticos sobre las bacterias asociadas a las quemaduras, como Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa19, así como en el impacto de diversos biomateriales (como apósitos de elastina, seda e hidrogel14,20) en células inflamatorias posteriores a la quemadura (como neutrófilos, macrófagos) o células madre (como células madre mesenquimales). Estos experimentos generalmente se llevan a cabo en entornos controlados artificialmente, y las células cultivadas in vitro pueden exhibir características de crecimiento y comportamientos que difieren de los in vivo, lo que puede no replicar completamente los procesos fisiológicos de la cicatrización de heridas por quemaduras, como las interacciones de célula a célula y la influencia de la matriz extracelular. Por estas razones, los modelos animales de quemaduras son esenciales para dilucidar los mecanismos patológicos posteriores a la quemadura y evaluar nuevos enfoques terapéuticos. El proceso de cicatrización de heridas en ratones y humanos pasa por cuatro etapas superpuestas pero distintas: inflamación, proliferación, reepitelización y remodelación21,22. El uso de ratones como sujetos experimentales tiene varias ventajas biológicas, incluida la disponibilidad de numerosos reactivos específicos para ratones y la viabilidad de crear modelos transgénicos para investigar las vías de señalización molecular involucradas en el proceso de recuperación. Esto convierte a los ratones en uno de los modelos animales más utilizados para la investigación de quemaduras y cicatrización de heridas.

El presente estudio estableció un modelo de herida similar a un tablero de ajedrez de lesión por quemadura de espesor completo y evaluó la eficacia de un apósito de hidrogel utilizando este modelo. Los resultados indican que este modelo puede monitorizar eficazmente el rendimiento clínico de los apósitos experimentales. Dentro de cada animal, seis heridas por quemaduras se distribuyeron simétricamente a lo largo de la columna vertebral. Las heridas por quemaduras se pueden crear en lugares similares pero en diferentes ratones. Debido al área limitada de la piel del dorso y al número de heridas, el análisis histológico mostró que las heridas no interactuaban entre sí, lo que garantizó una evaluación independiente de cada apósito experimental en diferentes ubicaciones en el mismo dorso de ratón, minimizando el sesgo relacionado con el proceso de cicatrización de la herida. Además, este modelo también se beneficia de garantizar que cada ratón sirve como su propio control, lo que permite comparar tratamientos experimentales y de control en el dorso del mismo ratón, lo que supone una reducción significativa del número de animales y del coste experimental. Debido a los diferentes impactos de los diferentes medicamentos en la salud general de los ratones, si se van a aplicar múltiples medicamentos en la piel del mismo ratón para el tratamiento de diferentes heridas y la posterior comparación, puede ser necesario observar y verificar si la aplicación de un solo medicamento o la aplicación combinada de diferentes medicamentos afectará la salud general del ratón. Además, se debe prestar atención a la estabilidad o adhesión de diferentes medicamentos en la superficie de la piel para evitar la contaminación cruzada de medicamentos o la infección de la herida debido al rascado del ratón durante el proceso de curación.

La recolección de muestras de piel es crucial para el análisis histológico posterior. El borde del tejido se encogerá y se doblará en el fijador sin ningún tratamiento16. Después de la deshidratación y el corte de la parafina, también se curvará o incluso se superpondrá parcialmente en el portaobjetos, lo que dará lugar a imágenes antiestéticas bajo el microscopio y podría afectar el análisis histológico posterior, como el análisis estadístico de la longitud o el grosor de la herida. Por lo tanto, el uso de papel de filtro para aplanar el tejido puede obtener una sección más lisa en el portaobjetos, lo que hace que la imagen histológica sea nítida y facilita el análisis estadístico posterior. También intentamos usar clips para fijar la muestra antes de la deshidratación, lo que ayudó a garantizar la suavidad del tejido. Sin embargo, la aplicación de clips puede ejercer presión sobre el tejido sujeto, lo que provoca compresión y deformación del tejido. Por lo tanto, cuando se utiliza este método, la parte de la herida quemada no se puede sujetar para evitar afectar la observación.

Numerosos factores pueden influir en el proceso de curación, como el dolor, la picazón y la infección bacteriana23. El tratamiento eficaz del dolor por quemaduras es crucial para la recuperación y reintegración de los pacientes con lesiones por quemaduras. Un control inadecuado del dolor puede impedir el proceso de curación, lo que lleva a desafíos físicos y psicológicos duraderos, así como a estancias hospitalarias prolongadas24. En general, el dolor afecta el comportamiento alimentario en ratones. Por lo tanto, cada herida se trató inmediatamente con hielo después de la quemadura y se inyectó buprenorfina (0,1 mg/kg) por vía subcutánea dos veces al día durante 3 días para el tratamiento del dolor. Además, los gránulos de comida se ablandaron y se colocaron en el suelo de la jaula para facilitar la alimentación. En las viviendas comunales, los ratones pueden rascarse y lamer las heridas de los demás, lo que puede retrasar la cicatrización de las heridas o causar infecciones. Por lo tanto, el alojamiento individual de los ratones se hace necesario como medida preventiva. El uso de apósito transpirable para cubrir el dorso después de la inducción de la quemadura puede evitar que los ratones se rasquen la herida y reducir el riesgo de infección25. Sin embargo, es esencial seleccionar los apósitos con criterio y cortarlos al tamaño adecuado para permitir el movimiento normal de los ratones. Los apósitos deben reemplazarse de inmediato si se caen, con la recomendación de cambiarlos al menos una vez cada dos días. El uso prolongado de apósitos puede provocar una absorción inadecuada de los exudados de la herida.

Aunque el modelo de ratón tiene sus ventajas específicas, todavía no puede simular completamente el proceso de cicatrización de heridas en humanos. Los seres humanos se curan principalmente a través de la reepitelización y la granulación. Por el contrario, la piel del ratón presenta un panículo carnoso único, una capa delgada de músculo esquelético que solo está presente en el platisma del cuelloen los seres humanos, por lo que la cicatrización de heridas ocurre principalmente a través de la contracción de la herida. Además, la piel del ratón puede poseer un grupo enriquecido de células progenitoras, lo que facilita la rápida curación y queratinización de la piel26,27. Estos factores contribuyen colectivamente a reducir sustancialmente el tiempo de curación. En modelos animales, se han utilizado anillos anti-contracción de heridas para mitigar el impacto de la contracción de la herida en el proceso de cicatrización e imitar la cicatrización de heridas fisiológica similar a la humana que cicatriza con tejido de granulación y reepitelización 12,17,28.

El establecimiento exitoso del modelo de lesiones por quemaduras en ratones proporciona una herramienta valiosa para estudiar la fisiopatología de las lesiones térmicas y evaluar posibles intervenciones terapéuticas. Los cambios histológicos observados en el tejido cutáneo quemado se alinean con los rasgos característicos de la lesión térmica, destacando la fiabilidad y validez del modelo en la recapitulación de las manifestaciones clínicas de las quemaduras.

En general, el modelo de lesiones por quemaduras en ratones ofrece una plataforma sólida para investigar los mecanismos moleculares que subyacen al daño tisular inducido por quemaduras, la inflamación y los procesos de cicatrización de heridas. Los estudios futuros que utilicen este modelo pueden contribuir al desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos destinados a mejorar los resultados de los pacientes con quemaduras y reducir la carga de morbilidad y mortalidad relacionadas con las quemaduras.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo del Programa de Ciencia y Tecnología de Sichuan (23ZYZYTS0120), las subvenciones del Hospital de Estomatología de China Occidental de la Universidad de Sichuan (RD-03-202011) y el Programa de Ciencia y Tecnología de Sichuan (2022NSFSC0614). Las figuras fueron creadas con BioRender. COM.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Punta de pipeta de 1 mlKIRGEN,USAKG1333Se utiliza para localizar sitios de heridas por quemaduras
3 M Tegaderm film3M,USA1624WCN 6 cm x 7 cmPara la cubierta de la herida después de la inducción de quemaduras
4% paraformaldehído (PFA)Biosharp,ChinaBL539ASe utiliza para fijar las muestras de piel
BuprenorfinaSigma-Aldrich,EE. UUPHR8955-50MGPara el manejo del dolor de los ratones
C57BL/6 ratonesChengdu Dashuo empresa de animales experimentales, ChinaningunoPara el establecimiento de la
crema depilatoriaVeet, China—Para la depilación del dorso de los ratones
Dispositivo de calentamiento digitalShenzhen Kapper Technology Company, ChinaNo.936DPara la inducción de quemaduras de los ratones
Afeitadora eléctricaAUX, ChinaAUX-A5Para la depilación del dorso de los ratones
Papel de filtroy mdash;—Se utiliza para desplegar las muestras de piel
Software GraphPad—Prisma GraphPad 9.5.0Para el análisis del área de la herida por quemadura
Guantes resistentes al calor——Se utiliza para sujetar la punta del dispositivo de calefacción digital
Kit de tinción de hematoxilina y eosinaSolarbio,ChinaG1120Para el análisis histológico de los portaobjetos
ImageJ software—ImagenJ 1.54fPara el análisis del área de la herida por quemadura
IsofluranoRWD, ChinaR510-22-10Para la anestesia de los ratones
Kit de tinción tricrómico de MassonSolarbio, ChinaG1340Para el análisis histológico de los portaobjetos
MicroscopioOlympus, Japón  VS200 ASWSe utiliza para escanear el H& Portaobjetos teñidos E y Masson
Cassette de tejidoCITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD, China31050102WPara la deshidratación de tejidos con parafina y la inclusión de parafina
. modelo de quemaduras

Referencias

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